Universidade Federal de Santa Catarina

Departamento de Química

Cromatografia líquida
de alta eficiência

Aula de: Michelle Barcellos

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Professor: Ivan Gonçalves de Souza
Cromatografia líquida de alta
eficiência

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 Modalidades e Classificação
Cromatografia
Líquida
Líquida

Fase
Móvel Cromatografia
Gasosa (CG)

Gás
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Introdução à cromatografia
líquida
Vantagens da técnica Limitações da técnica
• Versatilidade • Alto custo do instrumento
• Sensibilidade • Alto custo de operação
• Resultados quantitativos • Falta de detector universal sensível
• Espécies não-voláteis e termolábeis • Necessidade de experiência no seu
• Automatização manuseio

Comparações entre CG e HPLC

Fator GC HPLC

Requisito p/ amostra Volátil e termicamente estável Solúvel na fase móvel

Tipos de amostra Gases, líquido e sólidos Líquidos e sólidos

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Introdução à cromatografia líquida
Equipamento de HPLC

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Introdução à cromatografia líquida
Instrumentação para HPLC

Injetor
fase móvel
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Introdução à cromatografia líquida
Instrumentação para HPLC

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Instrumentação para HPLC
Fase móvel

Reservatório da Fase Móvel

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Instrumentação para HPLC
Fase móvel

Características da fase móvel

• Alto grau de pureza ou fácil purificação;
• Dissolver a amostra sem decompor seus componentes;
• Não decompor ou dissolver a fase estacionária;
• Ter baixa viscosidade;
• Ser compatível com o tipo de detector;
• Polaridade adequada para permitir a separação dos componentes da
amostra.

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Instrumentação para HPLC
Bomba para HPLC

Bomba

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Instrumentação para HPLC
Bomba para HPLC

Sistema de bombeamento
REQUISITOS:

• Vazão contínua, sem pulsos

(ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos);
• Vazões de 0,1 a 10 ml/min
• Controle de vazão e reprodutibilidade melhor que 1 %;
• Inércia química: componentes resistente à corrosão.

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Instrumentação para HPLC
Inejtor para HPLC

Injetor
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Instrumentação para HPLC
Inejtor para HPLC

Sistema de injeção Loop

• Loop de 0,5 a 500 µL

• Reprodutível

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Instrumentação para HPLC
Inejtor para HPLC

Preenchendo o Loop (Load)

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Instrumentação para HPLC
Inejtor para HPLC

Injetando no Loop

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Instrumentação para HPLC
Colunas para HPLC

Coluna
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Instrumentação para HPLC
Colunas para HPLC

Pré-colunas

• Pequena e de constituição similar à da coluna analítica

• Retém:
• Material particulado
• Contaminantes do solvente
• Componentes da amostra que se ligam irreversivelmente à fase estacionária.
• Custo reduzido

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Instrumentação para HPLC

Características das colunas de HPLC

Geralmente em aço inox
Coluna empacotada
Preço: > R$ 1.500,00

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Cromatografia líquida de alta eficiência
Tipos de interação soluto/fase estacionária

Fase normal
Si-OH + R3SiCl Si-O-Si-(CH3)2R + HCl

••
OH Ciano (-C2H4CN)

Si R= Diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH)
silanol livre
Amina (–C3H6NH2)
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Cromatografia líquida de alta eficiência
Tipos de interação soluto/fase estacionária

Fase reversa – Fase ligada

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Cromatografia líquida de alta eficiência
Tipos de interação soluto/fase estacionária

Cromatografia Quiral
Separação de isômeros ópticos

Fase estacionária: ciclodextrinas, éteres de coroa;

Fase móvel: tampões, solventes polares, seletores quirais;

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Cromatografia líquida de alta eficiência

Tipos de eluição
Separação isocrática ou por gradiente

A eluição isocrática é feita com um único solvente (ou

mistura de solventes).

Se um solvente não propiciar uma eluição

suficientemente rápida de todos os componentes, então
pode ser utilizada uma eluição por gradiente.

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Cromatografia líquida de alta eficiência
Separação isocrática

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Cromatografia líquida de alta eficiência
Separação isocrática

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Cromatografia líquida de alta eficiência
Separação isocrática

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Cromatografia líquida de alta eficiência
Separação por gradiente

Com base nas eluições isocráticas foi elaborado o gradiente a seguir.

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Cromatografia líquida de alta eficiência
Separação por gradiente

30% ACN

40 % MeOH 32% de THF

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Cromatografia líquida de alta eficiência
Monógrafo

Porcentagem de volume de solvente com mesma força.

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Instrumentação para HPLC
Detectores para HPLC

Detector 29
Instrumentação para HPLC
Detectores para HPLC

Características ideais para o detector

A sensibilidade deve ser compatível com a concentração do analito na amostra.

Detector universal

Detector seletivo:

Permite detectar uma de duas ou mais espécies que coeluam.

Em geral, melhor linha base.

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Instrumentação para HPLC
Detectores para HPLC

Características ideais para o detector

Ampla faixa linear:

Maior comodidade no dimensionamento do volume de amostra.

Analisar em uma mesma corrida cromatográfica espécies de concentrações diferentes.

Baixo volume interno

Grande volume: Alargamento dos picos registrados.

Resposta Rápida

Sinal que represente o exato instante de detecção.

Detector lento: Picos deformados (baixo e largo) e com cauda longa. 31
Instrumentação para HPLC
Detectores para HPLC

Detector por espectrofotometria UV-visível

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Instrumentação para HPLC
Detectores para HPLC

Detector por arranjo de diodos - DAD

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Instrumentação para HPLC
Resultado da detecção - Cromatograma

Detector por arranjo de diodos - DAD

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Instrumentação para HPLC
Resultado da detecção – Cromatograma em 3D

Detector por arranjo de diodos - DAD

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Referências

1. COLLINS, C.; BRAGA, G.L.; BONATO, P.S. Fundamentos de

Cromatografia. 1ª reimpressão.. Editora da UNICAMP - Campinas:
Editora da UNICAMP, 2007.

2. SKOOG, D. A., WEST, D. N. Fundamentos de Química Analítica.

Barcelona : Reverte, 1974.

3. SKOOG, D. A., HOLLER, F. J., NIEMAN, T. A. Principles of

instrumental analysis. Philadelphia: Saunders College Publishing ,
c1998

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