UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ

Centro de Tecnologia- CTC

Departamento de Engenharia Química – UEM
Análise Instrumental – 217 – Turma 01

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
RESUMO EXPANDIDO

ACADÊMICOS: RA:
Poliana Larissa de Souza Goes 119780

PROFESSOR: Lucas Spessato de Souza

Maringá, 11 de janeiro de 2024

1. CROMATOGRAFIA GASOSA
A cromatografia gasosa pode ser definida como a separação de gases ou substancias
voláteis. O princípio dessa técnica consiste na diferente distribuição das substâncias da amostra
entre a fase estacionária (sólida ou líquida) e uma fase móvel (gasosa).
O uso de um detector da coluna torna possível a classificação das substancias, visto que a
amostra é introduzida em uma coluna contendo a fase estacionaria, assim com a manipulação
da temperatura, as substancias chegam a saída da coluna em tempos diferentes.
O surgimento dessa técnica é datado por volta de 1930 e acelerado em 1952 por James e
Martin. O seu grande desenvolvimento possibilitou que hoje seja largamente utilizada. Um dos
motivos do seu sucesso é o fato de analisar dezenas de substâncias de uma mesma amostra,
além de sua sensibilidade, que consegue detectar cerca de 10-12 g, ou seja, é possível utilizar
apenas uma pequena quantidade da amostra. Ademais, é também uma técnica que oferece bons
resultados quantitativos de concentração.
No entanto, existem também algumas desvantagens deste método. Tal como precisar ser
feita com substâncias estáveis termicamente. Apesar de ser uma técnica rápida há a necessidade
de preparar a amostra, que pode ser longa e complexa.

1.1. Técnicas usadas em cromatografia gasosa

A técnica mais usada é a eluição, em que uma corrente continua de gás passa pela
coluna e a amostra vaporizada é introduzida nessa corrente, sendo arrastada pela coluna,
quando as substancias separadas chegam ao detector é emitido um sinal para o registrador.
A temperatura da coluna pode manter-se constante ou não. A programação da
temperatura é muito importante visto que melhora a separação e diminui o tempo de análise,
além de ser útil quando a amostra tem grande diferença no ponto de ebulição. A depender
da fase estacionária tem-se cromatografia gás-sólido, com compostos apolares de baixa
massa molecular e gás-líquido, que corresponde a 95% do total de aplicações.

1.2. Eficiência
A cromatografia gasosa é medida em termos de número de pratos teóricos, os quais são
influenciados por fatores como comprimento, diâmetro interno, temperatura e vazão da fase
móvel. A eficiência é expressa pela equação N = 16(Dr/Wb)^2, onde Dr representa a
largura dos picos. A equação de Van Deemter relaciona a altura equivalente a um prato
teórico, velocidade linear do gás de arraste e fatores que causam alargamento de picos,
incluindo A (caminhos diferentes das moléculas), B (difusão molecular na fase móvel) e C
(espessura do filme na fase estacionária).
Para otimizar a eficiência, sugere-se o uso de colunas com diâmetros internos pequenos,
partículas uniformes, gases de arraste com maiores massas moleculares e fase líquida de
baixa viscosidade. A equação de Van Deemter também destaca a importância da escolha
do gás de arraste de acordo com o tipo de detector usado. Fatores extra-coluna, como
volumes excessivos nas conexões coluna-injetor e coluna-detector, podem causar
alargamento de picos e devem ser evitados para obter uma separação mais eficiente. O
conhecimento desses fatores pode ser aplicado para melhorar a eficiência na separação de
substâncias em cromatografia gasosa.

1.3 Cromatografia Gasosa Sólida

A técnica de cromatografia gasosa sólida emprega uma fase estacionária sólida
composta por um sólido finamente dividido para realizar a separação com base em
processos de adsorção física e química. A eficácia das colunas é influenciada pela
uniformidade das partículas, geralmente variando em malhas de 40-140. Entretanto, essa
abordagem apresenta desafios, como a não linearidade da adsorção, tempos de retenção
variáveis e adsorção irreversível, especialmente em temperaturas elevadas, o que pode
induzir alterações catalíticas na amostra.
Apesar das limitações mencionadas, a cromatografia gasosa sólida possui vantagens,
como a estabilidade dos adsorventes em altas temperaturas e resistência ao oxigênio. Os
principais adsorventes, como os polímeros porosos da série Parapak e Chromosorb
Century, são comuns e podem ser ajustados para diferentes polaridades. No entanto, a
ampla área superficial desses adsorventes pode resultar em tempos de retenção
excessivamente longos, especialmente para moléculas grandes e polares.
Comparada à cromatografia gasosa líquida, a cromatografia gasosa sólida destaca-se
pela estabilidade em temperaturas elevadas e pela ausência do problema de sangria da
coluna. Apesar dos desafios, como picos com caudas devido à não linearidade da adsorção,
essa técnica continua a ser aplicada na separação de compostos apolares e polares de baixa
massa molecular, bem como gases permanentes. Os polímeros porosos, amplamente
utilizados, proporcionam flexibilidade ao serem modificados para atender a diversas
necessidades de polaridade na separação de amostras.
 O carvão grafitizado é produzido aquecendo carvão a 3000°C em atmosfera inerte,
resultando em uma superfície praticamente livre de ligações insaturadas, radicais livres e
íons. A retenção de amostras nesse material ocorre em sítios apolares, com pouca afinidade
por moléculas com grupos funcionais, e em sítios polares, presentes em pequenas
quantidades, mas capazes de estabelecer interações fortes e específicas com solutos polares.
Os adsorventes à base de sílica abrangem uma ampla faixa de área superficial e
diâmetro de poros. Recomendados junto com a alumina, são ideais para separar
hidrocarbonetos insaturados e saturados de baixa massa molecular, hidrocarbonetos
halogenados e derivados do benzeno. A inclusão de solutos polares é lenta, resultando em
picos geralmente assimétricos devido à interação forte com grupos polares na superfície do
adsorvente. A retenção em sílica e alumina depende da área superficial, presença de
contaminantes polares e capacidade da substância em interagir especificamente, como na
formação de pontes de hidrogênio.

1.4 Cromatografia Líquida

Na cromatografia líquida, um líquido pouco volátil reveste um suporte sólido, atuando
como fase estacionária. Essa fase líquida deve solubilizar seletivamente as substâncias na
amostra para evitar a co-eluição sem a devida separação. A fase estacionária deve ser
termicamente estável e quimicamente inerte às substâncias na temperatura de uso. A
separação baseia-se nas diferentes solubilidades e volatilidades das substâncias na fase
estacionária, envolvendo forças de interação molecular como forças de orientação, dipolo
induzido, dispersão e interações específicas, como ligações químicas e pontes de
hidrogênio.
Um suporte ideal deve ter uma área superficial específica suficientemente grande para
permitir um revestimento uniforme da fase estacionária, com partículas de diâmetros
regulares e poros uniformes, além de rigidez mecânica para evitar quebras durante o uso.
O suporte não deve interagir com as moléculas da amostra e passa por tratamentos, como
seleção de diâmetros de partículas adequados, remoção de centros ativos e revestimento
com materiais não polares, como filmes metálicos.
A eficiência da coluna aumenta com o uso de partículas de menor diâmetro, embora
isso resulte em maior resistência ao fluxo da fase móvel. Tratamentos químicos extensivos,
como a silanização, nem sempre removem completamente os sítios ativos, levando a picos
assimétricos em substâncias fortemente ácidas ou básicas. Agentes redutores de caudas,
como hidróxido de sódio, são adicionados para superar isso. Suportes baseados em terras
diatomáceas, especialmente os rosa, como Chromosorb Pe A, oferecem maior rigidez
mecânica e densidade para usos analíticos ou preparativos, enquanto os brancos, como
Chromosorb We G, são mais frágeis e adequados para colunas analíticas.
O teflon, embora inerte, resulta em colunas menos eficientes devido à dificuldade de
adesão da fase líquida. Vários líquidos podem servir como fases estacionárias em
cromatografia gasosa, sendo essenciais a termoestabilidade e a seletividade para as
substâncias da amostra. A volatilidade da fase estacionária define sua temperatura máxima
de uso, evitando a sangria e prolongando a vida útil da coluna. A classificação das fases
líquidas muitas vezes utiliza os números de ROHRSNEIDER ou McREYNOLDS,
derivados do índice de retenção de KOVATS, determinado pelo número de átomos de
carbono de alcanos saturados normais com tempos de retenção ajustados.
A comparação do índice de retenção de um composto em uma coluna com fase
estacionária apolar e outra com fase estacionária polar está diretamente ligada à polaridade
da fase estacionária. Normalmente, o esqualano é adotado como padrão para a fase
estacionária apolar, representado como: △I=I (polar)-I (apolar). Quanto maior o valor de
△I, maior é a polaridade da fase estacionária analisada. ROHRSNE
IDER determinou os valores de △I para substâncias como benzeno, etanol, 2-butanona,
nitrometano e piridina em diversas fases estacionárias, utilizando esqualano como fase
apolar. Os números de McREYNOLDS foram determinados utilizando outros compostos
para calcular os índices de retenção, realizando essas determinações em condições
experimentais idênticas (20% de fase em Chromosorb W-AW, malha 80-120, a 120°C). A
Tabela VIII-2 exemplifica algumas fases estacionárias líquidas.

1.5 Gás de Arraste na Cromatografia Gasosa

A cromatografia gasosa é conhecida por sua eficiência resultante da rápida interação
entre a fase móvel gasosa e a fase estacionária. Um cilindro pressurizado contendo gases
como nitrogênio, hélio, hidrogênio ou argônio atua como fonte de gás de arraste,
transportando as substâncias da amostra para fora da coluna quando não estão interagindo
com a fase estacionária. A escolha do gás deve ser compatível com o detector utilizado,
considerando, por exemplo, hélio e hidrogênio para condutividade térmica e nitrogênio
puro ou argônio com 5% de metano para captura de elétrons.
 A pureza do gás é crucial, sendo recomendado um nível superior a 99,999%, e filtros
com sílica gel são aconselhados para eliminar impurezas como água e hidrocarbonetos. A
presença de impurezas, embora não afete significativamente a separação cromatográfica,
influencia a estabilidade e a resposta dos detectores, sendo mais crítica em limites de
detecção mais baixos. Na programação de temperatura, a pureza é vital para evitar a
retenção de impurezas no topo da coluna, que seriam eluídas com as substâncias da amostra
ao aumentar a temperatura.

1.6 Controle de Fluxo e Pressão na Cromatografia Gasosa

O controle da vazão do gás de arraste na cromatografia gasosa é alcançado por meio de
reguladores de pressão e/ou controladores de fluxo. Reguladores de pressão ajustam
manualmente o fluxo para manter constante a pressão na entrada do sistema, sendo
eficientes quando a temperatura da coluna e a pressão na saída são mantidas constantes.
Em situações de variação de temperatura durante a análise ou quando se deseja adaptar o
sistema para a coleta de efluente, a pressão de entrada é mantida constante, e a vazão é
ajustada. Isso demanda controladores de fluxo para garantir a repetibilidade nos tempos de
retenção.

1.7 Injeção de Amostra na Cromatografia Gasosa

A injeção de amostra na cromatografia gasosa requer cuidados para garantir a obtenção
de uma banda única e estreita, evitando assimetrias nos picos cromatográficos. A
quantidade de amostra deve respeitar a capacidade da coluna determinada pela fase
estacionária, pois o volume injetado influencia a eficiência da coluna. Assegurar a
repetibilidade é essencial.
A injeção pode ser realizada por seringas ou válvulas, sendo o sistema aquecido para
vaporizar totalmente a amostra. Para amostras líquidas, microsseringas ou válvulas são
comumente empregadas, utilizando um septo. Isso garante repetibilidade, embora possa
apresentar desafios como vazamentos e sangrias, exigindo trocas periódicas do septo e
podendo causar instabilidades na linha de base e picos fantasmas com a programação de
temperatura.

1.8 Injeção em Colunas Capilares

Em colunas capilares, a quantidade reduzida de fase estacionária demanda cuidados na
injeção para evitar ultrapassar a capacidade da coluna. Métodos como injetor com
divisor/sem divisor, vaporizador com programação de temperatura ou injeção em coluna
fria são empregados. Cada método possui características específicas, como discriminação
de compostos ou maior repetibilidade. O uso de uma lacuna de retenção entre o injetor e a
coluna é recomendado para preservar a integridade da fase estacionária.
Colunas recheadas para cromatografia são geralmente construídas com aço inoxidável
ou vidro, sendo que este último pode apresentar interações indesejadas com a amostra
devido a grupos silanóis remanescentes. A silanização prévia da coluna de vidro evita o
alargamento dos picos cromatográficos. Colunas de PTFE ou revestidas com este material
são empregadas na análise de compostos corrosivos.
As colunas capilares oferecem vantagens como um aumento significativo no número
de pratos por coluna devido à baixa pressão, permitindo análises mais rápidas mesmo em
baixas temperaturas. A estabilidade física e química das colunas capilares é crucial, sendo
afetada pela pressão do gás de arraste, impurezas e instabilidades químicas. Impurezas no
gás de arraste, como oxigênio e água, podem causar instabilidade na linha de base e
mudanças nas características de retenção. O volume de amostra injetado depende do tipo
de amostra e das dimensões da coluna, sendo maior em colunas preparativas. Sistemas
especiais para injeção de pequenos volumes em colunas capilares são discutidos em seções
específicas.
Atualmente, a maioria das colunas cromatográficas é fabricada utilizando aço
inoxidável ou vidro. As colunas de vidro, embora possam interagir com os compostos,
resultando no alargamento dos picos, podem ser aprimoradas através do polimento da
camada de enchimento. As colunas analíticas cromatográficas costumam ter um diâmetro
interno de aproximadamente 4 mm, com comprimento variando entre 1 e 3 metros. Por
outro lado, as colunas preparativas possuem um diâmetro interno maior, variando de 5 a
100 mm, permitindo a injeção de volumes mais significativos de amostra.
As colunas capilares, introduzidas por Golay em 1958, são extremamente finas,
apresentando diâmetros internos que variam entre 0,15 a 0,75 mm e comprimentos de 10 a
100 metros. Essas colunas podem ser construídas com materiais como níquel, aço
inoxidável, vidro ou, de maneira preferencial, sílica fundida. Existem diversos tipos de
colunas capilares, incluindo aquelas com parede reforçada, parede revestida com
adsorvente (SCOT) e colunas capilares com camada porosa (PLOT). Atualmente, fases
estacionárias imobilizadas ou quimicamente ligadas às paredes dos tubos (WBUT) são
empregadas para minimizar problemas como volatilização e instabilidade do filme.
 As colunas capilares oferecem diversas vantagens, tais como menor pressão,
possibilitando o uso de colunas mais longas e evitando o alargamento dos picos, resultando
em análises mais rápidas. No entanto, é essencial garantir estabilidade física e química. A
estabilidade física refere-se à manutenção do filme depositado nas paredes do capilar,
evitando deslocamentos e perdas por volatilização. A instabilidade química ocorre quando
as fases entram em contato com a superfície ativa dos capilares, levando à decomposição e
instabilidade na linha de base. O volume de amostra injetado depende do tipo de amostra e
das dimensões da coluna. A atual tendência de miniaturização das colunas capilares destaca
a necessidade de sistemas especiais para a injeção de pequenas quantidades de amostra.

1.9 Elaboração de Colunas Recheadas

No processo de preparação de recheios para colunas cromatográficas, a fase líquida é
primeiramente dissolvida em um solvente apropriado e misturada ao suporte. A remoção
do solvente ocorre por evaporação sob agitação lenta, visando evitar a quebra das partículas
e assegurar um revestimento homogêneo do suporte. Essa abordagem demonstra eficácia
para porcentagens de fase líquida entre 10% e 30%. Para porcentagens menores, a técnica
de fibração, que envolve a filtração da suspensão e evaporação do solvente remanescente,
é mais apropriada, mantendo os mesmos cuidados.
Uma vez que o recheio está pronto, pode ser introduzido em tubos de vidro ou aço
inoxidável de dimensões predefinidas. Tubos metálicos, em particular, exigem um processo
prolongado de limpeza utilizando diversos solventes e soluções. Após a limpeza, os tubos
de vidro são sinalizados para recobrir possíveis sítios ativos remanescentes.
O enchimento da coluna é realizado por meio de uma bomba de vácuo conectada a uma
extremidade do tubo. Durante esse processo, pode-se empregar um vibrador para garantir
uma distribuição homogênea. Após o enchimento completo, um tampão de lã de vidro é
posicionado na outra extremidade. Antes de utilizar a coluna, é necessário um estágio de
condicionamento para eliminar resíduos de solvente e impurezas voláteis. A coluna é então
instalada no cromatógrafo, com a saída para o detector desativada, enquanto o gás de arraste
flui pela coluna. A temperatura é gradualmente aumentada até 27°C acima da temperatura
máxima de utilização da coluna, sem ultrapassar o limite da fase estacionária. O tempo de
condicionamento varia de horas a dias, dependendo da natureza da fase estacionária.

1.10 Sistema de Detecção

 O processo de análise cromatográfica começa com a passagem das substâncias pela
coluna, onde são separadas, culminando na detecção. A escolha do detector é crucial,
levando em consideração características como a seletividade, que varia de universal a
específica.
A seletividade dos detectores pode ser universal, respondendo a todas as substâncias,
ou seletiva, reagindo apenas a uma classe específica. A sensibilidade, relacionada à
quantidade detectada, classifica os detectores como sensíveis à velocidade ou concentração
da fase móvel. O ruído, manifestado como flutuações na linha de base, pode ser estático ou
dinâmico, sendo desejável que ambos sejam próximos. A quantidade mínima detectável
depende da sensibilidade e é determinada como a amostra que gera resposta duas vezes
maior que o nível de ruído.
A faixa linear é crucial para a análise quantitativa, definida como a relação entre
concentração e resposta do detector. Outras características desejáveis incluem
insensibilidade a variações de temperatura e resistência a condições adversas de trabalho.
Os detectores, categorizados como integrais ou diferenciais, respondem de maneira
acumulativa ou instantânea à substância eluída, respectivamente, sendo a última mais
comum na cromatografia gasosa.

1.11 Detector de Condutividade Térmica

Os detectores de condutividade térmica são dispositivos de resposta universal, sensíveis
à concentração. Sua operação fundamenta-se no princípio de que um corpo aquecido perde
calor a uma taxa que depende da composição dos gases ao seu redor. Portanto, a taxa de
perda de calor pode ser utilizada como uma medida da composição do gás. A Figura VIII-
7 apresenta um esquema do detector por condutividade térmica.
Neste tipo de detector, o corpo aquecido consiste em filamentos de metal (platina,
tungstênio, níquel) dentro de um bloco metálico. A linha de gases é configurada de modo
que apenas o gás de arraste flua por uma das células contendo os filamentos, enquanto o
efluente da coluna passa pela outra. Os filamentos aquecidos, interligados para formar uma
ponte de Wheatstone, perdem calor de maneira constante quando apenas o gás de arraste
percorre as duas células. Essa perda constante de calor resulta em um sinal registrado na
forma de uma linha de base. Quando moléculas da amostra são liberadas da coluna junto
com o gás de arraste, ocorre uma diminuição na perda de calor pelo filamento na célula,
gerando um sinal.
 O gás de arraste utilizado com esse detector deve ter alta condutividade térmica, o que
significa uma massa molecular pequena. Conforme a Tabela VIII-5, hidrogênio e hélio são
os gases mais adequados para este tipo de detector. A amostra, composta geralmente por
moléculas de massa molecular elevada, resulta em uma redução na condutividade térmica
do gás circundante ao filamento aquecido. A medida da perda de calor pelo filamento a
uma taxa menor é utilizada para gerar um sinal.
Este detector preserva a integridade da amostra que elui da coluna, possibilitando a sua
recuperação na mesma forma química em que foi injetada, o que o torna útil para fins
preparativos.
As condições ideais de operação deste detector podem ser alcançadas utilizando um gás
com alta condutividade térmica, aumentando a temperatura do filamento, diminuindo a
temperatura do bloco e reduzindo a vazão do gás de arraste.

1.12 Detector por Ionização em Chama

Este tipo de detector é amplamente utilizado devido à sua alta sensibilidade e resposta
quase universal, embora seja sensível às propriedades do soluto. Ele reage ao fluxo de
massa que passa por ele em um determinado tempo. O gás de arraste chega ao detector, e
uma chama resultante da combustão de ar e hidrogênio queima e ioniza algumas das
moléculas presentes na corrente gasosa (impurezas no gás de arraste, produtos provenientes
das sangrias da coluna e septo). Quando as moléculas da amostra presentes no gás de arraste
alcançam o detector, elas são queimadas na chama, resultando na formação de íons, que
são coletados por um eletrodo. A quantidade de íons formados quando a amostra está
presente no gás eluente é significativamente maior do que quando apenas o gás de arraste
está sendo queimado. A corrente gerada é convertida em voltagem, amplificada e registrada
pelo dispositivo de registro.
Este detector demonstra uma resposta satisfatória para quase todos os compostos,
excluindo He, Ar, Kr, Xe, O2, N2, H2S, NO, SO2, N₂O, NO2, CO, CO2, COS, SiCl4,
SiHCl3 e SiF4. É pouco sensível a CS2 e água, tornando-os solventes adequados para as
amostras injetadas. A magnitude do sinal está diretamente relacionada ao número de
átomos de carbono (e hidrogênio) na molécula, sendo reduzida pelo processo de captura de
elétrons, que envolve grupos eletronegativos formados durante a combustão.

A eficiência deste detector também depende da proporção das vazões dos gases que
alimentam a chama. Em geral, uma boa sensibilidade e estabilidade são alcançadas quando
se utiliza a proporção de 1:1:10 para o gás de arraste, hidrogênio e ar comprimido,
respectivamente. Este detector é amplamente empregado em bioquímica, como na análise
de esteroides. A presença de oxigênio ou enxofre nas moléculas pode reduzir a resposta,
mas ainda assim, é útil na análise de compostos como ácidos orgânicos e ésteres de ácidos
graxos e dicarboxílicos.

1.13 Detector por Captura de Elétrons

Este detector é altamente seletivo, respondendo eficientemente a halogênios orgânicos,
aldeídos conjugados, nitrilas, nitratos e organometálicos. Ele é praticamente insensível a
hidrocarbonetos, álcoois e cetonas. Sua sensibilidade seletiva a haletos torna este detector
particularmente útil na análise de pesticidas clorados.
No processo, quando o gás de arraste (N₂) passa pelo detector, ele é ionizado por
partículas beta emitidas por fontes de H ou Ni. Os elétrons gerados nesse processo são
coletados em um anodo, resultando em uma corrente que é amplificada por um eletrômetro,
gerando a linha de base. Moléculas que eluem da coluna e são capazes de capturar elétrons
diminuem essa corrente, resultando em um sinal proporcional à sua concentração (Figura
VIII-9).

1.14 Detector termiônico

Os detectores termiônicos pertencem à categoria de detectores por ionização, nos quais
sais de metais alcalinos são empregados em um plasma gerado pela aplicação de um
potencial elétrico adequado em um fluxo de ar e hidrogênio.
Nesse tipo de detector, uma pérola contendo um sal de metal alcalino, como brometo
de césio ou sulfato de rubídio, é eletricamente aquecida e posicionada entre o queimador e
o eletrodo coletor. A fonte é mantida com um potencial negativo para evitar a perda dos
íons do metal alcalino e neutralizar a resposta do detector no modo de ionização de chama.
Na região da pérola, ocorre a formação de chama ou plasma, suportados pelo fluxo de ar e
hidrogênio.
A ação catalítica do metal alcalino em compostos contendo nitrogênio ou fósforo
resulta na formação de íons com carga negativa, que são coletados no ânodo (eletrodo
coletor), gerando uma corrente. A Figura VIII-10 apresenta um esquema ilustrativo do
detector termiônico.
A capacidade seletiva e sensibilidade do detector termiônico são influenciadas por
diversas variáveis experimentais, destacando-se a corrente de aquecimento da pérola, o
potencial do queimador, a escolha do gás de arraste, as taxas de fluxo de ar e hidrogênio,
além da posição específica da pérola.
Amplamente empregado em análises ambientais e biomédicas, esse detector
desempenha um papel crucial na identificação e quantificação de pesticidas e
medicamentos.

1.15. Registrador
O sinal gerado pelo detector, quando a amostra é detectada após passar pela coluna, é
registrado de maneira gráfica. Os registradores utilizados em cromatografia gasosa são
predominantemente do tipo potenciométrico, operando na escala de 1 mV, com um tempo
de resposta geralmente inferior a um segundo.
Outra abordagem para o registro dos sinais envolve o processamento em integradores
ou microcomputadores que estão conectados ao detector. Além de apresentarem os
cromatogramas de forma visual, esses sistemas registram informações cruciais, como os
tempos de retenção e as áreas de cada pico cromatográfico. Os microcomputadores, quando
devidamente programados, podem fornecer uma gama mais ampla de dados calculados a
partir do cromatograma.

1.16 Análise Qualitativa

A análise qualitativa utilizando cromatografia é uma técnica que possibilita a separação
de compostos em uma amostra, simplificando sua identificação. Esse processo envolve a
comparação do tempo de retenção dos compostos na amostra com os de padrões
conhecidos. Ajustes no tempo de retenção são aplicados para eliminar variações,
considerando fatores como a fase móvel. A técnica de comparação inclui o tempo de
retenção ajustado da amostra em relação a um padrão, usando o índice de retenção de
Kovats. A identificação também pode incorporar propriedades da amostra, como
temperatura de fusão ou número de átomos de carbono. Em casos de grandes volumes de
amostra, a saída do detector e a coleta de compostos são realizadas de forma sistemática. O
acoplamento de técnicas, como a cromatografia gasosa (CG) e a espectrometria de massa
(EM), é comum nesse contexto, proporcionando uma abordagem completa para a análise
qualitativa.
A principal complexidade ao acoplar um cromatógrafo a gás com um espectrômetro de
massas está na redução da pressão na saída da coluna, especialmente para valores inferiores
a 10 Pa (10 Bar) na câmara de ionização. Esse desafio é mais notável em colunas recheadas,
onde a vazão da fase móvel geralmente varia de 20-50 mL/min. No entanto, ao utilizar
colunas capilares, com vazões mais baixas (1 a 5 mL/min), essa conexão torna-se mais
facilitada. Uma junção eficaz deve preservar a resolução obtida com detectores
convencionais, sem alterar a natureza química dos compostos antes de entrarem na câmara
de ionização. Isso pode ser alcançado através de separadores moleculares, conexão direta
e divisores abertos.
Os separadores moleculares são amplamente empregados, especialmente em colunas
recheadas com vazões de fase móvel excessivamente elevadas. Esses sistemas buscam
separar as moléculas do gás de arraste das moléculas da amostra. Exemplos incluem
dispositivos nos quais o efluente da coluna passa por um orifício alinhado com outro. Nesse
processo, as moléculas do gás de arraste, devido à sua menor massa molecular, difundem-
se mais rapidamente para fora do feixe, permitindo que as moléculas da amostra, mais
concentradas, ingressem na câmara de ionização através de um segundo orifício.
Quando a vazão da fase móvel é reduzida (1-5 mL/min), como em colunas capilares,
torna-se viável o acoplamento direto de colunas ao espectrômetro de massas. Atualmente,
a presença de bombas de alto vácuo na câmara de ionização reduz a limitação da vazão de
fase móvel para esse acoplamento direto. No entanto, é crucial destacar que ocorrem
mudanças na retenção da amostra devido à diferença de pressão na saída da coluna, em
comparação com outros tipos de detectores.
No acoplamento através de divisor aberto, há uma separação entre o final da coluna e a
entrada do espectrômetro de massas. Essa região é purgada com hélio, que arrasta parte da
fase móvel, concentrando a amostra. Esse sistema apresenta vantagens, como a ausência de
alargamento dos picos no final da coluna sob pressão atmosférica, resultando em poucas
alterações na retenção das substâncias presentes na amostra.
A ionização das moléculas da amostra ocorre na câmara de ionização, principalmente
por impacto eletrônico ou ionização química. A câmara de ionização é aquecida para evitar
a condensação da amostra e mantida sob vácuo para evitar colisões entre íons formados e
outras moléculas neutras não ionizadas.
No método de impacto eletrônico, um fluxo de elétrons com energia específica é gerado
por um filamento aquecido. Esses elétrons colidem com as moléculas da amostra,
provocando ionização e fragmentação. Em casos em que o íon molecular formado é
instável, recorre-se à ionização química.
A ionização química ocorre por reações íon-molécula entre a molécula neutra da
amostra e íons provenientes de reagentes presentes na câmara de ionização, como metano.
Para favorecer esse mecanismo, a concentração do reagente é mantida maior que a da
amostra, garantindo que a maioria das moléculas do reagente seja ionizada por impacto
eletrônico. Após a separação, os dados obtidos são processados para fornecer informações
qualitativas e quantitativas.

1.17 Análise Quantitativa

Na análise quantitativa, é de suma importância evitar erros em todas as etapas, desde
garantir que a amostra seja representativa até cuidar da separação no cromatógrafo para
evitar problemas como adsorção irreversível e alterações no detector. Após obter o
cromatograma, a integração dos sinais é essencial, podendo ser realizada por métodos como
a altura do pico (influenciada por variações instrumentais) ou a área do pico, calculada
através de tangentes nos lados do pico.
A área do pico pode ser calculada utilizando a largura na meia altura, formando um
triângulo na metade superior do pico (Figura VIII-12c), com a fórmula A = ax Wh, onde
Wh é a largura do pico na meia altura. Além disso, a integração pode envolver pesar o
pedaço de papel delimitado pelo pico, sendo a preferência manual para picos altamente
assimétricos. Atualmente, integradores eletromecânicos ou eletrônicos também são
utilizados.
As medidas obtidas na integração podem ser relacionadas à concentração da substância
na amostra por meio de métodos como a normalização, que compara a área do
cromatograma com a porcentagem de composição da mistura: %A = (área A) / (área total)
x 100. Outro método é o fator de resposta, utilizado quando o detector não responde de
maneira similar para todas as substâncias. Este fator é determinado injetando-se uma
mistura de concentração conhecida, relacionando a porcentagem conhecida e observada
para cada composto (fa = % A conhecida / % A observada).
A calibração externa compara a área da substância a ser quantificada na amostra com
as áreas obtidas desta mesma substância em soluções padrão de concentrações conhecidas.
Preparam-se várias soluções da substância a ser quantificada em diversas concentrações,
obtém-se o cromatograma correspondente a cada uma delas, e em um gráfico, relacionam-
se as áreas obtidas com as concentrações.
A padronização interna consiste em adicionar uma quantidade conhecida de uma
substância padrão na amostra a ser analisada e relacionar as duas áreas obtidas. Idealmente,
a substância usada como padrão interno deve ser similar à substância a ser quantificada, ter
concentração e tempo de retenção próximos a esta substância, ser inerte, não fazer parte da
amostra e, quando cromatografada, ficar separada das demais substâncias presentes na
amostra.
O método envolve a preparação de soluções padrão de concentrações conhecidas, às
quais se adiciona uma quantidade conhecida de um padrão interno. Após a análise dessas
soluções, constrói-se um gráfico relacionando a razão de áreas (área da substância a ser
quantificada / área do padrão interno) com a concentração desta substância (Figura VIII-
14). A amostra também é analisada após adição da mesma quantidade conhecida do padrão
interno. Através da razão de áreas obtidas no cromatograma, tem-se a concentração da
substância na amostra, utilizando-se o gráfico construído anteriormente.
A extrapolação linear por adição padrão envolve a adição de quantidades conhecidas
da substância que está sendo analisada a quantidades conhecidas da amostra. Após a
obtenção dos cromatogramas, constrói-se uma curva de calibração relacionando as
quantidades da substância adicionada à amostra com as respectivas áreas obtidas. O ponto
onde a reta corta o eixo das ordenadas corresponde à área do pico da substância a ser
determinada, sem qualquer adição do padrão. A extrapolação da reta define, no eixo das
abcissas, a concentração da substância na amostra analisada (Figura VIII-15). O método da
adição padrão é especialmente importante quando a amostra é muito complexa, as
interações com a matriz são significativas e há dificuldade em encontrar um padrão interno
adequado.

1.18. Derivação na Cromatografia Gasosa

A cromatografia gasosa destaca-se na análise de gases e substâncias voláteis
termicamente estáveis. Contudo, para substâncias de alta massa molecular ou com grupos
funcionais fortemente polares, é necessário recorrer à derivação. Este processo transforma
a substância de interesse em um derivado com características adequadas para análise por
cromatografia gasosa, podendo também introduzir grupos específicos para melhorar a
detectabilidade.
Os equipamentos para derivação geralmente são simples, envolvendo a mistura da
substância com o reagente, podendo ser acelerado por aquecimento. Sistemas
miniaturizados, tubos de hidrôneo e outros dispositivos estão comercialmente disponíveis
para reações de derivação mais complexas. Os derivatizantes mais versáteis para moléculas
polares com grupos funcionais incluem alquilisilanos, sendo o trimetilsilil o mais comum.
Homólogos de cadeia maior, grupos alquila contendo halogênios ou grupos amino são
utilizados para melhorar a estabilidade, características de separação e solubilidade.
Exemplos de compostos derivados incluem açúcares, álcoois, aminas, ésteres, aminoácidos
e ácidos carboxílicos.
As reações de derivatização geralmente ocorrem à temperatura ambiente, mas reações
específicas podem ser aceleradas pelo aquecimento ou catalisadores. Essas reações devem
ser realizadas em condições controladas. Além disso, métodos de derivatização envolvendo
grupos alquila provenientes de compostos imáticos ou grupos cianetos são utilizados.
Reagentes de clorificação também são empregados, proporcionando uma ampla gama de
opções para a derivação em cromatografia gasosa. Uma variedade de métodos e reagentes
são utilizados na alquilação. Haletos de alquila, na presença de óxido de prata, óxido de
bário ou hidreto de sódio, convertem ácidos carboxílicos no correspondente alquil éster.
Esse tipo de reagente também tem sido empregado na alquilação de açúcares.
A alquilação extrativa é empregada para derivar ácidos, fenóis, álcoois ou amidas em
solução aquosa. Por exemplo, para derivar uma substância de caráter ácido, o pH da solução
aquosa é ajustado para garantir a completa ionização da mesma, que então é extraída por
um solvente orgânico imiscível, formando um par iônico pela adição de hidróxido de
tetralaquilamônio. Certos tipos de alquilação podem ocorrer na própria coluna
cromatográfica, onde um agente alquilante é injetado simultaneamente com a amostra. A
temperatura do injetor e da coluna inicia e completa a derivação. Hidróxido de
trimetilanilina é comumente usado para a formação de 1,3-dimetil derivados de
barbitúricos.
Reações simples de esterificação são empregadas para a formação de derivados com
ácidos carboxílicos e outros grupos funcionais ácidos. Em uma reação típica, o ácido
carboxílico é dissolvido em um excesso de álcool contendo um catalisador, como ácido
clorídrico, ácido sulfúrico, trifluoreto de boro, etc. Álcoois, fenóis, aminoácidos e aminas
primárias e secundárias podem ser derivados por reações de acetilação, utilizando anidridos
ácidos, como o anidrido acético ou anidrido heptafluorobutírico, este último para aumentar
a sensibilidade em detectores por captura de elétrons.
Alguns íons metálicos, como crômio, berílio, cobre, níquel, paládio, etc., podem ser
derivados através da formação de complexos voláteis com ligantes quelantes como
betadicetonas, betacetoaminas, betatiocetonas, etc.
 1.19. Aplicações da Cromatografia Gasosa
A cromatografia gasosa é, atualmente, uma das técnicas analíticas mais amplamente
utilizadas. Ela desempenha um papel essencial na separação e quantificação de uma ampla
gama de produtos, além de servir como uma técnica de identificação em situações especiais,
principalmente quando acoplada a detectores qualitativos, como espectrômetro de massas.
Os avanços recentes, especialmente com o uso de colunas capilares, tornam a cromatografia
gasosa altamente atrativa.
Assim, a aplicação da cromatografia gasosa é diversificada e abrange áreas como
análise ambiental, indústrias químicas e farmacêuticas, análise de alimentos, produtos
petroquímicos, medicina, pesquisa e muito mais. Na área médica, em particular, a
cromatografia gasosa desempenha um papel significativo como uma ferramenta poderosa
para estudar substâncias endógenas, monitorar terapeuticamente certos medicamentos e
tratar casos de intoxicação. Por exemplo, destaca-se a separação de 14 antiepilépticos ou
seus produtos de biotransformação.
A introdução de colunas capilares ampliou significativamente a aplicabilidade da
cromatografia gasosa, permitindo a separação eficiente de diversos constituintes em
amostras complexas. Dessa forma, a cromatografia gasosa tornou-se uma ferramenta
amplamente útil em vários laboratórios de pesquisa e análise.

2. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

2.1. Princípios de cromatografia líquida de alta eficiência
Conhecida também como CLAE, trata-se da mais importante técnica de separação,
indispensável no uso em laboratórios. A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
representa uma tecnologia essencial nos laboratórios químicos, farmacêuticos, bioquímicos,
entre outros. Este método, também conhecido como cromatografia líquida de alta performance,
emprega colunas pequenas e uma fase móvel eluída sob altas pressões, possibilitando a
separação e análise quantitativa de uma ampla gama de compostos em poucos minutos, com
alta resolução e sensibilidade. O termo "alta eficiência" é frequentemente associado a essa
técnica, que utiliza instrumentos sofisticados, muitos dos quais podem ser totalmente
automatizados.
A CLAE é reconhecida por suas vantagens, como a capacidade de análise rápida e eficiente
de diversas amostras. O desenvolvimento significativo dessa técnica ocorreu a partir dos anos
70, transformando a cromatografia líquida de um estado subdesenvolvido para um nível de
sofisticação atual. Inicialmente, experimentos no início do século já exploravam princípios da
cromatografia líquida, mas foi o progresso tecnológico revolucionário que impulsionou a
CLAE, permitindo sua evolução gradual e alcance do alto desempenho e eficiência observados
hoje. Consequentemente, compreender as vantagens, limitações, componentes e critérios de
escolha de equipamentos associados à CLAE tornou-se imperativo para os profissionais de
laboratório que buscam análises precisas e eficientes.
Desde 1968, tornou-se possível o preenchimento de colunas com partículas de pequeno
tamanho, essenciais para alta resolução, juntamente com o desenvolvimento de equipamentos
capazes de operar em altas pressões, garantindo uma eluição eficiente. Nos últimos 12 anos,
houve avanços significativos em detectores espectrofotométricos, abrangendo comprimentos
de onda até 190 nm, e um aumento na utilização de detectores de fluorescência, eletroquímicos
e por fluorescência induzida por laser. A análise de traços em amostras complexas, como
sangue, urina, solo, alimentos e petróleo, também foi aprimorada.
O uso de instrumentação controlada por microprocessadores contribuiu para melhorias
significativas na eficiência dos equipamentos. Atualmente, é comum realizar estudos com
partículas pequenas, utilizar a CLAE com fase reversa, empregar equipamentos para eluição
com gradiente e aplicar métodos especiais, como a formação de pares iônicos. Esses avanços
permitiram superar dificuldades anteriores, tornando rotineiras as separações de compostos
como corantes polares, isômeros, drogas básicas e seus metabolitos.
A CLAE continua a ser alvo de inovações, indicando um futuro com um uso ainda mais
amplo, seja na análise com colunas de microdiâmetro ou na utilização de colunas enormes
(30x500 cm) capazes de separar grandes quantidades de amostra, até mesmo na escala de
quilogramas.

2.2 Cromatografia líquida de alta eficiência e cromatografia líquida clássica

Na cromatografia líquida de coluna (CLC), o recheio é geralmente utilizado apenas uma
vez, pois parte da amostra se adsorve de maneira irreversível, exigindo a repetição do
enchimento da coluna a cada separação. Isso resulta em um significativo desperdício de
material e mão de obra. A aplicação da amostra na CLC requer habilidade e tempo por parte
do operador. A eluição na CLC é impulsionada pela gravidade, e as frações individuais da
amostra são coletadas manualmente ou por meio de um coletor de frações.
Devido às separações típicas com CLC demandarem várias horas, o tempo dedicado a essa
operação é tedioso. A detecção e qualificação são realizadas por meio da análise manual das
frações, individualmente. O número geralmente grande de frações coletadas demanda
considerável tempo e esforço para processamento. Geralmente, técnicas auxiliares como
espectrofotometria, análise química ou um registro gravimétrico são empregadas para dosar
cada componente da amostra nas frações coletadas. Os resultados são finalmente registrados
em forma de cromatograma, um gráfico que representa a concentração da amostra em relação
ao número da fração.
Na cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), utiliza-se uma coluna fechada e
reutilizável, permitindo realizar centenas de separações individuais com a mesma coluna,
embora em alguns casos seja necessário regenerá-la após algumas separações. O custo de uma
coluna individual pode ser distribuído por várias amostras, possibilitando o uso de colunas de
alta resolução, mesmo que mais caras, exigindo um enchimento cuidadoso para resultados
aprimorados. Essas colunas são eficazes, porém apresentam resistência à vazão da fase móvel,
o que demanda o emprego de sistemas de bomba de alta pressão (até 400 bars) para garantir
uma migração eficiente da fase móvel pela coluna.
A CLAE oferece vantagens, como operações mais reproduzíveis devido ao controle fácil
da vazão da fase móvel. Injeções precisas de amostra são alcançadas rapidamente com
microsseringas ou válvulas de injeção. Diversos tipos de detectores, posicionados na saída da
coluna, permitem um registro contínuo da composição do efluente, gerando cromatogramas
semelhantes aos obtidos na cromatografia gasosa, facilitando a identificação e quantificação
dos componentes das amostras.
A CLAE reduz separações repetitivas a uma única injeção de amostra e anotações dos dados
finais, tornando-a mais conveniente e menos dependente do operador em comparação com a
cromatografia líquida de coluna (CLC). A análise quantitativa pela CLAE alcança níveis
elevados de exatidão e precisão, com uma precisão superior a 0,5%. Além disso, as separações
em escala preparativa de miligramas de amostras são relativamente simples. Essas diversas
vantagens tornaram a CLAE uma das técnicas analíticas mais procuradas atualmente.

2.3 Cromatografia gasosa e cromatografia líquida de alta eficiência

A cromatografia gasosa (CG) é atualmente uma técnica amplamente difundida e mais
utilizada do que a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A comparação entre ambas
as técnicas é conveniente, considerando o número significativo de pessoas familiarizadas com
a cromatografia gasosa.
Na CG, é essencial que a amostra seja suficientemente volátil para passar pela coluna
na forma de vapor e, ao mesmo tempo, seja termicamente estável para evitar decomposição nas
condições de separação. A volatilidade da amostra pode ser aumentada elevando a temperatura
do forno, mas esse aumento tem um limite prático de cerca de 400°C devido a considerações
como a fase estacionária, os detectores, entre outros. Portanto, apenas gases e
aproximadamente 20% dos compostos orgânicos conhecidos podem ser analisados por CG sem
a necessidade de modificações na estrutura dos compostos para aumentar sua volatilidade.
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) apresenta uma vantagem sobre a
cromatografia gasosa, pois, independentemente das limitações de volatilidade ou estabilidade
térmica, requer apenas que a amostra seja solúvel na fase móvel. Portanto, a CLAE é um
método ideal para a separação de espécies iônicas, macromoléculas de interesse biológico,
produtos naturais lábeis e uma vasta gama de outros compostos com alta massa molecular e/ou
baixa estabilidade térmica.
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) apresenta vantagens sobre a
cromatografia gasosa (CG) em termos de separações desafiadoras, uma vez que:
- Possui duas fases cromatográficas de interação seletiva com as moléculas da amostra,
em comparação com apenas uma na CG.
- Oferece uma maior variedade de possíveis mecanismos de separação.
- Permite a separação de compostos termicamente instáveis em temperaturas mais
baixas.
Apesar de os métodos de detecção na CG serem mais rápidos e sensíveis, com
equipamentos mais fáceis de manipular e geralmente mais acessíveis financeiramente, a CLAE
não é tão sensível nem rápida, porém, possui uma aplicação mais ampla, enquanto o
instrumento é consideravelmente mais caro. No entanto, à medida que o volume de vendas
aumenta, é possível prever uma redução nos custos. Conclui-se que não há uma competição
direta entre a CLAE e a CG, pois, essas técnicas se complementam e geralmente são aplicadas
a diferentes tipos de amostras.

2.4 As vantagens e as limitações da CLAE

A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), como toda técnica, possui algumas
limitações, vantagens e comentários, conforme apresentados na Tabela IX-3. No entanto,
observa-se, de maneira geral, que as limitações da CLAE não têm impedido a utilização eficaz
de suas vantagens. Como resultado, a técnica tem sido cada vez mais empregada, demonstrando
sua crescente aceitação e aplicação prática.

3. As técnicas da CLAE
Existem cinco tipos diferentes de fases estacionárias na cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE), cada uma correspondendo a um mecanismo distinto. A simples troca de
coluna e fase móvel permite a utilização de cada um desses mecanismos. Vários problemas em
separação cromatográfica podem ser abordados por mais de um método, enquanto outros
podem requerer um método específico. A seguir, serão apresentadas algumas noções gerais
sobre os mecanismos da CLAE e as classes de compostos em que são mais empregados; para
problemas mais específicos, é recomendada a consulta à literatura especializada.

3.1 Cromatografia líquido-sólido ou por adsorção

Para que a molécula do soluto seja adsorvida na fase estacionária, é necessário deslocar
uma molécula da fase móvel da superfície. Grupos apolares, como hidrocarbonetos, têm pouca
afinidade por uma superfície polar (por exemplo, sílica ou alumina) e não serão retidos. Grupos
funcionais polares capazes de formar pontes de hidrogênio terão forte afinidade pela superfície
e, portanto, serão fortemente retidos. Moléculas polarizáveis, como moléculas aromáticas,
apresentarão interação dipolo induzindo-dipolo com a superfície do adsorvente, sendo também
retidas, e o grau de retenção dependerá da polarização de cada molécula ou grupo funcional.
É crucial que as partículas da fase estacionária possuam uma grande área de superfície,
ou seja, um grande número de sítios ativos. A atividade da superfície de muitos sólidos,
incluindo sílica e alumina, pode ser afetada pela retenção de moléculas altamente polares, como
álcoois, fenóis e água. Em algumas situações, reproduzir os resultados das análises torna-se
difícil devido a mudanças nas propriedades da superfície. Portanto, a sílica utilizada na CLAE
é frequentemente submetida a processos de desativação para reduzir a retenção de moléculas
muito polares e manter a superfície em condições uniformes, contribuindo para aprimorar a
reprodutibilidade das análises.
Em situações em que há uma forte adsorção ou retenção de alguns componentes da
amostra no sólido ativo, é necessário aumentar a polaridade da fase móvel de maneira constante
e uniforme. Esse processo, conhecido como eluição por gradiente ou programação da fase
móvel, resulta em um aumento da solubilidade dos componentes da amostra na fase móvel. A
vasta literatura em cromatografia em camada delgada permite prever as retenções da amostra
nessas colunas, e devido à simplicidade e flexibilidade dessa técnica, é frequentemente mais
conveniente estabelecer a melhor combinação de fase estacionária e fase móvel usando
cromatografia em camada delgada e depois transferir as condições de separação para a
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), onde pode-se aproveitar sua maior eficiência.
 A CLAE permite a fácil separação de compostos diferenciados em termos lipofílicos
ou número de grupos funcionais. Exemplos incluem ácidos graxos, álcoois, alcaloides, aminas,
antioxidantes, barbitúricos, corantes, esteroides, fenóis, lipídios, vitaminas, entre outros.

3.2 Cromatografia líquido-líquido ou por partição

A cromatografia líquido-liquido (CLL), desenvolvida por Martin e Synge em 1941,
utiliza uma fase estacionária de água em sílica e clorofórmio como fase móvel para a separação
de aminoácidos. O mecanismo de distribuição, baseado nas diferentes solubilidades dos
componentes na fase móvel e estacionária, resulta na retenção seletiva dos componentes mais
solúveis na fase estacionária, enquanto os menos solúveis são transportados mais rapidamente
pela fase móvel. A CLL é adequada para compostos levemente polares com massas
moleculares inferiores a 200X. Um inconveniente é a solubilidade da fase estacionária na fase
móvel, levando à deterioração rápida da coluna e à falta de reprodutividade em separações
repetitivas. Duas abordagens para superar isso são saturar a fase móvel com a fase estacionária
por meio de uma pré-coluna ou utilizar materiais com a fase estacionária quimicamente ligada
a um suporte sólido, permitindo a execução de uma programação da fase móvel.

3.3 Cromatografia líquida com fase ligada

A cromatografia líquida com fase ligada (CLFL) surgiu como consequência de
problemas associados à CLL. Como a fase estacionária está quimicamente ligada à superfície
de um suporte, elimina-se o problema da solubilidade da fase estacionária na fase móvel. O
mecanismo principal desta técnica baseia-se na partição, levando alguns autores a considerá-la
uma técnica de líquido-líquido. Por outro lado, como esta fase estacionária também apresenta
influência de grupos ativos (polares) da superfície, isto é, também ocorre o mecanismo de
adsorção, a maioria dos pesquisadores considera esta técnica um método separado.
Variando a natureza dos grupos funcionais da fase estacionária, é possível obter
diferentes tipos de seletividade. Tais grupos podem ser de natureza polar, como o grupo amino
(-NH2) e o grupo nitrilo (-CN), que, funcionando similarmente às fases polares da CLS, são
chamados de fase normal, ou de natureza apolar, como os grupos octil (-C8H17), octadecil (-
C18H37), fenil (-C6H5), etc., que são de fase reversa. Infelizmente, a quantidade de fase
estacionária que é possível ligar em um suporte (geralmente partículas de sílica) é limitada e,
como consequência, as quantidades de amostras separadas nestas colunas são necessariamente
pequenas.
 Esta técnica, usando as fases apolares, tem inúmeras aplicações, resolvendo vários
problemas cujas soluções até então eram consideradas muito difíceis. Algumas classes de
compostos que são facilmente separadas pela técnica de fase reversa são alcaloides, álcoois,
antibióticos, aromáticos, barbitúricos, pesticidas clorados e vitaminas. Algumas classes que são
facilmente separadas usando as fases polares são alcaloides, álcoois, anilinas, aromáticos,
complexos metálicos, corantes, esteroides, fenóis e pesticidas. Compostos fracamente iônicos
(ácidos e bases) podem ser separados se a dissociação for suprimida por tamponação na escala
de pH 2-8, contanto que ocorra equilíbrio.
A cromatografia líquida com fase ligada (CLFL) é altamente útil para moléculas de
baixa ou média polaridade, não iônicas, com massa molecular inferior a 2000 e solúveis em
solvente orgânico. Quando não é fácil manter todas as moléculas na forma não ionizada, a
cromatografia líquida por pares de íons (CLPI), uma forma especial de CLFL, pode ser
utilizada. Nela, a molécula da amostra iônica ou ionizável forma um par de íons ao se associar
com um contra-íon orgânico adequado da fase móvel. O par de íons é então distribuído entre a
fase estacionária, normalmente uma de fase reversa, onde o par de íons é solúvel, e a fase
móvel, normalmente aquosa-orgânica, que solubiliza as espécies ionizadas. O equilíbrio
envolvido confere um alto grau de solubilidade. Um alto grau de seletividade pode ser
introduzido na separação ajustando os parâmetros de polaridade da fase móvel, o pH, a natureza
e concentração do contra-íon e, em menor extensão, a natureza da fase estacionária.
A CLPI é uma alternativa à cromatografia por troca iônica, com vantagens como o uso
de colunas de longa vida e maior reprodutibilidade. Além disso, a CLPI permite a determinação
simultânea de compostos ácidos, básicos e neutros. Os termos FASE NORMAL (FN) e FASE
REVERSA (FR) são artificiais, mas amplamente utilizados, baseados na ideia de que a CLS é
"normal" e usa fase móvel apolar, enquanto o inverso é a reversa.

3.4 Cromatografia por exclusão

A cromatografia por exclusão (CE) realiza a separação com base no tamanho efetivo
das moléculas. A coluna é preenchida com material inerte, cujos poros têm tamanhos
controlados. Moléculas pequenas penetram na maioria dos poros e têm maior tempo de
retenção, enquanto as maiores são excluídas de todos os poros. Dessa forma, moléculas grandes
movem-se rapidamente através da coluna, enquanto as pequenas são eluídas lentamente pela
fase móvel. A faixa de massas moleculares que pode ser abordada pela CE varia de cerca de
1000 até vários milhões. A CE clássica utiliza materiais frágeis, incapazes de suportar pressões
superiores a 4 bar, enquanto a CLAE exige materiais com estruturas mais rígidas, geralmente
de sílica, mas também de resina altamente cruzada. Embora existam exemplos de aplicações
de CE para a separação de moléculas orgânicas e inorgânicas em sistemas aquosos e não
aquosos, a técnica é predominantemente usada para análises de compostos de alta massa
molecular, incluindo polímeros orgânicos, silicones e biopolímeros. A aplicação da CE tem
crescido na caracterização de polímeros de alto peso molecular, permitindo a determinação da
distribuição de suas massas moleculares.

3.5 Cromatografia por troca iônica

Na cromatografia por troca iônica (CTI), a fase estacionária geralmente é uma resina
de poliestireno entrecruzada com divinilbenzeno, à qual estão ligados grupos iônicos, como,
por exemplo, o grupo -SO3 no trocador de cátions e o grupo -NR no trocador de ânions. Esses
grupos iônicos têm um contra-íon com carga oposta, deslocável pelos íons da fase móvel com
carga semelhante. As colunas para a CTI na CLAE são mais eficientes do que as usadas na
CLC. Exemplos típicos de compostos separados por CTI incluem ácidos carboxílicos,
açúcares, analgésicos, vitaminas, ânions inorgânicos e cátions metálicos ou complexos. Além
disso, essa técnica pode ser aplicada na separação de peptídeos, aminoácidos e ácidos
nucléicos, que podem ionizar em soluções tamponadas adequadamente.

3.6 Sumário das técnicas da CLAE

Ao escolher a melhor técnica cromatográfica para a separação dos componentes de
uma amostra específica, é crucial considerar propriedades como massa molecular, solubilidade
e estrutura. Um guia geral para essa escolha é apresentado na Figura IX-2 (livro original).

3.7 Características da fase móvel usada em CLAE

As fases móveis utilizadas em CLAE devem apresentar características essenciais para
uma operação eficaz:
a. Dissolver a amostra sem decompor seus componentes.
b. Ser de alto grau de pureza ou facilmente purificáveis.
c. Não decompor ou dissolver a fase estacionária.
d. Ter baixa viscosidade.
e. Ser compatível com o tipo de detector utilizado.
f. Possuir a polaridade adequada para uma separação eficiente dos componentes da
amostra.
 A pureza da fase móvel é crucial, especialmente ao usar detectores sensíveis, como os
de fluorescência ou absorbância no ultravioleta. Impurezas na fase móvel podem afetar a
sensibilidade do detector. Optar por uma fase móvel de fácil purificação pode reduzir custos.
É fundamental que a amostra seja solúvel na fase móvel e não sofra decomposição,
permitindo seu transporte através da coluna sem alterações nos componentes. Quando possível,
utilizar o solvente da amostra como parte ou totalidade da fase móvel para evitar precipitação
e preservar a resolução na separação.
Quando a cromatografia líquido-líquido é utilizada, a fase móvel pode dissolver a fase
estacionária. Para evitar isso, a fase móvel é saturada com a fase estacionária por meio de
tratamento prévio ou pelo uso de uma pré-coluna contendo uma alta percentagem da mesma
fase estacionária. Colunas com fase estacionária quimicamente ligada ou fase sólida não
requerem esse pré-tratamento; apenas a filtração é necessária. A baixa viscosidade da fase
móvel é crucial para a eficiência da separação, impactando a transferência de massa e a
intensidade da vazão. A fase móvel deve ser compatível com o detector, especialmente
relevante na cluição por gradiente, onde mudanças na composição podem afetar o detector.
Solventes frequentemente utilizados na CLAE, com propriedades interessantes, são
mencionados no Apêndice 4 (livro original).

4. Características das fases estacionárias usadas em CLAE

Na CLAE, materiais tradicionalmente usados na cromatografia líquida clássica, como
alumina, celulose, sílica gel e zeólita, são pouco empregados devido às suas partículas
irregulares, tamanho considerável e dificuldade na reprodução dos resultados. Os materiais
ideais para CLAE devem proporcionar máxima capacidade de amostra, excelente resolução na
separação, fácil introdução na coluna, baixa queda de pressão e custo reduzido. Embora esses
materiais ideais ainda não existam, em certas situações, pode-se aceitar compromissos entre as
vantagens. Partículas usadas têm dimensões pequenas e, frequentemente, formato regular para
garantir uniformidade no enchimento da coluna. A variação mínima nos diâmetros das
partículas também é uma característica importante para manter a uniformidade.
Na CLAE, os recheios podem ser classificados com base em propriedades físicas e
químicas, como rigidez, porosidade, forma, diâmetro das partículas e presença de grupos
funcionais ou camadas poliméricas ligadas à sua superfície. Os sólidos rígidos à base de sílica
são amplamente utilizados, oferecendo resistência a pressões relativamente altas e permitindo
a produção de colunas eficientes com partículas pequenas. Partículas porosas de policloreto de
poliestireno entrecruzado são exemplos de sólidos semi-rígidos, variando em rigidez e
porosidade. São empregados em pressões até 350 bars, sendo de particular interesse na CLAE
por exclusão com fase móvel orgânica e em técnicas como a troca iônica.
Em CLAE, sólidos não rígidos, como agarose ou dextrose, usados tradicionalmente em
cromatografia por exclusão clássica, são impraticáveis devido à sua incapacidade de resistir às
pressões da técnica. Sólidos porosos e peliculares são utilizados, sendo introduzidos facilmente
nas colunas, podendo ser empregados em técnicas específicas, como cromatografia líquido-
sólido ou líquido-líquido. Materiais pelculares ou porosos também são empregados em
cromatografia por troca iônica. Os adsorventes peliculares, embora apresentem eficiência e
rapidez, têm visto uma diminuição no uso devido à menor capacidade em comparação com
adsorventes completamente porosos. A uniformidade na distribuição das partículas na coluna
é crucial para alta eficiência de separação, e partículas esféricas são preferidas pelo processo
de enchimento, enquanto as irregulares podem ser escolhidas por razões econômicas. O
tamanho das partículas controla o processo de difusão das moléculas da amostra durante a
penetração e saída dos poros da partícula.
Na CLAE, o tamanho da partícula porosa desempenha um papel crucial. Partículas
maiores resultam em um processo de difusão mais lento, levando a uma transferência de massa
mais lenta entre a fase estacionária e a fase móvel. Isso ocorre devido ao aumento da
profundidade dos poros, resultando em uma saída mais demorada da amostra dos poros
profundos. Aumentar a vazão da fase móvel para análises rápidas pode causar alargamento dos
picos, já que as moléculas da amostra migram mais rapidamente na fase móvel. Partículas
menores proporcionam uma saída mais rápida da amostra dos poros, permitindo análises
rápidas sem perda de eficiência. Portanto, na CLAE, são utilizados materiais porosos com
partículas de tamanho igual ou menor que 104 m, exceto na cromatografia por troca iônica.
Também são empregadas partículas esféricas não porosas, revestidas com uma camada fina de
adsorvente poroso, conhecidas como pelicular de camada porosa, de porosidade superficial ou
de centro não poroso.
Os próximos parágrafos descreverão algumas das fases estacionárias comumente
empregadas em diversas técnicas de CLAE. Além dessas, existem outras fases sintetizadas para
propósitos específicos, como a separação de enantiômeros, carboidratos ou ácidos
intermediários do ciclo de Krebs, sendo recomendado consultar catálogos de revendedores
especializados ou a literatura apropriada para obter informações mais detalhadas.

4.1 Fases estacionárias para CLAE líquido-sólido

 Nas separações por adsorção (CLS), geralmente, utilizam-se partículas totalmente porosas,
com tamanhos entre 5 e 10 µm, e, ocasionalmente, materiais maiores (30-40 µm) com película
porosa. Essas separações são predominantemente realizadas com alguns tipos específicos de
adsorventes, sendo a sílica e a alumina os mais comuns. A retenção e a separação nesses
adsorventes costumam ser semelhantes, favorecendo a retenção dos componentes mais polares
da amostra. A ordem típica de eluição é: hidrocarbonetos saturados < olefinas <
hidrocarbonetos aromáticos = haletos orgânicos < sulfetos < éteres < ésteres aldeídos cetonas
< álcoois aminas < amidas < ácidos carboxílicos.
Na cromatografia por partição com fase líquida, é preferível usar suportes que sejam
inertes, mas na CLAE, não existem suportes inertes com a rigidez e uniformidade necessárias.
Assim, utiliza-se a sílica, ciente de seus pontos adsorventes que precisam ser completamente
cobertos ou desativados, semelhante ao que ocorre na cromatografia gasosa (CG). Os poros
devem ser suficientemente grandes para permitir o acesso total das moléculas do soluto à fase
estacionária dentro da estrutura dos poros, mas também pequenos o suficiente para resistir à
remoção do líquido estacionário pelo arraste mecânico da fase móvel. Suportes totalmente
porosos ou superficialmente porosos podem ser empregados na preparação de colunas para
cromatografia líquido-líquido (CLL).
Alguns exemplos de adsorventes peliculares são encontrados na Tabela IX-6. Esses
materiais são caracterizados por uma baixa capacidade de amostra, geralmente da ordem de
microgramas por grama (µg por g) de adsorvente. No entanto, devido à sua alta eficiência,
possibilitam análises muito rápidas. Os peliculares têm uma forma esférica, sendo os mais
comuns aqueles que apresentam uma camada de sílica gel sobre a superfície da esfera dura.
Alguns sólidos têm uma superfície pouco ativa e são úteis apenas como suporte para CLL,
como o Zipac. Outros, como Corasil, Pellosil, Vydac, etc., são empregados tanto para CLL
como para CLS. Todos esses adsorventes geralmente contêm uma porcentagem mínima de uma
fase líquida para desativar os sítios mais ativos de sua superfície. No caso da CLS, é comum
depositar uma certa percentagem de água (aproximadamente 0,02 a 0,04 g de água por cada
100 m² de superfície), suficiente para desativar parcialmente o adsorvente e aumentar a faixa
linear da fase.

4.2. Fases estacionárias para CLAE com fase ligada

Superfícies de sílica, sendo o suporte mais popular, podem ser modificadas por
diferentes métodos, incluindo:
a. Formação do éster silicato (Si-O-R) por reação do grupo silanol com um álcool
 b. Formação da ligação siloxano (Si-O-SiR) por reação do grupo silanol com um
organoclorossilano
c. Formação da ligação silício-carbono pelo tratamento do grupo silanol com cloreto de
tionila, produzindo o cloreto, que, em seguida, reage com um composto organometálico para
produzir um grupo orgânico ligado diretamente à superfície da sílica. Materiais preparados
pelos métodos b e c têm uma maior estabilidade (até pH 8), enquanto o tipo éster, preparado
pelo método "a", não é tão estável.
A Tabela IX-7 lista alguns materiais comumente utilizados na CLFL em CLAE. Todas
as fases quimicamente ligadas baseiam-se em núcleos que são sólidos da Tabela IX-5,
mantendo o mesmo nome, com poucas exceções (por exemplo, Bondapak vs. Porasil), junto
com algumas especificações para identificar o grupo funcional. A tabela não inclui o tamanho
da partícula, pois isso já foi mencionado na Tabela IX-5. Em vez disso, destaca a porcentagem
total de carbono por massa (uma medida do grau de cobertura). A maioria desses materiais
contém a ligação Si-O-SiRR2, onde R é o grupo quimicamente ligado, ativo na separação, e R'
é normalmente o grupo metil. Alguns desses materiais têm diferentes percentagens da fase
quimicamente ligada com o mesmo nome, por exemplo, Partisil ODS-X, onde X 1,2 ou 3
corresponde a 5, 15 e 10% de carbono ligado ao Partisil, respectivamente. Essa porcentagem
de fase quimicamente ligada limitará a quantidade de amostra que pode ser utilizada na
separação. Outro parâmetro importante, especialmente para as fases ligadas apolares, é se os
grupos silanóis remanescentes após a reação de preparação da fase estacionária foram ou não
desativados por reações de capamento ("end capping") com trimetilmetoxissilano ou um
reagente similar. Dos materiais citados na Tabela IX-7, os mais utilizados são os da
cromatografia com fase reversa, que apresentam grupos octadecil, octil, dimetil, entre outros.
Também são amplamente empregados grupos amino e nitrilo, produzindo fases estacionárias
de caráter polar. A Tabela IX-8 lista alguns dos materiais normalmente usados para CLFL,
baseados em partículas peliculares.

4.3. Fases estacionárias para CLAE por troca iônica

Os materiais utilizados como recheio para a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(CLAE) por Troca Iônica (CTI) incluem partículas porosas de resinas poliméricas, sílica com
camada pelicular, micropartículas porosas de sílica e micropartículas porosas de resinas
poliméricas. Tradicionalmente, as partículas porosas de resina polimérica são empregadas na
separação de aminoácidos, peptídeos e carboidratos. Esses materiais consistem em partículas
rígidas do copolímero poliestireno-divinilbenzeno, cuja superfície e poros contêm grupos
trocadores de íons. Eles têm uma capacidade elevada, geralmente da ordem de miliequivalentes
por grama de material, e estão disponíveis com diâmetros maiores (30-40 µm) ou menores (5
µm, 10 µm). As sílicas com camadas peliculares consistem em partículas vítreas esféricas
recobertas por uma fina camada do copolímero poliestireno-divinilbenzeno, contendo grupos
trocadores de íons ativos. Esses materiais têm uma capacidade reduzida, da ordem de 10 µg/g,
mas são muito eficazes.
A maioria das sílicas com camadas peliculares pode ser utilizada com solventes
orgânicos. Além disso, existem materiais que resistem a pressões elevadas e possuem uma
capacidade de troca superior aos materiais peliculares: as micropartículas porosas de sílica com
grupos trocadores quimicamente ligados. Os grupos quimicamente ligados presentes nesses
materiais de troca iônica são SO₃ para trocadores fortes de cátions, COO para trocadores fracos
de cátions, e NR₂ ou NH₂ para trocadores de ânions, sendo R um trocador fraco de ânions. As
capacidades indicadas na Tabela IX-9 são aproximadas, pois o valor real depende da amostra.
Devido à sensibilidade dos processos de troca iônica à temperatura, é recomendável ter um
sistema de controle térmico ao empregar esse tipo de fase estacionária, pois mudanças normais
na temperatura ambiente podem afetar os resultados.

4.4. Fases estacionárias para CLAE por exclusão

A cromatografia por exclusão utiliza a resolução com base no tamanho efetivo das
moléculas na amostra. Existem limites de permeação e exclusão que determinam a faixa de
tamanhos úteis. Materiais para essa técnica variam em rigidez e intervalo de tamanho. A
escolha depende do tamanho efetivo das moléculas a serem separadas.
Existem três tipos de materiais para cromatografia por exclusão. O primeiro são os
materiais não rígidos, seguidos pelos semi-rígidos que resistem a pressões de 100 a 150 bars,
constituídos por microesferas de copolímero como poliestireno-divinilbenzeno. Esses são
utilizados em CLAE e CE clássica. Os materiais rígidos, o terceiro tipo, resistem a qualquer
pressão e são geralmente feitos de partículas de sílica ou vidro poroso, permitindo separações
rápidas, mas podem apresentar adsorção ou degradação, sendo tratados para evitar esses
efeitos.

5. Características das colunas usadas EM CLAE

As colunas em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) são geralmente feitas de
aço inoxidável, com diâmetro interno preciso e superfícies internas polidas para otimizar a
eficiência. O diâmetro interno varia de 3 a 5 mm para análises analíticas e é igual ou maior que
10 mm para colunas preparativas. Colunas com microdiâmetro têm entre 0,05 e 2 mm. O
comprimento típico varia de 10 a 50 cm, e a capacidade da coluna é determinada pelo
comprimento, diâmetro e material de recheio. As colunas de menor comprimento são usadas
para análises rápidas, mas têm capacidade limitada, exigindo detectores sensíveis.
Em cromatografia líquida preparativa, que visa separar e recuperar componentes em maior
quantidade, são usadas colunas com maior capacidade. Colunas preparativas podem ser mais
demoradas e menos eficientes que as analíticas. Colunas retas são preferíveis, mas, em casos
de colunas longas, podem-se conectar colunas retas ou usar configurações em "8", "S" ou "U"
com curvatura grande, lembrando que qualquer estrangulamento pode resultar em perda de
eficiência. Discos nos extremos retêm o recheio sem aumentar excessivamente a pressão. A
eficiência atual das colunas permite alcançar cerca de 60.000 pratos teóricos por metro,
superando a eficiência comumente obtida em cromatografia gasosa com colunas recheadas. Os
avanços são atribuídos à uniformidade das partículas, micropartículas, processos químicos
eficientes e técnicas avançadas de enchimento.

5.1. Técnicas de enchimento das colunas

O enchimento de colunas para CLAE pode ser feito a seco ou usando uma suspensão da
fase estacionária em um solvente apropriado. Devido à tendência das pequenas partículas
formarem aglomerados durante o enchimento a seco com vibração, resultando em concentração
desigual, o método por suspensão é preferido para partículas com diâmetro inferior a 30 µm.

5.1.1. Enchimento por vibração, a seco, para sólidos rígidos

O procedimento ideal para o enchimento a seco de colunas com sólidos rígidos é o seguinte:
a. Desengordurar a parede interna da coluna com diclorometano, acetona e água
sequencialmente.
b. Esfregar o interior do tubo da coluna com uma solução de detergente quente, lavar com
água e metanol, e secar.
c. Colocar o filtro poroso em uma extremidade da coluna, garantindo que ele fique na
extremidade inferior.
d. Adicionar pequenas porções do recheio na coluna, uma de cada vez, por meio de um
funil, preenchendo 3-6 mm da coluna. Bater levemente a coluna sobre um banco de madeira
cerca de 100 vezes, ou utilizar um vibrador mecânico.
f. Girar a coluna e bater suavemente nos lados na altura do nível do recheio.
 g. Bater verticalmente na coluna no banco por 15 segundos. Adicionar uma nova porção do
recheio e repetir as etapas e, f, g.
j. Limpar a extremidade do tubo e adicionar o outro filtro poroso quando a coluna estiver
cheia.

5.1.2. Enchimento por suspensão com alta pressão

O método de enchimento por suspensão com alta pressão é utilizado com solventes cuja
densidade seja próxima à da partícula, mantendo-a suspensa durante o processo. A escolha do
solvente depende da viscosidade desejada, pois solventes mais viscosos prolongam o período
de suspensão, mas também demandam maior pressão. Diferentes aparelhos podem ser
empregados nesse método, mas, de maneira geral, envolvem a degasificação do solvente, a
preparação da suspensão e a conexão ao reservatório da coluna. Este método evita a formação
de aglomerados, garantindo um enchimento eficaz da coluna.
No método de enchimento por suspensão com alta pressão, a suspensão é deslocada para a
coluna através de uma bomba de alta pressão, aplicando a pressão necessária por cerca de 5
minutos. Após desligar a bomba e interromper a vazão de solvente, a coluna pode ser
desconectada. Em seguida, limpa-se a extremidade da coluna, coloca-se o outro filtro e fecha-
se ambas as extremidades.

5.2. Cuidados com as colunas da CLAE

O uso de colunas de partículas microporosas na CLAE requer precauções, como a proteção
da coluna com uma pré-coluna ao lidar com amostras muito sujas. A pré-coluna, de
características semelhantes à coluna principal, é colocada entre o injetor e a coluna e deve ser
renovada após um número específico de injeções. Devido aos grandes volumes de solventes, é
crucial garantir a alta pureza dos solventes para evitar a contaminação da coluna. Testar e, se
necessário, purificar os solventes são práticas recomendadas. Além disso, os solventes devem
ser filtrados para remover partículas sólidas que possam danificar o sistema.
Solventes contendo impurezas polares podem interferir no seu uso como fase móvel na
CLAE. Por exemplo, o clorofórmio, estabilizado com metanol, pode ser imiscível com a água;
uma extração e secagem podem remover essa impureza polar. Solventes halogenados podem
conter traços de ácidos, reagindo com o aço inoxidável da coluna e partes do sistema. A
natureza corrosiva potencial de cada solvente pode apresentar problemas, como a solubilização
de íons metálicos na coluna.
6. Equipamento para CLAE
O equipamento para CLAE é mais sofisticado que o da CLC, com uma variedade de
instrumentos refinados. Há uma ampla gama de opções em termos de custo, versatilidade e
complexidade. Características como versatilidade e rapidez são essenciais ao considerar um
instrumento para aquisição, capaz de lidar com amostras diversas e técnicas cromatográficas,
buscando eficiência nas análises, como programação de gradiente da fase móvel e reciclagem
de frações.
Ao escolher um equipamento para CLAE, a reprodutibilidade, estabilidade, e sensibilidade
são cruciais para um desempenho consistente e duradouro. Controles adequados sobre
parâmetros como vazão, temperatura, pressão e composição da fase móvel são essenciais,
exigindo recursos como controles de temperatura e vazão. A sensibilidade, determinada pelo
sistema de detecção, é vital para detectar componentes em amostras pequenas, podendo atingir
níveis de nanograma ou menos com detectores modernos. Considerar essas características
facilitará a escolha do instrumento ideal para o trabalho desejado.

6.1. Reservatório da fase móvel

O reservatório da fase móvel na CLAE pode ser feito de vidro, aço inoxidável ou plástico
inerte, com capacidade de 1 a 3 litros. É essencial filtrar a fase móvel para evitar obstruções no
sistema de bombeamento e na coluna, sendo recomendado um filtro capaz de reter partículas
sem causar queda excessiva de pressão. Para fases móveis polares, que têm propensão a
dissolver gases, é crucial remover gases dissolvidos para evitar bolhas que possam impactar o
funcionamento do detector e a eficiência da coluna. Métodos como aplicar vácuo, agitar
magneticamente ou usar ultra-som/aquecimento podem ser empregados para essa remoção.
A formação de bolhas na fase móvel na CLAE tem sido mitigada com a inclusão de um
filtro na saída do detector. Esse filtro, ao restringir a vazão e criar uma leve pressão na cela do
detector, ajuda a prevenir a formação fácil de bolhas.

6.2. Sistema de Bombeamento

O desenvolvimento do sistema de bombeamento é crucial para a Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE). A bomba deve proporcionar vazão adequada e constante,
considerando pressões máximas de operação, vazões contínuas, intervalos específicos e inércia
química aos solventes. Existem bombas mecânicas, incluindo as recíprocas (pistão ou
diafragma) e as tipo seringa, além das bombas pneumáticas, cada uma com suas características
distintas.
 6.2.1. Bombas recíprocas
Bombas recíprocas em CLAE escoam volumes de forma pulsante, sendo a pressão máxima
em torno de 600 bars. Operam com pistão ou diafragma, movimentados por válvulas
alternadas, preenchendo e esvaziando uma câmara. A desvantagem é a vazão pulsante,
impactando a eficiência da coluna e a estabilidade do detector. Pulsos são amortecidos usando
um tubo capilar flutuante. Apesar disso, oferecem vazão constante, vantajosa para a coluna.
Manômetros Bourdon medem a pressão, parcialmente atenuando as pulsações. Essas bombas
têm a capacidade de alimentar o sistema de forma contínua.

6.2.2. Bombas tipo seringa

A bomba tipo seringa, também chamada de êmbolo ou de deslocamento contínuo, desloca
um pistão de forma uniforme, proporcionando uma vazão contínua e livre de pulsações.
Operando a pressões de até 600 bars, essa bomba é preferida em colunas com diâmetro interno
reduzido (<2 mm), garantindo uma vazão sem pulsos. Apesar do custo elevado e da dificuldade
no reabastecimento com nova fase móvel, essa bomba é utilizada quando se necessita uma
vazão precisa e contínua, especialmente em colunas microcapilares.

6.2.3. Bombas pneumáticas

Bombas pneumáticas deslocam o líquido através da pressão de um gás inerte a alta pressão,
podendo ser aplicada diretamente sobre o líquido ou sobre o recipiente que o contém. Apesar
de proporcionar vazões livres de pulsações e de pressão constante, ajustando-se à resistência
da coluna, essas bombas têm limitações na pressão máxima e no volume total bombeado. A
difusão do gás no líquido pode ser mitigada com interfaces apropriadas. Projetos especiais,
com amplificadores de pressão, podem atingir pressões de até 410 bars com baixas pressões de
gás.

6.3. Programadores de Fase Móvel

A técnica de programação de fase móvel na CLAE envolve a alteração da composição da
fase móvel durante a análise. Geralmente, solventes de diferentes polaridades são utilizados,
variando a proporção em misturas binárias ou ternárias. Isso resulta em análises mais rápidas e
melhor simetria nos picos em comparação com a eluição isocrática. No entanto, desvantagens
incluem a necessidade de regenerar a coluna antes de novas injeções de amostra e possíveis
incompatibilidades com o detector. Programadores de fase móvel são dispositivos complexos,
podendo ter custo elevado. Existem basicamente dois tipos:
a) Mistura em uma câmara antes de ser enviada para a coluna pela bomba.
b) Programadores de Mistura em Corrente: Outra categoria são os programadores que
realizam a mistura em corrente, exigindo duas ou mais bombas. Embora sejam mais
versáteis, permitindo a criação de qualquer gradiente desejado, também são mais caros.
Esses programadores podem ser utilizados para criar misturas isocráticas e até regenerar
colunas conforme necessário. A incorporação de microprocessadores, possivelmente os
mesmos usados para o tratamento de dados, permite a automação total na criação de
gradientes.

6.4. Medidor e Controlador de Pressão

A pressão na CLAE depende de diversos fatores, como a permeabilidade da coluna e a

viscosidade da fase móvel. Medidores, como os do tipo Bourdon ou diafragma, são utilizados
para otimizar a separação e diagnosticar problemas no sistema, como entupimentos ou
vazamentos. Embora simples e econômicos, os transdutores de pressão oferecem maior
precisão e podem incluir alarmes ou desligamento automático para proteger o sistema contra
sobrecarga de pressão. O uso de válvulas de segurança é recomendado para sistemas com
bombas de deslocamento constante.

6.5. Válvulas para amostragem

A introdução de amostras na CLAE, até recentemente, assemelhava-se à técnica usada na
cromatografia gasosa. Utilizava-se uma microsseringa para injetar a amostra em uma pequena
câmara, onde era diluída e arrastada pela fase móvel.
Equipamentos modernos geralmente utilizam válvulas para amostragem, ilustradas
esquematicamente na Figura IX-9. A amostra, introduzida por uma seringa, preenche o espaço
interno de um tubo capilar de aço, conhecido como alça de amostragem. Essa alça, com volume
entre 1 a 100 μL, permite injeções precisas na coluna, alterando a posição de entrada e saída
pela ativação da válvula. Isso possibilita injeções em diferentes pressões, com ampla variação
de volumes de amostra e alta reprodutibilidade. As válvulas são construídas com materiais
inertes, como teflon e aço inoxidável, resistindo a elevadas pressões.

6.6. Detectores usados em CLAE

 Detectores usados em CLAE requerem instrumentação mais avançada devido à
necessidade de alta sensibilidade para monitorar o efluente da coluna. Soluções para o desafio
de detecção envolvem medições diferenciadas das propriedades de amostra e fase móvel.
Idealmente, um detector para CLAE seria altamente sensível, com baixo limite de detecção,
resposta rápida, insensibilidade a mudanças de temperatura e vazão, além de ser independente
da fase móvel. Entretanto, não há um detector que reúna todas essas propriedades, a menos que
seja desenvolvido especificamente para isso.
Os detectores em CLAE não são versáteis ou universais como os da cromatografia gasosa,
mas oferecem uma ampla gama de aplicações. Embora não haja equivalentes para
condutividade térmica ou ionização em chama, a escolha do detector depende da natureza da
amostra. Detectores seletivos são ideais para análises de amostras complexas, enquanto
detectores universais são preferidos para laboratórios de pesquisa que lidam com diversos tipos
de amostras. Cada detector possui características específicas, vantagens e limitações que devem
ser consideradas ao escolher o mais adequado para uma aplicação específica.
A sensibilidade em CLAE é definida como a relação entre o sinal gerado pelo detector e a
quantidade de amostra que causa esse sinal. É um termo relativo, pois o sinal pode variar
significativamente entre diferentes amostras mesmo quando usando o mesmo detector.
A linearidade refere-se à faixa linear do sistema, onde o sinal do detector é diretamente
proporcional à concentração do soluto, sendo crucial em análises quantitativas. Se a
concentração ultrapassar a faixa linear, diluições adequadas podem ser aplicadas. O limite
mínimo de detecção é a menor quantidade de substância detectável, gerando um sinal acima
do dobro do nível de ruído do instrumento. O ruído, variações não atribuídas à amostra, pode
surgir de falhas eletrônicas, instalações inadequadas, flutuações de temperatura, entre outros.
Detectores muito sensíveis, mas ruidosos, podem ser menos úteis do que aqueles com menor
sensibilidade e menor ruído. As mudanças na composição da fase móvel podem afetar a linha
de base, especialmente ao aplicar gradientes.
Na CLAE, os detectores fotométricos, baseados na absorvância UV/visível, são
amplamente utilizados, seguidos pelos refratométricos e classes especiais mais específicas. A
Tabela IX-12 resume algumas propriedades desses detectores, enquanto as seções a seguir
abordam outras características.

6.6.1. Detectores por absorbância no ultravioleta e no visível

Detectores por absorvância no ultravioleta e no visível na CLAE são baseados na absorção
de luz pela amostra em um determinado comprimento de onda. Existem dois tipos principais:
espectrofotômetros de comprimento de onda variável e detectores fotométricos de
comprimento de onda fixo. O primeiro é mais versátil, sensível e caro, enquanto o último é
econômico e suficiente para compostos que absorvem na faixa de operação. Detectores de
comprimento de onda fixo geralmente operam em 254 nm e 280 nm, proporcionando
sensibilidades de até 0,001 unidade de absorvância. São relativamente insensíveis às variações
de vazão e temperatura, permitindo análises por gradiente. A sensibilidade pode atingir
décimos de nanogramas para compostos que absorvem intensamente no ultravioleta.
O detector de comprimento de onda fixo na CLAE, mostrado esquematicamente na Figura
IX-10, utiliza radiação UV a 254 nm de uma lâmpada de mercúrio de baixa pressão. Essa
radiação passa através da célula da amostra, sendo parte dela absorvida. A quantidade não
absorvida atinge a célula fotoclétrica da amostra. Simultaneamente, a radiação da fonte passa
por um divisor de feixe para a célula de referência, atingindo sua célula fotoclétrica. A
diferença de corrente entre essas células é amplificada, gerando um sinal de saída linear com a
concentração do soluto para o registrador.
Na CLAE, quando há variação significativa de absorvância para o ultravioleta durante a
aplicação de gradiente na fase móvel, é essencial utilizar a célula de referência para compensar
essa variação. Se a fase móvel não absorve ou a absorvância é constante, é possível deixar a
célula de referência vazia ou preenchida com um dos componentes da fase móvel. Alguns
compostos absorvem na região visível do espectro eletromagnético, sendo analisados por
detectores que operam nessa faixa. Adição contínua ou periódica de reagentes ao efluente pode
formar compostos coloridos, monitorados por detectores específicos. Esta técnica é aplicada
em analisadores automáticos de aminoácidos, onde a reação do aminoácido com a ninidrina
gera uma cor púrpura detectada a 570 nm. Detectores por absorvância na faixa visível podem
ter comprimento de onda fixo com filtros ou variável com monocromador. Espectrofotômetros
de comprimento de onda variável UV-VIS, que cobrem de 190 a 800 nm, oferecem vantagens
como maior absorvância e seletividade ao escolher o comprimento de onda desejado.
Detectores UV-VIS de comprimento de onda variável em CLAE promovem eficiência em
gradiente ao selecionar um comprimento de onda onde os componentes da fase móvel mantêm
uma absorvância constante. Além disso, possibilitam a obtenção do espectro de absorvância de
cada componente individualmente após interromper a vazão da fase móvel.
Detectores espectrofotométricos por conjunto de fotodiodos permitem análises em
diferentes comprimentos de onda sem interromper o fluxo da fase móvel. A luz passa pela cela
do detector, é dispersada por uma grade holográfica e focalizada sobre uma fila de fotodiodos,
possibilitando o armazenamento do espectro completo usando um microcomputador. Este
detector, embora complexo e caro, oferece a vantagem de evitar o alargamento da base do pico
por dispersão pós-coluna devido ao seu pequeno volume de cela. A pureza espectroscópica da
fase móvel é crucial, especialmente em comprimentos de onda abaixo de 240 nm.

6.6.2. Detectores por absorvância no infravermclho

Os detectores na região do infravermelho servem como métodos de detecção universais ou
específicos. Embora sua sensibilidade seja limitada para as quantidades usuais de amostras, são
empregados com sistemas de CLAE por exclusão. A técnica envolve interromper a vazão com
a amostra na célula, permitindo a obtenção de um espectro infravermelho para uma análise
completa da amostra. A eficácia desse detector depende da fase móvel, que deve ser
transparente no comprimento de onda utilizado.

6.6.3. Detectores por fluorescência

A espectroscopia de fluorescência, altamente sensível para compostos que fluorescem,
permite a detecção de quantidades da ordem de picogramas (10^(-12) g), comparável aos
detectores por captura de elétrons em CG. Alta intensidade de fluorescência é esperada em
compostos conjugados simetricamente. É possível induzir fluorescência em compostos não
fluorescentes pós-coluna, como esteroides aquecidos em ácido sulfúrico. Amplas aplicações
incluem análises em alimentos, produtos farmacêuticos e caracterização de destilados de
petróleo de alto ponto de ebulição. A escolha cuidadosa da fase móvel é crucial, especialmente
em análises quantitativas e eluição por gradiente, onde os componentes da fase móvel não
devem interferir na fluorescência. O esquema do detector inclui filtros para selecionar o
comprimento de onda excitante e eliminar esse comprimento, permitindo apenas a passagem
do comprimento de onda emitido pela amostra.

6.6.4. Detectores por índice de refração

O detector por índice de refração é amplamente utilizado na CLAE como o segundo mais
comum. Ele monitora continuamente a diferença no índice de refração entre a fase móvel pura
e o efluente contendo os componentes da amostra. Este detector é ideal para solutos que não
absorvem no UV ou visível, oferecendo uma resposta universal com sensibilidade moderada,
geralmente na ordem de microgramas. Contudo, apresenta desafios como a sensibilidade a
variações de vazão, mudanças na composição da fase móvel e dificuldades na implementação
de gradientes devido às variações nos índices de refração dos solventes. Diversos modelos de
detectores por índice de refração estão disponíveis, e um deles se baseia na lei de Fresnel, onde
a quantidade de luz transmitida e refletida em um prisma de vidro é proporcional ao ângulo de
incidência da luz e ao índice de refração do líquido na interface vidro-liquido.
Os detectores por índice de refração são comuns na CLAE, sendo o segundo mais utilizado.
Um tipo usa a lei de Fresnel, ajustando o ângulo de incidência para medições. Outro, o
refratômetro de deflexão, registra a mudança na posição do raio de luz devido à alteração no
índice de refração. O tipo Fresnel é sensível a mudanças de temperatura, requerendo dois
prismas para cobrir a faixa de índice de refração. O refratômetro de deflexão tem ampla
linearidade e é menos sensível a mudanças de temperatura, mas suscetível a vibrações.

6.6.5. Detectores eletroquímicos

Os detectores eletroquímicos, especialmente os polarográficos com eletrodo de mercúrio
gotejante, destacam-se como uma solução promissora para a CLAE, oferecendo alta
seletividade e sensibilidade, sendo particularmente adequados para análises de traços. Esses
detectores são seletivos para moléculas que passam por oxidação ou redução. Métodos
condutométricos e potenciométricos, embora tenham sido utilizados na cromatografia líquida
clássica, receberam pouca atenção na CLAE, apesar de serem eficazes para fases móveis
aquosas, como na cromatografia por troca iônica e por exclusão.

6.6.6. Detectores de radioatividade

Detectores de radioatividade são projetados especificamente para detectar solutos
radiomarcados à medida que são eluídos da coluna. Embora não sejam comuns
comercialmente, alguns detectores, como os que detectam a partícula ß do P e do C, são
disponíveis. Detectores radioquímicos possuem ampla faixa de resposta, sendo insensíveis a
mudanças de fases móveis, permitindo seu uso em gradientes. Aplicações cromatográficas com
emissores de γ ou forte (como 210Po, 125I) usando sistemas de cintilação ou contadores Geiger
foram publicadas. A sensibilidade pode ser melhorada aumentando o tempo de contagem, mas
isso geralmente resulta em alargamento de picos. A técnica de parar a vazão possibilita um
aumento do tempo de contagem sem prejudicar a separação cromatográfica, sendo mais
adequada para colunas relativamente largas e tempos de análise longos.

6.6.7. Outros detectores

Diversos detectores baseados em propriedades como constante dielétrica, pressão de vapor,
viscosidade, entre outras, têm sido propostos para uso na CLAE. No entanto, muitos desses
detectores dependem da temperatura, limitando sua aplicabilidade devido à variação
significativa da resposta com as mudanças de temperatura. Alguns desses detectores estão
sendo comercializados, enquanto outros estão em fase de desenvolvimento, podendo
representar o "detector do futuro" com as características desejadas mencionadas no início desta
seção.

6.7 Registro dos dados

Para registrar ou manipular os dados na CLAE, pode-se usar um registrador
potenciométrico para representar graficamente o sinal elétrico do detector. Integradores mais
sofisticados ou microcomputadores também são empregados, proporcionando maior
versatilidade, exatidão e precisão. O microcomputador desempenha funções como processar,
armazenar e registrar dados, além de controlar a composição da fase móvel, vazão, injeção da
amostra e temperatura da coluna, otimizando o desempenho do sistema e diagnosticando
problemas.

6.8. Controle da temperatura da coluna e detector

Na maioria das análises, a temperatura ambiente é suficiente, e muitos equipamentos não
possuem controle de temperatura da coluna. Em casos específicos, como cromatografia por
troca iônica ou por exclusão, pode ser necessário um controle mais preciso, geralmente em
torno de 2°C. Para temperaturas superiores, utilizam-se banhos circuladores termostatizados
ou fornos elétricos. O controle da temperatura do detector varia conforme o tipo utilizado;
alguns não necessitam, enquanto outros exigem um controle minucioso, podendo ser realizado
com banhos termostatizados ou fornos aquecidos por resistência elétrica.

6.9. Coletor de frações

Na cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), a facilidade de coletar os componentes
da amostra analisada é uma grande vantagem. Para essa finalidade, são utilizados coletores
automáticos, que podem ser integrados ao equipamento ou adicionados como acessórios.
Alguns desses coletores automáticos são refrigerados para evitar a decomposição das
substâncias separadas.

6.10. Determinação da vazão

Na cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), a determinação da vazão através da
coluna pode ser realizada por métodos volumétricos, gravimétricos ou usando medidores de
bolha. Métodos volumétricos e gravimétricos medem ou pesam o volume da fase móvel
coletada em um período de tempo, proporcionando leituras sensíveis e precisas, mas não
contínuas. Já o medidor de bolha, que faz a fase móvel deslocar-se através de um tubo de vidro,
é rápido e preciso, mas também não contínuo. Além disso, sistemas de bombas avançadas,
controladas por microprocessadores, eliminam a necessidade de medição direta da vazão,
ajustando automaticamente as condições de operação conforme as ordens do operador.

7. Aplicações da CLAE
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) inicialmente concebida como uma
técnica de separação, evoluiu para uma posição proeminente como uma técnica analítica tanto
qualitativa quanto quantitativa. Os procedimentos aplicados na CLAE para análises qualitativas
e quantitativas seguem princípios semelhantes aos discutidos no Capítulo VIII. Apesar de ser
uma técnica relativamente recente, a CLAE já possui uma vasta quantidade de publicações em
química e bioquímica, descrevendo diversas aplicações. Alguns exemplos destacados a seguir
fornecem uma visão da versatilidade e potencial analítico dessa técnica.
A potencialidade da técnica analítica da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
é ilustrada por alguns exemplos. A Figura IX-17 apresenta um cromatograma dos componentes
de um comprimido de analgésico, destacando o interesse na análise qualitativa e quantitativa
desses componentes para controlar a estabilidade pós-fabricação. Já a Figura IX-18 mostra um
cromatograma de anticonvulsivantes em soro sanguíneo, relevante para monitorar níveis e
períodos de permanência em pacientes neurológicos. A Figura IX-19 destaca a determinação
de esteroides à base de cortisona, utilizados em diversas aplicações médicas, cuja análise é
desafiadora devido à sua termossensibilidade, tornando a CLAE uma escolha vantajosa em
relação à cromatografia gasosa.
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) destaca-se na análise química de
alimentos, como o mel, visando à caracterização e controle de qualidade. Na Figura IX-20, é
mostrada uma rápida análise dos açúcares do mel. A CLAE também facilita a análise de
vitaminas, como evidenciado na Figura IX-21, proporcionando resultados eficientes em curtos
períodos. Além disso, a CLAE desempenha um papel significativo na resolução de problemas
relacionados à contaminação ambiental, sendo uma ferramenta eficaz para a determinação de
pesticidas, como ilustrado na Figura IX-22, onde cinco inseticidas são analisados com sucesso.
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma ferramenta eficaz na
determinação de contaminantes atmosféricos, como os policíclicos aromáticos, conforme
mostrado na Figura IX-23. Essa abordagem é mais acessível do que a cromatografia gasosa,
que exige condições de alta temperatura. Na Figura IX-24, ao analisar HMX e RDX
(substâncias explosivas), observa-se que o RDX tem uma resposta ligeiramente superior a 254
nm, indicando absorvência semelhante ao HMX nesse comprimento de onda. No entanto, a
230 nm, a absorvência do RDX diminui em relação ao HMX.
A crescente produção de açúcar, álcool e derivados a partir da cana-de-açúcar destaca a
importância da análise do caldo de cana. O cromatograma da Figura IX-25 permite determinar
rapidamente a porcentagem relativa dos principais componentes do caldo de cana. Para
compostos de alta massa molecular, a CLAE por exclusão é um método apropriado. Em casos
mais complexos, a combinação de diferentes técnicas cromatográficas pode ser empregada,
como a separação inicial por massa molecular seguida de adsorção ou partição para obter
compostos puros em cada fração. Para amostras extremamente complexas, é possível utilizar
várias colunas em série.
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) por exclusão é altamente
recomendada na determinação da distribuição de massas moleculares de polímeros e na análise
de produtos naturais baseada na massa molecular. A Figura IX-26 exemplifica a determinação
das massas moleculares em polímeros. A CLAE por troca iônica é amplamente utilizada para
análises bioquímicas de misturas de moléculas pequenas. A rápida determinação de
aminoácidos é um destaque, como mostrado na Figura IX-27, onde a CLAE por troca catiônica,
acoplada a um reator pós-coluna e um detector por absorvância no visível, permite a separação
dos aminoácidos em um hidrolisado proteico.
Enquanto a CLAE é valiosa para análises qualitativas e quantitativas, seu aspecto
preparativo também é destacado. Na Figura IX-28, o cromatograma a representa uma separação
analítica de intermediários na síntese de vitamina B-12, enquanto o cromatograma b ilustra
uma separação preparativa em uma coluna de sílica porosa. Essas capacidades tornam a CLAE
uma técnica eficaz para isolar quantidades significativas de componentes para uso em padrões,
intermediários de síntese ou materiais extraídos de produtos naturais para ensaios biológicos.
A eficiência da separação pode ser aumentada com o uso de partículas menores em colunas,
proporcionando resolução equivalente em um tempo de separação mais curto.

8. Referência
Carol H. Collins, Gilberto L. Braga, Pierina S. Bonato - Introdução a Métodos
Cromatográficos-Editora da UNICAMP (1997) [Todas as tabelas e imagens citadas no resumo
podem ser encontradas no livro texto original.]