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Introdução a técnicas

cromatográficas
CROMATOGRAFIA = método de
separação no qual os constituintes de
uma amostra a serem separados são
distribuídos entre 2 fases:

 Estacionária: geralmente de grande


área, sólida ou líquida
 Móvel: um fluido que percola através
da fase estacionária
 1903 - TSWETT, botânico russo:
separação e isolamento de pigmentos de plantas em
colunas de sílica gel (cromatografia = color writing)

éter de
petróleo
mistura de
pigmentos

CaCO3 pigmentos
separados

Cromatografia =
kroma [cor] + graph [escrever]
(grego)
 Décadas de 30 – 40 MARTIN & SYNGE:
cromatografia partição
 Década de 50:
TLC e GC
 Década de 60:
cromatografia permeação em gel
 Décadas de 70 e 80:
HPLC moderna
 Cromatograma
É o resultado da cromatografia.
 Cromatógrafo
É o equipamento através do qual se faz a
cromatografia.
 Tempo de retenção
É o tempo que um analito fica em contato com a fase
estacionária
Fase Estacionária: Sílica (polar)
Fase Móvel: Hexano (apolar)

Frente do solvente

Nível do solvente
Amostra

Fase estacionária Detetor


Fase móvel
FASE MÓVEL:
 Líquido ⇒ Cromatografia Líquida (CL) 
HPLC

 Gás ⇒ Cromatografia Gasosa (CG)  CGAR

 Gás em condições supercríticas ⇒ SFC


(Cromatografia a fluido supercrítico)
Fluxo por gravidade
Cromatografia
Clássica Tempo Volume de Massa
(min) FM (ml) residual
(mg)
0 0 0
5 10 0
10 20 23
C 15 30 61
B 20 40 36
25 50 88
30 60 40
A
FE = CaCO3 35 70 4
40 80 0
FM = Éter de Petróleo
45 90 11
50 100 20
55 110 10
60 120 3
Cromatografia Clássica
Cromatograma

120

100
Massa residual (mg)

80

60

40

20

0
0 10 20 30 40 50 60 70
Tempo (min)
Separação dos componentes da amostra
CROMATOGRAFIA

CFS CL CG
Cromatografia a Cromatografia a Cromatografia a
Fluido Supercrítico Líquido Gás

CL CL
Planar Coluna

CCD Coluna "Open


Cromatografia Coluna
Cromatografia Tubular" Capilar
Papel Empacotada
Camada Delgada dc < 350 um

Coluna Capilar Coluna Coluna Coluna


empacotada Microbore "Analítica" Preparativa
dc <= 350 um 350 um < dc < 1 mm 1 mm < dc < 8 mm dc >= 8 mm

FONTE: LOUGH & WAINER, 1997.


Analitos
Técnica
Pré-requisito Interação
GC Voláteis e termicamente Fase estacionária
estáveis (nas condições de
operação)
HPLC Solúveis na fase móvel Fase estacionária e
fase móvel

Sensível a diversas amostras, incluindo


orgânicas, biomoléculas e íons - Pode-se analisar
um universo de substâncias significativamente
maior do que por GC
 Cromatografia de adsorção (sólido-líquido)
 Cromatografia de partição (líquido-líquido)
 Cromatografia de troca iônica
 Cromatografia por exclusão de tamanho
Ligação Iônica = transferência de elétrons
-
Na Cl Na+ Cl
cátion ânion

íons

Ligação Covalente = compartilhamento de um par de


 APOLAR: elétrons entre 2 átomos

H H F F O O
H H F F O O
 POLAR:
δ + δ - δ - δ + δ - δ +
H Cl O H N H
Descrição dos grupos de EXEMPLOS
substâncias
Apolares Hidrocarbonetos, lipídeos,
polímeros plásticos...

Polares Ésteres, cetonas, aldeídos,


álcoois, amidas, aminas,
heterocíclicos...
Iônicos Sais, ácidos, bases...
Isômeros Isômeros estruturais,
geométricos e óticos.
Biopolímeros Proteínas, enzimas,
polissacarídeos...
 ADSORÇÃO = tendência de acúmulo de uma
substância sobre a superfície de outra, quando 2
fases imiscíveis são colocadas em contato

FASE MÓVEL

 FASE ESTACIONÁRIA
(sólida)
 QUÍMICA = formação de ligações químicas
 FÍSICA = envolve interações como pontes de
hidrogênio, dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido,
etc

* ↑ temperatura : adsorção física ⇒ adsorção


química
 Sólida
 Apresenta na superfície cargas iônicas
ou polares.

Exemplos:
• Sílica gel
• Alumina
• Florisil
• Carvão
• Carbonato de cálcio
polar

Fluxo
apolar
 Separação de misturas em classes de
compostos de diferentes polaridades

Grupo funcional Estrutura


Metil -CH3 P
Fluoro -F O
Cloro -Cl L
Nitro -NO2 A
Aldeído -CHO R
Acetil -O-COCH3 I
D
Hidroxi -OH A
Ceto -CO- D
Amino -NH2 E
Carbonila -COOH
Fluorocarbonos
Hidrocarbonetos saturados
Olefinas
Hidrocarbonetos aromáticos Lista em
Compostos halogenados ordem
Éteres crescente
de tempo
Nitrocompostos
de
Ésteres ~ Cetonas ~ retenção
Aldeídos
Álcoois ~ Aminas
Amidas
 PARTIÇÃO = distribuição de uma substância entre 2 fases
heterogêneas fluidas, imiscíveis entre si. Por exemplo: um gás e
um líquido, ou 2 líquidos imiscíveis
FASE ESTACIONÁRIA
 Fina camada de líquido que cobre as
partículas de um suporte sólido
 Este líquido pode ser:
• polar: polietilenoglicol, ODPN (β , β ´-
oxidipropionitrila)
• apolar: hexano

FASE MÓVEL
 Sempre de polaridade contrária
 Alta estabilidade
FASE ESTACIONÁRIA
 Líquido é quimicamente ligado ao suporte
sólido.

FASE MÓVEL
 Sempre de polaridade contrária
 Alta estabilidade
GRUPO ESTRUTURA DO
MODO
FUNCIONAL GRUPO LIGADO

CH3
Dimetil silil Si
CH3

Octil silil Si CH2 (CH2)6 CH3


FASE
REVERSA
Octadecil silil Si CH2 (CH2)16 CH3

Fenil silil Si
MODO GRUPO ESTRUTURA DO
FUNCIONAL GRUPO LIGADO

Amino NH2

Ciano (nitrila) CN
FASE
NORMAL
Si O CH2 CH CH2OH

Diol O OH

Si O CH2 CH CH2OH

O OH
1. Si – OH + ROH Si – OR + H2O
2. Si – OH + R3SiCl Si – OSiR3 + HCl
3. Si – OH + SOCl2 Si – Cl + SO2
4. Si – Cl + RLi Si –R + LiCl
apolar

Fluxo
polar
polar
 Hidrocarbonetos aromáticos,
óleos, esteróides, plásticos,
polímeros, alcalóides (C18)
 Ácidosurinários, ácidos
carboxílicos, sulfonamidas,
hormônios tireóide,
azocorantes (C8)
Classificação baseada na Natureza das
Fases
 NPC
 Fase móvel Apolar ⇒ hexano, isooctano
 Fase estacionária Polar ⇒ sílica, alumina
 RPC
 Fase móvel Polar ⇒ acetonitrila, metanol,
água
 Fase estacionária Apolar ⇒ C8, C18
GERALMENTE:

 NPC ⇒ Cromatografia Adsorção

 RPC ⇒ Cromatografia Partição


 FASE ESTACIONÁRIA = grupos iônicos quimicamente
ligados a um suporte (sílica ou polímeros de alto PM).
Pode ser:
 trocadora de cátions: grupo iônico = sulfonato
 trocadora de ânions: grupo iônico = amônia quaternária

 FASE MÓVEL = soluções tampão (controle pH). Por


exemplo: ácido cítrico, fosfato de amônia, acetato de
sódio, borato de sódio, etc.
 APLICAÇÕES = compostos iônicos, aminoácidos,
proteínas, peptídeos, etc
-
SO Na +
3
Suporte
Polimérico
ou de Sílica pH

Fluxo
+
SO 3 Na
 A separação é baseada no tamanho da molécula e
não em fenômenos de interações físicas ou
químicas

 FASE ESTACIONÁRIA = partículas com diâmetro


médio de poro fabricado sob medida. Assim,
algumas moléculas (menores) podem entrar nos
poros pequenos, outras nos poros médios, ou seja,
são permeadas seletivamente. As moléculas
grandes são excluídas → exclusão por tamanho.
FLUXO

Gel

Poro
 Originalmente:
 separação de materiais biológicos
 fase móvel = aquosa
FILTRAÇÃO
 fase estacionária = gel de
EM
dextran/epicloridrina GEL

 Posteriormente:
 separação de polímeros

 fase móvel = solventes


PERMEAÇÃO
orgânicos EM
 fase estacionária = polímero GEL
tipo poliestireno
 Controlequalidade de
polímeros de alto PM
(assegurar propriedades
físicas)

 Separação polímeros de baixo


PM (poliestireno, ftalatos)
 Tempo de retenção (tr)
 Largura do pico (wb)
 Fator de Capacidade (k´)
 Seletividade (α )

 Resolução (Rs)

 Fator de Simetria
Formato Ideal do Pico (Gaussiana)

Distribuição estatística das moléculas


A difusão pode causar
alargamento do pico
cromatográfico
O Cromatograma
Rs = 2 ( tr2 – tr1 ) / wb2 + wb1

Rs = separação real dos picos


Rs = 0 (sem separação),
Rs = 0,75 (separação ruim),
Rs = 1,00 (separação parcial),
Rs = 1,25 (separação da linha base).
A/B
Ideal = 1
Rs
Cromatografia gasosa de alta
resolução
 Substâncias que podem ser “arrastadas” por um
fluxo de um gás;
 Misturas cujos constituintes sejam voláteis;
 De forma geral, CG é aplicável para separação
e análise de misturas cujos constituintes tenham
PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e sejam
termicamente estáveis.
2 6
1
3
4
5

1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão.


2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra.
3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna.
4 - Detector.
5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal.
6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador).
1. Temperatura do forno
2. Vazão do gás de arraste
3. Escolha da fase estacionária
4. Temperatura de injeção e do
detector
A Fase Móvel em CG não interage com a
amostra; ela apenas a carrega através da
coluna. Assim é usualmente referida
como GÁS DE ARRASTE;
Requisitos:
• INERTE Não deve reagir com a amostra, fase
estacionária ou superfícies do instrumento;
• PURO Deve ser isento de impurezas que possam
degradar a fase estacionária.
1
2
3
4

1 - Septo (silicone)
2 - Alimentação de
gás de arraste)
 TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser
suficientemente elevada para que a amostra
vaporize-se imediatamente, mas sem
decomposição;
 Regra Geral: Tinj = 50oC acima da
temperatura de ebulição do componente
menos volátil;
 VOLUME INJETADO Depende do tipo de
coluna e do estado físico da amostra. Típico:
poucos microlitros (amostra líquida em coluna
capilar)
Microsseringa de 10 µ L:

êmbolo agulha (inox 316)

corpo (pirex)
Coluna

EMPACOTADA CAPILAR
(pouco usada) ∅ = 0,1 a 0,5 mm
∅ = 3 a 6 mm L = 5 m a 100 m
L = 0,5 m a 5 m Paredes internas recobertas
LÍQUIDOS Depositados sobre a superfície de: só-lidos
porosos inertes (colunas empacotadas) ou de tubos finos de
materiais inertes (colunas capilares)
FE
líquida
SUPORTE Tubo capilar de
Sólido inerte material inerte
poroso
Para minimizar a perda de FE líquida por volatilização,
normalmente ela é:

Entrecruzada: as Quimicamente ligadas: as


cadeias poliméricas cadeias poliméricas são
são quimicamente “presas” ao suporte por
ligadas entre si ligações químicas
SÓLIDOS Colunas recheadas com material finamente
granulado (empacotadas) ou depositado sobre a superfície
 AMPLA FAIXA DE TEMPERATURAS DE USO Maior
flexibilidade na otimização da separação;
 BOA ESTABILIDADE QUÍMICA E TÉRMICA Maior
durabilidade da coluna, não reage com componentes
da amostra;
 POUCO VISCOSA Colunas mais eficientes (menor
resistência à transferência do analito entre fases);
 DISPONÍVEL EM ELEVADO GRAU DE PUREZA Colunas
reprodutíveis; ausência de picos “fantasma” nos
cromatogramas.
Coluna
Além da interação com a FE, o tempo que
um analito demora para percorrer a coluna
Estrutura
depende de sua PRESSÃO DE VAPOR
p0 = f 0 química
(pTemperatur
).
do analito
a
da coluna
Temperatura Pressão Velocidade
da de de
coluna vapor migração

ANALITO ELUI MAIS


RAPIDAMENTE (MENOR
FE Sólidas: Adsorção
O fenômemo físico-químico responsável pela
interação analito + FE sólida é a ADSORÇÃO

A adsorção ocorre na interface entre o gás de arraste


e a FE sólida
Sólidos com grandes áreas
superficiais (partículas
finas, poros)

ADSORÇÃO Solutos polares

Sólidos com grande número


de sítios ativos (hidroxilas,
pares de eletrons...)
Características
- Sólidos finamente granulados (diâmetros de par-
Gerais:
tículas típicos de 105 µm a 420 µm).
- Grandes áreas superficiais (até 102 m2/g).
Mais
Polímeros Porosos Porapak (copolímero estireno-divi-
usados:
nilbenzeno), Tenax (polióxido de difenileno)
Sólidos Inorgânicos Carboplot, Carboxen (carvões ativos
grafitizados), Alumina, Peneira Molecular (argila microporosa)

- Separação de gases fixos


Principais Aplicações: - Compostos leves
- Séries homólogas

GASES DE REFINARIA
Coluna:Carboxen-1000 60-80
mesh; 15’ x 1/8”
TCOL : 35oC a 225oC / 20oC. min-1
Gás de Arraste: He @ 30 ml.min-1
Detector: TCD
FE Líquidas: Partição
POLIGLICÓIS Muito polares; sensíveis a
umidade e oxidação; ainda muito importantes.
Principal: Polietilenoglicol (nomes comerciais:
Carbowax,
Estrutura DB-Wax,
Química: Supelcowax,
H HP-Wax,
O CH 2 CH2 etc.)
OH

AMINAS ALIFÁTICAS
Coluna:4 % Carbowax
20M s/ Carbopack B +
0,8% KOH
TCOL : 200oC
(isotérmico) Gás de
Arraste: N2 @ 20
mL.min-1
Detector: FID
Amostra: 0,01
µ L da mistura de
aminas
Maior parte das aplicações em CG moderna
Quatro grandes grupos estruturais:

PARAFINAS Apolares; alta inércia química;


praticamente abandonadas. Principais: esqua-lano
(C30 H62 ), Apiezon (graxas para vácuo).

POLIÉSTERES Ésteres de diálcoois com di-


ácidos. Polares; altamente sensíveis a umidade e
oxidação; uso em declínio. Principais: DEGS, EGA,
EGS.
ÉSTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS
GRAXOS
Coluna:5%DEGS-PS s/ Supel-coport
100/120 mesh; 6’ x 1/8”
TCOL : 200oC (isotérmico)
Gás de Arraste: N2 @ 20 ml.min-1
Detector: FID
Amostra: 0,5 µ L de solução em
clorofórmio contendo 0,5 µ g de cada
O fenômemo físico-químico responsável pela
interação analito + FE líquida é a Partição

A partição ocorre no interior do filme de FE líquida

Filmes espessos de FE
líquida
Grande superfície líquida
ABSORÇÃO exposta ao gás de arraste

Interação forte entre a FE


líquida e o analito (grande
solubilidade)
SILICONES (polisiloxanas) As FE mais
empregadas em CG. Cobrem ampla faixa de pola-
ridades e propriedades químicas diversas.
CH3 R1 CH3
H3C Si O Si O Si CH3
CH3 R2 CH3
R1, R2 = qualquer
n
radical orgânico
- Ligação Si-O extremamente estável = elevada estabilidade
térmica e química das FE.

- Silicones são fabricados em larga escala para diversas


aplicações = minimização de custo do produto + tecnologia
de produção e purificação largamente estudada e conhecida.

- Praticamente qualquer radical orgânico ou inorgânico pode


ser ligado à cadeia polimérica = FE “ajustáveis” a separações
específicas + facilidade de imobilização por entrecruzamento
FE derivadas de polidimetilsiloxano (PDMS) por substituição
de -CH3 por radicais orgânicos, em ordem crescente
aproximada de polaridade:

Su

Diferenças entre FE de composição similar


provenientes de fornecedores diferentes:
Separação de pesticidas - FE = 100 % PDMS
1 - TCNB
2 - Dichloram
3 - Lindano
4 - PCNB
5 - Pentacloroanilina
6 - Ronilano
7 - Antor
8 - pp’-DDE
9 - Rovral
10 - Cypermetrin
11 - Decametrin

17 min

Coluna: CP-Sil 5 (25 m x 0,32 mm x 0,12 µ m)


TCOL :195 C (6,5 min) / 195 C a 275 C (10 C.min )
o o o o -1

Gás de Arraste: He @ 35 cm.min-1 Detector: FID


Separação de piridinas - FE = 100 % CNpropilsilicone
1 - piridina
2 - 2-metilpiridina
3 - 2,6-dimetilpiridina
4 - 2-etilpiridina
5 - 3-metilpiridina
6 - 4-metilpiridina

3 min
Coluna: CP-Sil 43CB (10 m x 0,10 mm x 0,2 µ
m)
TCOL :110 C (isotérmico)
o

Gás de Arraste: N2 @ 16 cm.min-1 Detector: FID


Amostra: 0,1 µ L de solução 1-2% das piridinas em 3-
Separação de fenóis - FE = fenilmetilsilicones

50%
Ph
50%
Me
5% Ph
95%
Me
Colunas empacotadas
Tubo de material inerte recheado com FE sólida granulada
ou FE líquida depositada sobre suporte sólido.
aço inox
MATERIAL vidro pirex ø = 3 mm a 6 mm
DO níquel L = 0,5 m a 5 m
TUBO TEFLON

MESH dp
60 - 80 mesh 177 - 250 µ m
Granulometria
do 80 - 100 mesh 149 - 177 µ m
recheio 100 - 120 mesh 125 - 149 µ m

Eficiência maximizada com:


- Diminuição de dC Limitados pela resistência à
passagem de gás de arraste
- Diminuição de dp
- Recheio regular
Colunas empacotadas
área superficial entre 0,5 e 10 m2.g-1
A FE líquida deve ser microporos regulares (~ 1 µ m)
disposta sobre um NÃO interagir com a amostra
SUPORTE sólido boa resistência mecânica

Uso quase universal: TERRA DIATOMÁCEA

secagem
calcinação
Esqueletos fósseis fusão com soda
(SiO2 + óxidos lavagem com ácido
Chromosorb
silanização
metálicos) de algas Anachrom
microscópicas Supelcoport
...
COLUNAS EMPACOTADAS
FE Líquidas: Suporte
Chromosorb - características gerais

Densidade Aparente
Chromosorb P Róseo, muito ativo.

Tamanho de Poro
Chromosorb W Branco, mais inerte que o P.

Área Superficial
Chromosorb G Similar ao W, maior resistência mecânica

% M áx. de FE
de inércia
crescente
Ordem

2 -1 -1
NOME m .g g.ml µm

ChromosorbP 4,0 0,47 0,4- 2 30


ChromosorbW 1,0 0,24 8- 9 15
ChromosorbG 0,5 0,58 - 5
Tratamentos especiais:
AW Lavado com ácido, para remoção de metais
NAW Sem lavagem com ácido
HP ou DMCS ou HDMS Silanizados (menor adsorção)
Colunas capilares
Tubo fino de material inerte com FE líquida ou sólida
depositada sobre as paredes internas.

sílica fundida ø = 0,1 mm


MATERIAL vidro pirex
aço inox a 0,5 mm
DO Nylon L=5m
TUBO Silcosteel a 100 m

Colunas de sílica são revestidas externamente com camada de polímero


(poliimida) para aumentar resistência mecânica e química

Colunas Capilares x Empacotadas:


CAPILARE

 L =  N Colunas mais eficientes


 Vi Dispositivos especiais de injeção
S
Separação de PAH com LVI (Vinj = 25 µ L, solução 400 ppb
em CH2Cl2)

Coluna: HP-5 (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm)


TCOL : 5 min a 50°C / 20°C min-1 / 2 min A 320°C
Gás de Arraste: He @ 2 ml.min-1 Detector: FID
Temperatura de coluna

A DA COLUNA
TEMPERATUR
CONTROLE CONFIÁVEL DA
TEMPERATURA DA COLUNA É
Forno da coluna
Características Desejáveis de um
•AMPLA
Forno: FAIXA DE TEMPERATURA
DE USO Pelo menos de Tambiente até
400oC. Sistemas criogênicos (T <
Tambiente ) podem ser necessários em
casos especiais.
•TEMPERATURA INDEPENDENTE
DOS DEMAIS MÓDULOS Não deve
ser afetado pela temperatura do
TCOL BAIXA:
- Componentes mais voláteis são
separados
- Componentes menos volá-teis
demoram a eluir, saindo como
picos mal definidos

TCOL ALTA:
- Componentes mais voláteis
não são separados
- Componentes menos voláteis
eluem mais rapidamente
Programação linear de
Temperatura de coluna

Consegue-se boa
separação dos
componentes da
amostra em
menor
Parâmetros de uma programação de tempo
temperatura:

TINI Temperatura Inicial TEMPERAT


TFIM
TFIM Temperatura Final R
tINI Tempo Isotérmico Inicial
URA

TINI
tFIM Tempo Final do Programa
tINI tFIM
R Velocidade de Aquecimento TEMPO
Detectores
Dispositivos que examinam
continuamente o material que sai da
coluna, gerando sinal quando da
passagem de substâncias que não o gás
de arraste

Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA


dealmente: cada substância separada aparece
Desempenho de detectores
QUANTIDADE MÍNIMA DETECTÁVEL
Massa de um analito que gera um pico com altura igual a
três vezes o nível de ruído
=
S
N 3
SINA
L (S)

RUÍDO (N)

RUÍDO Qualquer componente do sinal gerado pelo detector


que não se origina da amostra

Fontes Contaminantes nos gases


de Impurezas acumuladas no detector
Ruído Aterramento elétrico deficiente
 DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT
OU TCD): Variação da condutividade térmica
do gás de arraste.
 DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU
FID) Íons gerados durante a queima dos
eluatos em uma chama de H2 + ar.
 DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE
OU ECD) Supressão de corrente causada pela
absorção de elétrons por eluatos altamente
eletrofílicos.
DCT
PRINCÍPIO: Variação na condutividade térmica do gás
quando da eluição de um analito.
A taxa de transferência de calor entre um corpo
quente e um corpo frio depende da condutividade
térmica do gás no espaço que separa os corpos

Se a condutividade térmica do gás diminui, a


quantidade de calor transferido também diminui - o
corpo quente se aquece.
Cela de Detecção do DCT:

i 1 Bloco metálico (aço)


2 Entrada de gás de arraste
5 3 Saída de gás de arraste
3
4 Filamento metálico (liga W-Re)
4 aquecido

2 1 5 Alimentação de corrente elétrica


para aquecimento do filamento
DIC
PRINCÍPIO Formação de íons quando um composto é
queimado em uma chama de hidrogênio e oxigênio

O efluente da coluna é misturado


com H2 e O2 e queimado. Como
numa chama de H2 + O2 não
existem íons, ela não conduz
corrente elétrica.

Quando um composto orgânico


elui, ele também é queimado.
Como na sua queima são
formados íons, a chama passa a
conduzir corrente elétrica
COLETOR

AR
FLAME TIP

H2

BLOCO

COLUNA
Uma diferença de potencial elétrico é
O ar e o H2 difundem para o interior
aplicada entre o flame tip e o coletor
do coletor, onde se misturam ao
- quando se formam íons na chama,
efluente da coluna e queimam:
flui uma corrente elétrica:
Compostos que NÃO produzem resposta no DIC:
Gases nobres NH3, NxOy

H2, O2, N2 SiX4 (X = halogênio)

CO, CO2, CS2 H2 O

CCl4, peralogenados HCOOH, HCHO *


Captura de elétrons
PRINCÍPIO Supressão de um fluxo de eletrons lentos
(termais) causada pela sua absorção por espécies
eletrofílicas Um fluxo contínuo de
eletrons lentos é
estabelecido entre um anôdo
(fonte radioativa
β -emissora) e um catodo.

Na passagem de uma
substância eletrofílica alguns
eletrons são absorvidos,
resultando uma supressão
de corrente elétrica.
2 1

1 Anodo (fonte radioativa β - emissora)

2 Saída de gases 3 Catodo

4 Cavidade 5 Coluna cromatográfica


HPLC

CLAE
Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência
HPLC Moderna Reservatórios para
Injetor os solventes

Pré-coluna

Bomba HPLC

Coluna Analítica

Sistema de Tratamento
Detector
de Dados
Filtro em linha Scavenger
 Velocidade fluxo
 0,1-3,0 mL/mim para colunas analíticas
 > 5,0 mL/min para colunas preparativas

 Pressão operação
 500-2000 psi para colunas analíticas
Entrada

Filtros

Tubo

Recheio

Filtro

Saída
Serve para proteger a coluna de
separação.
Fase e diâmetro iguais aos da coluna
de separação.
10-20% do comprimento da coluna de
separação
 ISOCRÁTICA = a composição da fase
móvel não muda durante a corrida.

GRADIENTE = a composição da fase


móvel varia durante a análise, de
acordo com a natureza dos analitos.
Passo Solve

1 30
Solvatante Baixa pressão de vapor

Baixa Viscosidade Atóxico

Transparência no UV Não corrosivo

Não Fluorescência Não inflamável


Baixo Custo
 Agitação mecânica ou magnética
Aquecimento

Banho de ultrassom
Filtração a vácuo
Borbulhamento de gás inerte
Solvente de base
Força de
Água / tampão eluição

Solventes moduladores
Metanol
Acetonitrila
THF
Solvente de base
Força de
eluição
n-hexano
Solventes moduladores
Clorofórmio
Acetato de etila
Metanol
 Equipamento com uma pequena célula de
fluxo conectado na saída da coluna e que
monitora a concentração dos analitos.

 Detectores mais comuns:


• UV/Vis (absorvância)
• Índice de Refração
• Espectrômetro de Massas
• Fluorescência
• Outros: Eletroquímico, Condutividade,
Infravermelho, etc.
 PRINCÍPIO: quando vários grupos funcionais são expostos
à radiação, sofrem excitação eletrônica a qual resulta na
absorção de energia em comprimentos de onda
específicos para os grupos.
 Comprimento de onda: 210-380 nm → UV
 Comprimento de onda: 380-800 nm → Visível
 ≈ 90% compostos orgânicos absorvem luz em alguma
região do UV-Vis
 ≈ 65% das amostras analisadas por CL absorvem luz na
região de comprimento de onda = 254 nm
Detector UV-VIS
 Detectam compostos
com fluorescência
natural (aflatoxinas)
ou que se tornam
fluorescentes após
reação de derivação
(cloreto dansyl,
fluoresceína, OPA)
 PRINCÍPIO: mede a mudança do índice de refração do
efluente da coluna
 IR : característica física de cada composto

 IR da substância analisada ≠ IR da fase móvel

 Análise isocrática, controle de temperatura

 Detector universal, não seletivo e pouco sensível

 Aplicações: separações preparativas, cromatografia de

exclusão por tamanho, açúcares, etc.


 SENSIBILIDADE
• Fluorescência: 1.000 vezes mais sensível que
UV-Vis
• UV-Vis: 1.000 vezes mais sensível que IR

 ESPECIFICIDADE
• Aumenta com a sensibilidade
 Amostra: 50 µ l,
quantidades
indicadas ao lado

 Coluna: SB-C18
4,6 x 75 mm
3,5 µ m
 Fase Móvel: 70 mM KH2PO4
1 mM
EDTA/ACN:água
97/3 pH 4,5;
 Fluxo: 1,5
ml/min;
 Temperatura: ambiente
 Detetor: Eletroquímico
Fluorescencia.
 Pode-se efetuar análises qualitativas
e quantitativas com rapidez

Tecnologia mais moderna

Pode-se fazer identificações de


substâncias de forma inequívoca
e- 70 eV A–B–C

e- <70 eV A – B – C+ . e- de baixa energia


.
A +
+B–C . A–B + C+

. .
A + B – C+ A – B+ + C

B+ + C B + C+ A+ + A + B+
B
 Partículasda fase estacionária
extremamente pequenas (diâmetro <
10 µ m) ⇒ bombas para operações a
altas pressões (até 2000 psi) e baixas
vazões (0,1 a 10 mL / min)
 Solventes especiais e ultra-puros
 Detectores seletivos e super-
sensíveis, com tamanho de célula de
detecção < 10 µ L
 Vantagens da HPLC:
 Alta resolução
 resolve (separa) até centenas de componentes
em amostras complexas
 Detecção de alta sensibilidade
 detecta até nos limites de pg - ng
 Análises rápidas e precisas
 análises de 1 - 60 min, precisão de 1% RSD
 Análises automatizadas
 usando injetor automático e sistema de
tratamento de dados
Substâncias químicas
• Pouco voláteis
• Polares ou iônica
• Macromoléculas
• Termicamente instáveis
• Enancioméricas
• Biomoléculas

Requisito: A mistura a ser analisada


deve ser solúvel na fase móvel.
Amostra

PM < 1.000

Insolúvel Solúvel
água água

Solúvel Solúvel
PM > 1.000 hexano metanol Não-iônica Iônica

Amostra Amostra
não-aquosa aquosa

NPC NPC RPC Cromatografia


RPC
(sílica) (fase ligada) "ion-pair" troca iônica

Biopolímeros
solúveis água

Condições
Polímeros Condições
desnaturantes
insolúveis água não-desnaturantes
(separação analítica)
Preparativa
Preparativa
Informação tamanho

Cromatografia Cromatografia Cromatografia


RPC
permeação gel filtração gel troca iônica
 Todos os cálculos são feitos a partir da
área de um pico, fornecida ao final da
corrida;
 Os compostos de interesse não podem
sofrer adsorção, decomposição térmica
ou decomposição catalítica no sistema
cromatográfico;
 Os padrões devem ter alta pureza;
 O pico de interesse deve corresponder a
somente uma substância, ou seja, não
deve ocorrer coeluição.
A quantidade de massa analisada
deve estar na faixa linear de resposta
do detector, do amplificador e do
sistema de integração;
Conhecimento máximo possível da
amostra (presença de substâncias
não detectáveis e /ou não eluídas);
Repetibilidade.
Do volume injetado;
Da concentração da substância;
Do fator de resposta de uma dada
substância em determinado detector.
 Considera que o fator de resposta é o
mesmo para todas as substâncias.
Assim, a composição percentual de um
composto A é dada por:

SA
%A = x100
S
Onde SA é a área do pico correspondente
à substância A e S é a área total do
cromatograma.
VANTAGENS DESVANTAGENS

 Simples e prática;  Não serve para amostras


 Independe do volume complexas;
injetado;
 Exige o registro de todos
os componentes da
 Independe da amostra;
estabilidade do aparelho;  Não é adequada para
 Não é necessária a análise de pequenas
utilização de padrões. concentrações;
 Normalmente a exatidão é
baixa;
 Presume que todos os
constituintes tem a mesma
resposta no detector.
Em uma análise do progresso da
reação A  B, retirou-se uma
alíquota do meio reacional e realizou-
se uma análise por CGAR, resultando
em um pico de área 3500 para o
composto A e 5000 para o composto
B. Qual o rendimento da reação?
Análoga à normalização interna, mas
leva em consideração os diferentes
fatores de resposta de cada
substância. Esses fatores são
determinados através da injeção de
padrões de concentração conhecida
de todos os constituintes da amostra.
 Uma amostra de duas substâncias, A e B foi
analisada cromatograficamente, obtendo-se
dois picos distintos, de áreas iguais a 200 e
400 respectivamente. A fim de se determinar
os fatores de resposta, foi injetada uma
amostra contendo a mesma concentração de
cada substância, resultando em áreas iguais
a 120 e 80. Qual a composição da amostra?
Análoga à utilizada em
espectrofotometria. Desta vez, tem-
se a curva de calibração em área x
concentração. Para facilitar os
cálculos, injeta-se sempre o mesmo
volume;
As condições do cromatógrafo devem
ser mantidas constantes.
VANTAGENS DESVANTAGENS

 É possível quantificar  Depende do volume


apenas um pico; injetado (evitável), que
 Independe da detecção carrega uma incerteza;
de todos os constituintes  Depende da estabilidade
da amostra (serve para do cromatógrafo e do
amostras mais detector durante todo o
complexas); análise.
 Possível análise de
concentrações pequenas
(traços).
 É muito difícil analisar amostras exatamente
nas mesmas condições dos padrões;
 Um padrão é injetado concomitantemente à
amostra de concentração desconhecida;
 Escolha do padrão interno:
• Não deve estar presente na amostra;
• Deve ter comportamento cromatográfico similar ao
da substância a ser analisada;
• Estar numa concentração conhecida;
• Ser termicamente estável;
• Não ficar adsorvido na fase estacionária;
• T.R. diferente dos constituintes da amostra.
 A curva de calibração tem a forma:
Sx CX
= f X / PI
S PI C PI
Onde Sx é a área do pico
correspondente à substância x; SPI é a
área do padrão interno; C as
concentrações e f o fator relativo.
 Preparam-se vários padrões com várias concentrações
conhecidas da substância a ser analisada;
 Adiciona-se uma quantidade conhecida do padrão interno, de
modo que as áreas (do padrão e do PI) sejam semelhantes;
 Constroi-se um gráfico em que o eixo X é a razão da
concentração (ou massa) da substância em análise pela
concentração (ou massa) do padrão interno e o eixo y é a
relação entre as áreas da substância X e do padrão interno;
 Para análise da amostra desconhecida introduz-se, de
preferência, a mesma quantidade de padrão interno utilizada
no preparo dos padrões;
 Injeta-se a mistura, calculam-se as áreas da substância e do PI
e as relações entre elas e interpola-se no gráfico obtido
anteriormente, de modo a se obter a relação de concentração.
E, a partir do resultado obtido, calcula-se a concentração de X
na amostra desconhecida.
VANTAGENS DESVANTAGENS

 Não são necessários  Dificuldade na escolha


vários padrões, como de um padrão interno
acontece na que atenda a todos os
normalização das áreas; requisitos necessários
 As mesmas da para uma dada análise;
padronização externa e
mais:
• Volume injetado e
estabilidade do
cromatógrafo deixam de
ser um fator limitante
Análisede cloreto de vinila, usando
hexano como padrão interno.
Construção da curva:
Y = 1,1436x – 0,0125
Pela relação das áreas obtidas, y =
1,458.
Nesse ponto, X = 1,286. Assim:

Cx
= 1,286
C PI
C x = 1,286C PI = 1,286 x 2 = 2,573 ppm