Cromatografia

Lus H.
Melo de Carvalho
Complementos de Qumica I - Mdulo de cromatografia
Lus H. Melo de Carvalho
SEPARAO CROMATOGRFICA
CLASSIFICAO DE MTODOS CROMATOGRFICOS EM COLUNA

Classificao geral Mtodo especfico Lquido-lquido ou partio Lquido-fase ligada Fase estacionria Tipo de equilbrio
Amostra
Fase mvel
Cromatografia lquida (LC) (fase mvel: lquido)
Lquido adsorvido num slido Espcies orgnicas ligadas a uma superfcie slida
Partio entre lquidos imiscveis Partio lquido/superfcie ligada
A+B
B A
Lquido-slido ou adsoro Troca inica
Slido
Adsoro
Resina de troca inica
Troca inica
B A
Excluso por tamanho
Lquido nos interstcios de um slido polimrico
Partio/peneiragem
Cromatografia gasosa
Gs-lquido
Lquido adsorvido num slido
Partio gs/lquido
B A Sinal do detector t0 t1 t2 t3 A B B t4 Detector
(GC) (fase mvel: gs) Gs-fase ligada
Espcies orgnicas ligadas a uma superfcie slida
Partio gs/superfcie ligada
Gs-slido
Slido
Adsoro Partio fluido supercrtico/superfcie ligada
t0
t1
t2 Tempo
t3
t4
Cromatografia de fluido supercrtico (SFC) (fase mvel: fluido supercrtico)
TEORIA DA CROMATOGRAFIA
SEPARAO CROMATOGRFICA
t1
Fase mvel Concentrao

B
Fase estacionria
t2
K=
CS CM
A B
Distncia migrada
ALARGAMENTO DE BANDA MELHORANDO A SEPARAO

Comportamento ideal
Resposta do detector
Cromatograma original
Sinal do detector
Tempo
Aumento da separao das bandas
Comportamento real
Diminuio do alargamento das bandas
Tempo
Tempo
ALGUMAS QUANTIDADES IMPORTANTES
QUANTIDADES IMPORTANTES (CROMATOGRAMA)

Tempo de reteno (Tr)
Tr Sinal do detector Tm Tr
Tr= Testacionria + Tmvel
Tempo morto (Tm) Tempo de reteno ajustado (Tr)

Tr= Tr - Tm
W1/2
0 Tempo Tm= tempo morto Tr = tempo de reteno total Tr = tempo de reteno ajustado (ou lquido) W1/2 = largura do pico a meia altura
Factor de reteno (k)

medida de reteno na fase estacionria
k' = Tempo que o analito passa na f ase estacionria = Tempo que o analito passa na f ase mvel
T Tm Tr ' = r = Tm Tm
Coeficiente de separao ou selectividade ()

medida de reteno na fase estacionria
(T ) T k' a= 2 = r 2 m k'1 (Tr )1 Tm
ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TERICO
PROCESSOS CINTICOS QUE CONTRIBUEM PARA O ALARGAMENTO DOS PICOS

H=
Processo
N de molculas
B + CS u + C M u u
Relao com as propriedades da coluna e do analito
Termo na equao
L
(L-1) (L+1)
Difuso longitudinal
B u
B 2k D DM = u u
Transferncia de massa
CS u
Distncia migrada
(fase estacionria lquida*) Transferncia de massa
CS u =
qk' d f2u (1 + k' ) 2 DS

2t d k' u ( 1 + k' ) 2 u
CS u
Introduo da amostra
DETERMINAO DE H E N
Detector
Enchimento
CS u =
(fase estacionria slida**) Transferncia de massa (fase mvel)
CM u
CM u =
2 2 f (dp , d c ,u )
DM
Sinal do detector
Tr
f: funo de; kD, q : constantes; td tempo mdio de dessoro do analito da superfcie; dc: dimetro da coluna; B: coeficiente de difuso longitudinal; CS e CM: coeficientes de transferncia de massa nas fases estacionria e mvel, respectivamente. * a fase estacionria um lquido imiscvel imobilizado ** a fase estacionria uma superfcie slida onde ocorre adsoro.
Varivel Velocidade linear da fase mvel Smbolo Unidades u
(a) (a)
Tm
cm.s
2 2
-1
W
Tempo
Coeficiente de difuso na fase mvel
DM DS k dp df
cm .s-1 cm .s cm cm
-1
Coeficiente de difuso na fase estacionria Coeficiente de capacidade Dimetro de partcula do enchimento
Espessura do revestimento lquido na fase estacionria

(a)
Aumenta quando a temperatura aumenta e a viscosidade diminui
EQUAO DE VAN DEEMTER

Contribuio para H, cm
ALARGAMENTO DE BANDAS
Efeito de percursos mltiplos
Largura de banda inicial
H=
B + CS u + CM u u
CSu
CMu
B/u Velocidade linear de fluxo, cm/s glc 2 8 6 H, mm 4 LC 2 0.2 GLC 4 6 8 10 0.8 0.6 0.4
Grau de alargamento de banda Largura de banda final
Fase mvel estagnada
Fluxo de fase mvel
1.0
2.0 lc
Velocidade linear de fluxo, cm/s
SEPARAO E RESOLUO
RS=0.75
LARGURA DE PICO NA BASE (W) E A MEIA ALTURA (W1/2)
RS=1.0 Sinal do detector
Resposta do detector
W1/2= 2.35
(Tr)B Tm (Tr)A A
WA/2 WB/2
RS=1.5 Z B
h 2
W = 4
Tempo
WB
WA
Tempo
TCNICAS PARA MELHORAR A RESOLUO

Objectivo: Separaes eficientes em tempos de anlise curtos.
EFEITO DO COMPRIMENTO DA COLUNA NA RESOLUO E NO TEMPO DE RETENO
1. Aumentar a distncia entre os picos, Tr=T2-T1 (a) Aumentar o comprimento da coluna, L (b) Aumentar a quantidade de fase estacionria, VS ou VL (c) Usar um coeficiente de selectividade melhor, =T2/T1 Diminuir a temperatura Escolher uma fase estacionria diferente Escolher uma fase mvel diferente (se for lquida)
2. Diminuir a largura da banda, W (a) Usar um enchimento mais uniforme Encher mais cuidadosamente Usar partculas mais pequenas (b) Aumentar a rea de interface entre as fases (c) Optimizar a velocidade de fluxo (d) Reduzir o tamanho da amostra (e) Reduzir o espao morto no sistema (f) Reduzir a constante de tempo do detector (g) Diminuir o dimetro da coluna
EFEITO DO TAMANHO DE PARTCULA E H
EFEITO DA TEMPERATURA NA CG
Isotrmica a 45C 1
0.2 H, cm
0.6 0.8 mm 0.4 0.6 mm 0.3 0.4 mm
2 3
4 5
0.1
0.25 0.3 mm 0.1 0.15 mm
x4
5 6
Isotrmica a 145C
10
15
20 7 8
Velocidade linear, cm/s
EFEITOS DO FACTOR DE CAPACIDADE

Resoluo, RS 4 RS/Q ou (Tr)B/Q Tempo de eluio, (Tr)B
Programada de 30C a 180C
1 2
7 6
10
Tempo (min)
90
20
30
5.0
10.0
15.0
30
60
120
150
180
Coeficiente de capacidade, kB
Temperatura (C)
EFEITO DA COMPOSIO DA FASE MVEL NA CROMATOGRAFIA LQUIDA
PARMETROS USADOS NAS TCNICAS DE OPTIMIZAO
70% metanol, 30% gua 60% metanol, 40% gua 50% metanol, 50% gua
Variao de N
Alterao do comprimento da coluna
40% metanol, 60% gua
Variao de H
Alterao da velocidade do fluxo da fase mvel Alterao do tamanho de partcula do enchimento Alterao da espessura do filme lquido que serve de fase estacionria (LC) Alterao do dimetro da coluna Alterao da viscosidade da fase mvel (e assim DM ou DS) Alterao da temperatura da coluna (GC)
Variao de k e de
Tempo de reteno, min Alterao da temperatura Alterao da composio da fase mvel Alterao do enchimento da coluna Utilizao de efeitos qumicos especiais
1 9,10-antraquinona 2 2-metil-9,10-antraquinona 3 2-etil-9,10-antraquinona 4 1,4-dimetil-9,10-antraquinona 5 2-t-butil-9,10-antraquinona
VARIAO DA RESOLUO
Tm
EFEITOS DE E N NA RESOLUO DE PICOS
Inicial
Factor de separao fraco N pequeno
Factor de separao bom N pequeno
diminuir k
aumentar k
Variao de k Resposta do detector
Factor de separao fraco N elevado
Factor de separao bom N elevado
Aumento de N
Aumento de
Tempo
10
O PROBLEMA GERAL DA ELUIO
Razo de altura dos picos = 1:1

RS = 0.4 0.5 0.6 0.7
Sinal do detector
0.8
1.0
1.25
Razo de altura dos picos = 8:1

RS = 0.4 0.5 0.6 0.7
Tempo 0.8 1.0 1.25
11
Lus Herculano Melo de Carvalho
Complementos de Qumica I
SOBREPOSIO DE PICOS
1) Localizao
Posio aparente Rs = 1
SOBREPOSIO DE PICOS
Erro na quantificao por rea de pico
1:1
4:1
Posio verdadeira
100% 8:1
96% 16:1
2) Medio de reas
93% 88%
% erro na rea do pico menor = (% indicada -100 %) % erro na rea do pico maior = - (1/x) % erro na rea do pico menor
12
EXPRESSES E QUANTIDADES IMPORTANTES EM CROMATOGRAFIA
QUANTIDADES EXPERIMENTAIS IMPORTANTES EM CROMATOGRAFIA
Nome Velocidade linear da fase
Expresso
Relao com outras quantidades
Nome
Tempo morto Tempos de reteno (de A e de B)
Smbolo Tm
Determinada a partir de: Cromatograma
mvel Volume da fase mvel
u=
L Tm
VM = Tm F
(Tr)A e (Tr)B Cromatograma (Tr)A e (Tr)B

Coeficiente de capacidade
k' =
(Tr
Tempo de reteno ajustado (de A e de B)
(Tr)A= (Tr)A - Tm
Coeficiente de partio
Tm ) Tm
k' =
KVS VM
CS CM
Largura de picos (de A e de B) Comprimento do enchimento da coluna Velocidade mdia das molculas da fase mvel
WA e WB L u
Cromatograma Medio directa Medio directa

Resoluo Factor de selectividade
K=
k' VM VS
K=
(Tr )B Tm (Tr )A Tm
W A + WB
2
k' B K B = k' A K A
RS =
2[(Tr )B (Tr ) A ]
RS =
Volume da fase estacionria
VS
Dados da preparao do enchimento Anlise e dados da preparao

N de pratos
N 1 k' B 4 1 + k' B
2 2
Concentrao de analito nas fases mvel e estacionria
T N = 16 r W
2 1 + k' B N = 16RS 1 k' B
CM e CS
Altura de prato
H=
L N
2
Tempo de reteno
(Tr )B
2 16RS H (1 + k' B )3 u 1 (k' B )2
13
COMPONENTES FUNDAMENTAIS DE UM SISTEMA DE GC

Detector
COLUNAS PARA CROMATOGRAFIA GASOSA

Tipo de coluna Capilar Caracterstica Comprimento (m) Dimetro interno (mm) Eficincia (pratos/m) (WCOT) 10 - 100 0.25 0.75 1000 - 4000 10 - 10 Baixa Rpida
3
Injector
Enchimento
1-6 2-4 500 - 1000 10 - 106 Alta Lenta
Gs de arraste
Quantidade de amostra (ng)
Forno Gs de arraste
Coluna Tratamento de dados
Presso relativa Velocidade relativa
INJECTOR DIRECTO
Septo Seringa Coluna
COLUNA TUBULAR ABERTA ( ou COLUNA CAPILAR)
Agulha da seringa Purga do septo Gs de arraste
Cmara de vaporizao
14
EFICINCIA DE COLUNAS CAPILARES E EMPACOTADAS

106
) OT (WC s e ilar Cap
GASES DE ARRASTE
N2 1.2 1.0 H (mm) 0.8 He 0.6 0.4 H2
10 N
104
adas acot Emp
103 10 102 Tempo (s) 103 104
0.2
20 2.0
40
60
80
Velocidade linear mdia (cm/s) H (mm) 1.5

s da ota c pa Em
1.0
(WCOT) Capilares
0.5
20
40
60
Velocidade linear mdia (cm/s)
15
DETECTOR DE IONIZAO DE CHAMA

Colector
DETECTOR DE EMISSO ATMICA

Bateria de dodos
Rede de difraco
170 nm 250 nm
ar Chama ar-H2 Bico de queima Parede do forno H2 Gs de complemento
480 nm
656 nm
Plasma Coluna
690 nm 748 nm 777 nm
Coluna
Amostra duma gasolina Monitorao da linha do C Sinal do detector
DETECTOR DE CONDUTIVIDADE TRMICA
10
20
30
Fluxo de sada
Monitorao da linha do O
Fluxo de entrada
Tempo (min)
16
SISTEMA DE INJECO DA AMOSTRA

COMPONENTES PRINCIPAIS DE UM SISTEMA DE HPLC
1) Carregamento da amostra 2) Injeco da amostra
loop
loop
Unidade de injeco
Para a coluna Para a coluna Da bomba Sada Sada
Coluna
Da bomba
Solventes
Detector
DETECTOR DE UV PARA HPLC

Da coluna
Bomba + sistema de gradiente Aquisio e processamento de dados Fonte de UV
Janelas de quartzo
Detector
Para o esgoto
17
CROMATOGRAFIA LQUIDA
EFEITO DA ELUIO EM GRADIENTE

Mistura de clorobenzenos Eluio em gradiente
Polaridades dos solutos: A > B > C
Inicio: 40:60 (v/v) MeOH/H2O
Eluio isocrtica
50:50 (v/v) MeOH/H2O
MeOH 8%/min
Fase normal
Fase mvel de polaridade baixa
Fase reversa
Fase mvel de polaridade alta
B
Tempo
B
Tempo
10 15 20 Tempo (min)
25
30
10 15 20 Tempo (min)
25
30
BOMBA RECPROCA PARA HPLC

Fase mvel de polaridade mdia Fase mvel de polaridade mdia Coluna Junta selada C B A
Tempo Amortecedor de pulsaes
A B C
Tempo
Motor
Vlvulas de esfera Pisto de vaivm Solvente
18
APLICAES DA CROMATOGRAFIA INICA
Eluente: NaHCO3 0.0028M / Na2CO3 0.0023M Volume de amostra: 50 L
Eluente: Fenilenodiamina.2HCl 0.025M / HCl 0.0025M Volume de amostra: 100 L
19

Cromatografia

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Cromatografia lquida (LC) (fase mvel: lquido)

Partio entre lquidos imiscveis Partio lquido/superfcie ligada

Lquido-slido ou adsoro Troca inica

Resina de troca inica

Excluso por tamanho

Lquido nos interstcios de um slido polimrico

Lquido adsorvido num slido

B A Sinal do detector t0 t1 t2 t3 A B B t4 Detector

(GC) (fase mvel: gs) Gs-fase ligada

Espcies orgnicas ligadas a uma superfcie slida

Partio gs/superfcie ligada

Adsoro Partio fluido supercrtico/superfcie ligada

Cromatografia de fluido supercrtico (SFC) (fase mvel: fluido supercrtico)

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Fase mvel Concentrao

ALARGAMENTO DE BANDA MELHORANDO A SEPARAO

Aumento da separao das bandas

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ALGUMAS QUANTIDADES IMPORTANTES

QUANTIDADES IMPORTANTES (CROMATOGRAMA)

Tr= Testacionria + Tmvel

Tempo morto (Tm) Tempo de reteno ajustado (Tr)

Factor de reteno (k)

Coeficiente de separao ou selectividade ()

(T ) T k' a= 2 = r 2 m k'1 (Tr )1 Tm

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ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TERICO

PROCESSOS CINTICOS QUE CONTRIBUEM PARA O ALARGAMENTO DOS PICOS

(fase estacionria lquida*) Transferncia de massa

qk' d f2u (1 + k' ) 2 DS

(fase estacionria slida**) Transferncia de massa (fase mvel)

Coeficiente de difuso na fase mvel

Coeficiente de difuso na fase estacionria Coeficiente de capacidade Dimetro de partcula do enchimento

Espessura do revestimento lquido na fase estacionria

Aumenta quando a temperatura aumenta e a viscosidade diminui

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EQUAO DE VAN DEEMTER

Fase mvel estagnada

Fluxo de fase mvel

Velocidade linear de fluxo, cm/s

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