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SIXTH COMMISSION DIRECTIVE 95/32/EC of 7 July 1995 relating to methods of analysis necessary for checking the composition of cosmetic products (Text with EEA relevance) THE COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES, Having regard to the Treaty establishing the European Community, Having regard to Council Directive 76/768/EEC of 27 July 1976 on the approximation of the laws of the Member States relating to cosmetic products (1), as last amended by Commission Directive 94/32/EC (2), and in particular Article 8 (1) thereof, Whereas Directive 76/768/EEC provides for the official testing of cosmetic products with the aim of ensuring that the conditions laid down by Commission provisions concerning the composition of cosmetic products are satisfied;

SEXTA DIRECTIVA 95/32/CE DA COMISSO de 7 de Julho de 1995 relativa aproximao das legislaes dos Estados-membros respeitantes aos mtodos de anlise necessrios para a fiscalizao da composio dos produtos cosmticos (Texto relevante para efeitos do EEE) A COMISSO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS, Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,

Tendo em conta a Directiva do Conselho 76/768/CEE, relativa aproximao das legislaes dos Estados-membros respeitantes aos produtos cosmticos (1), com a ltima redaco que lhe foi dada pela Directiva 94/32/CEE da Comisso (2), e, nomeadamente, o n 1 do seu artigo 8, Considerando que a Directiva 76/768/CEE prev fiscalizaes oficiais dos produtos cosmticos destinadas a assegurar que sejam respeitadas as condies previstas nas disposies comunitrias relativas composio dos produtos cosmticos; Whereas all the necessary methods of analysis should be laid down as quickly as possible; whereas certain methods Considerando que importa definir o mais rapidamente possvel todos os mtodos de anlise necessrios e que alguns have already been adopted in Commission Directives 80/1335/EEC (3), as amended by Directive 87/143/EEC (4), mtodos j foram adoptados pela Directiva 80/1335/CEE da Comisso (3), com a redaco que lhe foi dada pela 82/434/EEC (5), as amended by Directive 90/207/EEC (6), 83/514/EEC (7), 85/490/EEC (8) and 93/73/EEC (9); Directiva 87/143/CEE (4), pela Directiva 82/434/CEE da Comisso (5), com a redaco que lhe foi dada pela Directiva 90/207/CEE (6), e pelas Directivas da Comisso 83/514/CEE (7), 85/490/CEE (8) e 93/73/CEE (9); Whereas the identification and determination of benzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid, sorbic acid, salicylic acid and Considerando que a identificao e o doseamento do cido benzico, do cido 4-hidroxibenzico, do cido srbico, do propionic acid in cosmetic products and the identification and determination of hydroquinone, hydroquinone cido saliclico e do cido propinico nos produtos cosmticos e a identificao e o doseamento da hidroquinona, do ter monomethylether, hydroquinone monoethylether and hydroquinone monobenzylether in cosmetic products constitute a monometlico da hidroquinona, do ter monoetlico da hidroquinona e do ter monobenzlico da hidroquinona nos sixth step; produtos cosmticos constituem a sexta fase; Whereas the measures provided for in this Directive are in accordance with the opinion of the Committee on the Considerando que as medidas previstas na presente directiva esto conformes com o parecer do Comit para a adaptation of Directive 76/768/EEC to technical progress, adaptao ao progresso tcnico da Directiva 76/768/CEE, HAS ADOPTED THIS DIRECTIVE: ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:

Article 1 Member States shall take all the necessary steps to ensure that during official testing of cosmetic products:

Artigo 1

Os Estados-membros tomaro todas as medidas necessrias para que, aquando das fiscalizaes oficiais dos produtos cosmticos: - identification and determination of benzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid, sorbic acid, salicylic acid and propionic acid, - a identificao e o doseamento do cido benzico, do cido 4-hidroxibenzico, do cido srbico, do cido saliclico e do cido propinico, - identification and determination of hydroquinone, hydroquinone monomethylether, hydroquinone monoethylether and - a identificao e o doseamento da hidroquinona, do ter monometlico da hidroquinona, do ter monoetlico da hydroquinone monobenzylether, hidroquinona e do ter monobenzlico da hidroquinona, shall be carried out in accordance with the methods described in the Annex. sejam efectuados segundo os mtodos descritos no anexo. Artigo 2

Article 2

1. Member States shall bring into force the laws, regulations and administrative provisions necessary to comply with this 1. Os Estados-membros poro em vigor as disposies legislativas, regulamentares e administrativas necessrias para Directive no later than 30 September 1996. They shall forthwith inform the Commission thereof. darem cumprimento s disposies da presente directiva at 30 de Setembro de 1996. Desse facto informaro imediatamente a Comisso. When Member States adopt these provisions, these shall contain a reference to this Directive or shall be accompanied As disposies adoptadas pelos Estados-membros faro referncia presente directiva ou sero acompanhadas de tal by such reference at the time of their official publication. The procedure for such reference shall be adopted by Member meno aquando da sua publicao. Caber aos Estados-membros determinar o procedimento relativo referncia em States. questo. 2. Member States shall communicate to the Commission the provisions of national law which they adopt in the field 2. Os Estados-membros comunicaro Comisso o texto das disposies de direito nacional que adoptarem no domnio covered by this Directive. regulado pela presente directiva. Article 3 This Directive shall enter into force on the 20th day following its publication in the Official Journal of the European Communities. Article 4 This Directive is addressed to the Member States. Done at Brussels, 7 July 1995. For the Commission Emma BONINO Member of the Commission (1) OJ No L 262, 27. 9. 1976, p. 169. (2) OJ No L 181, 15. 7. 1994, p. 31. (3) OJ No L 383, 31. 12. 1980, p. 27. (4) OJ No L 57, 27. 2. 1987, p. 56. (5) OJ No L 185, 30. 6. 1982, p. 1. (6) OJ No L 108, 28. 4. 1990, p. 92. (7) OJ No L 291, 24. 10. 1983, p. 9. (8) OJ No L 295, 7. 11. 1985, p. 30. (9) OJ No L 231, 14. 9. 1993, p. 34. Artigo 3 A presente directiva entra em vigor no vigsimo dia seguinte ao da sua publicao no Jornal Oficial das Comunidades Europeias. Artigo 4 Os Estados-membros so os destinatrios da presente directiva. Feito em Bruxelas, em 7 de Julho de 1995. Pela Comisso Emma BONINO Membro da Comisso (1) JO n L 262 de 27. 9. 1976, p. 169. (2) JO n L 181 de 15. 7. 1994, p. 31. (3) JO n L 383 de 31. 12. 1980, p. 27. (4) JO n L 57 de 27. 2. 1987, p. 56. (5) JO n L 185 de 30. 6. 1982, p. 1. (6) JO n L 108 de 28. 4. 1990, p. 92. (7) JO n L 291 de 24. 10. 1983, p. 9. (8) JO n L 295 de 7. 11. 1985, p. 30. (9) JO n L 231 de 14. 9. 1993, p. 34.

ANNEX I. IDENTIFICATION AND DETERMINATION OF BENZOIC ACID, 4-HYDROXYBENZOIC ACID, SORBIC ACID, SALICYLIC ACID AND PROPIONIC ACID IN COSMETIC PRODUCTS 1. Scope and field of application The method is applicable to the identification and determination of benzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid, sorbic acid, salicylic acid and propionic acid in cosmetic products. Separate procedures describe the identification of these preservatives; the determination of propionic acid; and the determination of 4-hydroxybenzoic acid, salicylic acid, sorbic acid and benzoic acid. 2. Definition The amounts of benzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid, salicylic acid, sorbic acid and propionic acid determined by this method are expressed as percentage by mass of the free acids. A. IDENTIFICATION 1. Principle Following acid/base extraction of the preservatives, the extract is analysed by thin layer chromatography (TLC) employing on-date derivatization. Depending on the results, the identification is confirmed by high performance liquid chromatography (HPLC) or, in the case of propionic acid, by gas chromatography (GC). 2. Reagents 2.1. General All reagents must be of analytical purity. Water used must be distilled water, or water of at least equivalent purity 2.2. Acetone 2.3. Diethyl ether 2.4. Acetonitrile 2.5. Toluene 2.6. n-Hexane 2.7. Paraffin, liquid 2.8. Hydrochloric acid, 4 M 2.9. Potassium hydroxide, aqueous, 4 M 2.10. Calcium chloride, CaCl2.2H2O 2.11. Lithium carbonate, Li2CO3 2.12. 2-Bromo-2′-acetonaphthone

ANEXO I. IDENTIFICAO E DETERMINAO DO CIDO BENZICO, DO CIDO 4-HIDROXIBENZICO, DO CIDO SRBICO, DO CIDO SALICLICO E DO CIDO PROPINICO NOS PRODUTOS COSMTICOS 1. Objectivo e mbito de aplicao O mtodo utilizvel para a identificao e determinao do cido benzico, do cido 4-hidroxibenzico, do cido srbico, do cido saliclico e do cido propinico nos produtos cosmticos. Em procedimentos separados descrita a identificao destes conservantes, a determinao do cido propinico e a determinao do cido 4-hidroxibenzico, do cido saliclico, do cido srbico e do cido benzico. 2. Definio Os teores em cido benzico, cido 4-hidroxibenzico, cido saliclico, cido srbico e cido benzico determinados segundo este mtodo, so expressos em percentagem por massa dos cidos livres. A. IDENTIFICAO 1. Princpio Aps a extraco cido/base dos conservantes, o extracto analisado por cromatografia de camada fina utilizando uma placa de derivatizao. Com base nos resultados obtidos, a identificao confirmada por cromatografia em fase lquida de elevada resoluo ou, no caso do cido propinico, por cromatografia em fase gasosa. 2. Reagentes 2.1. Geral Todos os reagentes devem ser analiticamente puros. Dever ser utilizada gua destilada ou de pureza equivalente. 2.2. Acetona 2.3. ter dietlico 2.4. Acetonitrilo 2.5. Tolueno 2.6. Hexano-n 2.7. Parafina lquida 2.8. cido clordrico, 4M 2.9. Hidrxido de potssio, aquoso, 4M 2.10. Cloreto de clcio, Ca CI2 7 2H2O 2.11. Carbonato de ltio, Li2CO3 2.12. 2-bromo-2′-acetonaftona

http://eur-lex.europa.eu/Notice.do?mode=dbl&lang=en&ihmlang=en&lng1=en,pt&lng2=bg,cs,da,de,el,en,es,et,fi,fr,hu,it,lt,lv,mt,nl,pl,pt,ro,sk,sl,sv,&val=307214:cs

06/05/2013

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2.13. 4-Hydroxybenzoic acid 2.14. Salicylic acid 2.15. Benzoic acid 2.16. Sorbic acid 2.17. Propionic acid 2.18. Reference solutions Prepare 0,1 % (m/v) solutions (100 mg/100 ml) of each of the five preservatives (2.13 to 2.17) in diethyl ether 2.19. Derivatization reagent 0,5 % (m/v) solution of 2-bromo-2′-acetonaphthone (2.12) in acetonitrile (2.4) (50 mg/10 ml). This solution should be prepared weekly and stored in a refrigerator 2.20. Catalyst solution 0,3 % (m/v) solution of lithium carbonate (2.11) in water (300 mg/100 ml). This solution should be freshly prepared 2.21. Development solvent Toluene (2.5)/A cetone (2.2) (20:0,5, v/v) 2.22. Liquid paraffin (2.7)/n-hexane (2.6) (1:2, v/v) 3. A pparatus Ordinary laboratory equipment 3.1. Water bath, capable of maintaining a temperature of 60 C 3.2. Developing tank 3.3. Ultraviolet light source, 254 and 366 nm 3.4. Thin layer plates, Kieselgel 60, without fluorescence indicator, 20 20 cm, layer thickness 0,25 mm with concentrating zone 2,5 20 cm (Merck 11845, or equivalent) 3.5. Microsyringe, 10 l 3.6. Microsyringe, 25 l 3.7. Oven, capable of maintaining temperatures up to 105 C 3.8. 50-ml glass tubes with screw cap 3.9. Filter paper, diameter 90 mm, Schleicher & Schull, Weissband No 5892, or equivalent 3.10. Universal pH indicator paper, pH 1-11 3.11. 5-ml glass sample vials 3.12. Rotating film evaporator (Rotavapor or equivalent) 3.13. Hot plate 4. Procedure 4.1. Sample prepartion

2.13. cido 4-hidroxibenzico 2.14. cido saliclico 2.15. cido benzico 2.16. cido srbico 2.17. cido propinico 2.18. Solues de referncia: Preparar solues (100 mg/100 ml) a 0,1 % (m/v) de cada um dos cinco conservantes (2.13 a 2.17) em ter dietlico. 2.19. Reagente de derivatizao: Soluo a 0,5 % (m/v) de 2-bromo-2′-acetonaftona (2.12) em acetonitrilo (2.4) (50 mg/10 ml). Esta soluo dever ser preparada todas as semanas e guardada no frigorfico. 2.20. Soluo catalisadora: Soluo a 0,3 % (m/v) de carbonato de ltio (2.11) em gua (300 mg/100 ml). Esta soluo dever ser preparada de novo. 2.21. Solvente para revelao: Tolueno (2.5)/acetona (2.2) (20:0,5, v/v) 2.22. Parafina lquida (2.7)/hexano-n (2.6) (1:2, v/v) 3. Material Equipamento habitual de laboratrio. 3.1. Banho-maria que se possa manter temperatura de 60 C 3.2. Tina para revelao 3.3. Fonte de luz ultravioleta, 254 e 366 nm 3.4. Placas de camada fina, Kieselgel 60, sem indicador de fluorescncia, 20 20 cm, camada de 0,25 mm de espessura com zona de concentrao de 2,5 20 cm (Merck 11845 ou equivalente) 3.5. Micro-seringa, 10 l 3.6. Micro-seringa, 25 l 3.7. Forno que possa manter temperaturas at 105 C 3.8. Tubos de vidro de 50 ml com tampas de rosca 3.9. Filtro de papel, 90 mm de dimetro, Schleider & Schull, Weissband n 5892 ou equivalente 3.10. Papel indicador universal de ph 1-11 3.11. Frasco para amostras, em vidro, de 5 ml 3.12. Evaporador com camada rotativa (Rotavapor ou equivalente) 3.13. Placa quente 4. Metodologia

Weigh approximately 1 g of the sample into a 50-ml glass tube with screw cap (3.8). A dd four drops of hydrochloric acid 4.1. Preparao da amostra 4 M (2.8) and 40 ml acetone (2.2). For strongly basic products such as toilet soap, 20 drops of hydrochloric acid 4 M (2.8) should be added. Check that the pH is approximately two, using indicator paper (3.10). Close the tube and shake vigorously for one minute. If necessary to facilitate the extrraction of the preservatives into the acetone phase, heat the mixture gently to about 60 Pesar aproximadamente 1 grama da amostra num tubo de vidro de 50 ml com a tampa de rosca (3.8). A dicionar 4 C to melt the liquid phase. gotas de cido clordrico 4M (2.8) e 40 ml de acetona (2.2). Para produtos fortemente bsicos, como o sabonete, adicionar 20 gotas de cido clordrico 4M (2.8). Verificar se o pH aproximadamente 2 utilizando papel indicador (3.10). Tapar o tubo e agitar vigorosamente durante um minuto. Cool the solution to room temperature and filter through a filter paper (3.9) into a conical flask. Se necessrio, para facilitar a extraco dos conservantes para a fase acetona, aquecer progressivamente a mistura at cerca de 60 C para derreter a fase lpida. Transfer 20 ml of the filtrate to a 200-ml conical flask, add 20 ml water and mix. A djust the pH of the mixture to A rrefecer a soluo at atingir a temperatura ambiente e filtrar com um filtro de papel (3.9) para um frasco cnico. approximately 10 with potassium hydroxide 4 M (2.9), using indicator paper (3.10) to measure the pH. justar o pH da A dd 1 g calcium chloride (2.10) and shake vigorously. Filter through a filter paper (3.9) into a 250-ml separating funnel Transferir 20 ml do filtrado para um frasco cnico de 200 ml, adicionar 20 ml de gua e misturar. A mistura com hidrxido de potssio 4M (2.9) at atingir cerca de 10. Utilizar o papel indicador (3.10) para medir o pH. containing 75 ml diethyl ether (2.3) and shake vigorously for one minute. A llow to separate and draw off the aqueous layer into a 250 ml conical flask. Discard the ether layer. Using indicator paper (3.10), adjust the pH of the aqueous solution to approximately two with hydrochloric acid 4 M (2.8). A dd 10 ml diethyl ether (2.3), stopper the flask and shake vigorously for one minute. allow to separate and transfer the ether layer to a rotating film evaporator (3.12). Discard the aqueous layer. Evaporate the ether layer almost to dryness and redissolve the residue in 1 ml of diethyl ether (2.3). Transfer the A dicionar 1 g de cloreto de clcio (2.10) e agitar vigorosamente. Filtrar com um filtro de papel (3.9) para uma ampola solution to a sample vial (3.11). de decantao de 250 ml contendo 75 ml de ter dietlico (2.3) e agitar vigorosamente durante um minuto. Deixar separar e escorrer a camada aquosa para um frasco cnico de 250 ml. Eliminar a camada de ter. Recorrendo a papel reagente (3.10), ajustar o pH da soluo aquosa at aproximadamente 2 com cido clordrico 4M (2.8). A dicionar 10 ml de ter dietlico (2.3), rolhar o frasco e agitar vigorosamente durante um minuto. Deixar separar e transferir a camada de ter para um evaporador rotativo (3.12). Eliminar a camada aquosa. 4.2. Thin layer chromatography Evaporar a camada de ter at ficar quase seca e dissolver novamente o resduo em 1 ml de ter dietlico (2.3). Transferir a soluo obtida para um frasco de amostras (3.11). For each of the references and the samples to be chromatographed, apply approximately 3l lithium carbonate solution 4.2. Cromatografia de camada fina (2.20) and with a syringe (3.5) at equal distances on the start line in the concentration zone of a TLC plate (3.4) and dry in a stream of cold air. Transfer the TLC plate to a hot plate (3.13), heated at 40 C, in order to keep the spots as small as possible. With a Para cada referncia ou amostra a cromatografar, aplicar cerca de 3 l de soluo de carbonato de ltio (2.20) com uma microsyringe (3.5) apply 10 l of each of the reference solutions (2.18) and the sample solution (4.1) to the start line of seringa (3.5) a distncias regulares na linha de partida da zona de concentrao da placa de cromatografia de camada the plate, on the exact spots where the lithium carbonate solution has been applied. fina (3.4) e secar numa corrente de ar frio. Finally apply approximately 15 l derivatization reagent (2.19) (2-bromo-2′-acetonaphthone solution), again on Colocar essa placa sobre uma placa quente (3.13), a 40 C para manter as manchas to pequenas quanto possvel. Com the exact spots where the reference/sample solutions and the lithium carbonate solution have been applied. uma micro-seringa (3.5) aplicar 10 l de cada soluo de referncia (2.18) e da soluo de amostra (4.1) na linha de partida da placa, nos pontos exactos em que a soluo de carbonato de ltio foi aplicada. Heat the TLC plate in an oven (3.7) at 80 C for 45 minutes. A fter cooling, develop the plate in a tank (3.2), that has Finalmente, aplicar cerca de 15 l de reagente de derivatizao (2.19) (soluo de 2-bromo-2′-acetonaftona), equilibrated for 15 minutes (without the use of filter paper lining), using development solvent 2.21 (toluene/acetone), mais uma vez nos pontos em que foram aplicadas as solues de referncia/amostra e a soluo de carbonato de ltio. until the solvent front has reached a distance of 15 cm (this may take approximately 80 minutes). Dry the plate in a stream of cold air and examine the spots obtained under UV light (3.3). To enhance the fluorescence A quecer a placa de cromatografia de camada fina num forno (3.7) a 80 C durante 45 minutos. of the weak spots, the TLC plate may be dipped in liquid paraffin/n-hexane (2.22). 5. Identification Deixar arrefecer a revelar a placa numa tina (3.2) equilibrada durante 15 minutos (sem utilizar filtro), recorrendo a solvente de revelao 2.21 (tolueno/acetona), at a frente do solvente atingir uma distncia de 15 cm (pode demorar aproximadamente 80 minutos). Calculate the Rf for each spot. Secar a placa numa corrente de ar frio e examinar as manchas obtidas sob luz ultra-violeta (UV) (3.3). Para permitir a fluorescncia das manchas fracas, mergulhar a placa de cromatografia fina em parafina/hexano-n (2.22). Compare the Rf and the behaviour under UV radiation obtained for the sample with that obtained for the reference 5. Identificao solutions. Draw a preliminary conclusion about the presence and identity of the preservatives present. Perform the HPLC described Calcular o Rf para cada mancha: in Section B, or, when it appears that propionic acid is present, the GC described in Section C. Compare the retention times obtained with those of the reference solutions. Combine the results from the TLC and HPLC or GC and base the final identification of the preservatives present in the Comparar o Rf e o comportamento sob raios UV obtido para a amostra com os valores obtidos para as solues de sample on the combined results. referncia. B. DETERMINA TION OF BENZOIC A CID, 4-HYDROXYBENZOIC A CID, SORBIC A CID A ND SA LICYLIC A CID Tirar concluses preliminares relativamente presena e identidade dos conservantes presentes. Proceder cromatografia lquida de elevada resoluo descrita na parte B ou, se se verificar a presena de cido propinico, cromatografia em fase gasosa descrita na parte C. Comparar os tempos de reteno obtidos para a amostra com os das solues de referncia. 1. Principle Combinar os resultados da cromatografia de camada fina com os da cromatografia lquida de elevada resoluo ou da cromatografia em fase gasosa. Basear na anlise dos resultados combinados a identificao dos conservantes presentes na amostra. A fter acidification, the sample is extracted with a mixture of ethanol and water. Following filtration the preservatives are B. DETERMINA O DO CIDO BENZICO, DO CIDO 4-HIDROXIBENZICO, DO CIDO SRBICO E DO CIDO determined by high performance liquid chromatography (HPLC). SA LICLICO 2. Reagents 1. Princpio 2.1. A ll reagegnts must be of analytical purity, and suitable for HPLC where appropriate. Water used must be distilled water, or water of at least equivalent purity 2.2. Ethanol, absolute 2.3. 4-Hydroxybenzoic acid 2.4. Salicylic acid 2.5. Benzoic acid 2.6. Sorbic acid 2.7. Sodium acetate, (CH3COONa.3H2O) 2.8. A cetic acid, ()04= 1,05 g/ml 2.9. A cetonitrile 2.10. Sulfuric acid, 2 M 2.11. Potassium hydroxide, aqueous, 0,2 M 2.12. 2-Methoxybenzoic acid 2.13. Ethanol/water mixture Mix nine volumes of ethanol (2.2) and one volume of water (2:1) 2.14. Internal standard solution Prepare a solution containing approximately 1 g 2-methoxybenzoic acid (2.12) in 500 ml ethanol/water mixture (2.13) 2.15. Mobile phase for HPLC 2.15.1. A cetate buffer: to 1 l of water add 6,35 g sodium acetate (2.7) and 20,0 ml acetic acid (2.8) and mix 2.15.2. Prepare the mobile phase by mixing nine volumes acetate buffer (2.15.1) and one volume acetonitrile (2.9) 2.16. Preservative stock solution A ps a acidificao, a amostra extrada com uma mistura de etanol e gua. Depois da filtrao, os conservantes so determinados atravs da cromatografia lquida de elevada resoluo. 2. Reagentes 2.1. Todos os reagentes devem ser analiticamente puros e apropriados para cromatografia lquida de elevada resoluo quando necessrio. Dever ser utilizada gua destilada ou de pureza equivalente. 2.2. Etanol, absoluto 2.3. cido 4-hidroxibenzico 2.4. cido saliclico 2.5. cido benzico 2.6. cido srbico 2.7. A cetato de sdio, (CH3COONa 7 3H2O) 2.8. cido actico, d204 = 1,05 g/ml 2.9. A cetonitrilo 2.10. cido sulfrico, 2M 2.11. Hidrxido de potssio, aquoso, 0,2M 2.12. cido 2-metoxibenzico 2.13. Mistura etanol/gua: misturar 9 volumes de etanol (2.2) e 1 volume de gua (2.1). 2.14. Soluo de referncia interna: preparar uma soluo contendo cerca de 1 g de cido 2-metoxibenzico (2.12) em 500 ml de mistura de etanol/gua (2.13). 2.15. Fase mvel para cromatografia lquida de elevada resoluo. 2.15.1. A cetato tampo: acresentar 6,35 g de acetato de sdio (2.7) e 20,0 ml de cido actico (2.8) a 1 litro de gua e

http://eur-lex.europa.eu/Notice.do?mode=dbl&lang=en&ihmlang=en&lng1=en,pt&lng2=bg,cs,da,de,el,en,es,et,fi,fr,hu,it,lt,lv,mt,nl,pl,pt,ro,sk,sl,sv,&val=307214:cs

06/05/2013

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misturar. Accurately weigh approximately 0,05 g 4-hydroxybenzoic acid (2.3), 0,2 g salicylic acid (2.4), 0,2 g benzoic acid (2.5) 2.15.2. Preparar a fase mvel, misturando 9 volumes de acetato tampo (2.15.1) com 1 volume de acetonitrilo (2.9). and 0,05 g sorbic acid (2.6) in a 50-ml volumetric flask and make up to volume with ethanol/water mixture (2.13). Store this solution in a refrigerator. The solution is stable for one week 2.17. Standard preservative solutions 2.16. Soluo-base de conservantes Transfer respectively 8,00, 4,00, 2,00, 1,00 and 0,50 ml of the stock solution (2.16) into a series of 20-ml volumetric flasks. To each flask, add 10,00 ml internal standard solution (2.14) and 0,5 ml sulfuric acid 2 M (2.10). Make up to volume with ethanol/water mixture (2.13). These solutions must be freshly prepared 3. Apparatus Usual laboratory equipment not otherwise specified, and: Pesar com exactido cerca de 0,05 g de cido 4-hidroxibenzico (2.3), 0,2 g de cido saliclico (2.4), 0,2 g de cido benzico (2.5) e 0,05 g de cido srbico (2.6) num frasco graduado de 50 ml; perfazer este volume, com mistura de gua/etanol (2.13). Guardar a soluo num frigorfico. A soluo permanecer estvel durante uma semana. 2.17. Solues de referncia de conservantes Transferir da soluo-base (2.16), respectivamente, 8,00, 4,00, 2,00, 1,00 e 0,50 ml para um conjunto de frascos graduados de 20 ml. Em cada frasco, adicionar 10,00 ml de soluo de referncia interna (2.14) e 0,5 ml de cido sulfrico 2M (2.10). Encher, at perfazer os 20 ml, com mistura etanol/gua (2.13). Estas solues devero ser preparadas na altura da utilizao. 3. Material Equipamento habitual de laboratrio, no discriminado, e: 3.1. Banho-maria, regulado a 60 C 3.2. Equipamento de cromatografia lquida, de alta resoluo com detector de UV de comprimento de onda varivel e dispositivo de injeco de 10 l 3.3. Coluna de anlise: ao inoxidvel, comprimento de 12,5-25 cm, dimetro interno de 4,6 mm, cheia com Nucleosil 5C18 ou equivalente 3.4. Papel de filtro, dimetro: 90 mm, Schleicher e Schull, Weissband n 5892 ou equivalente 3.5. Tubos de vidro de 50 ml com tampa de rosca 3.6. Frascos de vidro para amostras, 5 ml 3.7. Granulados para facilitar a ebulio, carborundo, 2-4 mm, ou equivalente 4. Metodologia

3.1. Water bath, set at 60 C 3.2. High performance liquid chromatograph with variable-wavelength UV detector and 10-l injection loop 3.3. Analytical column Stainless steel, length 12,5 to 25 cm, internal diameter 4,6 mm, packed with Nucleosil 5C18, or equivalent 3.4. Filter paper, diameter: 90 mm, Schleicher and Schull, Weissband No 5892, or equivalent 3.5. 50-ml glass tubes with screw cap 3.6. 5-ml glass sample vials 3.7. Boiling chips, carborundum, size 2 to 4 mm, or equivalent 4. Procedure 4.1. Sample preparation 4.1.1. Sample preparation without addition of internal standard

Weigh 1 g of the sample in a 50-ml glass tube with screw cap (3.5). Pipette 1,00 ml sulfuric acid 2 M (2.10) and 40,0 ml 4.1. Preparao da amostra ethanol/water mixture (2.13) into the tube. Add approximately 1 g of boiling chips (3.7), close the tube and shake vigorously for at least one minute until a homogeneous suspension is obtained. To facilitate the extraction of the preservatives into the ethanol phase, place the tube for exactly five minutes in a water bath (3.1) kept at 60 C. Cool the tube immediately in a stream of cold water and store the extract at 5 C for one hour. 4.1.1. Preparao da amostra sem adio interna de referncia. Filter the extract through a filter paper (3.4). Transfer approximately 2 ml of the extract into a sample vial (3.6). Store the extract at 5 C and perform the HPLC determination within 24 hours of preparation. Pesar 1 g da amostra num tubo de vidro de 50 ml com tampa de rosca (3.5). Adicionar com uma pipeta 1,00 ml de cido sulfrico 2M (2.10), 40,0 ml de mistura etanol/gua (2.13). Juntar aproximadamente 1 g de granulados para facilitar a ebulio (3.7), fechar o tubo e agitar vigorosamente durante um minuto, pelo menos, at obter uma suspenso homognea. Colocar o tubo durante 5 minutos exactos em gua a 60 C (3.1) para facilitar a extraco dos conservantes para a fase etanol. Arrefecer imediatamente o tubo num fluxo de gua fria e manter o extracto temperatura de 5 C durante uma hora. Filtrar o extracto com papel de filtro (3.4). Transferir aproximadamente 2 ml do extracto para um frasco de amostras (3.6). Conservar o extracto a 5 C e proceder determinao por cromatografia lquida de elevada resoluo nas 24 horas subsequentes preparao. 4.1.2. Preparao da amostra com adio de referncia interna.

4.1.2. Sample preparation including addition of internal standard

Weigh to three decimal places 1 0,1 g (a grams) of the sample in a 50-ml glass tube with screw cap (3.5). Add by pipette 1,00 ml sulfuric acid 2 M (2.10) and 30,0 ml ethanol/water mixture (2.13). Add approximately 1 g of boiling chips (3.7) and 10,00 ml internal standard solution (2.14). Close the tube and shake vigorously for at least one minute until an homogeneous suspension is obtained. To facilitate extraction of the preservatives into the ethanol phase place the tube for exactly five minutes in a water bath (3.1) kept at 60 C. Cool the tube immediately in a stream of cold water and store the extract at 5 C for one hour.

Filter the extract through a filter paper (3.4). Transfer approximately 2 ml of the filtrate into a sample vial (3.6). Store the filtrate at 5 C and perform the HPLC-determination within 24 hours of preparation. 4.2. High performance liquid chromatography

Pesar com preciso de trs dcimos 1 g 0,1 g (gramas a) da amostra num tubo de vidro de 50 ml com tampa de rosca (3.5). Com uma pipeta, adicionar 1,00 ml de cido sulfrico 2M (2.10) e 30,0 ml de mistura de etanol/gua (2.13). Juntar cerca de 1 g de granulados para facilitar a ebulio (3.7) e 10,00 ml da soluo de referncia interna (2.14). Fechar o tubo e agitar vigorosamente durante um minuto, pelo menos, at obter uma suspenso homognea. Colocar o tubo durante exactamente 5 minutos em gua temperatura de 60 C (3.1) para facilitar a extraco dos conservantes para a fase etanol. Arrefecer imediatamente o tubo num fluxo de gua fria e manter o extracto temperatura de 5 C durante uma hora. Filtrar o extracto com papel de filtro (3.4). Transferir aproximadamente 2 ml do filtrado para um frasco de amostras (3.6). Manter o filtrado temperatura de 5 C e realizar a determinao por cromatografia lquida de elevada resoluo nas 24 horas subsequentes preparao. 4.2. Cromatografia lquida de elevada resoluo Fase mvel: acetonitrilo/acetato tampo (2.15). Ajustar o fluxo da fase mvel na coluna a 2,0 ml/minuto 0,5 ml/minuto.

Mobile phase: acetonitrile/acetate buffer (2.15). Adjust the flow rate of mobile phase through the column to 2,0 0,5 ml/minute. Set the detector wavelength to 240 nm. 4.2.1. Calibration

Inject 10 l portions of each of the standard preservative solutions (2.17) into the liquid chromatography (3.2). For each Fixar o detector de comprimento de onda em 240 nm. solution determine the ratios of the peak heights of the investigated preservatives to the height of the internal standard peak obtained from the chromatograms. Plot a graph for each preservative relating the peak height ratio to the concentration of each standard solution. Ascertain that a linear response is obtained for the standard solutions in the calibration procedure. 4.2.1. Calibragem Injectar quantidades de 10 l de cada uma das solues de conservantes de referncia (2.17) no cromatgrafo lquido (3.2). Relativamente a cada soluo determinar as razes entre as alturas dos picos dos conservantes analisados e a altura do pico da referncia interna dos cromatogramas obtidos. Elaborar um grfico para cada conservante, relacionando a razo da altura de pico com a concentrao de cada soluo de referncia. Inject 10 l of the sample extract (4.1.1) into the liquid chromatograph (3.2) and record the chromatogram. Inject 10 l Verificar se se obtm uma resposta linear para as solues de referncia no processo de calibragem. of a standard preservative solution (2.17) and record the chromatogram. Compare the chromatograms obtained. If in the chromatogram of the sample extract (4.1.1) no peak appears to be present having approximately the same retention time as 2-methoxybenzoic acid (recommended internal standard), inject 10 l sample extract with added internal standard (4.1.2) into the liquid chromatograph and record the chromatogram. If an interfering peak is observed in the chromatogram of the sample extract (4.1.1) having the same retention time as 4.2.2. Determinao 2-methoxybenzoic acid, another appropriate internal standard should be selected. (If one of the preservatives under investigation is absent from the chromatogram, this preservative can be used as the internal standard.) Ascertain whether the chromatograms obtained for a standard solution and the sample solution meet the following Injectar 10 l da amostra de extracto (4.1.1) no cromatgrafo lquido (3.2) e registar o cromatograma. Injectar 10 l de requirements: uma soluo de referncia de conservante (2.17) e registar o cromatograma. Comparar os cromatogramas obtidos. Se no cromatograma da amostra de extracto (4.1.1) no ocorrerem picos com, aproxidamente, o mesmo tempo de reteno do cido 2-metoxibenzico (referncia interna recomendada), injectar 10 l de amostra de extracto com referncia interna (4.1.2) no cromatgrafo lquido e registar o cromatograma. - the peak separation of the worst separated pair shall be at least 0,90. (For definition of peak separation, see figure 1). Se se verificar a interferncia de um pico no cromatograma da amostra de extracto (4.1.1) com o mesmo tempo de reteno do cido 2-metoxibenzico, seleccionar outra referncia interna adequada (se um dos conservantes em estudo no aparecer no cromatograma, esse conservante poder ser utilizado como referncia interna). >REFERENCE TO A FILM> Verificar se os cromatogramas obtidos para uma soluo de referncia e a soluo amostra preenchem os seguintes requisitos: Figure 1: Peak separation - o pico de separao do par menos separado dever ser de 0,90, pelo menos (para uma definio de pico de separao, observar a figura 1). OJ No L 231, 14. 9. 1993, p. 34.- If the required separation is not achieved, either a more efficient column should be >REFERNCIA A UMA IMAGEN> used, or the mobile phase composition should be adjusted until the requirement is met. - The asymmetry factor As of all peaks obtained shall range between 0,9 to 1,5. (For definition of the peak asymmetry Figura 1: pico de separao factor, see Figure 2). To record the chromatogram for the determination of the asymmetry factor a chart speed of at least 2 cm/minute is recommended. >REFERENCE TO A FILM> JO n- Se no se obtiver a separao necessria, haver que utilizar uma coluna mais eficaz ou adaptar a composio da fase mvel at serem alcanadas as condies pretendidas, Figure 2: Peak asymmetry factor - o factor de assimetria As de todos os picos obtidos dever estar compreendido entre 0,9 e 1,5 (para uma definio de factor de assimetria do pico, ver figura 2). Para registar o cromatograma com vista determinao do facto de assimetria, recomenda-se uma velocidade da banda de registo no inferior a 2 cm/minuto, - A steady baseline shall be obtained. >REFERNCIA A UMA IMAGEN> 5. Calculation Figura 2: Factor de assimetria do pico Use the ratios of the heights of the peaks of the investigated preservatives to the height of the 2-methoxybenzoic acid - dever obter-se uma linha de base estvel. (internal standard) peak and the calibration graph to calculate the concentration of the acid preservatives in the sample solution. Calculate the benzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid, sorbic acid or salicylic acid content of the sample, as a percentage by mass (xi), using the formula: xi % (m/m) = 100 7 20 7 b 106 7 a = b 500 7 a 5. Clculo in which: Utilizar a razo entre as alturas dos picos dos conservantes analisados para a altura do pico do cido 2-metoxibenzico (referncia interna) e o grfico de calibragem para calcular a concentrao dos conservantes cidos na soluo de amostra. Calcular o teor da amostra em cido benzico, cido 4-hidroxibenzico, cido srbico ou cido saliclico, em percentagem por massa (xi), utilizando a frmula: xi % (m/m) = 100 7 20 7 b 106 7 a = b 500 7 a em que: a = massa (g) da quantidade analisada (4.1.2). b = concentrao (g/ml) do conservante no extracto de amostra (4.1.2) obtido no grfico de calibragem; 6. Repetibilidade (1) Para um teor em cido 4-hidroxibenzico de 0,40 %, a diferena entre os resultados de duas determinaes paralelas efectuadas com a mesma amostra no deve ultrapassar um valor absoluto de 0,035 %. Para um teor em cido benzico de 0,50 %, a diferena entre os resultados de duas determinaes paralelas efectuadas com a mesma amostra no deve ultrapassar um valor absoluto de 0,050 %. Para um teor em cido saliclico de 0,50 %, a diferena entre os resultados de duas determinaes paralelas efectuadas com a mesma amostra no deve ultrapassar um valor absoluto de 0,045 %. Para um teor em cido srbico de 0,60 %, a diferena entre os resultados de duas determinaes paralelas efectuadas com a mesma amostra no deve ultrapassar um valor absoluto de 0,035 %. 4.2.2. Determination

a = the mass (g) of the test portion (4.1.2), b = the concentration (g/ml) of the preservative in the sample extract (4.1.2) obtained from the calibration graph. 6. Repeatability (1) For a 4-hydroxybenzoic acid content of 0,40 % the difference between the results of two determinations in parallel carried out on the same sample should not exceed an absolute value of 0,035 %. For a benzoic acid content of 0,50 % the difference between the results of two determinations in parallel carried out on the same sample should not exceed an absolute value of 0,050 %. For a salicylic acid content of 0,50 % the difference between the results of two determinations in parallel carried out on the same sample should not exceed an absolute value of 0,045 %. For a sorbic acid content of 0,60 % the difference between the results of two determinations in parallel carried out on the same sample should not exceed an absolute value of 0,035 %. 7. Remarks 7.1. Results of a ruggedness test performed on the method indicated that the amount of sulfuric acid added to extract the acids from the sample is critical, and the limits for the amount of sample worked up should be kept within the prescribed boundaries.

http://eur-lex.europa.eu/Notice.do?mode=dbl&lang=en&ihmlang=en&lng1=en,pt&lng2=bg,cs,da,de,el,en,es,et,fi,fr,hu,it,lt,lv,mt,nl,pl,pt,ro,sk,sl,sv,&val=307214:cs

06/05/2013

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7.2. If desired, an appropriate guard column can be used. C. DETERMINATION OF PROPIONIC ACID

1. Scope and field of application This method is suitable for the determination of propionic acid, maximum concentration 2 % (m/m) in cosmetic products. 2. Definition The concentration of propionic acid measured by this method is expressed as a percentage by mass (% m/m) of the product. 3. Principle Following extraction of propionic acid from the product determination is performed by means of gas chromatography with the use of 2-methylpropionic acid as internal standard. 4. Reagents All the reagents must be of analytical purity; distilled water or water of equivalent quality must be used. 4.1. Ethanol 96 % (v/v) 4.2. Propionic acid 4.3. 2-Methylpropionic acid 4.4. Orthophosphoric acid, 10 % (m/v) 4.5. Propionic acid solution

7. Observaes 7.1. Os resultados do teste de robustez realizado segundo o mtodo descrito revelaram que a quantidade de cido sulfrico adicionada para extrair os cidos da amostra crtica, devendo a quantidade de amostra utilizada manter-se dentro dos limites prescritos. 7.2. Se se desejar, poder ser utilizada uma coluna de proteco adequada. C. DETERMINAO DO CIDO PROPINICO 1. Objectivo e mbito de aplicao Este mtodo aplicvel para a determinao do cido propinico em todos os produtos cosmticos, sendo a concentrao mxima de 2 % (m/m). 2. Definio A concentrao de cido propinico, determinada segundo este mtodo, expressa em percentagem por massa (% m/m) do produto. 3. Princpio Aps o cido propinico ser extrado do produto, a determinao feita atravs de cromatografia em fase gasosa, utilizando o cido 2-metilpropinico como referncia interna. 4. Reagentes Todos os reagentes devem ser analiticamente puros; dever ser utilizada gua destilada ou de pureza equivalente. 4.1. Etanol 96 % (v/v) 4.2. cido propinico 4.3. cido 2-metilpropinico

Accurately weigh approximately 1,00 g (p grams) of propionic acid into a 50-ml volumetric flask and make up to volume 4.4. cido ortofosfrico, 10 % (m/v) with ethanol (4.1) 4.6. Internal standard solution 4.5. Soluo de cido propinico Accurately weigh approximately 1,00 g (e grams) of 2-methylpropionic acid into a 50-ml volumetric flask and make up to volume with ethanol (4.1) 5. Apparatus 5.1. Usual laboratory equipment, and: 5.2. Gas chromatograph with flame-ionization detector 5.3. Glass tube (20 150 mm) with screw cap 5.4. Water bath at 60 C 5.5. 10 ml glass syringe with filter membrane (pore diameter: 0,45 m) 6. Procedure 6.1. Sample preparation 6.1.1. Sample prepartion without the internal standard Pesar com preciso aproximadamente 1,00 g (gramas p) de cido propinico num frasco de 50 ml e acrescentar etanol at perfazer aquele volume (4.1). 4.6. Soluo de referncia interna: Pesar aproximadamente 1,00 g (gramas e) de cido 2-metilpropinico num frasco de 50 ml e adicionar etanol at perfazer aquele volume (4.1). 5. Material 5.1. Equipamento habitual de laboratrio e: 5.2. Equipamento para cromatografia em fase gasosa com detector de ionizao por chama 5.3. Tubo de vidro (20 150 mm) com tampa de rosca 5.4. Banho-maria temperatura de 60 C 5.5. Seringa de vidro de 10 ml com filtro de membrana (dimetro dos poros: 0,45 m) 6. Metodologia

Into a glass tube (5.3), weigh approximately 1 g of the sample. Add 0,5 ml of phosphoric acid (4.4) and 9,5 ml of 6.1. Preparao da amostra ethanol (4.1). Close the tube and shake vigorously. If necessary, place the tube in a water bath heated at 60 C (5.4) for five minutes 6.1.1. Preparao da amostra sem a referncia interna in order to completely dissolve the lipid phase. Cool rapidly under running water. Filter part of the solution through a membrane filter (5.5). Chromatograph the filtrate the same day. 6.1.2. Sample preparation with the internal standard Pesar cuidadosamente 1 g da amostra num tubo de vidro (5.3). Adicionar 0,5 ml de cido fosfrico (4.4) e 9,5 ml de etanol (4.1). Weigh to three decimal places 1 0,1 g (a grams) of the sample into a glass tube (5.3). Add 0,5 ml of phosphoric acid Tapar o tubo e agitar vigorosamente. Se necessrio, colocar o tubo em gua temperatura de 60 C (5.4) durante 5 (4.4), 0,50 ml of the internal standard solution (4.6) and 9 ml of ethanol (4.1). minutos para dissolver abundantemente a fase lipdica. Arrefecer rapidamente sob gua corrente. Filtrar uma parte da soluo com um filtro de membrana (5.5). Proceder cromatografia do filtrado do prprio dia. Close the tube and shake vigorously. If necessary, place the tube in a water bath heated to 60 C (5.4) for five minutes 6.1.2. Preparao da amostra com referncia interna in order to dissolve the lipid phase. Cool rapidly under running water. Filter part of the solution through a membrane filter (5.5). Chromatograph the filtrate the same day. 6.2. Conditions for gas chromatography Pesar com preciso de trs dcimos 1 g 0,1 g (gramas a) de amostra num tubo de vidro (5.3). Adicionar 0,5 ml de cido fosfrio (4.4), 0,50 ml de soluo de referncia interna (4.6) e 9 ml de etanol (4.1). The following operation conditions are recommended: Tapar o tubo e agitar vigorosamente. Se necessrio, colocar o tubo em gua temperatura de 60 C (5.4) durante 5 minutos para dissolver a fase lipdica. Arrefecer rapidamente sob gua corrente. Filtrar parte da soluo com um filtro de membrana (5.5). Proceder cromatografia do filtrado no prprio dia. Column 6.2. Condies para cromatografia em fase gasosa Type Stainless steel Length 2 m Diameter 1/8 ″ Packing 10 % SPTM 1000 (or equivalent) + 1 % H3PO4 on Chromosorb WAW 100 to 120 mesh Temperature Injector 200 C Column 120 C Detector 200 C Carrier gas nitrogen Flow rate 25 ml/min 6.3. Chromatography 6.3.1. Calibration Recomendam-se as seguintes condies para proceder cromatografia em fase gasosa: Coluna Tipo Ao-inoxidvel Comprimento 2 m Dimetro 1/8″ Enchimento 10 % SPTM 1 000 (ou equivalente) + 1 % H3PO4 em Chromosorb WAW 100-120 mesh Temperatura Injector 200 C Coluna 120 C Detector 200 C Gs de arraste:

Nitrognio Into a series of 20-ml volumetric flasks, transfer by pipette 0,25, 0,50, 1,00, 2,00 and 4,00 ml respectively of the propionic acid solution (4.5). To each volumetric flask transfer by pipette 1,00 ml of the internal standard solution (4.6); make up to volume with ethanol (4.1) and mix. The solutions prepared in this way contain e mg/ml of 2-methylpropionic acid as internal standard (that is to say, 1 mg/ml if e = 1 000) and p/4, p/2, p, 2p, 4p mg/ml propionic acid (that is to say, 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, 4,00 mg/ml if p = 1 000). Inject 1 l of each of these solutions and obtain the calibration curve by plotting the ratio of the propionic acid/2Fluxo: 25 ml/minuto methylpropionic acid mass on the x-axis and the ratio of the corresponding peak areas on the y-axis. Make three injections of each solution and calculate the average peak area ratio. 6.3. Cromatografia 6.3.2. Determination 6.3.1. Calibrao Inject 1 l of the sample filtrate 6.1.1. Compare the chromatogram with that of one of the standard solutions (6.3.1). If Verter com uma pipeta respectivamente 0,25, 0,50, 1,00, 2,00 e 4,00 ml de soluo de cido propinico (4.5) para um a peak has approximately the same retention time as 2-methylpropionic acid, change the internal standard. If no conjunto de frascos de 20 ml de volume. A cada um acrescentar com uma pipeta 1,00 ml de soluo de referncia interference is observed, inject 1 l of the sample filtrate 6.1.2 and measure the areas of the propionic acid peak and interna (4.6); perfazer o volume de 20 ml com etanol (4.1) e misturar. As solues assim preparadas contm e mg/ml the internal standard peak. de cido 2-metilpropinico como referncia interna (ou seja, 1 mg/ml se e=1,000) e p/4, p/2, p, 2p, 4p mg/ml de cido propinico (ou seja, 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, 4,00 mg/ml se p=1,000). Make three injections of each solution and calculate the average peak area ratio. Injectar 1 l de cada uma destas solues e obter a curva de calibrao inscrevendo no eixo x a relao entre as massas do cido propinico e do cido 2-metilpropinico e no eixo y a relao entre as reas de pico correspondentes. 7. Calculations Proceder a 3 injeces de cada soluo e calcular a relao mdia entre as reas de pico. 7.1. From the calibration curve obtained in 6.3.1, obtain the ratio of mass (K) corresponding to the peak area ratio calculated in 6.3.2. 7.2. From the ratio of mass thus obtained calculate the propionic acid content of the sampe (X) as a percentage by mass using the formula: 6.3.2. Determinao Injectar 1 l do filtro da amostra 6.1.1. Comparar o cromatograma com uma das solues de referncia (6.3.1). Se o pico apresenta um tempo de reteno sensivelmente anlogo ao do cido 2-metilpropinico, mudar a referncia interna. Se no se observar interferncia, injectar 1 l do filtrado da amostra 6.1.2 e medir as reas do pico do cido propinico e do pico da referncia interna. Fazer trs injeces de cada soluo e calcular a relao mdia entre as reas de pico. 7. Clculos 7.1. A partir da curva de calibrao obtida em 6.3.1, determinar a razo da massa (K), correspondente razo da rea do pico calculada em 6.3.2. 7.2. A partir da razo da massa obtida desta forma, calcular o teor da amostra (x) em cido propinico, em percentagem por massa recorrendo frmula: x % (m/m) = K 0,5 7 100 7 e 50 7 a = K e a em que: K = razo calculada em 7.1; e = massa, em gramas, da referncia interna pesada em 4.6; a = massa, em gramas, da amostra pesada em 6.1.2. II. IDENTIFICATION AND DETERMINATION OF HYDROQUINONE, HYDROQUINONE MONOMETHYLETHER, HYDROQUINONE MONOETHYLETHER AND HYDROQUINONE MONOBENZYLETHER IN COSMETIC PRODUCTS A. IDENTIFICATION 1. Scope and field of application The method describes the detection and identification of hydroquinone, hydroquinone monomethylether, hydroquinone II. IDENTIFICAO E DETERMINAO DA HIDROQUINONA, DO TER MONOMETLICO DE QUINOL, DO TER monoethylether and hydroquinone monobenzylether (monobenzone) in cosmetic products for lightening the skin. MONOETLICO DE QUINOL E DO TER MONOBENZLICO DE QUINOL EM PRODUTOS COSMTICOS 2. Principle Hydroquinone and its ethers are identified by thin layer chromatography (TLC). 3. Reagents All reagents must be of analytical grade. 3.1. Ethanol, 96 % (v/v) 3.2. Chloroform A. IDENTIFICAO 1. Objectivo e mbito de aplicao Este mtodo descreve a deteco e a identificao da hidroquinona, do ter monometlico de quinol, do ter monoetlico de quinol e do ter monobenzlico de quinol (monobenzona) em produtos cosmticos para branqueamento da pele. 2. Princpio A hidroquinona e os respectivos teres so identificados por cromatografia de camada fina (CCF). Arredondar os resultados dcima. 8. Repetibilidade (1) Para um teor em cido propinico de 2 % (m/m), a diferena entre os resultados de duas determinaes paralelas efectuadas com a mesma amostra no deve ultrapassar 0,12 %.

x % (m/m) = K 0,5 7 100 7 e 50 7 a = K e a in which: K = the ratio calculated in 7.1, e = mass in grams of the internal standard weighed in 4.6, a = mass in grams of the sample weighed in 6.1.2. Round off results to one decimal place. 8. Repeatability (1) For a propionic acid content of 2 % (m/m) the difference between the results of two determinations in parallel carried out on the same sample should not exceed 0,12 %.

http://eur-lex.europa.eu/Notice.do?mode=dbl&lang=en&ihmlang=en&lng1=en,pt&lng2=bg,cs,da,de,el,en,es,et,fi,fr,hu,it,lt,lv,mt,nl,pl,pt,ro,sk,sl,sv,&val=307214:cs

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3.3. Diethyl ether 3.4. Developing solvent: Chloroform/Diethyl ether, 66:33 (v/v) 3.5. Ammonia, 25 % (m/m) (d04 = 0,91 g/ml) 3.6. Ascorbic acid 3.7. Hydroquinone 3.8. Hydroquinone monomethylether 3.9. Hydroquinone monoethylether 3.10. Hydroquinone monobenzylether (monobenzone) 3.11. Reference solutions The following reference solutions should be freshly prepared, and are stable for one day. 3.11.1. Weigh 0,05 g hydroquinone (3.7) into a 10-ml graduated test tube. Add 0,250 g of ascorbic acid (3.6) and 5 ml of ethanol (3.1). Add ammonia (3.5) until the pH is 10 and make up to a volume of 10 ml with ethanol (3.1). 3.11.2. Weigh 0,05 g hydroquinone monomethylether (3.8) into a 10-ml graduated test tube. Add 0,250 g of ascorbic acid (3.6) and 5 ml of ethanol (3.1). Add ammonia (3.5) until the pH is 10 and make up to a volume of 10ml with ethanol (3.1). 3.11.3. Weigh 0,05 g hydroquinone monoethylether (3.9) into a 10-ml graduated test tube. Add 0,250 g of ascorbic acid (3.6) and 5 ml of ethanol (3.1). Add ammonia (3.5) until the pH is 10 and make up to a volume of 10ml with ethanol (3.1). 3.11.4. Weigh 0,05 g hydroquinone monobenzylether (3.10) into a 10-ml graduated test tube. Add 0,250 g of ascorbic acid (3.6) and 5 ml of ethanol (3.1). Add ammonia (3.5) until the pH is 10 and make up to a volume of 10ml with ethanol (3.1). 3.12. Silver nitrate

3. Reagentes Os reagentes devem ser todos de pureza analtica. 3.1. Etanol, 96 % (v/v) 3.2. Clorofrmio 3.3. ter dietlico 3.4. Solvente de revelao: Clorofrmio/ter dietlico, 66:33 (v/v) 3.5. Amnia, 25 % (m/m) (d204 = 0,91 g/ml) 3.6. cido ascrbico 3.7. Hidroquinona 3.8. ter monometlico de quinol 3.9. ter monoetlico de quinol 3.10. ter monobenzlico de quinol (Monobenzona)

3.11. Solutos de referncia:

Os seguintes solutos de referncia devem ser preparados de fresco e mantm-se estveis durante 1 dia.

3.13. 12-Molybdophosphoric acid

3.14. Potassium ferricyanide hexahydrate

3.15. Ferric chloride, hexahydrate

3.16. Spray reagents 3.16.1. To a 5 % (m/v) aqueous solution of silver nitrate (3.12), add ammonia (3.5) until the precipitate that forms dissolves. Warning: the solution becomes explosively unstable on standing and should be discarded after use. 3.16.2. 10 % (m/v) solution of 12-molybdophosphoric acid (3.13) in ethanol (3.1). 3.16.3. Prepare a 1 % (m/v) aqueous solution of potassium ferricyanide (3.14) and a 2 % (m/v) aqueous solution of ferric chloride (3.15). Mix equal parts of both solutions just before use. 4. Apparatus Normal laboratory equipment, and: 4.1. Usual TLC equipment

3.11.1. Introduzir 0,05 g de hidroquinona (3.7.) num tubo de ensaio graduado de 10 ml. Acrescentar 0,250 g de cido ascrbico (3.6.) e 5 ml de etanol a 96 % (3.1.). Acrescentar amnia (3.5.) at se atingir um pH de 10. Perfazer um volume de 10 ml com etanol (3.1.). 3.11.2. Introduzir 0,05 g de ter monometlico de quinol (3.8.) num tubo de ensaio graduado de 10 ml. Acrescentar 0,250 g de cido ascrbico (3.6.) e 5 ml de etanol (3.1.). Acrescentar amnia (3.5.) at se atingir um pH de 10. Perfazer um volume de 10 ml com etanol (3.1.). 3.11.3. Introduzir 0,05 g de ter monoetlico de quinol (3.9.) num tubo de ensaio graduado de 10 ml. Acrescentar 0,250 g de cido ascrbico (3.6.) e 5 ml de etanol (3.1.). Acrescentar amnia (3.5.) at se atingir um pH de 10. Perfazer um volume de 10 ml com etanol (3.1.). 3.11.4. Introduzir 0,05 g de ter monobenzlico de quinol (3.10.) num tubo de ensaio graduado de 10 ml. Acrescentar 0,250 g de cido ascrbico (3.6.) e 5 ml de etanol (3.1.). Acrescentar amnia (3.5.) at se atingir um pH de 10. Perfazer um volume de 10 ml com etanol (3.1.). 3.12. Nitrato de prata 3.13. cido 12-molibdofosfrico 3.14. Ferricianeto de potssio hexahidrato 3.15. Cloreto frrico, hexahidrato 3.16. Reagentes para nebulizao: 3.16.1. A um soluto aquoso de nitrato de prata (3.12.) a 5 % (m/v) acrescentar amnia (3.5.) at dissoluo do precipitado formado. Aviso: o soluto torna-se explosivamente instvel em repouso e deve ser eliminado aps utilizao. 3.16.2. Soluto a 10 % (m/v) de cido 12-molibdofosfrico (3.13.) em etanol (3.1.).

3.16.3. Preparar um soluto aquoso de ferricianeto de potssio (3.14.) a 1 % (m/v) e um soluto aquoso de cloreto frrico (3.15.) a 2 % (m/v). Misturar partes iguais de ambos os solutos imediatamente antes da utilizao. 4.2. TLC plates, ready for use: silica gel GHR/UV254; 20 20 cm (Machery, Nagel, or equivalent). Layer thickness 0,25 4. Material mm 4.3. Ultrasonic bath Equipamento normal de laboratrio, e: 4.4. Centrifuge 4.5. UV lamp, 254 nm 5. Procedure 5.1. Preparation of the sample 4.1. Equipamento convencional de CCF 4.2. Placas CCF, prontas para utilizao: silicagel GHR/UV254; 20 cm 20 cm (Machery, Nagel ou equivalente); espessura da camada: 0,25 mm. 4.3. Banho ultra-snico 4.4. Centrifugadora

Weigh 3,0 g of sample into a 10-ml graduated tube. Add 0,250 g of ascorbic acid (3.6) and 5 ml of ethanol (3.1). Adjust 4.5. Lmpada UV, 254 nm the pH of the solution to 10, using amonia (3.5). Make up to a volume of 10 ml with ethanol (3.1). Close the tube with a stopper and homogenize in an ultrasonic bath for 10 minutes. Filter through a filter paper or centrifuge at 3 000 rpm. 5.2. TLC 5. Procedimento 5.2.1. Saturate a chromatographic tank with developing solvent (3.4). 5.1. Preparao da amostra: 5.2.2. Deposit on a plate 2 l of the reference solutions (3.11) and 2 l of the sample solution (5.1). Develop in the dark Introduzir 3,0 g da amostra num tubo de ensaio graduado de 10 ml. Acrescentar 0,250 g de cido ascrbico (3.6.) e 5 at ambient temperature until the solvent front has migrated 15 cm from the start. ml de etanol (3.1.). Fazer o soluto atingir o pH 10 com amnia (3.5.). Perfazer um volume de 10 ml com etanol (3.1.). Rolhar o tubo e homogeneizar num banho ultra-snico durante dez minutos. Filtrar atravs de papel de filtro ou centrifugar a 3 000 rpm. 5.2.3. Remove the plate and allow to dry at room temperature. 5.2. CCF 5.3. Detection 5.3.1. Observe the plate under UV light at 254 nm, and mark the position of the spots. 5.3.2. Spray the plate with: - silver nitrate reagent (3.16.1), or - 12-molybdophosphoric acid reagent (3.16.2); heat to approximately 120 C, or - potassium ferricyanide solution and ferric chloride solution (3.16.3). 6. Identification Calculate the Rf value for each spot. 5.2.1. Saturar um tanque cromatogrfico com solvente de revelao (3.4.). 5.2.2. Depositar numa placa 2 l de soluto de referncia (3.11.) e 2 l de soluto amostra (5.1.). Revelar temperatura ambiente em situao de obscuridade at que a frente de solvente tenha migrado 15 cm desde o ponto de partida. 5.2.3. Retirar a placa e deixar secar temperatura ambiente. 5.3. Deteco 5.3.1. Observar a placa com luz UV de 254 nm e assinalar a posio das manchas. 5.3.2. Aspergir a placa com: - reagente de nitrato de prata (3.16.1.), ou - reagente de cido 12-molibdofosfrico (3.16.2.); aquecer aproximadamente at aos 120 C, ou

Compare the spots obtained for the sample solution with those for the reference solutions with respect to: their Rf - soluto de ferricianeto de potssio e soluto de cloreto frrico (3.16.3.) values; the colour of the spots under UV radiation; and the colours of the spots after visualization with the spray reagent. Perform the HPLC described in the following section (B), and compare the retention times obtained for the sample peak 6. Identificao (s) with those for the reference solutions. Combine the results from TLC and HPLC to identify the presence of hydroquinone and/or its ethers. Calcular o valor Rf para cada mancha. 7. Remarks Under the conditions described, the following Rf values were observed: hydroquinone: 0,32 hydroquinone monomethylether: 0,53 hydroquinone monoethylether: 0,55 hydroquinone monobenzylether: 0,58 B. DETERMINATION 1. Scope and field of application This method specifies a procedure for the determination of hydroquinone, hydroquinone monomethylether, hydroquinone monoethylether and hydroquinone monobenzylether in cosmetic products for lightening the skin. 2. Principle Comparar as manchas obtidas a partir do soluto amostra com as obtidas a partir dos solutos de referncia relativament a: valores Rf; cor das manchas sob radiao UV; cor das manchas aps visualizao com reagente de nebulizao. Executar a tcnica CLER (Cromatografia Lquida de Elevada Resoluo) descrita na seco seguinte (B), e comparar os tempos de reteno obtidos para o(s) pico(s) da amostra com os dos solutos de referncia. Combinar os resultados obtidos com as tcnicas CCF e CLER para identificar a presena de hidroquinona e/ou dos respectivos teres. 7. Observaes Nas condies descritas, observaram-se os seguintes valores Rf: hidroquinona 0,32 ter monometlico de quinol 0,53 ter monoetlico de quinol 0,55 ter monobenzlico de quinol 0,58 B. DETERMINAO

The sample is extracted with a water/methanol mixture under gentle heating to melt any lipid material. Determination of 1. Objectivo e mbito de aplicao the analytes in the resulting solution is performed by reversed phase liquid chromatography with UV detection. 3. Reagents Este mtodo especifica a natureza de um procedimento para determinao da hidroquinona, de ter monometlico de quinol, do ter monoetlico de quinol e do ter monobenzlico de quinol em produtos cosmticos para branqueamento da pele. 3.1. All reagents must be of analytical quality. Water used must be distilled water, or water of at least equivalent purity 2. Princpio 3.2. Methanol A amostra extrada com uma mistura gua/metanol sob o efeito de um ligeiro aquecimento para fundir quaisquer lpidos presentes. A determinao das substncias a analisar no soluto obtido executada por cromotografia lquida de fase invertida com deteco UV. 3. Reagentes 3.1. Os reagentes tm todos que ser de qualidade analtica. A gua utilizada tem que ser destilada ou de pureza pelo menos equivalente. 3.2. Metanol 3.3. Hidroquinona 3.4. ter monometlico de quinol 3.5. ter monoetlico de quinol

3.3. Hydroquinone 3.4. Hydroquinone monomethylether 3.5. Hydroquinone monethylether 3.6. Hydroquinone monobenzylether (monobenzone) 3.7. Tetrahydrofuran, HPLC grade 3.8. Water/methanol mixture 1:1 (v/v). Mix one volume of water and one volume of methanol (3.2)

3.9. Mobile phase: tetrahydrofuran/water mixture 45:55 (v/v). Mix 45 volumes of tetrahydrofuran (3.7) and 55 volumes 3.6. ter monobenzlico de quinol (Monobenzona) of water 3.10. Reference solution 3.7. Tetrahidrofurano de grau CLER Weigh 0,06 g of hydroquinone (3.3), 0,08 g hydroquinone monomethylether (3.4), 0,10 g hydroquinone monoethylether 3.8. Mistura gua/metanol 1:1 (v/v). Misturar 1 volume de gua e 1 volume de metanol (3.2.). (3.5) and 0,12 g hydroquinone monobenzylether (3.6) into a 50-ml volumetric flask. Dissolve and make up to volume with methanol (3.2). Prepare the reference solution by diluting 10,00 ml of this solution to 50,00 ml with water/methanol mixture (3.8). These solutions must be freshly prepared. 4. Apparatus 3.9. Fase mvel: mistura de tetrahidrofurano/gua 45:55 (v/v). Misturar 45 volumes de tetrahidrofurano (3.7.) e 55 volumes de gua.

http://eur-lex.europa.eu/Notice.do?mode=dbl&lang=en&ihmlang=en&lng1=en,pt&lng2=bg,cs,da,de,el,en,es,et,fi,fr,hu,it,lt,lv,mt,nl,pl,pt,ro,sk,sl,sv,&val=307214:cs

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Normal laboratory equipment and: 4.1. Water bath, capable of maintaining a temperature of 60 C

4.2. High-performance liquid chromatograph with a variable-wavelength UV detector and 10-l injection loop 4.3. Analytical column: Stainless steel chromatographic column, length 250 mm, internal diameter 4,6 mm, packed with Zorbax phenyl (chemically bonded phenethylsilane on Zorbax SIL, end-capped with trimethylchlorosilane), particle size 6 m, or equivalent. Do not use a guard column, except phenyl guard, or equivalent 4.4. Filter paper, diameter 90 mm, Schleicher and Schull, Weissband No 5892, or equivalent 5. Procedure 5.1. Sample preparation Weigh to three decimal places 1 0,1 g (a gram) of sample into a 50-ml volumetric flask. Disperse the sample in 25 ml water/methanol mixture (3.8). Close the flask and shake vigorously until a homogeneous suspension is obtained. Shake for at least one minute. Place the flask in a water bath (4.1) kept at 60 C to enhance the extraction. Cool the flask, and make up to volume with water/methanol (3.8). Filter the extract using a filter paper (4.4). Perform the HPLC determination within 24 hours of preparing the extract. 5.2. High performance liquid chromatography. 5.2.1. Adjust the flow rate of the mobile phase (3.9) to 1,0 ml/min and set the detector wavelength to 295 nm. 5.2.2. Inject 10 l of the sample solution obtained as described in section 5.1, and record the chromatogram. Measure the peak areas. Perform a calibration as described under 5.2.3. Compare the chromatograms obtained for sample and standard solutions. Use the peak aeras and the response factors (RF) calculated under 5.2.3 to calculate the concentration of the analytes in the sample solution. 5.2.3. Calibration

3.10. Soluto de referncia: Verter 0,06 g de hidroquinona (3.3.), 0,08 g de ter monometlico de quinol (3.4.), 0,10 g de ter monoetlico de quinol (3.5.) e 0,12 g de ter monobenzlico de quinol (3.6.) para um frasco de 50 ml. Dissolver e perfazer este volume com metanol (3.2.). Preparar o soluto de referncia diluindo 10,00 ml deste soluto em 50,00 ml de mistura gua/metanol (3.8.). Estes solutos tm que ser preparados de fresco. 4. Material Equipamento normal de laboratrio e:

4.1. Banho-maria, susceptvel de manter a temperatura a 60 C 4.2. Cromatgrafo de fase lquida de elevada reduo com um detector de UV de comprimento de onda varivel e um dispositivo de injeco de 10 l 4.3. Coluna analtica: Coluna cromatogrfica de ao inoxidvel, de 250 mm de comprimento, dimetro interno de 4,6 mm, cheia com fenil Zorbax (fenetilsilano ligado quimicamente em Zorbax SIL, tamponado com trimetilclorosilano) partculas de 6 m, ou equivalente. No utilizar uma coluna de guarda, com excepo de guarda de fenil ou equivalente

4.4. Papel de filtro, dimetro 90 mm, Schleicher e Schull, Weissband n 5892 ou equivalente 5. Procedimento 5.1. Preparao da amostra

Inject 10 l of the reference solution (3.10) and record the chromatogram. Inject several times until a constant peak area is obtained. Determine the response factor RFi: RFi = pi ci in which: pi = peak area for hydroquinone, hydroquinone monomethylether, hydroquinone monoethylether or hydroquinone monobenzylether, and

Pesar com preciso de trs dcimos 1 g 0,1 g (gramas a) de amostra num recipiente graduado de 50 ml. Dispersar a amostra em 25 ml de mistura gua/metanol (3.8.). Fechar o recipiente e agitar vigorosamente at obter uma suspenso homognea. Agitar durante pelo menos um minuto. Colocar o recipiente em banho-maria (4.1.) mantido a 60 C a fim de aumentar a extraco. Arrefecer o recipiente e perfazer o volume de 50 ml com gua/metanol (3.8.). Filtrar o extracto com um papel de filtro (4.4.). Executar a determinao CLER nas 24 horas subsequentes preparao do extracto. 5.2. Cromatografia lquida de elevada resoluo. 5.2.1. Ajustar o fluxo da fase mvel (3.9.) a 1,0 ml/minuto e fixar o detector de comprimento de onda em 295 nm. 5.2.2. Injectar 10 l do soluto amostra, obtido conforme descrito na seco 5.1. e registar o cromatograma. Medir as reas de pico. Executar uma calibrao conforme descrito em 5.2.3. Comparar os cromatogramas obtidos com os solutos amostra e padro. Utilizar as reas de pico e os factores resposta (FR) calculados na seco (5.2.3.) para determinar a concentrao das substncias a analisar no soluto amostra. 5.2.3. Calibrao

ci = concentration (g/50 ml) in the reference solution (3.10) of hydroquinone, hydroquinone monomethylether, hydroquinone monoethylether or hydroquinone monobenzylether. Ascertain whether the chromatograms obtained for a standard solution and the sample solution meet the following Injectar 10 l do soluto de referncia (3.10.) e registar o cromatograma. Injectar vrias vezes at obter um rea de pico requirements: constante. - the peak separation of the worst separated pair shall be at least 0,90. (For definition of peak separation, see Figure 1.) Determinar o factor resposta RFi: >REFERENCE TO A FILM> Figure 1: Peak separation If the required separation is not achieved, either a more efficient column should be used, or the mobile phase composition should be adjusted until the requirement is met. - The asymmetry factor AS, of all peaks obtained shall range between 0,9 to 1,5. (For definition of the peak asymmetry factor, see Figure 2.) To record the chromatogram for the determination of the asymmetry factor a chart speed of at lest 2 cm/min is recommended. >REFERENCE TO A FILM> Figure 2: Peak asymmetry factor - A steady baseline shall be obtained. 6. Calculation Use the areas of the analyte peaks to calculate the concentration(s) of the analyte(s) in the sample. Calculate the analyte concentration in the sample, as a percentage by mass, (xi) using the formula: xi % (m/m) = bi 7 100 RFi 7 a RFi = pi ci em que, pi = rea de pico de: hidroquinona, ter monometlico de quinol, ter monoetlico de quinol ou ter monobenzlico de quinol; e ci = concentrao (g/50 ml) no soluto de referncia (3.10.) de: hidroquinona, ter monometlico de quinol, ter monoetlico de quinol ou ter monobenzlico de quinol. Verificar se os cromatogramas obtidos relativos aos solutos padro e amostra obedecem aos seguintes requisitos: - a separao de picos do par de picos mais mal separados deve ser, no mnimo, de 0,90. (Para definio da separao de picos, ver figura 1). >REFERNCIA A UMA IMAGEN> Figura 1: Separao de picos Se no se obtiver a separao necessria, haver que utilizar uma coluna mais eficaz ou adaptar a composio da fase mvel at serem alcanadas as condies pretendidas, - o factor As de assimetria de todos os picos obtidos deve situar-se na gama de valores compreendidos entre 0,9 e 1,5 (para definio do factor de assimetria de picos, ver figura 2). Para registar o cromatograma com vista determinao do factor de assimetria, recomenda-se uma velocidade de registo de pelo menos 2 cm/min, >REFERNCIA A UMA IMAGEN> Figura 2: factor de assimetria de picos - dever obter-se uma linha de base estvel. 6. Clculo Utilizar as reas dos picos das substncias a analisar para calcular as respectivas concentraes na amostra. Calcular a concentrao da substncia a analisar na amostra, em percentagem por massa, (xi) por meio da seguinte frmula: xi % (m/m) = bi 7 100 RFi 7 a em que: a= massa da amostra em gramas; bi = rea de pico da substncia a analisar i na amostra RFi = factor resposta

in which: a= mass of the sample in grams, and bi = peak area of analyte i in the sample. 7. Repeatability (1) 7.1. For a hydroquinone content of 2,0 % the difference between the results of two determinations carried out in parallel on the same sample should not exceed an absolute value of 0,13 %. 7.2. For a hydroquinone monomethylether content of 1,0 % the difference between the results of two determinations carried out in parallel on the same sample should not exceed an absolute value of 0,1 %. 7.3. For a hydroquinone monoethylether content of 1,0 % the difference between the results of two determinations carried out in parallel on the same sample should not exceed an absolute value of 0,11 %. 7.4. For a hydroquinone monobenzylether content of 1,0 % the difference between the results of two determinations carried out in parallel on the same sample should not exceed an absolute value of 0,11 %. 8. Reproducibility (1) 8.1. For a hydroquinone content of 2,0 % the difference between the results of two determinations carried out on the same sample under different conditions (different laboratories, different operators, different apparatus and/or different time) should not exceed an absolute value of 0,37 %. 8.2. For a hydroquinone monomethylether content of 1,0 % the difference between the results of two determinations carried out on the same sample under different conditions (different laboratories, different operators, different apparatus and/or different time) should not exceed an absolute value of 0,21 %. 8.3. For a hydroquinone monoethylether content of 1,0 % the difference between the results of two determinations carried out on the same sample under different conditions (different laboratories, different operators, different apparatus and/or different time) should not exceed an absolute value of 0,19 %. 8.4. For a hydroquinone monobenzylether content of 1,0 % the difference between the results of two determinations carried out on the same sample under different conditions (different laboratories, different operators, different apparatus and/or different time) should not exceed an absolute value of 0,11 %. 9. Remarks 9.1. When a hydroquinone content considerably higher than 2 % is found and an accurate estimate of the content is required, the sample extract (5.1) should be diluted to a similar concentration as would be obtained from a sample containing 2 % hydroquinone, and the determination repeated. (In some instruments the absorbance may be out of the linear range of the detector for high hydroquinone concentrations.) 9.2. Interferences

7. Repetibilidade (1)

7.1. Para um teor de hidroquinona de 2,0 % a diferena entre os resultados de duas determinaes efectuadas em paralelo na mesma amostra no deve exceder um valor absoluto de 0,13 %. 7.2. Para um teor de ter monometlico de quinol de 1,0 % a diferena entre os resultados de duas determinaes efectuadas em paralelo na mesma amostra no deve exceder um valor absoluto de 0,1 %. 7.3. Para um teor de ter monoetlico de quinol de 1,0 % a diferena entre os resultados de duas determinaes efectuadas em paralelo na mesma amostra no deve exceder uma valor absoluto de 0,11 %. 7.4. Para um teor de ter monobenzlico de quinol de 1,0 % a diferena entre os resultados de duas determinaes efectuadas em paralelo na mesma amostra no deve exceder um valor absoluto de 0,11 %. 8. Reprodutibilidade (1)

8.1. Para um teor de hidroquinona de 2,0 % a diferena entre os resultados de duas determinaes efectuadas na mesma amostra em condies diferentes (laboratrios, operadores, material e/ou tempo de execuo diferentes) no deve exceder um valor absoluto de 0,37 %. The method described above allows the determination of hydroquinone and its ethers in a single isocratic run. The use 8.2. Para um teor de ter monometlico de quinol de 1,0 % a diferena entre os resultados de duas determinaes of the phenyl column assures sufficient retention for hydroquinone, which cannot be guaranteed when a C18 column is efectuadas na mesma amostra em condies diferentes (laboratrios, operadores, material e/ou tempo de execuo used with the mobile phase described. diferentes) no deve exceder um valor absoluto de 0,21 %. However, this method is prone to interferences by a number of parabens. In such cases the determination should be 8.3. Para um teor de ter de monoetlico de quinol de 1,0 % a diferena entre os resultados de duas determinaes repeated employing a different mobile phase/stationary phase system. Suitable methods may be found in references 1 efectuadas na mesma amostra em condies diferentes (laboratrios, operadores, material e/ou tempo de execuo and 2, namely: diferentes) no deve exceder um valor absoluto de 0,19 %. Column: Zorbax ODS, 4,6 mm 25 mm, or equivalent: 8.4. Para um teor de ter monobenzlico de quinol de 1,0 % a diferena entre os resultados de duas determinaes efectuadas na mesma amostra em condies diferentes (laboratrios, operadores, material e/ou tempo de execuo diferentes) no deve exceder um valor absoluto de 0,11 %. temperaure: 36 C 9. Observaes flow: 1,5 ml/min 9.1. Quando se determinar um teor de hidroquinona consideravelmente superior a 2 % e for necessrio um clculo exacto, o extracto da amostra (5.1.) deve ser diludo at atingir uma concentrao idntica que seria obtida com uma amostra com um teor de hidroquinona de 2 % e a determinao repetida (com alguns equipamentos a absorvncia pode situar-se fora da gama linear do detector para concentraes elevadas de hidroquinona). 9.2. Interferncias O mtodo acima descrito permite a determinao da hidroquinona e dos respectivos teres com um nico ciclo isocrtico. A utilizao da coluna de fenil garante uma reteno suficiente de hidroquinona, reteno essa que no pode ser garantida quando utilizada uma coluna C18 durante a fase mvel descrita. No entanto, este mtodo est sujeito s interferncias de um determinado nmero de parabenos. Em tal caso a determinao deve ser repetida recorrendo a um sistema diferente de fase mvel/fase estacionria. Nas notas (1) e (2) esto descritos mtodos adequados: Coluna: Zorbax ODS, 4,6 mm 25 cm, ou equivalente Temperatura: 36 C Dbito: 1,5 ml/min Fase mvel: para a hidroquinona: metanol/gua 5/95 (V/V) para o ter monometlico de quinol: metanol/gua 30/70 (V/V) para o ter monobenzlico de quinol: metanol/gua 80/20 (V/V) (1)

mobile phase: for hydroquinone: methanol/water 5/95 (V/V)

for hydroquinone monomethylether: methanol/water 30/70 (V/V)

for hydroquinone monobenzylether: methanol/water 80/20 (V/V) (1). Column: Spherisorb S5-ODS, or equivalent: mobile phase: water/methanol 90/10 (V/V) flow: 1,5 ml/min. These conditions are suitable for hydroquinone (2). (1) ISO 5725.

http://eur-lex.europa.eu/Notice.do?mode=dbl&lang=en&ihmlang=en&lng1=en,pt&lng2=bg,cs,da,de,el,en,es,et,fi,fr,hu,it,lt,lv,mt,nl,pl,pt,ro,sk,sl,sv,&val=307214:cs

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(1) ISO 5725. (1) ISO 5725. (1) M. Herpol-Borremans et M.-O. Masse, Identification et dosage de l'hydroquinone et de ses thers mthylique et benzylique dans les produits cosmtiques pour blanchir la peau. Int. j. Cosmet. Sci. 8-203-214 (1986). (2) J. Firth and I. Rix, Determination of hydroquinone in skin toning creams, Analyst (1986), 111, p. 129.

Coluna: Spherisorb S5-ODS, ou equivalente fase mvel: gua/metanol 90/10 (V/V) dbito: 1,5 ml/min Estas condies so adequadas para a hidroquinona (2). (1) ISO 5725. (1) ISO 5725. (1) ISO 5725. (1) M. Herpol-Borremans and M.O. Masse, Identification et dosage de l'hydroquinone et ses thers mthylique et benzylique dans les produits cosmtiques pour blanchir la peau. Int. J. Cosmet. Sci 8-203-214 (1986). (2) J. Firth and I. Rix, Determination of Hydroquinone in skintoning creams, Analyst (1986), 111, p. 129.

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06/05/2013