Cromatografia em Camada

Delgada

Discentes: Daniely de Godoy Silva

Germano Blaquez Junior
Gislaine Ap. da Cunha
Docentes: Profº. Drº José Eduardo de Oliveira
Profª Amanda Coelho Danuello
 Histórico da Cromatografia em
Camada Delgada
BEYERINCK em 1889 usou sólidos em camada delgada
sobre vidro, para o desenvolvimento circular de misturas
de sais inorgânicos.

Em 1938 IZMAILOV e SCHRAIBER reintroduziram a

Cromatografia em Camada Delgada, para análise de
produtos farmacêuticos, mas não foi muito usada até o
desenvolvimento, por KIRCHNER do método de aderir os
sólidos ao suporte.

Em 1956 atingiu grande desenvolvimento, pelo método

de preparar as placas com reprodutibilidade por STAHL.
Cromatografia :
Método físico-químico de separação dos componentes de uma
mistura, realizada através da distribuição destes componentes
entre duas fases, que estão em contato íntimo.Uma das fases
permanece estacionária enquanto a outra move-se através dela.
Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, os
componentes da mistura são distribuídos entre as duas fases, de
tal forma que cada um dos componentes é seletivamente retido
pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais
destes componentes.
 Critério de classificação Cromatografia

Técnica Planar Coluna

Fase Móvel Líquido Gás Líquido

Fase LíquidoSólido Fase Líquido Sólido Fase Líquido Sólido

Fase
Estacionária ligada ligada
ligada

CGL CGS CGFL CLL CLS CE CLFLCTI CB

Tipo de CP CCD CCD
cromatografia
 Métodos cromatográficos

Cromatografia Gasosa (CG):Gasosa

Cromatografia
(aplicada a compostos orgânicos voláteis).
•A fase móvel é um gás

•A fase estacionária é frequentemente um líquido

de alto p.e. sobre um suporte sólido ou um
adsorvente sólido
Cromatografia Líquida em coluna clássica (CCC)
(utilizada para separar analitos em solução, incluindo
íons) metálicos e compostos orgânicos).
Cromatografia Líquida em
•A fase móvel é um solvente
Coluna Clássica
•A fase estacionária é um líquido sobre um suporte
sólido, um sólido ou uma resina de troca iônica, etc.

Disco de
papel
filtro

Algodão
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLAE)
(uma variação da cromatografia líquida que
Cromatografia Líquida de Alta
utiliza bombas de alta pressão para aumentar
Eficiência
a eficiência das separações)
. SOLVENTES

BOMBA DETETOR COLETOR

INJETOR COLUNA
DESCARTE
 Outra Classificação

Fase Normal
Polaridade: FE > FM
FE utilizada : Sílica G

Fase Reversa
Polaridade: FE < FM
FE utilizada: Sílica C18
 Cromatografia em Camada
Delgada
Consiste na separação de uma mistura através
da migração de seus componentes sobre uma
camada delgada de adsorvente (fase
estacionária) retido sobre uma superfície plana,
geralmente placas de vidro. Isso acontece devido
a processos de adsorção. Após ocorrido o
processo, a placa passa a se chamar
cromatograma.

Fase Estacionária (FE): Contém o adsorvente

Fase Móvel (FM): Contém o solvente

 Mecanismos
Adsorção Partição Exclusão
Líquido/gás gel/sólido
Líquido/gás líquido
Líquido/gás sólido

Troca Iônica
Líquido sólido
INTERAÇÕES INTERMOLECULARES
Iônicas
+ Ponte de Hidrogênio
- van der Waals Keeson (dipolo/dipolo)
+ Debye (dipolo/dipolo induzido)
London (dipolo induzido/dipolo
+ - induzido)
Aplicações:

9 Identificação de compostos orgânicos com pontos de fusão

próximos;
9Estudos preliminares da complexidade dos componentes de um
extrato orgânico;
9Investigação de: Casos de envenenamento; ingestão de
estimulantes por atletas;
9 Estudos de reações : presença de intermediários estáveis;
9Análise da pureza de compostos;
9Análise da eficiência de: destilação e cristalização
Vantagens da Cromatografia em Camada Delgada

a. Maior rapidez;
b. Menor trajeto da fase móvel ;
c. Boa resolução;
d. Alta sensibilidade;
e. Manchas em geral menos difusas;
f. Possibilidade, quase sempre, de emprego de reagentes de
detecção corrosivos;
g. Baixo custo;
h. Facilidade de raspar a camada, com espátula fina ou com
uma lâmina para microscopia, para recuperar, por eluição o
conteúdo de uma mancha ou de uma banda;
 ADSORVENTES UTILIZADOS EM CCD
Adsorvente: termo geral para Fase Estacionária
Atividade dos adsorventes varia em função da quantidade de água presentes
no mesmos. Quanto menor o teor de água, maior será a sua atividade, isto é,
maior sua afinidade para com as substâncias a separar. A atividade depende,
pois, da temperatura e do tempo de aquecimento a que é submetido o
adsorvente.
Na prática, as cromatoplacas, após sua ativação, devem ser utilizadas logo a
seguir, ou então conservadas em dessecadores de dimensões apropriadas,
para que não tenham seu grau de atividade diminuído, por adsorção de água
do ambiente.
Exemplos de adsorventes:
¾Sílica-Gel ou àcido Silícico;
¾Óxido de alumínio ou alumina;
¾Celulose;
¾Kieselgur;
¾Poliamida;
 Sílica gel ou Ácido silícico
Mais usada na CCD
O O Substância porosa e amorfa.
Apresenta caráter ácido.
O Si O Si OH Possui característica polar, devido à presença de
grupos hidroxilas denominados silanóis. Deve
apresentar número de hidroxilas razoável para ser
O O seletivo na separação de substâncias de diferentes
polaridades
Mecanismo de adsorção:
-Si-OH: Interações polares por ponte de hidrogênio, como doador ou aceptor de H.
-Si-OH e –Si-O-Si-: dipolo/dipolo ou dipolo/dipolo induzido

Tratamento térmico → eliminação de água ( temperatura recomendada para a sua ativação de

105 a 110ºC)
CUIDADO! A aspiração da sílica causa
Caracterização do tipo básico de sílica gel :
silicose, um tipo de inflamação
G: adição de sulfato de cálcio, gipsita, (aglutinante); pulmonar crônica!
H: indica ausência de aglutinante;
F: indica adição de substâncias fluorescentes;
P: indica adsorvente para uso preparativo;
R: indica adsorvente de alto grau de pureza;
Preparação: 30g de sílica com 60-70 mLde água = 5 placas de 20x20cm com espessura de 0,3
mm
 Alumina ou Óxido de Alumínio
Segundo adsorvente mais empregado em CCD;
Há três grupos deste adsorvente:
Cl
ÁCIDA ONa
BÁSICA H3C Al O
H3C Al Cl
pH 4,0 H3C Al ONa
NEUTRA
pH 9,0 O Al pH 7,0
O Al Cl
O Al ONa 2+
O Al
O Al
O Al
CH3
CH3
Mecanismo de adsorção:
Al3+: campo positivo favorece interação com moléculas polarizáveis ( sistemas conjugados)
O2-: sítios básicos favorecem a interação com doadores de H+

A ativação da alumina faz-se,após secagem ao ar durante cerca de 2 h, pelo

aquecimento em estufa a 120ºC por 60 min.
A alumina é caracterizada pelo diâmetro dos poros dos grânulos.
Tipo E: apresenta superfície específica de 120 – 180 m2. g-1.
Tipo T: apresenta superfície específica de 60 – 90 m2. g-1.
Preparação: 5 placas de 20x20 cm e espessura de 0,3 mm, recomenda-se a
utilização de uma suspensão de 30 g de alumina em 40 mL de água destilada.
 Celulose
Existem dois tipos de celulose empregadas em
CCD: a nativa ( celulose fibrosa) e a celulose
microcristalina.
Existem ainda as celuloses quimicamente tratadas
aplicadas na CCD:
Tipos:
CM-celulose ( carboximetilcelulose) → trocador iônico fraco;
DEAE-celulose (dietilaminoetilcelulose) → trocador aniônico básico forte;
ECTEOLA-celulose (mistura alcalina, trietanolamina e epicloridrina → trocador aniônico
básico fraco;
PEI-celulose (polietilenimina) → trocador iônico básico forte;
Celulose fosforilada → trocador catiônico forte;
Celulose microcristalina constitui-se em excelente material para separação de
substâncias orgânicas hidrofílicas.
Mecanismo: Partição ou troca iônica.
Preparação: 5 placas de 20 x 20 cm, mistura-se 25 g de celulose com 90 mL de água
destilada, agitando-se por 2 min, antes de colocar na placa de vidro.
 Kieselgur ou terra de diatomáceas
É um tipo de ácido silícico oriundo de carapaças de diatomáceas fósseis.
Comparado a sílica e alumina é menos adsorvente e com menor poder
de resolução.
Pode ser adicionado à sílica para diminuir seu poder adsorvente.
Apresenta baixa atividade
Tipos:
Com aglutinantes;
Sem aglutinantes;
Mecanismo: Partição
Preparação: 30g do adsorvente com 60-70 mLde água = 5 placas de
20x20cm com espessura de 0,3 mm
Poliamida
Separação de fenóis e ácidos carboxílicos
A separação depende da intesindade das forças decorrentes das ligações de
hidrogênio com o analito.
Baixa aderência ao vidro: dificuldade de preparação da placas

Tipos:
11 – ácido poliaminoundecanóico (Nylon 11)
6 – aminopolicaprolactama (Perlon)
6.6 – poli-hexametildiaminamonoadipato
Poliamida acetilada
Preparação:
15g em 60 mL de metanol = 5 placas (20 x 20 x 0,03 cm)
Técnica Geral
Escolha da fase estacionária;
Preparação das placas cromatográficas;
Ativação das placas cromatográficas;
Seleção da fase móvel;
Aplicação das amostras nas cromatoplacas;
Preparação da cuba cromatográfica e desenvolvimento do
cromatograma;
Revelação dos cromatogramas;
Documentação;
Calculo do fator de retenção Rf;
 Escolha da fase estacionária

Liofilicidade e liofobicidade
Interação com os componentes (polaridade)

Necessidade de aditivos
Aglutinantes
Substâncias fluorescentes

Capacidade adsorvedora
 Preparação da placas
As placas devem ser: resistentes, inertes aos reagentes e solventes, resistentes à
temperatura e uniformes.

Procedimentos para a preparação das placas

Limpeza da placa de vidro → detergente e água corrente (eliminação de gordura);
Secagem → em estufa
Preparação das camadas finas dos adsorventes:
Utilização de espalhadores ( mais empregada);
Submersão, aspersão ou vertendo-se sobre as placas suspensão do
adsorvente apropriado.

Dificuldades: Obtenção de solução com viscosidade adequada.

Placas pré fabricadas: Dispensam a fase de preparação; são mais uniformes e

homogêneas, melhorando a separação e tornando os valores de Rf mais reprodutíveis.
 Riscar as placas,
determinando a altura
de ínicio e fim da
cromatografia
 Ativação das placas

Objetivo: retirar substâncias interferentes e

eliminar água

Metodologia : Varia de uma adsorvente para outro.

Exemplo : Sílica e alumina ⇒ estufa 105 – 110 ºC por 30 –
60 min;
Celulose ⇒ estufa 105ºC por 10 min;
 Seleção da fase móvel
Depende: natureza química das substâncias a serem separadas e polaridade da fase
móvel.

Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por adsorção: levar em conta a

natureza da fase móvel, da fase estacionária e do soluto. Assim, para solutos muito
polares deve-se utilizar um adsorvente de baixa atividade e uma fase móvel de grande
poder eluente.
Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por partição: Realizada com os
adsorventes celulose microcristalina e kieselgur, constitui um processo de separação
que depende das diferenças de solubilidade dos componentes das amostras, nas fases
estacionária e móvel e na imiscibilidade dessas fases.
 Aplicação das amostras
A amostra é aplicada na forma de solução 0,1 – 1%,dependendo
da sensibilidade do revelador, usando solventes mais voláteis
possíveis.

Aplica-se a amostra com micropipetas, microsseringas ou tubos

capilares.

As amostras devem estar a mais ou menos 2,0 cm da parte

inferior da placa, afim de que essas não entrem em contato direto
com o solvente durante o desenvolvimento do cromatograma.
Alinhamento horizontal uniforme.
 Preparação da cuba
A placa deve ser colocada, rapidamente ( para evitar
evaporação) e verticalmente, após aplicadas as amostras, numa
cuba de vidro contendo a fase móvel desejada. A cuba deve estar
saturada com vapor de fase móvel para que o cromatograma se
desenvolva regularmente. Para isso, coloca-se papel de filtro na
cuba, que ajuda na evaporação e na conseqüente saturação. A
cuba deve ser dotada tampa esmeriladas de forma a vedá-la
hermeticamente, garantindo uma boa saturação da atmosfera
interna.
Desenvolvimento de um cromatograma numa
cuba
 Revelação dos cromatogramas

Procedimentos químicos, físicos, ou biológicos

aplicados ao cromatograma para tornar visível as manchas
das substâncias separadas por cromatografia.
A- Procedimentos Físicos:
sicos Luz ultravioleta (aromáticos ou
dupla ligação conjugada).
C- Procedimentos Biológicos e Enzimáticos:
ticos Antibióticos,
Enzimas e Substratos.
D- Procedimentos Químicos:
micos Aplicação de um reativo
químico para formar um derivado colorido ou fluorescente.
 Reveladores Físicos

Radiação ultravioleta para compostos fluorescentes.

Ex: clorofila.
 Reveladores Químicos
Consiste em utilizar reveladores químicos que, em contato com
as substâncias da amostra, as tornam coloridas e visíveis.

Tipos de reveladores químicos

Alcalóides: Dragendorff, iodoplatinato
Flavonóides: NP-PEG
Anti-oxidantes: β-caroteno
Saponinas, terpenos e esteróides: anisaldeído sulfúrico
Antraquinonas e cumarinas: vapor de amônia
Fenólicos, saponinas e terpenóides: vapor de iodo e solução de
CeSO4
Compostos fenólicos: FeCl3
 Reveladores Biológicos
Utiliza-se reações enzimáticas ou bacterianas para
tornar a mancha visível.
Ex.: para testar se uma amostra contém substância anti-
fúngica, revela-se o cromatograma com esporos de
fungos. Os fungos não crescerão onde houver essas
substâncias.
Fator de Retenção Rf (Relation front ou Rate
factor)
Rf = distância percorrida pela substância / distância percorrida pela fase
móvel.
Os valores Rf variam entre 0 e 1 e são dados com dois algarismos após a
vírgula.

Linha de chegada da FM

Ws1
dm

Ws2

dr1
dr2

Ponto de partida da amostra

Profundidade da FM
Parâmetros Utilizados na Cromatografia Planar

• Fartor de Retenção (Rf):

•
• Rf = dr / dm
•
• Resolução (Rs):
•
• Rs = 2(dr1 – dr2) / (Ws1 + Ws2)
•
• Eficiência:
•
• n = 16 (dr – Ws)2
 Desvantagens da CCD

Difícil reprodutibilidade:
quantidade de amostra aplicada
obtenção de cromatoplacas com características idênticas.
Baixa sensibilidade:
detecção
difusão da amostra
Difícil determinação exata do Rf.
Constantes Físicas
 Bibliografia

•COLLINS, Carol H. et al, introdução a métodos cromatográficos, 6ª ed, ed.

Unicamp,Campinas,1995.

•NETTO, J. Z., CAZETTA, J. O. Cromatografia Plana, Funep, Jaboticabal, 2005

•THE MERCK INDEX, 13th, ed. Merck & CO., Inc., Usa, 2001.
 Tabela de constantes físicas e Toxicidade

Densidade/ M.M/ Fórmula

Substância -1 p.f/ºC p.e./ºC Toxicidade
g.mL g.mol-1 molecular
Causa náusea,
Etanol 0,789 -114,1 78,4 46,07 C2H5OH
vômito e depressão
Se ingerido causa
Ácido acético 1,049 16,7 118 60,05 C2H4O2 vômito, diarréia e
colapso circulatório
Causa fadiga,
Diclorometano 1,326 -25 39,75 84,93 CH2Cl2 náusea, irritação
nos olhos e cabeça
Depressão do
1,2 -
1,257 -40 83-84 98,96 C2H4Cl2 sistema nervoso
dicloroetano
central
Náusea, vomito e
Aspirina 1,40 135 - 180,16 C9H8O4
irritação
Acetaminofenol 1,293 170,5 - 151,16 C8H9NO2 [Anti-térmico]
Estimulante do
Cafeína 1,23 238 - 194,19 C8H10N4O2 sistema nervoso
central
Irritação nos olhos,
Acetato de Etila 0,902 -83 77 88,10 C4H8O2 pele, nariz e
garganta.
Ácido
- 152 - 300,26 C16H12O6 [Anti-térmico]
Acetilsalicílico
Dermatite, dor de
Metanol 0,7866 -97,8 64,7 32,04 CH4O cabeça, náusea,
vômitos, anorexia
 Fluxograma
Análise Cromatográfica em Camada Delgada
Determinação dos Rf dos padrões:

Solução de 1,2 dicloroetano e ácido acético 0,1g de cafeína Placa de vidro

12:1 0,1g de ácido acetilsalicílico (com sílica)
ó 0,1g de acetoaminofen
- Transferir a solução para uma cuba - Riscar a placa
cromatográfica até atingir 1,5 cm de - Adicionar em cada tubo de ensaio 5,0 em 4 colunas
altura mL de etanol e diclorometano (1:1)
- Colocar uma folha de papel de filtro - Aquecer rapidamente em banho- Placa riscada
da altura da cuba e deixar saturar até maria, evitando a perda de solvente
que toda a folha esteja umedecida - Ativar a placa
com a fase móvel em estufa a
Soluções Mistura de 110ºC por 10
Cuba Padrão referência
- Num outro tubo de ensaio pipetar 1 Placa ativada
Saturada mL de cada solução padrão
- Agitar bem e homogeneizar a solução

Aplicar cada solução no centro de cada coluna (a 2 cm da base)

Placa aplicada
- Colocar dentro da cuba e esperar a fase móvel atingir o limite traçado

Cromatograma padrão
- Revelar com UV
- Revelar numa cuba com vapores de iodo
Cromatograma padrão revelado

Cálculo dos fatores de retenção dos padrões

Análise de Analgésicos

3 comprimidos
(Amostras)

- Triturar
- Transferir para 3 béqueres de 10 mL
- Adicionar 5 mL de etanol/diclorometano 1:1
- Dissolver [banho-maria]

Soluções das
amostras
- Aplicar cada solução em cada coluna da placa
juntamente com a MISTURA PADRÃO

Placa aplicada
- Eluir na cuba

Cromatograma

- Revelar em UV e em iodo

Cromatograma
revelado

- Medir Rf

Determinação
das amostras