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Métodos
Cromatográficos
ANÁLISE INSTRUMENTAL
Prof. Bruno Cortez
1º semestre - 2008
DEFINIÇÃO
Conjunto de técnicas de separação cujo
princípio depende da distribuição
diferenciada dos componentes de uma
mistura entre duas fases, uma
considerada estacionária, e a outra,
móvel.
KROMA + GRAPH
(COR) (ESCREVER)
DEFINIÇÃO
Diferenças nas propriedades das fases móvel e
estacionária possibilitam com que os componentes da
amostra se desloquem através do material
cromatográfico com velocidades desiguais, gerando a
separação
ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
AFINIDADE SEPARAÇÃO
PRINCIPAIS FATOS HISTÓRICOS
Separação de pigmentos;
proposição do termo Cromatografia em Primeira publicação
cromatografia papel em fase gasosa
Mikhail Tswett Izmailov e Shraiber Martin e Synge
1903-1906 1938 1952
PLANAR COLUNA
Considere a aplicação de
uma mistura de compostos
orgânicos no topo de uma
coluna cromatográfica
ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Separação em
colunas
convencionais
Estabelecida a percolação da FE
com o eluente (FM), os
componentes da mistura passarão
a migrar com velocidades desiguais
caso o sistema seja adequado para
a separação
ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Separação em colunas
convencionais
Uma boa seletividade
cromatográfica garantirá uma
boa separação entre os
componentes da amostra
ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Separação em
colunas
convencionais
Cada componente da amostra
poderá ser coletado isoladamente,
através de um coletor de frações
(neste caso, um simples frasco
coletor)
ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Separação em coluna
O monitoramento do eluato da coluna pode ser feito
através de um detector, cujo sinal identifica a
“saída” de cada componente da mistura,
isoladamente
ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Separação em
coluna
A resposta do detector é
traduzida em um gráfico,
ou CROMATOGRAMA, que
relaciona o seu sinal com o
tempo necessário para a
eluição de cada
componente.
ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Separação em coluna
As moléculas de cada componente também migram
com velocidades desiguais devido a fenômenos de
difusão e transferência de massa
ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Eluição típica em cromatografia líquida
DEFINIÇÃO DE TERMOS
Tempo de retenção
O tempo gasto desde o ato
de injeção até a saída do
ponto máximo do pico do
sistema
O tempo de retenção
engloba todo o tempo que o
componente em questão fica
no sistema cromatográfico,
quer na fase móvel quer na
fase estacionária
DEFINIÇÃO DE TERMOS
Tempo de retenção
corrigido
Quando as moléculas do soluto
ficam na fase móvel, elas
devem movimentar-se com a
mesma velocidade das
moléculas da própria fase
móvel.
Parte do tempo em que as
moléculas do soluto estão na
fase móvel é igual ao tempo
gasto para as moléculas da fase
móvel percorrerem a coluna, tm
SENDO ASSIM, PARTE DO
TEMPO EM QUE AS
MOLÉCULAS DO SOLUTO
FICAM RETIDAS NA FASE
ESTACIONÁRIA É CALCULADA
PELA DIFERENÇA
DEFINIÇÃO DE TERMOS
Seletividade
Para a cromatografia
em coluna, o fator de
separação
(SELETIVIDADE) é
calculado pela razão
entre os respectivos
fatores de retenção
que, por sua vez, são
relacionados aos
tempos de retenção
corrigidos
DEFINIÇÃO DE TERMOS
Seletividade
DEFINIÇÃO DE TERMOS
Capacidade
MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
TEORIAS
Martin e Synge – Biochem. J. 35, 1358 (1941)
Meio descontínuo análogo às colunas de destilação
fracionada, constituído por um grande número de
estágios de equilíbrio ou PRATOS TEÓRICOS (TEORIA
DOS PRATOS TEÓRICOS)
VanDeemerter, Zuiderweg e Klinkenberg – Chem.
Eng. Sci. 5, 271 (1956)
Meio contínuo através do qual a separação ocorre por
fenômenos de difusão e transporte de massa (TEORIA
DA VELOCIDADE)
TEORIA DOS PRATOS
TEÓRICOS
Número de pratos teóricos
Coluna cromatográfica definida como uma série de estágios
independentes onde acontece um quase-equilíbrio entre o
analito dissolvido na fase estacionária (FE) e o gás de
arraste
TEORIA DOS PRATOS
TEÓRICOS
Número de pratos teóricos
O coeficiente Kc determina a distribuição da amostra (A)
entre as fases móvel (M) e estacionária (S) em um
determinado estágio do equilíbrio, obviamente hipotético.
Quanto mais efetiva for a presença de A na fase móvel (M)
menor será o seu tempo de retenção
TEORIA DOS PRATOS
TEÓRICOS
Número de pratos teóricos
TEORIA DOS PRATOS
TEÓRICOS
Número de pratos teóricos
TEORIA DOS PRATOS
TEÓRICOS
Cálculo do número de pratos teóricos
TEORIA DOS PRATOS
TEÓRICOS
Altura equivalente à um prato teórico
DEFINIÇÃO DE TERMOS
RESOLUÇÃO
CROMATOGRÁFICA
Equação geral
RESOLUÇÃO
CROMATOGRÁFICA
Otimização de Separações
DETECTORES
Definições Gerais
Dispositivosque geram um sinal elétrico
proporcional à quantidade eluída de um analito
~60 detectores já usados em CG
~15 equipam cromatógrafos comerciais
4 respondem pela maior parte das aplicações
Detector por Condutividade Térmica DCT
Detector por Ionização em Chama DIC
Detector por Captura de Elétrons DCE
Detector Espectrométrico de Massas EM
DETECTORES
Parâmetros Básicos de Desempenho
Quantidade Mínima Detectável
Massa de um analito que gera um pico com
altura igual a três vezes o nível de ruído
DETECTORES
Parâmetros Básicos de Desempenho
Limite de Detecção
Quantidade de analito que gera um pico com
S/N=3 e wb=1 unidade de tempo
DETECTORES
Parâmetros Básicos de Desempenho
Velocidade de Resposta
Tempo decorrido entre a entrada do analito na
cela do detector e a geração do sinal elétrico
DETECTORES
Parâmetros Básicos de Desempenho
Sensibilidade
Relação entre o incremento de área do pico e o
incremento de massa do analito.
DETECTORES
Parâmetros Básicos de Desempenho
Faixa Linear Dinâmica
Intervalo de massas dentro do qual a resposta
do detector é linear
DETECTORES
CLASSIFICAÇÃO
DETECTORES
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE
TÉRMICA
Princípio:
Variação na condutividade
térmica do gás quando da eluição de um
analito
DETECTORES
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE
TÉRMICA
SELETIVIDADE
SENSIBILIDADE/ LINEARIDADE
VAZÃO DO GÁS DE
ARRASTE
DETECTORES
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE
TÉRMICA
Configuração tradicional do DCT: bloco metálico com
quatro celas interligadas em par – por duas passa o
efluente da coluna e por duas, o gás de arraste puro
DETECTORES
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE
TÉRMICA
Quando da eluição de um composto com condutividade
térmica menor que a do gás de arraste puro:
DETECTORES
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE
TÉRMICA
Os filamentos do DCT são montados numa ponte de
Wheatstone que transforma a diferença de resistência
quando da eluição de amostra numa diferença de voltagem:
DETECTORES
CARACTERÍSTICAS OPERACIONAIS DO DCT
SELETIVIDADE: Observa-se sinal para qualquer substância
eluída diferente do gás de arraste = UNIVERSAL
SENSIBILIDADE/LINEARIDADE: Dependendo da
configuração particular e do analito: QMD=0,4 ng a 1 ng
com linearidade de 104 (ng = dezenas de g)
VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE: O sinal é proporcional à
concentração do analito no gás de arraste que passa pela
cela de amostra
DETECTORES
Características
Operacionais do DCT
Natureza do Gás de Arraste:
Quanto maior a diferença de
Δ entre a condutividade
térmica do gás de arraste
puro, A, e do analito X,
MAIOR A RESPOSTA.
Δ = A - X
Como ≈ 1/M
(M=massa molecular)
QUANTO MENOR A MASSA
MOLECULAR DO GÁS DE
ARRASTE, MAIOR A
RESPOSTA
DETECTORES
Características Operacionais
do DCT
FATORES DE RESPOSTA:
Quanto menor a
condutividade térmica do
analito, maior o sinal
Os fatores de resposta
dependem da
condutividade térmica do
analito
Quantidades iguais de
substâncias diferentes
geram picos
cromatográficos com
áreas diferentes!!!
DETECTORES
Características Operacionais do DCT
TEMPERATURAS DE OPERAÇÃO: Quanto
maior a diferença entre a temperatura dos
filamentos e do bloco metálico maior a
resposta.
DETECTORES
APLICAÇÕES
Separação e
quantificação de
compostos que não
geram sinal em outros
detectores (gases
nobres, gases fixos)
Por ser um detector
NÃO-DESTRUTIVO, pode
ser usado em CG
preparativa ou detecção
seqüencial com dois
detectores em “tandem”.
DETECTORES
CONDUTIVIDADE TÉRMICA DE ALGUNS GASES
DETECTORES
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM
CHAMA
PRINCÍPIO: Formação de íons quando um
composto é queimado em uma chama de
hidrogênio e oxigênio.
DETECTORES
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM
CHAMA
DETECTORES
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA
Região de quebra: Mistura dos gases, pré-
aquecimento, início da quebra das moléculas de
H2, O2 e outros analitos
Zona de reação: Reações exotérmicas com
produção e/ou consumo de radicais H, O, OH, HO2
(provenientes do H2), CH e C2 (proveniente do
analito) e íons CHO+ (analito)
Zona de incandescência: Emissão de luz por
decaimento de espécies excitadas: OH (luz UV),
CH e C2 (visível)
DETECTORES
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM
CHAMA
DETECTORES
Características
Operacionais do DIC
SELETIVIDADE: Seletivo
para substâncias que
contém ligações C-H em
sua estrutura química
Como virtualmente todas as
substâncias analisáveis por CG
são orgânicas, na PRÁTICA o
DIC é UNIVERSAL)
DETECTORES
Características Operacionais do DIC
SENSIBILIDADE/LINEARIDADE: QMD típicas = 10
pg a 100 pg com linearidade entre 107 e 108 (pg a
mg)
VAZÕES DE GASES: Além do gás de arraste, as
vazões de alimentação de ar (comburente) e
hidrogênio (combustível) devem ser otimizadas.
DETECTORES
Características Operacionais do DIC
TEMPERATURA DE OPERAÇÃO: O efeito
da temperatura sobre o sinal do DIC é
negligenciável.
TRATAMENTO DO SINAL: Por causa da
baixa magnitude da corrente elétrica
gerada (pA a nA), ela deve ser amplificada
para poder ser registrada.
DETECTORES
Características Operacionais do DIC
FATORES DE RESPOSTA: O fator de resposta de um
determinado composto é aproximadamente proporcional ao
número de átomos de carbono. Presença de
heteroelementos diminui o fator de resposta.
DETECTORES
DETECTOR DE NITROGÊNIO-
FÓSFORO
Modificação
do DIC altamente seletiva
para compostos orgânicos nitrogenados e
fosforados
DETECTORES
DETECTORES POR CAPTURA DE
ELÉTRONS
PRINCÍPIO: Supressão de um fluxo de elétrons lentos
(termais) causada pela sua absorção por espécies
eletrofílicas
DETECTORES
DETECTOR POR CAPTURA DE
ELÉTRONS
MECANISMO DE CAPTURA DE ELÉTRONS
DETECTORES
Características Operacionais do DCE
FONTE RADIOATIVA: O ânodo deve estar
dopado com um isótopo radioativo β ou α
emissor
DETECTORES
Características Operacionais do DCE
Polarização dos eletrodos: Vários modos de polarização
possíveis
VOLTAGEM CONSTANTE: Pouco usada modernamente
picos cromatográficos podem ser deformados
VOLTAGEM PULSADA: Menos anomalias elétricas
maior sensibilidade e linearidade
Temperatura do detector: Dependência do sinal com
temperatura de operação bastante significativa
Variação de ± 3 ºC na temperatura Erro ~10% na área dos
picos
Magnitude e sinal do erro depende do composto analisado!
TEMPERATURA DO DCE DEVE SER RIGOROSAMENTE
CONTROLADA
DETECTORES
Características Operacionais do DCE
GÁS DE ARRASTE: Funcionamento do
DCE é muito dependente da natureza do
gás de arraste
DETECTORES
Características Operacionais do DCE
SENSIBILIDADE/LINEARIDADE:
QMD=0,01 pg a 1 pg (organoclorados),
linearidade ~104 (pg a ng)
DETECTORES
Características Operacionais do DCE
SELETIVIDADE/FATORES DE RESPOSTA
Valores de S maximizados para compostos eletrofílicos
DETECTORES
Detector de Captura
de Elétrons
APLICAÇÃO
DETECTORES
CROMATOGRAFIA GASOSA
Colunas empacotadas
CROMATOGRAFIA GASOSA
CROMATOGRAFIA GASOSA
COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
Coluna
Empacotada
VANTAGENS
Simples preparação e uso
Tecnologia clássica
Grande número de fases líquidas
Capacidade alta e longa durabilidade
Usada para análise de gases com DCT
DESVANTAGENS
Número de pratos limitado
Exige controle da vazão da fase móvel
Análises relativamente demoradas
Baixa resolução para amostras complexas
CROMATOGRAFIA GASOSA
Temperatura da Coluna
Além da interação da FE, o tempo que um
analito demora para percorrer a coluna
depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0)
CROMATOGRAFIA GASOSA
Temperatura da Coluna
CONTROLE CONFIÁVEL
DA TEMPERATURA DA
COLUNA É ESSENCIAL
PARA OBTER BOA
SEPARAÇÃO EM CG
CROMATOGRAFIA GASOSA
FORNO DA COLUNA
Características desejáveis de um forno:
Ampla faixa de temperatura de uso: Pelo
menos de Tamb até 400 ºC. Sistemas criogênicos
(T < Tamb) podem ser necessários em casos
especiais
Temperatura independente dos demais
módulos: Não deve ser afetado pela
temperatura do injetor e detector
Temperatura uniforme em seu interior:
Sistemas de ventilação interna muito eficientes
para manter a temperatura homogênea em
todo forno
CROMATOGRAFIA GASOSA
FORNO DA COLUNA
Características desejáveis de um forno:
Fácil acesso à coluna: A operação de troca de
coluna pode ser freqüente
Aquecimento e resfriamento rápido: Importante
tanto em análises de rotina e durante o
desenvolvimento de metodologias analíticas
novas
Temperatura estável e reprodutível: A
temperatura deve ser mantida com precisão e
exatidão de ± 0,1 ºC
EM CROMATÓGRAFOS MODERNOS (DEPOIS DE 1980)
O CONTROLE DE TEMPERATURA DO FORNO É
TOTALMENTE OPERADO POR
MICROCOMPUTADORES
CROMATOGRAFIA GASOSA
Programação Linear de Temperatura
Misturas complexas (constituintes com
volatilidades muito diferentes) separadas
ISOTERMICAMENTE:
CROMATOGRAFIA GASOSA
Programação Linear de Temperatura
A temperatura do forno pode ser variada
linearmente durante a separação:
CROMATOGRAFIA GASOSA
Programação Linear de Temperatura
POSSÍVEIS PROBLEMAS
ASSOCIADOS À PLT
CROMATOGRAFIA GASOSA
DETECTORES: Dispositivos que
examinam continuamente o material eluído,
gerando sinal quando da passagem de
substâncias que não o gás de arraste
CROMATOGRAFIA GASOSA
DETECTORES MAIS IMPORTANTES:
Detector por condutividade térmica (DCT ou
TCD): Variação da condutividade térmica do gás
de arraste
Detector por Ionização de Chama (DIC ou FID):
Íons gerados durante a queima dos eluatos em
uma chama de H2 + ar
Detector por Captura de Elétrons (DCE ou ECD):
Supressão de corrente causada pela absorção de
elétrons por eluatos altamente eletrofílicos
CROMATOGRAFIA GASOSA
FASES ESTACIONÁRIAS
CROMATOGRAFIA GASOSA
Características de uma FE ideal
SELETIVA: Deve interagir diferencialmente
com os componentes da amostra