CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA

De acordo com a farmacopeia brasileira 6ª ed:

"O fator de retenção, k, é a razão entre a quantidade da substância com afinidade pela fase estacionária e a
quantidade com afinidade pela fase móvel. Quanto maior a afinidade da substância pela fase estacionária
maior a sua retenção."

Fase móvel

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma técnica de separação

utilizadas somente para fins qualitativos e quantitativos.
 destrutivo

Os principais detectores utilizados em cromatógrafos líquidos (CLAE) são:

 Espectrofotômetros UV-VIS (espectroscopia de absorção molecular);
 Detector de Fluorescência (espectroscopia de emissão molecular);
 Detector por espalhamento de luz;
 Detectores eletroquímicos (ex: amperométrico, condutométrico, polarográfico e potenciométrico, detector
sensível à constante dielétrica);
 Detector de índice de refração;
 Espectrômetro de massa.

Menos polar
Na cromatografia em fase reversa, a fase estacionária (FE) é de baixa polaridade (+ apolar), logo, os
constituintes da fase móvel (FM) deverão ser os mais polares possíveis.

eluente = fase móvel

Para fins qualitativo e quantitativo

 menor

Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) pode ser definida pelo mecanismo de separação ou pelo tipo de fase
estacionária:
• partição ou cromatografia líquido-líquido;
• adsorção ou cromatografia líquido-sólido;
• troca iônica ou cromatografia de íons;
• cromatografia por exclusão;
• cromatografia por afinidade;
• cromatografia quiral. 
CLAE NORMAL: Fase estacionaria é mais polar que a fase móvel.
A CLAE tem como principal característica a utilização de ALTA PRESSÃO, esta aumenta a eficiência do método em
muito.
Outro ponto é que esse tipo de técnica pode ser realizado com uma coluna de FASE NORMAL (fase estacionária é
POLAR) ou EM FASE REVERSA (fase estacionária é APOLAR).
A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é adequada à separação de espécies não voláteis ou termolábeis.
Na cromatografia gasosa é adequadas para separação de espécies voláteis.
 menor

COMPOSTO MAIS APOLAR

Fase estacionária APOLAR

hidrocarboneto - apolar
COMPOSTO MAIS POLAR

Fase móvel POLAR

metanol - polar
Método isocrático quer dizer composição da fase móvel constante, enquanto o gradiente significa que está
composição varia ao longo da corrida analítica. Dizer que isocrático é usar um único solvente está errado,
assim como não é correto dizer que o gradiente é uma mistura de dois solventes. (poder ser mais de dois)
COLUNA DE FASE NORMAL - FASE ESTACIONÁRIA POLAR; FASE MÓVEL APOLAR. É
empregado, geralmente em substâncias polares.
COLUNA DE FASE REVERSA - FASE ESTACIONÁRIA APOLAR; FASE MÓVEL POLAR. É
empregado, geralmente em substâncias Apolares (que é o caso de hidrocarbonetos que são compostos
orgânicos.
A FASE MÓVEL DO HPLC TEM QUE SER DE ALTO GRAU DE PUREZA, porém é necessário
lembrar que a cromatografia gasosa exige um grau mais elevado de pureza.
ítem A - Princípio do Real time PCR
ítem B - Cromatografia líquida (coluna ou CLAE)
ítem C - Absorção/emissão atômica
ìtem D - CG
ítem E - Pode sim, usando uma técnica de eliminação de solvente como Electrospray ou MALDI.
(Partículas regulares na fase estacionária. Por que isso aumenta a eficiência? Essas partículas estão relacionadas ao
recheio que compõem a fase estacionária, quando mais regulares, uniformes e pequenas, menor será o tempo em
que as moléculas, relacionadas à determinado analito, levaram para alcançar a superfície, ou seja, terão menos
caminhos para percorrer até atingirem o detector. Isso resulta em um menor alargamento da banda cromatográfica, e
consequentemente uma maior eficiência.
Os detectores UV-Vis são mais comuns na CLAE - cromatografia líquida de alta eficiência - ou HPLC, em inglês.

a)  separação cromatográfica tem base no princípio da atração eletromagnética entre os componentes da amostra

e a fase estacionária. ERRADA
A atração eletromagnética é um fenômeno físico que é induzido por corrente elétrica em um solenóide, espira ou
similar. Este tipo de separação ocorre quando temos cargas sendo formadas como por exemplo em espectrometria de
massas. Na cromatografia não temos este tipo de separação uma vez que nas diferentes modalidades temos interação
físico-química entre fase estacionária e móvel a depender da polaridade do soluto a ser separado.

b)  separação cromatográfica tem base no princípio da adsorção diferencial dos componentes da amostra com a
fase estacionária. CERTA
A diferença do grau de adsorção é expresso na forma do Fator de Retenção (Rf) que é dado pela relação entre a
distância de cada componente da mistura em relação a linha da aplicação da amostra e a frente de progressão da fase
móvel.

c)  separação cromatográfica tem base no princípio da diferença de solubilidades entre os componentes da

amostra e o solvente. ERRADA
Esta definição se encaixa melhor na operação unitária chamada extração. Na cromatografia nos interessa a aderência
entre os componentes da amostra com a fase estacionária e com o solvente da fase móvel que será utilizada para eluir
a amostra.

d)  fase móvel é polar na cromatografia líquida de fase reversa. ERRADA (obs.: em outras bancas seria
considerado correto dizer que a fase REVERSA tem FE APOLAR e a FM POLAR)
acho que esta banca considerou errada, porque o correto mesmo é falar que a fase móvel é mais polar quando
comparado com a fase estacionária na cromatografia líquida de fase reversa, pois ela precisa ter uma polaridade
suficiente para que os compostos possam ser eluidos. Mas essa questão foi bem atípica, porque praticamente todas as
bancas consideram essa alternativa como correta.

e)  cromatografia líquida de alta eficiência é conhecida por usar sistemas em baixa pressão. ERRADA
Pelo contrário, todo o desenvolvimento da cromatografia líquida de alta eficiência se dá no sentido de aumentar a
pressão da coluna para que os componentes da amostra sejam melhor separados.

estreitos

Pireno e estireno são componentes apolares. E a fase estacionaria nesse caso é apolar. A fase móvel polar.
 Fase móvel apolar

1 é a mais apolar é igual a fase móvel por isso sai primeiro, A 5 é mais polar igual a fase estacionaria.
 Para fase reversa

a) É utilizada pra determinação de compostos não-voláteis.

d) Esses detectores são mais indicados para CLAE.

Fase estacionária apolar

hidrocarboneto
Descendente

Perceba que é fase reversa. A fase móvel é polar e arrasta a substância em primeiro lugar pois é a mais polar. A
retenção nesse caso é baixa.
Detectores de CLAE
1.Detector de UV-visível (espectrofotométrico)
2.Detector de Fluorescência (fluorimétrico)
3.Detector de índice de refração (RI - Refrative index)
4.Detector eletroquímico (amperométrico)
5.Detector condutimétrico
6.Espectrômetro de massas
OBS: O detector de condutividade térmica é utilizado em Cromatografia Gasosa.