QUÍMICA

ALIMENTAR
Instituto de Tecnologia
Agro-Alimentar

Daniel Kavunguilika
ITA 2022 – 2023 Isaac Salvador
 CROMATOGRAFIA
Cromatografia em fase gasosa

Sistema de
3. Injetor dados

1. Fase móvel 5. Detector

4. Coluna
cromatográfica

2. Forno
 CROMATOGRAFIA
Cromatografia em fase gasosa

Fase estacionária

Detecção
Fase móvel
Separação
 Cromatografia Gasosa
Aplicabilidade

Quais misturas podem ser separadas por CG ?

para que uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo
de um gás ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gás.

Misturas cujos constituintes sejam

VOLÁTEIS (=“evaporáveis”)

DE FORMA GERAL:
CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham
PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que sejam termicamente estáveis.
 Cromatografia Gasosa
Requisitos - Gás de arraste (FM)

INERTE: Não deve reagir com a amostra, nem com a fase

estacionária ou superfícies do instrumento.
PURO: Deve ser isento de impurezas que possam degradar a
fase estacionária.

Impurezas típicas em gases e seus efeitos:

H2O, O2 oxida / hidrolisa algumas FE

incompatíveis com DCE

hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC

 Cromatografia Gasosa
Requisitos - Gás de arraste (FM)

A = 99,995 % (4.5)

CUSTO
CUSTO: Gases de altíssima C B = 99,999 % (5.0)
pureza podem ser muito caros. B C = 99,9999 % (6.0)
A
PUREZA

COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda

um gás de arraste específico para melhor funcionamento.

DCT He , H2
Seleção de Gases de
Arraste em Função DIC N2 , H2
do Detector: DCE N2, Ar + 5% CH4
 Cromatografia Gasosa
Injetor

Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover

meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica

t = 0

Injeção instantânea:
t = x

t = 0

Injeção lenta:
t = x
 Cromatografia Gasosa
Injetor “on column”

1 - Septo (silicone)
2 - Alimentação de gás de arraste)
3 - Bloco metálico aquecido
4 - Ponta da coluna cromatográfica

1 - Ponta da agulha da microsseringa é introduzida no início da coluna.

2 - Amostra injetada é vaporizada instantaneamente no início da coluna.
3 - “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna.
 Cromatografia Gasosa
Parâmetros de injeção
1. TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente elevada
para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição.

Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do

componente menos volátil.

2. VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado

físico da amostra.
Amostras Amostras
Sólidos: COLUNA Líquidas Gasosas

convencionalmente se dissolve empacotada

 = 3,2 mm 0,2 L ... 20 L 0,1 mL ... 50 mL
em um solvente adequado e
injeta-se a solução capilar
 = 0,25 mm 0,01 L ... 3 L 1 L ... 100 L
 Cromatografia Gasosa
Microsseringas para injeção

LÍQUIDOS: Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L

êmbolo agulha (inox 316)

Microsseringa de 10  L:

corpo (pirex)

corpo agulha

Microsseringa de 1  L
(seção ampliada):
guia
êmbolo (fio de aço
soldado ao guia)
Cromatografia Gasosa
Colunas
EMPACOTADA
 = 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
Recheada com sólido pulverizado (FE sólida
ou FE líquida depositada sobre as
partículas do recheio)

CAPILAR
 = 0,1 a 0,5 mm
L = 5 m a 100 m
Paredes internas recobertas com um filme
fino (fração de m) de FE líquida ou sólida
 Cromatografia Gasosa
Temperatura da Coluna
Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer
a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0).

Estrutura química do analito

p0 = f
Temperatura da coluna

Temperatura da Pressão de Velocidade de

coluna vapor migração

ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE

(MENOR RETENÇÃO)
Cromatografia Gasosa
Temperatura da Coluna

AUMENTO DA TEMPERATURA DA
CONTROLE CONFIÁVEL
DA TEMPERATURA DA

COLUNA
COLUNA É ESSENCIAL
PARA OBTER BOA
SEPARAÇÃO EM CG
 Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura

Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito

diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:

TCOL BAIXA: TCOL ALTA:

- Componentes mais voláteis são separados - Componentes mais voláteis não são
separados
- Componentes menos voláteis demoram a - Componentes menos voláteis eluem mais
eluir, saindo como picos mal definidos rapidamente
 Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura
A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação:
TFIM

TEMPERATURA
R
TINI

tINI tFIM
TEMPO

TINI - Temperatura Inicial

Consegue-se boa separação
dos componentes da amostra
em menor tempo
TFIM - Temperatura Final
tINI - Tempo Isotérmico Inicial
tFIM - Tempo Final do Programa
R - Velocidade de Aquecimento
Cromatografia Gasosa

Programação linear de temperatura

a) Isotérmico a 45 ºC;
b) isotérmico a 145 °C;
c) programado de 30 ºC a 180 ºC
 Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura

Possíveis problemas associados à PLT:

VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE

ARRASTE: A viscosidade de um gás viscosidade vazão
aumenta com a temperatura.

DERIVA (“DRIFT”) NA LINHA DE BASE:

Devido ao aumento de volatilização de FE líquida
 Cromatografia Gasosa
Fase Estacionária
REGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível próximas
das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...)

FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os componentes

da amostra.

FE Seletiva:
separação adequada dos constituintes da amostra

FE pouco Seletiva:
má resolução mesmo com coluna de boa eficiência
 Cromatografia Gasosa
Fase Estacionária Sólida
• O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE sólida
é a ADSORÇÃO

A adsorção ocorre na interface

entre o gás de arraste e a FE sólida

• Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas, poros)

ADSORÇÃO • Solutos polares

• Sólidos com grande nº de sítios ativos (hidroxilas, pares de elétrons...)
 Cromatografia Gasosa
Fase Estacionária Líquida

• O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE líquida

é a ABSORÇÃO

A absorção ocorre no interior do filme

de FE líquida (fenômeno INTRAfacial)

• Filmes espessos de FE líquida

ABSORÇÃO • Grande superfície líquida exposta ao gás de arraste
• Interação forte entre a FE líquida e o analito (grande solubilidade)
 Cromatografia Gasosa
Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal quando
da passagem de substâncias que não o gás de arraste.

Características ideais:
1. Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.
2. Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3. Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza.
4. Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos 400 ºC.
5. Tempo de resposta curto e independente da vazão.
6. Alta confiabilidade e facilidade de uso.
7. Similaridade de resposta para todos os solutos.
8. Não destrutivo.
 Cromatografia Gasosa
Detectores

REGISTRO DE
SINAL

ANALÓGICO
Registradores XY
DIGITAL
Integradores
Computadores

Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA

Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma.
 Cromatografia Gasosa
Detectores

DCT DCE DNP

UNIVERSAIS: SELETIVOS:
Geram sinal para Detectam apenas ESPECÍFICOS:
qualquer substâncias Detectam substâncias que
substância eluída. com determinada possuam determinado
propriedade elemento
físico-química. ou grupo funcional em suas
estruturas
 Cromatografia Gasosa
Detectores - Funcionamento

DETECTOR POR CONDUTIVIDADE

TÉRMICA (DCT OU TCD): Variação da
condutividade térmica do gás de arraste.

DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM

CHAMA (DIC OU FID): Íons gerados
durante a queima dos eluatos em uma
chama de H2 + ar.
 Cromatografia Gasosa
Detectores - Funcionamento

DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS

(DCE OU ECD): Supressão de corrente
causada pela absorção de elétrons por
eluatos altamente eletrofílicos.

DETECTOR TERMOIÔNICOS (DNP OU NPD): Modificação do DIC.

Os eluatos queimados na chama H2 + ar passam por uma superfície de
silicato de rubídio onde se formam íons de moléculas com N e P.
 Cromatografia Gasosa
Detectores – Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico. Um dos detectores mais
poderosos para a cromatografia gasosa é o espectrômetro de massas. Observa-se para
qualquer substância eluída um sinal, mesmo que complexo.
 Cromatografia Gasosa
Análise qualitativa
O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o
TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, tR’:
tR tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre
a injeção e o ápice do pico cromatográfico)
tR’ = tR - tM
tM = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido
(tempo mínimo para um composto que não interaja
com a FE atravesse a coluna)
SINAL

tM
tR’ = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio
que as moléculas do analito passam sorvidas na FE)

TEMPO
 Cromatografia Gasosa
Análise qualitativa
Coluna HP-Innowax (PEG – altamente polar): 30 m x 0,25 mm x 0,25 m
Detector FID: 250 ºC
Injetor com divisão de fluxo: 250 ºC
Volume injetado: 1 L
Mistura de benzeno, n-propanona, n-propanol, Como se explica esta ordem
n-butanol, isobutanol e n-pentanol. de eluição?
1. A n-propanona elui primeiro devido à
sua maior volatilidade.
2. O benzeno em segundo devido sua
natureza apolar (menor e).
3. Para os demais compostos, cujas
diferenças de polaridade não são
elevadas, a volatilidade se torna o
principal parâmetro que define a ordem
de eluição.
 Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa
O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é:
• Altura da banda cromatográfica: não recomendado, pois a banda necessita ser
perfeitamente simétrica.
• Área da banda cromatográfica.
SINAL

Área Altura

TEMPO
 Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa

Área
amostra

Concentração

tempo
Pausa para
um café…
 Cromatografia Líquida
Cromatografia em fase líquida
 Cromatografia Líquida - CLAE
Aplicabilidade

Quais misturas podem ser separadas por CLAE ?

para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um líquido ela
deve dissolver-se nesse líquido.

Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar de 32 até 4000000.

DE FORMA GERAL:
CL é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes sejam
solúveis na FM. Não há limitação de volatilidade ou de estabilidade térmica.
 Cromatografia Líquida - CLAE
Aumento de polaridade
Insolúvel em água Solúvel em água
Apolar Iônico
Polar não iônico
Tipos e
Partição
Aplicações da
102

Cromatografia Adsorção
Partição
em fase
Partição
em fase
Troca
103 iônica
Líquida
Massa molecular
reversa normal

104

Permeação Filtração
em gel Exclusão em gel
105

106
Cromatografia Líquida - CLAE
Componentes típicos - CLAE
 Cromatografia Líquida - CLAE
Requisitos dos sistemas de bombeamento

1 – Geração de pressões até 6.000 psi

2 – Saída com ausência de pulsos
3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min
4 – Controle e reprodutibilidade de fluxo de 0,5% ou melhor
5 – Componentes resistentes à corrosão

Bomba recíproca (também são chamadas de

bombas de pistão ou de diafragma)
Cromatografia Líquida - CLAE
Sistemas de injeção de amostras
 Cromatografia Líquida - CLAE
Fase móvel para CLAE
Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a polaridade
requerida na separação.
• Eluição isocrática:
• Quando a separação é feita utilizando um único solvente de composição
constante.
• Eluição com gradiente:
• São utilizados dois ou três sistemas de solventes que diferem bastante entre si
em polaridade.
• Depois que a eluição começa, a razão entre os solventes é variada de modo
programado, de forma contínua ou em passos.

A eluição com gradiente produz efeitos similares aos produzidos pela programação
de temperatura na CG.
 Cromatografia Líquida - CLAE
Eluição com gradiente
Coluna C18, 5 m, fase reversa
Detector fluorescência: excit. 334 nm – emis. 425 nm
 Cromatografia Líquida - CLAE
Colunas para CLAE

As colunas geralmente são construídas de aço inox, embora tubos

de vidro com paredes resistentes sejam encontrados
ocasionalmente. No entanto, estes últimos são restritos a
pressões mais baixas do que 600 psi.

Existem comercialmente centenas de colunas empacotadas, diferindo entre

si no tamanho e na fase estacionária. Preços variam de 200 a 500 dólares.
Cromatografia Líquida - CLAE
Colunas para CLAE
•Remoção de material particulado

Pré-coluna •Contaminantes do solvente

•Contaminantes da amostra
•Saturar a FM com a FE

Aumenta a vida útil da coluna

COLUNAS TÍPICAS
•Material: aço inox
•Comprimento: 10 a 30 cm
•Diâmetro: 4 a 10 mm
•FE: Partículas de 5 a 10 m
•Eficiência: 40 mil a 60 mil pratos/metro
 Cromatografia Líquida - CLAE
Separação isocrática de alta velocidade

Coluna de alta - 4 cm de comprimento

velocidade e - 0,4 cm
alta eficiência - FE: spherisorb 3 m
1– p-xileno
FM: 4,1% em n-Hexano
2- anisol
3- acetato de benzila
4- dioctil-ftalato
5- dipentil-ftalato
6- dibutil-ftalato
7- dipropil-ftalato
8- dietil-ftalato
 Cromatografia Líquida - CLAE
Fase estacionária para CLAE

Basicamente são dois tipos de FE:

• Pelicular:
• Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso, esférico, com diâmetros
típicos da ordem de 30 a 40 m, recoberto com uma camada fina e porosa de:
• Sílica
• Alumina
• Resina de poliestireno-divinil-benzeno
• Resina trocadora de íons
• Partícula porosa:
• Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de 3 a 10 m. As partículas
são constituídas dos mesmos materiais do recobrimento pelicular.
 Cromatografia Líquida - CLAE
Detectores

As características desejáveis para os detectores para CLAE não são

diferentes daquelas para CG.
Existem dois tipos de detectores:
• Propriedades universais (índice de refração, densidade ou constante dielétrica).
• Propriedades do soluto (absorbância, fluorescência, etc).

Características ideais:
1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.
2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza.
4.Tempo de resposta curto e independente da vazão.
5.Alta confiabilidade e facilidade de uso.
6.Similaridade de resposta para todos os solutos.
7.Não destrutivo.
8.Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão.
 Cromatografia Líquida - CLAE
Detectores
• Absorbância
• UV/Vis – S: 10-9 g/mL – FL: 105
• IV

• Fluorescência – S: 10-9 a 10-12 g/mL – FL: 103

• Índice de refração (universal) –
S: 10-7 g/mL – FL: 104
 Cromatografia Líquida - CLAE
Detectores

• Eletroquímicos:
• Amperométricos
• Coulométricos
• Condutométricos – S: 10-8 g/mL – FL: 104
• Polarográficos – S: 10-12 g/mL – FL: 106
 Cromatografia Líquida - CLAE
Detectores
• Espectrometria de massa - universal
• Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrômetro de massa
potencializa a técnica de separação e quantificação
• Um grande problema é o descompasso entre os volumes relativamente grandes
de solventes na CL e os requisitos de vácuo na EM.
Interface CL-EM
 Cromatografia Líquida - CLAE
Tipos de CLAE

Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como um gás ideal e não

contribui para o processo de separação, a FM líquida da CLAE interage
tanto quanto a FE com os componentes da amostra.

Isto torna o desenvolvimento dos métodos em CLAE um tanto mais

complexo que na CG.
 Cromatografia Líquida - CLAE
Tipos de CLAE

• PARTIÇÃO: líquido-líquido e fase ligada. A diferença entre elas consiste em

como a FE é mantida nas partículas do suporte do empacotamento → Adsorção e
ligação química. Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase reversa.

Fase normal: FE de natureza fortemente polar (ex. água)

FM apolar (ex. hexano ou éter isopropílico)
O componente menos polar é eluído primeiro por ser o mais solúvel na fase
móvel.
Fase reversa: FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos)
FM polar (ex. água, metanol ou acetonitrila)
O componente mais polar aparece primeiro e o aumento da polaridade da
fase móvel aumenta o tempo de eluição.
 Cromatografia Líquida - CLAE
Tipos de CLAE

• ADSORÇÃO: líquido-sólido. FE sílica ou alumina. É a forma clássica da CL

introduzida no início do século 20. Sofreu adaptações e tornou-se o mais
importante dos métodos de HPLC.
• TROCA IÔNICA: líquido-sólido. FE resina com capacidade de troca iônica.
• EXCLUSÃO: líquido-gel. FE gel. Um material polimérico, hidrofóbicos ou
hidrofílicos, com muitas ligações cruzadas, são capazes de promover a separação
de acordo com os tamanhos das moléculas → EXCLUSÃO DE TAMANHO. Se o
material reticulado for uma resina de troca iônica, tem-se a cromatografia de
EXCLUSÃO DE ÍONS.
CONCLUSÃO
NGASSAKIDILA