INTRODUÇÃO À CROMATOGRAFIA

 O que é Cromatografia??
A cromatografia é um método físico-químico de
separação dos componentes de uma mistura.

Está fundamentada na migração diferencial dos

componentes de uma mistura, que ocorre devido a
diferentes interações, entre duas fases imiscíveis:

a fase móvel (FM) e a fase estacionária (FE).

Cromatografia: definição
International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) - “Técnica
usada para a separação dos componentes de uma amostra, os quais
se distribuem entre duas fases, uma estacionária e a outra móvel”.

FASE ESTACIONÁRIA  Sólido ou líquido

FASE MÓVEL  Líquida, gasosa, fluido supercrítico

Passagem da fase móvel  componentes distribuídos e retidos

seletivamente pela fase estacionária

MIGRAÇÕES DIFERENCIAIS
 CROMATOGRAFIA  Princípio básico
Separação dos componentes de uma mistura:
 a velocidade de passagem de um soluto (analito) no
sistema cromatográfico depende de sua afinidade entre
as duas fases.
Kd = Ce / Cm
Kd = coeficiente de distribuição
Ce = concentração do analito na fase estacionária
Cm = concentração do analito na fase móvel

Analito apresenta maior

Valor de Kd elevado
afinidade pela FE

Maior tempo de retenção

 CROMATOGRAFIA  Princípio básico
Separação de misturas por interação diferencial:
• maior interação com a FE = maior retenção (movimento lento)
• menor interação com a FE = menor retenção (mais rápida)

FASE MÓVEL

FASE ESTACIONÁRIA

os componentes da mistura são separados em bandas.

Por que a Cromatografia é importante?

 Permite: SEPARAR
IDENTIFICAR
QUANTIFICAR

... diversas espécies químicas...

 associada a outras técnicas instrumentais de análise:

Ex.: espectrofotometria, espectrometria de massas,...
 PRINCIPAIS FATOS HISTÓRICOS
Primeira publicação
em fase gasosa
Martin e Synge
Separação de pigmentos;
1952 (Prêmio Nobel)
proposição do termo Cromatografia em papel
cromatografia Izmailov e Shraiber Equipamentos CG
Mikhael Tswett 1938 comerciais
1903-1906 1955

1897-1903 1930 1941 1958

David T. Day Kuhn e Lederer Martin e Synge Golay: colunas
Separação de Cromatografia Particição em capilares em CG
HC do em coluna: cromatografia
petróleo Xantofilas de gema líquida; Princípios
de ovo de fase gasosa
PRINCIPAIS FATOS HISTÓRICOS

Mikhael Semenovich Tswett

nascido em Asti (Itália) a 14 de Maio de 1872, sendo a família
originária da Rússia.

É considerado o pai da
cromatografia moderna,
através dos vários trabalhos
experimentais que efetuou.
 M. TSWEET (1906): Separação de misturas de
pigmentos vegetais em colunas recheadas com
adsorvente sólido (F.E.) e solvente (F.M.).

éter de
petróleo mistura de
pigmentos
CaCO3 pigmentos
separados

Cromatografia =
kroma [cor] + graph [escrever] (Grego)
CLASSIFICAÇÃO DAS
TÉCNICAS
CROMATOGRÁFICAS
CLASSIFICAÇÃO DAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

Critérios: suporte físico, estado físico das fases móveis e estacionárias

Cromatografia

Suporte Planar Em Coluna

Fase móvel Líquido Gás Fluido Líquido

Supercrítico*

*Fluido Supercrítico: vapor pressurizado, em temperatura e pressão acima de seu ponto crítico
CLASSIFICAÇÃO DAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

Técnica Planar

Fase móvel Líquido

(FM)

Líquido Sólido Fase

Fase estacionária
ligada
(FE)

Tipo de
CP CCD CCD
Cromatografia

CP = cromatografia em papel
CCD = cromatografia em camada delgada
 Cromatografia em papel

Cromatografia em camada delgada

CLASSIFICAÇÃO DAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

Critérios: suporte físico, estado físico das fases móveis e estacionárias

Cromatografia

Suporte Planar Em Coluna

Fase móvel Líquido Gás Fluido Líquido

Supercrítico*

*Fluido Supercrítico: vapor pressurizado, em temperatura e pressão acima de seu ponto crítico
CLASSIFICAÇÃO DAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

Técnica Em Coluna

FM Gás Fluido Líquido

Supercrítico

Fase Fase Líquido Fase

FE Líquido Sólido Sólido Ligada Sólido Ligada
Ligada

TC CGL CGS CGFL CSS CSFL CLL CE

CLS

CLL = cromatografia líquido-líquido CLFL CTI CB

CLS = cromatografia líquido-sólido
CE = cromatografia por exclusão
CLFL = cromatografia líquida com fase quimicamente ligada
CTI = cromatografia por troca iônica
CB = cromatografia por bioafinidade
CLASSIFICAÇÃO DAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

Cromatografia em coluna:

• de acordo com o diâmetro interno e objetivo da separação:

- preparativa (6-50 mm)
- analítica (2-6 mm)
- microdiâmetro (1-2 mm)
- capilar (<1 mm)

• Pressão:
- clássica (sob pressão atmosférica, colunas de vidro)
- média pressão
- alta pressão

... há outros critérios

CLASSIFICAÇÃO DAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

 Critério: polaridade relativa das fases

- em gasosa: fase móvel é inerte (“gás de arraste”)
- em líquida: Fase Normal (FE > FM)
Fase Reversa (FM > FE)

 Critério: mecanismo de separação

processos: - químicos (troca iônica, quiral, afinidade),
- físicos (sorção – adsorção ou absorção/partição)
ou
- mecânicos (exclusão por tamanho molecular)
 Cromatografia em coluna - CL

Coluna aberta CLAE - HPLC

Cromatografia em coluna - CG
Tipos básicos de colunas capilares:
- Colunas empacotadas ou “recheadas”: preenchida com partículas de
suporte que contém a FE
- Colunas tubulares abertas (típicas de CGAR): FE é colocada
diretamente sobre a parede interior da coluna.
http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/gc/
MECANISMOS DE SEPARAÇÃO
 Mecanismos de separação
1. Processos físicos: forças de atrações dipolares, formação de ligação
de H.
- adsorção: FE sólida com grupos ativos na superfície (ex.: sílica,
alumina); ocorre na interface com FM; dessorção por volatilidade (CG)
ou solubilidade na FM (CL e CFS); é o processo mais comum (CCD,
CGS, CLS, CSS)

CCD (camada delgada), CGS (gás-sólido), CLS (líquido-sólido), CSS (supercrítica com FE sólida)
 Mecanismos de separação
1. Processos físicos:
- absorção (partição): FE líquida e espalhada na superfície de
um suporte sólido e inerte (ou paredes do tubo cromatográfico);
processo intrafacial; baseia-se na solubilidade dos compostos da
amostra na FE; o retorno à FM depende da volatilidade (CG) ou
solubilidade na FM; ocorre na CP, CGL, CLL.

CP = cromatografia em papel; CGL = cromatografia gás-líquido

CLL = cromatografia líquido-líquido
Mecanismos de separação
Com fases estacionárias quimicamente ligadas:
mistura de partição e adsorção
 Mecanismos de separação

2. Processos químicos:

- troca iônica: FE contém grupos funcionais ionizáveis

(trocadores de íons – catiônico ou aniônico), FM consiste em
solução iônica compatível (propriedades tamponantes) que
promove a eluição dos compostos da amostra por substituição
ou deslocamento.
Mecanismos de separação

2. Processos químicos:
- afinidade (bioafinidade): FE contém grupos químicos com
especificidade biológica quimicamente ligados ao suporte (ex.:
antígenos, enzimas), retiram da FM somente as substâncias
complementares da amostra; a eluição ocorre por modificação
de propriedades da fase móvel ou por deslocamento.
 Mecanismos de separação
3. Processo mecânico:
- exclusão por tamanho molecular: FE tem composição
inerte, com partículas de forma, tamanho e porosidade
uniformes; moléculas grandes são excluídas dos poros e eluem
com a FM intersticial, moléculas menores penetram facilmente
nos poros e eluem com velocidades variáveis.
Acompanhamento da separação cromatográfica
Acompanhamento da separação cromatográfica
Exemplo de cromatografia em camada delgada:
análise visual, luz UV, reveladores
Visualização ou detecção de bandas: manchas na superfície
Cromatografia em coluna: coleta de frações
Cromatografia em coluna: coleta de frações
Cromatografia em coluna: coleta de frações
Cromatografia em coluna: uso de detectores
Cromatografia líquida em coluna: uso de detectores

Detector: posicionado sempre no final (saída) da coluna

Sinal registrado em função do tempo ou do volume de FM
ANÁLISE CROMATOGRÁFICA

 Separação em coluna
 A resposta do detector é
traduzida em um gráfico,
CROMATOGRAMA, que
relaciona o sinal registrado com
o tempo (ou volume) necessário
para a eluição de cada
componente.
 Eluição típica em cromatografia líquida

Posição dos picos (bandas)  identificação de componentes da

amostra. Área: fornece medida de quantidade.