1.

INTRODUO
Com o crescente avano tecnolgico, encontra-se cada vez mais em indstrias novos equipamentos que do resultados mais eficazes e em menor tempo. Os mtodos instrumentais esto sendo expandidos para a escala industrial e abrangem as mais diversas anlises nas inmeras reas de atuao na industria qumica. Um exemplo disso so os mtodos espectrofotomtricos, como o caso do mtodo em estudo, o mtodo do DNS. um mtodo rpido e prtico na determinao de acares redutores, e tem grande aplicabilidade industrial. No controle de qualidade envolve a caracterizao das matrias primas para fins de processamento, e verificao se determinado produto est dentro dos parmetros e padres exigidos pela legislao. Na indstria aucareira, serve para controlar se o acar, a sacarose, quando hidrolisado sofreu processo de reduo, que no to facilmente percebido no acompanhamento do processo. Tambm utilizado no acompanhamento do processo de fermentao, que permite verificar as taxas de consumo de acar pelo microorganismo, necessrio para a compreenso da cintica do processo.

2. OBJETIVOS
Construir a curva padro de glicose, plotando absorbncia x concentrao e, atravs de regresso linear, determinar a equao da curva e o coeficiente de correlao. Determinar tambm a concentrao de aucares redutores numa amostra de concentrao desconhecida.

3. FUNDAMENTAO TERICA
Os carboidratos, ou mais comumente, acares, abrangem um dos maiores grupos de compostos orgnicos conhecidos na natureza, e juntamente com as protenas formam os principais constituintes dos organismos vivos, alm de serem a mais abundante fonte de energia para o homem. So acetais ou cetais poliidroxilicos com a frmula emprica (CH2O)n. Os carboidratos simples mais abundantes so as pentoses e hexoses. Os acares possuem um ou mais tomos assimtricos de carbono, portanto podem existir na forma de estereoismeros. J os aucares de ocorrncia natural, por exemplo, glucose, frutose e manose, pertencem as sries D (forma de isomeria tica). Os carboidratos tem diversas classificaes, de acordo com seu tamanho, de acordo com o grupo funcional que derivado, entre outras. As classificaes podem ser: monossacardeos, oligossacardeos e polissacardeos. Os monossacardios so carboidratos simples que no podem ser hidrolisados a aucares de menor peso molecular. Podem ser classificados em aldoses (poliidroxialdedos) e cetoses (poliidroxicetonas), sendo subdivididos em trioses, tetroses, pentoses e hexoses, de acordo com o nmero de carbonos na cadeia. Os oligossacardios so polmeros compostos de resduos de monossacrdios unidos por ligaes hemiacetlicas, neste caso denominadas ligaes glicosdicas, em nmero que variam de duas, at, aproximadamente, dez unidades. So compostos importantes na determinao de estruturas de polissacardios. Polissacardios so macromolculas facilmente encontradas na natureza e que ocorrem em quase todos organismos exercendo diversas funes. Formam-se a partir das ligaes glicosdicas geralmente com mais de 10 unidades de monossacardios ou seus derivados. As unidades monossacardias mais decorrentes so: D-glucose, D-manose, D-frutoses, D e L-galactose, D-xilose e D-arabinose. O polissacardios mais conhecido o amido, que um dos mais importantes constituintes dos alimentos. Na indstria, bem como na natureza, existem diversas reaes tanto de degradao como de formao desses aucares que so determinantes no controle de qualidade dos produtos produzidos. Um acar redutor um acar no qual o carbono carbonila (anomrico) no est envolvido em uma ligao glicosdica e, portanto, pode sofrer oxidao. Os monossacardeos podem ser oxidados por agentes oxidantes relativamente suaves, tais como os ons frrico e cprico. O carbono do grupo carbonila oxidado a cido carboxlico (LENINGHER, 1995). Todos os monossacardeos so potencialmente redutores, devido a presena da carbonila. Outros carboidratos necessitam ser hidrolisados para se tornarem redutores. O mtodo do DNS um mtodo onde ocorre a oxidao do grupo carbonila. O oxidante, chamado DNS utiliza o cido dinitro-saliclico; sal de Rochelle, (soluo de trtaro de sdio de potssio) que serve para prevenir o reagente da ao do oxignio dissolvido; fenol, que utilizado para aumentar a quantidade de cor produzida; bissulfito, que um estabilizante da cor obtida na presena do fenol; hidrxido de sdio, que o redutor da ao da glicose sobre

o cido dinitro-saliclico. Ocorre no mtodo do DNS a seguinte reao de oxidao:

Figura 1: Reao de oxidao da carbonila pelo reagente DNS. Ocorre neste caso a reduo do 3,5-di-nitrosalicitato (de cor amarelo forte) cido e a oxidao do monossacardeo, a glicose, formando o 3-amino-5nitro-salicilato (de cor laranja-marrom forte), na proporo estequiomtrica. Portanto, pela determinao da luz absorvida a 540nm pelo 3-amino-5nitrosalicilato, pode-se determinar a concentrao de acar redutor presente na soluo. Tambm para cada tipo de amostra deve se levantar uma curva padro do acar em estudo, por exemplo, se a amostra analisada contm frutose, devemos fazer a curva padro para a frutose, dentro de um determinado intervalo de concentrao, e respeitando a Lei de Beer.

4. MATERIAIS E MTODOS
4.1 Materiais Utilizados: Tubos de ensaio; Pipetas graduadas de 1mL e 10mL; Pipeta volumtrica de 1mL; Pipetador; gua destilada; Soluo padro de glicose; Reagente DNS; Banho Maria; Estante para tubos de ensaio; Becker; Espectrofotmetro.

4.2 Metodologia: Preparo da Curva Padro: Separou-se 5 tubos de ensaio, numerando-os de acordo com as diluies; Adicionou-se a cada tubo a amostra de glicose padro visando as seguintes concentraes: 1g/L, 0,8g/L, 0,6g/L, 0,4g/L e 0,2g/L, ou seja, adicionou-se 1mL, 0,8mL, 0,6mL, 0,4mL e 0,2 mL de amostra padro de glicose; Completou-se o volume dos tubos, com H2O, a 1mL: 0mL no 1 tubo; 0,2mL no 2; 0,4mL no 3; 0,6mL no 4 e 0,8mL no ltimo; Adicionou-se em seguida 0,5mL do reagente DNS em cada tubo de ensaio; Levou-se os 5 tubos ao banho Maria durante 5 minutos e a temperatura de 100C; Aps o tempo decorrido, interrompeu-se a reao colocando os tubos num banho de gua fria; Adicionou-se a cada tubo 8,5mL de gua destilada para elevar o volume a 10mL; Levou-se os tubos ao espectrofotmetro, e leu se os valores em %Transmitncia, no comprimento de onda de 540nm (=540nm) devidamente calibrado o espectro e com o auxilio de uma cubeta; Construiu-se a curva com o auxilio do Excel. Preparo do Branco e da Amostra: Branco: Utilizou-se 1mL de gua como amostra em lugar da soluo de glicose e adicionou-se 0,5mL do reagente DNS e levou-se ao banho Maria juntamente com os tubos da curva padro, e em seguida tambm foi resfriada em gua fria e elevado seu volume com gua destilada a 10mL.

Amostra Desconhecida: Utilizou-se 1mL de amostra convenientemente diluda, e adicionou-se 0,5mL do reagente DNS e levou-se ao banho Maria juntamente com os tubos da curva padro, e em seguida tambm foi resfriada em gua fria e elevado seu volume com gua destilada a 10mL.

5. RESULTADOS E DISCUSSES
Curva padro de glicose: Na tabela 1 abaixo esto listados os dados obtidos durante a prtica:
[Conc] (g/L) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 %T 13,7 19,9 32 46,8 78,9 Abs 0,863279 0,701147 0,49485 0,329754 0,102923

Tabela 1: Dados obtidos durante a construo da curva padro. Onde: [Conc]: a concentrao das amostras padro nos tubos de ensaio; %T: a transmitncia lida no espectrofotmetro; Abs: a absorbncia calculada a partir dos dados de transmitncia; Para se construir a curva padro de glicose, deve se plotar os dados de Abs x [Conc]. Para isso necessrio se usar da lei de Beer para fazer a transformao de %T em Abs, e isto pode ser descrito pela equao 1 abaixo:

Abs 2 log%T (1)

O grfico 1 abaixo demonstra a equao obtida pela plotagem dos dados, e o seu coeficiente de correlao linear:
Curva Padro de Glicose 1 0,9 0,8 0,7 0,6 y = 0,8966x - 0,033 R2 = 0,994

Abs

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 [Conc] g/L

Grfico 1: Curva padro de glicose. A partir da equao 2 obtida no grfico, podemos calcular a concentrao da amostra desconhecida. Entretanto precisa-se avaliar se a

leitura de %T da amostra desconhecida necessita descontar o valor obtido no branco ou no. Como o espectro foi calibrado com o branco, e no com gua no necessrio fazer esse desconto pois a leitura feita diretamente. Essa tcnica causa mais erros, no entanto mais direta. Abaixo na tabela 2 esto os valores lidos para o branco e para a amostra desconhecida.
[Conc] (g/L) 0 ? %T 100 21,9 Abs 0 0,659556

BRANCO AMOSTRA

Tabela 2: Dados obtidos durante as leituras do branco e da amostra. Atravs da equao 1 o valor de transmitncia lido da amostra convertido em absorbncia. O valor encontrado para a absorbncia foi tabelado conforme descrito na tabela 2 acima. Com este valor podemos ento pela equao 2 obtida no grfico encontrar o valor da amostra desconhecida.

y 0,8966 x 0,033 0,659556 0,8966 x 0,033 x 0,772425

Onde: x: o valor da concentrao em g/L; y: o valor da absorbncia; Isto indica que a concentrao encontrada da amostra desconhecida de aproximadamente 0,77g/L de glicose.

6. CONCLUSO
Devido prtica realizada em laboratrio percebemos que o mtodo do DNS uma medida rpida e eficaz. A concentrao encontrada na amostra desconhecida foi de 0,77g/L, e pode-se provar que este um valor bastante confivel visto que o coeficiente de correlao linear foi de 0,994. O mtodo do DNS considerado um mtodo barato e conveniente, entretanto a sua especificidade baixa, podendo haver muitos interferentes durante a identificao da reao. Desta forma necessrio para cada anlise construir uma curva padro para poder minimizar estes possveis interferentes.

7. REVISO BIBLIOGRFICA
BOBIO, Paulo A.; BOBIO, Florinda O. Introduo a Qumica de Alimentos. So Paulo: Editora Livraria Varela, 2003; LEHNINGER, Albert L. Bioqumica; So Paulo: Editora Edgard Blucher LTDA,1976 ; OLIVEIRA, Eduardo Augusto de. Controle de qualidade em refrigerante. Londrina, 2007. Disponvel em: <http://www2.uel.br/pos/engproducao/arquivos/Eduardo_Oliveira.pdf> acesso em 26 mar. 2010. PERRY, R. H. ; GREEN, D. W. . Perrys Chemical Engeneering Handbook. 6 Ed. . Editora McGraw Hill. 1984; SKOOG & WEST. Princpios de Anlise Instrumental. New York: Editora Holt Reinhardt Winston, 1971.

ANEXO 1
Perguntas relacionadas ao Artigo Cientfico: 2a. Acar invertido uma mistura de aucares em soluo, constituda principalmente de glicose, frutose e sacarose. Esta reao pode ser catalisada por enzimas, por cidos ou por resinas trocadoras de ctions. Essas propriedades tem como vantagem a contribuio no aumento do valor de xaropes, para uso em vrios produtos alimentcios, sobretudo na industria de refrigerantes. b. Para a produo do acar invertido, dois mtodos de inverso de sacarose podem ser usados: a hidrlise enzimtica, catalisada pela enzima invertase e a hidrlise cida, catalisada por um cido. A acidez gerada na hidrlise cida pode ser devido ao direta de um cido (hidrlise homognea) ou atravs da liberao de H+ da resina catinica (hidrlise heterognea). O meio cido promovido pela resina catinica pode causar perde de acar por degradao do mesmo, levando formao do hidroximetil furfural (HMF) com conseqente desenvolvimento de cor do xarope. Isso pode ser minimizado se o tempo de residncia do xarope na coluna e a temperatura do processo se mantiverem baixas. A inverso do acar provoca a quebra da sacarose em dois acares que formam a sua molcula: glicose e frutose. A frmula da reao qumica a seguinte: C12H22O11 (sacarose) + H2O (gua) = C6H12O6 (glicose) + C6H12O6 (frutose). O termo invertido decorre de uma caracterstica fsica da sacarose, que se altera nesse processo: originalmente, um raio de luz polarizada que incide sobre a sacarose gira para a direita. Aps o processamento de inverso, a luz desvia para a esquerda. Para obteno de um xarope invertido de elevada qualidade, deve haver uma etapa de descolorao e outra de inverso, usando como variveis a concentrao de sacarose, o fluxo atravs da coluna de resina de troca-inica e a temperatura do processo.

Esquema do sistema de descolorao

Esquema do sistema na inverso do xarope c. Concordamos com a expresso usada na equao trs para o clculo da concentrao de acar, pois podemos usar a massa especfica da soluo como forma de simplificao na equao, j que a concentrao em graus brix P/P. Assim chegamos na dimenso desejada concentrao da amostra diluda (g/ml).

d.

.....

e. A dosagem de sacarose, frutose e glicose foi feita por Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE), equipado com detector de ultra-violeta (Waters 486) a 280nm. 15L das amostras foram eludos atravs de uma coluna C-18 de 250 x 4,6mm 5 utilizando como eluente uma mistura de gua: metanol 90:10 a 1,0 mL/min. O sistema de integrao usado foi o Milenium. Esta tcnica cromatogrfica utiliza a fase mvel alta presso. Atravs das altas presses se consegue uma reduo do dimetro das partculas da fase estacionria, encontrada no interior da coluna cromatogrfica. O uso de partculas menores (na ordem de 5,0 m) no recheio da coluna implica em uma rea superficial, o stio de adsoro, maior (geralmente da ordem de centenas de metros quadrados por grama de fase estacionria), o que resulta em uma separao mais eficiente dos componentes da amostra. Essa "miniaturizao" das partculas da coluna possibilita o uso de colunas menores, volumes menores de amostras e um gasto menor de fase mvel. Com isso, em cromatografia lquida de alta eficincia trabalha-se na faixa dos microlitros (L).

CLAE, em ingls: High Performance/Pressure Liquide Chromatography, HPLC

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE ESCOLA DE QUMICA E ALIMENTOS

RELATRIO TCNICO CIENTFICO Disciplina de Bioqumica Industrial Professor Andr Burkert

Determinao de Acares Redutores pelo mtodo do DNS

Ana Carolina Butzke 40726 Caroline Lindemann 40755 Thiago Carvalho 41400 Vanessa Wendt Schmidt 40748

Rio Grande, Abril de 2010