CENTRO DE ENERGIA NUCLEAR NA AGRICULTURA

CROMATOGRAFIA COM ÊNFASE

EM CLAE:
APLICAÇÕES PRÁTICAS

Alessandra de Cássia Romero

Doutoranda em Ciências

acromero@cena.usp.br
 HISTÓRICO:

 SÉCULO XX: século da cromatografia

♦ Utilização descrita em textos antigos,

gregos e egípcios

♦ Michael Tswett (1872-1919)

♦ 1903 1906: “cromatografia”

♦ Martin & Synge cromatografia de partição

 CROMATOGRAFIA:

 Técnica de separação (física/química) na qual os

componentes a serem separados são distribuídos
entre 2 fases: sendo uma fixa e de grande área
superficial, denominada “fase estacionária”, e
outra, denominada fase móvel, um fluido que
percola através da fase estacionária
SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA

 Substâncias têm afinidades diferentes com a fase

estacionária e com a fase móvel.

 Fase móvel percola a fase estacionária separação

♦ Fase Estacionária: adsorção do soluto

♦ Fase Móvel: dessorção do soluto da F.E.

Eluição do analíto
TIPOS DE CROMATOGRAFIA:

Lanças, F.M. Cromatografia em fase gasosa, 1993 (com modificações)

 DEFINIÇÕES GERAIS:
 ADSORÇÃO

Os compostos são retidos na fase estacionária (polaridade)

por um período de tempo (tempo de retenção – TR) até que a
passagem constante da fase móvel seja capaz de retirar
gradativamente, cada um desses compostos.

 PARTIÇÃO

Os compostos passam por uma distribuição (solubilidade)

entre a fase móvel e a estacionária, que é colocada na
coluna na forma de um filme em um suporte sólido hidrofílico.
 DEFINIÇÕES GERAIS:
 FATOR DE RETENÇÃO (k): razão entre a massa do soluto
presente na FM e na FE.
♦ Quanto maior o k , maior o tempo de retenção na coluna.
♦ Juntamente com o fluxo, determina o TR do pico.

 SELETIVIDADE (α): relação entre o tempo que 2 solutos

passam na fase líquida.
♦ Mede a capacidade de separação entre 2 picos e é alterada
com a troca do solvente da FM, pH, FE e temperatura.
α
 DEFINIÇÕES GERAIS:
 EFICIÊNCIA DA COLUNA:

Número de pratos teóricos (N): número de distribuição de

equilíbrio entre a fase móvel e a estacionária.
♦ Quanto maior o nº de N, mais eficiente a coluna.

 RESOLUÇÃO:

Medida quantitativa da separação de 2 picos consecutivos,

determinada pela distância entre os TRs e a largura da base
dos picos.
DEFINIÇÕES GERAIS:

α = TR (B)
TR (A)

A B

Rs = t N = 16 TR 2

wb2 wb
 HIGH RESOLUTION GAS
CHROMATOGRAPHY (HRGC)

 Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CG).

 Fase móvel é um gás.

 Fase estacionária: sólida ou líquida.

 Mecanismo de separação:
CGS: tubo percolado com um sólido adsorção
CGL: suporte sólido revestido por um líquido partição
CROMATOGRAFIA GASOSA (CG):

 Vantagens da técnica:
♦ resolução
♦ velocidade em análise
♦ sensibilidade
♦ exatidão (repetibilidade excelente)

 Limitações:
♦ amostra deve ser volátil (gás, líquido ou sólido)
♦ amostras sujas requerem limpeza
♦ uso de outro instrumento para confirmação de identidade
♦ treinamento e experiência
CROMATOGRAFIA GASOSA (CG):
 Escolhas para uma boa utilização da técnica:

♦ Detector (seletivo ou universal)

♦ Coluna (recheio, espessura, comprimento)
♦ Gás de arraste
♦ Introdução da amostra
♦ Controle da temperatura (injeção, coluna e detector)
♦ Quantificação Registrador
Detector
Injetor

Controle de fluxo

Coluna
Cilindro do gás de arraste
Forno
 DETECTORES GC:

 CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS:

♦ Alta sensibilidade

♦ Resposta/detecção adequada a amostra

♦ Linearidade

♦ Ruído baixo

♦ Quantidade mínima detectada

 DETECTORES GC:

 Principais detectores em CG:

♦ Detector por Condutividade Térmica (TCD): Universal.

♦ Detector por Ionização de Chama (FID): Orgânicos.

♦ Detector por Captura de Elétrons (ECD): Orgânicos com

capacidade de capturar elétrons.
 COLUNAS GC:

 Empacotadas: maior quantidade de amostra injetada; menor

resolução e pratos teóricos.
 Capilares: menor quantidade de amostra; maior resolução e pratos
teóricos.
 Quanto maior o comprimento, maior a resolução e eficiência (mas
também, o custo, o TR, a pressão...).
 Quanto menor o diâmetro, maior a eficiência.
 Uso adequado de temperatura.
 COLUNAS GC:

 Gás-sólido: (recheio de sílica gel, carvão ativado, aluminosilicato

sintético): Adsorção interação entre o analíto e FE, na interface com
o gás de arraste (FM); quanto maior a afinidade da amostra pela FE,
maior o tempo de adsorção.

 Gás-líquido: (recheio é um sólido recoberto com um líquido de alto ponto

de ebulição) Partição quanto mais similares forem a fase líquida e a
amostra, mais simples e eficiente será a separação.
 GÁS DE ARRASTE:

 Fase móvel.
 Não interagir com a fase estacionária ou com a amostra.
 Baixo custo.
 Elevado grau de pureza.
 Ser adequado ao detector utilizado.
 Fluxo do gás de arraste irá influenciar na eficiência da coluna.
 INTRODUÇÃO DA AMOSTRA:

 Uma introdução ou injeção de amostra eficiente deve permitir

que quantidades controladas cheguem até a coluna,
constituindo uma composição idêntica ou pelo menos
representativa da amostra.

 Não existe uma forma universal de injeção que atenda a todas

as demandas.

 A escolha depende da coluna utilizada, das condições

operacionais, da T°C e das características da amostra.
 INTRODUÇÃO DA AMOSTRA:

 SPLIT: amostra vaporiza no pórtico de injeção e uma porção é

introduzida na coluna.

 SPLITLESS: sem divisão da amostra.

 ON COLUMN: diretamente na coluna

♦ Cold on column: amostra depositada à frio na coluna dentro

do forno.
♦ PTV (Programação de Temperatura Variável): permite a
injeção de amostras líquidas em colunas capilares
 ANÁLISE QUALITIVA:

 Tempo de retenção: característico do composto, mas não

exclusivo dele.

 TR varia com a coluna, fluxo do gás de arraste, fase líquida,

temperatura da coluna.

 Identificação por fortificação.

 Sistemas acoplados “on-line” ou “off-line” (Ex: GC-MS).

 ANÁLISE QUANTITATIVA:
Massa A (%) = área A x 100
 Normalização da área simples área total

Fator de correção: massa / área

 Normalização da área corrigida
Massa A (%) = área A / FC x 100
área total / FC

 Padrão externo: curva de calibração

 Padrão interno: curva de calibração com adição de padrão

interno a cada ponto da curva.
SHIMADZU - LANA:
SHIMADZU - LANA:
CROMATOGRAMA:

Lanças, F.M. Cromatografia em fase gasosa, 1993

THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
(TLC)

 Cromatografia em camada delgada (CCD)

- Aplicação da amostra em papel recoberto por sílica;
- Aplicação de concentrações de padrões analíticos;
- Desenvolvimento da placa em sistemas de solvente;
- Comparação visual entre o desenvolvimento dos padrões e
da amostra (distância e intensidade).
THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
(TLC)
THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
(TLC)
THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
(TLC)
 HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY (HPLC)

 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).

 CLAE: Separação de substâncias em uma mistura,

proporcionada pela impulsão de um solvente a fluxo
constante e elevada pressão, através de uma coluna na
qual essa mistura é seletivamente separada.
 CLASSIFICAÇÃO:

 Quantidade de Amostra
 Mecanismo de separação
 Fase Estacionária
 Quantidade de amostra:

 Cromatografia em escala preparativa (>1g)

 Cromatografia em escala semi-preparativa (µg – g)

 Cromatografia analítica (pg - µg)

 Mecanismo de Separação:

 Cromatografia líquida de adsorção (Líquido-sólido):

adsorção sobre superfície polar.

 Cromatografia de partição líquido-líquido

 Líquido-líquido em Fase ligada: partição (FE e FM).

 Troca iônica: adsorção reversível de íons.

 Exclusão: poros internos separam partículas por tamanho.

 Fase Estacionária:

 Fase Normal: FE polar, FM apolar.

 Fase Reversa: FE apolar, FM polar.

 ELUIÇÃO
 4 PASSOS:

- Introdução da amostra
- Interação entre a amostra, FE e FM
- Remoção de interferentes
- Eluição do analíto
 TIPOS DE ELUIÇÃO:
 ISOCRÁTICA
- proporção entre os solventes utilizados na fase
móvel é constante durante a eluição.

 GRADIENTE
- a proporção entre os solventes utilizados varia
gradualmente durante a eluição.
 PRIMEIROS PASSOS

ANALÍTO????

 Escolha do tipo de coluna

 Modo de detecção
 Escolha da Fase Móvel
 Otimização de parâmetros para cromatografia
 Validar o método
 ANALÍTO: Colunas

 As características do analíto determinam quais as

escolhas acertadas quanto ao tipo de equipamento
utilizado e suas configurações RESULTADOS

AMOSTRA APOLAR AMOSTRA POLAR

COLUNA DE FASE NORMAL COLUNA DE FASE REVERSA

Recheio é polar Recheio é apolar
 ANALÍTO: Detecção

DETECÇÃO:

 O analíto apresenta fluorescência natural ou

pode ser derivatizado?
DETECTOR DE FLUORESCÊNCIA

 O analíto absorve a luz branca?

DETECTOR UV, UV-VIS ou PDA UV-Vis
 OUTROS DETECTORES:

 Detector de índice de refração: diferença de

refração entre o solvente e o soluto.

 Detector eletroquímico: oxidação ou redução de

um composto.

 Espectrometria de massas: combinação de

processos de ionização, fragmentação e
separação iônica.
 DETECTORES:
 Seletivos: UV fixo e variável, fluorescência

 Universais: IR e MS

 UV, fluorescência e MS podem utilizar eluição

gradiente, o IR não.

 Quantidade Mínima Detectada:

♦ UV: ng
♦ IR: µg
♦ Fluorescência: pg
♦ MS: ng-pg
 ESCOLHA DA FASE MÓVEL
 CONSIDERAÇÕES GERAIS:
 Alto grau de pureza
 Força do solvente
 Polaridade
 Seletividade

 Polaridade ou Força: determina por quanto tempo

os eluentes são retidos (TR)
 Seletividade: retenção relativa pode afetar o
formato dos picos
ESCOLHA DA FASE MÓVEL

 Modo de eluição?
 Tempo de retenção?
 Presença de interferentes?
 Resolução de picos.
 Linha de base.
 Repetibilidade.
 FASE MÓVEL

 Nem todos os solventes podem ser utilizados

em conjunto!

- Podem interagir quimicamente;

- Viscosidade (pressão);
- Alta pressão de vapor (bolhas);
- Interferir na detecção do analíto;
- Filtrados e degaseificados.
COMPONENTES HPLC:
SHIMADZU
 INICIANDO:
 Purga
 Acionar a bomba / subir fluxo
OPERANDO:
AGILENT 1100 - LANA:
SOFTWARE:
 MÉTODO:

 A amostra é solúvel?
 É possível analisá-la por HPLC?
 Se sim, qual o detector?
 Qual o modo da coluna?
 Qual a coluna? FE, comprimento, diâmetro, etc.
 FM? Polaridade, pH, força iônica.
 A amostra é solúvel?

 Desejável: 1% solução em solvente fraco. Tente hexano,

MeOH ou água.

 Ácido ou básico (sal?)?

0,01 N HAc – pH ~ 3,4
0,5 N NH4OH – pH ~ 10,6

 Alguns polímeros precisam ser aquecidos.

Ex: polietileno-tolueno (120°C)
 Qual detector?
 Se a amostra pode ser analisada por HPLC (consulte a
literatura, busque informações sobre a amostra), o
próximo passo é definir qual o detector.

 UV-Vis é a primeira escolha.

 LC/MS – é a melhor escolha.

 Fluorescência – apenas se houver o conhecimento prévio

de que é apropriado para a amostra.

 IR – quando não houver informação suficiente sobre a

amostra universal, mas pouco sensível.
Que tipo de coluna?

Lanças, F.M. Cromatografia líquida moderna, 2009 – com modificações

 Qual a coluna?
 Se solúvel em hexano, a amostra não é polar:
- Sílica gel
- Alumina
- Ciano

 Se solúvel em MeOH:
- RP-18 ou ODS
- RP-8
- Fenil
 Qual a coluna?

 Comprimento:
- Começar com 15 cm, 5mm
- Maior comprimento, maior TR

 Diâmetro da partícula:
- 10 e 5 µm

 Diâmetro interno:
- 4 mm ~ 1mL/min.
- 2 mm ~ 250µL/min.
 Fase Móvel:

 Começar com solvente forte, fluxo rápido.

- Obtenha os picos;
- Reduza a força do solvente, se necessário.

 Meça os picos eluídos e otimize a seletividade.

 Aumente o N: fluxo mais lento, menos amostra, maior

T°C, comprimento maior, partículas menores.
TROUBLESHOOTING
 DIAGNÓSTICO DE PROBLEMAS:

 ALARGAMENTO DOS PICOS:

- TR alto
- Viscosidade da FM muito alta
- Eficiência pobre da coluna
- Eluição de analítos de injeções anteriores
- Dispersão do pico na válvula de injeção
- Coluna com grande volume extra
- Volume da cela do detector muito grande
 DIAGNÓSTICO DE PROBLEMAS:

 PICOS FANTASMAS:

- Contaminação
- Eluição posterior de analítos retidos
- Água contaminada em FR
- Interferentes desconhecidos na amostra

Branco?
Padrão?
 DIAGNÓSTICO DE PROBLEMAS:
 Formação de cauda frontal:

- Formação de caminhos preferenciais

- Sobrecarga da coluna
- Cauda lateral: TR elevado, degradação coluna, volume morto
 DIAGNÓSTICO DE PROBLEMAS:
 Sobreposição de picos:

- Frit entupido
- Co-eluição de interferentes (corrida atual ou anterior)
- Sobrecarga da coluna (uso ou volume)
 DIAGNÓSTICO DE PROBLEMAS:

 Mudanças no tempo de retenção:

- Contaminantes
- Tempo de condicionamento insuficiente
- Poucas injeções anteriores (sítios ativos)
- Mistura inadequada da FM ou evaporação seletiva
- Temperatura variável da coluna
- Sobrecarga da coluna com amostra
- Fluxo instável
- Degradação da coluna
 DIAGNÓSTICO DE PROBLEMAS:
 Pressão alta:

- Entupimento
- Viscosidade muito alta da FM
- Crescimento de microorganismos
- Precipitação de sais
- Adsorção irreversível na coluna

 Pressão baixa:

- Vazamentos
- Válvula de purga aberta ou com vazamento
 ANÁLISE QUALITIVA:

 Tempo de retenção: característico do composto, mas não

exclusivo dele.

 TR varia com a coluna, fase móvel e temperatura.

 Identificação por fortificação.

 PDA: mais informações sobre o composto.

 Sistemas acoplados “on-line” ou “off-line” (Ex: LC-MS).

 ANÁLISE QUANTITATIVA:
Massa A (%) = área A x 100
 Normalização da área simples área total

Fator de correção: massa / área

 Normalização da área corrigida
Massa A (%) = área A / FC x 100
área total / FC

 Padrão externo: curva de calibração

 Padrão interno: curva de calibração com adição de padrão

interno a cada ponto da curva.
 VALIDAÇÃO:
 Instrumento
- Check-list do aparelho
- Testes nos módulos

 Método
- Definir os parâmetros da validação objetivo da análise
- Exatidão e precisão
- Sensibilidade
- LD e LQ
- Linearidade
- Recuperação
- ...
 ALGUMAS APLICAÇÕES
PRÁTICAS:

 AFLATOXINAS

 DERIVADOS DE PURINAS

 ÉSTERES DE FORBOL
AFM1 EM FLUIDOS BIOLÓGICOS:
 AFM1 EM FLUIDOS BIOLÓGICOS:
 Parâmetros cromatográficos:

- CLAE (Shimadzu)
- Extração com colunas de imunoafinidade
- Fase reversa, C18, 250 x 4,6mm, 3 µm (Phenomenex)
- Fase móvel: ACN:H2O (75:25, v/v), isocrática
- Detector de fluorescência
- Volume de Injeção de 100 µL (manual)
- Quantificação em ppt
- Tempo de retenção e derivatização para qualificação
AFM1 EM FLUIDOS BIOLÓGICOS:

AFM1 em urina Amostra derivatizada – confirmação AFM1

 DERIVADOS DE PURINAS:
 Parâmetros cromatográficos:

- CLAE (Agilent 1100)

- Alantoína, creatinina, ácido úrico, hipoxantina e xantina
- Diluição / centrifugação
- Fase reversa, C18, 250 x 4,6mm (Zorbax)
- FM - tampão A: NH4H2PO4 0,0025 M e tampão B (tampão A:MeOH,
19:1)
- Detector: Arranjo de fotodiodos
- Volume de Injeção de 20uL (automática)
- Quantificação em ppb
- Qualificação por comparação espectral
 DERIVADOS DE PURINAS:

CREATININA

ÃC. ÚRICO

ALANTOÍNA
NA
NTI

IN OL
XA

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OX
A
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 ÉSTERES DE FORBOL:
 Parâmetros cromatográficos:

- CLAE (Agilent 1100)

- Extração por solvente / centrifugação
- Fase reversa, C18, 250 x 4,6mm (Zorbax)
- FM – ACN, tampão B (1,75mL de ácido ortofosfórico, 85%) e

THF (eluição gradiente)

- Detector: Arranjo de fotodiodos
- Volume de Injeção de 20uL (automática)
- Quantificação em ppb
 ÉSTERES DE FORBOL:
DAD1 E, Sig=284,8 Ref=360,100 (LANA\CURVA TPA 1\250PPM 22ABRIL 2 F_OTIMIZADO.D)
mAU

26.904 26.775
*D A D 1 , 1 7 .7 8 7 (6 3 .9 m A U , - ) R e f= 1 7 .6 0 0 & 1 8 .0 6 7 o f 2 5 0 P P M 2 2 A B R IL 2 F _ O T IM IZ A D O .D
250 m AU

50

40

26.850
30

20
200 10

0
225 250 275 300 325 350 nm

24.143
D A D 1 , 1 7 .6 0 0 (4 .4 m A U , - ) o f 2 5 0 P P M 2 2 A B R IL 2 F _ O T IM IZ A D O .D
D A D 1 , 1 8 .0 6 7 (4 .6 m A U , - ) o f 2 5 0 P P M 2 2 A B R IL 2 F _ O T IM IZ A D O .D
D A D 1 , 1 7 .7 8 7 (6 7 .2 m A U , - ) o f 2 5 0 P P M 2 2 A B R IL 2 F _ O T IM IZ A D O .D
150 m AU

50
40
30
20
10
100 0

225 250 275 300 325 350 nm

FORBOL - TPA

50

21.713
21.528
21.785
17.789
3.048

0 5 10 15 20 25 min
 Considerações Finais:

 SÉCULO XXI:

UPLC ou U-HPLC
LC-MS
Cromatografia Multidimensional (LC-LC ou LC/LC, idem CG)
Cromatografia Abrangente (LCxLC ou CGxCG)
OBRIGADA!

acromero@cena.usp.br
(19) 3429-4811