UFRPE – Universidade Federal Rural de Pernambuco

UAST – Unidade Acadêmica de Serra Talhada

Licenciatura em Química
Química Orgânica Experimental 2

PRÁTICA 03: CROMATOGRAFIA

Maria Clara Santiago da Silva

SERRA TALHADA
2023
 Maria Clara Santiago da Silva

PRÁTICA 03: CROMATOGRAFIA

O presente trabalho discorre acerca

da prática de cromatografia, destinado a
cadeira de Química Orgânica Experimental
2 para acúmulo de crédito ou pontuação
em Trabalhos Acadêmicos no curso de
Licenciatura em Química.
Docente: Elayne Bessa.
Período: 2022.1

SERRA TALHADA
2023

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 SUMÁRIO

1. Introdução ----------------------------------------------------------------------------------------4
2. Objetivo -------------------------------------------------------------------------------------------5
3. Procedimento Experimental -----------------------------------------------------------------5
3.1. Materiais ---------------------------------------------------------------------------------5
3.2. Reagentes ------------------------------------------------------------------------------5
3.3. Metodologia ----------------------------------------------------------------------------6
4. Resultado e Discussão -----------------------------------------------------------------------8
5. Conclusão --------------------------------------------------------------------------------------17
6. Referências Bibliográficas ------------------------------------------------------------------17

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 1. Introdução
A cromatografia é um método físico-químico de separação e identificação de
substâncias, não sendo um método clássico. Esse método é utilizado para misturas
muito complexas, como também para amostras pequenas ou de concentrações
baixas.

Segundo Fonseca e Gonçalves (2004), a cromatografia é utilizada para separar

as misturas que contêm duas ou mais substâncias ou íons, contendo duas fases: uma
fase estacionária e a outra fase móvel. A fase estacionária é a fase fixa na qual a
substância está sendo separada ou identificada fixa-se na superfície de outro material.
Já a fase móvel os componentes se movem por um solvente fluido, que pode ser tanto
líquido quanto gasoso.

“A fase móvel transporta a amostra através da

fase estacionária. A velocidade média das
partículas da amostra depende da sua natureza.
Desse modo, cada componente atingirá o final da
coluna em um instante diferente. (SCHULER, A.
2010, p.1)”.

De acordo com Engel, et al. (2012), essas diferenças dependem principalmente

das polaridades relativas dos componentes da mistura. Ainda de acordo com Engel,
et al. (2012), existem muitos tipos de técnicas cromatográficas, desde as mais baratas
até as de alta eficiência, como a cromatografia líquida de alta eficiência.

Existem alguns tipos de cromatografias, sendo eles: cromatografia em papel,

cromatografia em camada delgada, cromatografia em coluna, cromatografia gasosa,
cromatografia líquida e cromatografia líquida de alta eficiência. Neste presente
trabalho utilizamos dois tipos de cromatografia: a cromatografia em coluna e a
cromatografia em camada delgada.

A cromatografia em coluna, conhecida também como cromatografia CC, é a

técnica na qual ocorre a separação da substância em uma mistura entre duas fases,
a fase sólida, que é geralmente sílica e a fase líquida, que é um solvente ou a mistura
de solventes. Segundo Engel, et al. (2012), a cromatografia em colunas é empregada
mais frequentemente que a TCL (cromatografia em camada delgada) para separar

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quantidades de compostos relativamente grandes. Com essa técnica de cromatografia
é possível coletar as amostras dos compostos e realizar testes adicionais.

A cromatografia em camada delgada (TCL) é uma técnica mais barata, simples

e importante para a separação rápida. De acordo com Engel, et al. (2012), a
cromatografia em camada delgada é uma técnica de partição sólido-líquido contudo,
a fase móvel líquida não percorre para baixo, ela sobe para a fina camada do
adsorvente.

2. Objetivo
Separar e identificar componentes através da coloração deles.
3. Procedimento Experimental
3.1. Materiais e Reagentes
3.2. Materiais
• Placas cromatográficas para CCD;
• Coluna cromatográfica;
• Capilares de vidro;
• Funil simples;
• Béqueres;
• Pipetas de Pasteur;
• Garras de sustentação;
• Gral de porcelana e pistilo;
3.3. Reagentes
• Sílica-gel 60 para cromatografia em coluna;
• Sulfato de sódio anidro;
• Hexano;
• Etanol;
• Ácido acético glacial;
• Iodo;
• Cenoura;
• Beterraba;
• Folha de couve.
3.4. Metodologia

Preparo da amostra
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 • Corte as hortaliças em pequenos pedaços e macere com auxílio de um gral
com pistilo, adicione pequenas porções de sulfato de sódio;
• Em seguida, seque o material em estufa à 60ºC por aproximadamente 10
minutos;
• Após a desidratação do material adicione uma pequena porção de sílica gel
até obter uma mistura seca e dispersa (“farofa”).

Empacotamento da coluna

• Misture cerca de 2g de sílica gel para cromatografia em coluna com

solvente hexano suficiente para molhar toda a sílica, deixando uma
camada de mais ou menos 2 cm de solvente acima do nível da sílica.
• Agite com bastão de vidro essa mistura para eliminar bolhas de ar e deixe
um pouco de excesso de solvente. Adicione todo este material com
auxílio de funil simples para uma pequena coluna cromatográfica. Caso
necessário use um pouco de solvente para “lavar” o frasco em que foi
preparada a mistura.
• Bata levemente a coluna com seus dedos para melhor sedimentação do
adsorvente. Abra a torneira para retirada parcial do solvente, deixando
aproximadamente +1 mm de solvente acima do gel.

Eluição

• Adicione na coluna cromatográfica, cuidadosamente uma espátula

pequena de “farofa” com auxílio de um funil simples, batendo levemente a
coluna com os dedos para melhor sedimentação e distribuição uniforme do
material na coluna. Adicione a farofa até uma espessura aproximada de 0,3
cm.
• Após o acondicionamento da “farofa”, inicie a eluição, adicionando na
coluna com auxílio de uma pipeta de Pasteur 3 mL de hexano. Abra a torneira
da coluna e inicie a coleta do solvente em um Erlenmeyer, continue a adição
aos poucos do solvente até o carreamento dos primeiros compostos, realize a
coleta dos compostos em béqueres.

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 • Antes da completa eluição da fração hexânica, adicione na coluna, 3 mL
de álcool etílico para eluição da segunda fração. Mais 3 mL do solvente devem
ser adicionados gradualmente até o início da coleta da fração etanólica em um
segundo béquer.
• Modifiquem o solvente, adicionando inicialmente 3 mL de uma mistura
álcool/etílico/ácido acético (30%), adicione o eluente progressivamente até a
total eluição da terceira fração, colete em um terceiro béquer.

Cromatografia em camada delgada (CCD)

• Separe placas cromatográficas comerciais para CCD cortadas no

tamanho 5 x 10 mm, ou utilize placas de vidro preparadas com gel de sílica
para cromatografia em camada fina. Marque na placa uma linha imaginária reta
horizontal a 1 cm acima da borda.
• Aplique sobre essa marcação com auxílio de um capilar as amostras
disponibilizadas pelo instrutor separando os spots um do outro em torno de
aproximadamente 0,5 cm. Basta tocar a superfície da placa que a solução será
adsorvida naturalmente pela sílica. Não faça um ponto muito grande; se achar
que a quantidade de amostra foi pouca faça aplicações sucessivas (duas ou
três), e siga a orientação do professor ou monitor. Sempre que for aplicar cada
amostra, tenha o cuidado de lavar o capilar com metanol em algodão por três
vezes.
• Prepare a câmara de eluição contendo hexano/etanol. A quantidade de
solvente nas câmaras deve ser suficiente para manter a porção inicial do
adsorvente coberta e a um nível antes do ponto de aplicação das amostras.
• Coloque meio papel de filtro na câmara de eluição e após molhar com o
solvente faça aderir à parede interna da câmara. Isto tem por objetivo saturar o
recipiente com os vapores do solvente e minimizar a vaporização da camada
adsorvente.
• Coloque as plaquinhas preparadas na câmara de eluição e acompanhe
a eluição da placa até que a “frente” do solvente atinja aproximadamente 1,0
cm antes da marca final da placa. Marque esta localização, você vai precisar
dessa medida. Imediatamente retire a plaquinha e deixe o solvente evaporar
totalmente (se necessário use capela).

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 • Com a plaquinha seca observes os pontos coloridos e em seguida
coloque-a numa câmara de iodo por cerca de 10 minutos para revelar manchas
de outras substancias não coloridas que possam estar presente. A distâncias
entre o centro da mancha e o ponto de aplicação na base é a medida que esse
determinado solvente “arrastou” aquela substância. Outra medida é aquela do
ponto de aplicação na base até onde o solvente eluiu.
• Desenhe cada plaquinha revelada utilizando o modelo abaixo e calcule
o Rf para cada amostra.
4. Resultado e Discussão

Na primeira parte da prática, foi feita a cromatografia em coluna.

Inicialmente foram feitos cortes pequenos nas amostras (hortaliças de

cenoura, beterraba e couve) e em seguida foi moído com o auxílio de um gral
com pistilo. Logo após, foi adicionado pequenas quantidades de sulfato de
sódio, como mostra a figura 1:

Figura 1: Hortaliças

Fonte: Própria (2023)

Depois, foi levado o material para a estufa à 60ºC para secar, por 10
minutos. Seguidamente, foi adicionado uma pequena porção de sílica gel até
obter uma “farofa” de hortaliças.

Posteriormente, foi pesado com a ajuda de um béquer cerca de 2 g de

sílica gel na balança analítica. Em seguida, foi adicionado o hexano e misturado

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com a sílica gel. Logo após, foi agitado com um bastão de vidro a mistura para
eliminar bolhas de ar, deixando um pouco de excesso de solvente.
Seguidamente, foi adicionado essa mistura com a ajuda de um funil simples,
para a coluna cromatográfica, como mostra a figura 2:

Figura 2: Coluna Cromatográfica

Fonte: Própria (2023)

Em seguida, foi adicionado uma pequena quantidade da “farofa” de

hortaliças na coluna. Posteriormente, foi iniciado a eluição adicionando 3 mL
de hexano na coluna cromatográfica. Logo após, foi feita a coleta da primeira
fração, em um béquer, como mostra as figuras 3 e 4:

Figura 3: Eluição da fração com hexano

Fonte: Própria (2023)

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 Figura 4: Primeira Fração

Fonte: Própria (2023)

Logo após, foi adicionado na coluna álcool etílico aos poucos para a
eluição da segunda fração, como mostra as figuras 5 e 6:

Figura 5: Eluição da segunda fração com álcool etílico

Fonte: Própria (2023)

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 Figura 6: Segunda Fração

Fonte: Própria (2023)

Seguidamente, foi modificado o solvente, adicionando uma quantidade

de uma mistura de álcool etílico/ácido acético (30%), formando a terceira
fração, como mostra a figura 7:

Figura 7: Eluição da terceira fração com ácido acético

Fonte: Própria (2023)

Segundo Degani, Cass e Vieira (1998), o empacotamento da coluna faz

com que a fase estacionária se distribua homogeneamente por toda a coluna,
permitindo mais eficácia na separação dos constituintes. A separação dos
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compostos ocorreu pela adição de eluentes com o aumento gradativo de
polaridade. Foi iniciado com o Hexano, um solvente de baixa polaridade,
posteriormente seguiu com o álcool etílico e por fiz uma mistura de álcool +
ácido acético (30%). Esse uso de solventes de polaridades crescente (do
menor para o maior), é o que facilita o desenvolvimento da cromatografia, pois,
solventes de menor polaridade apresentam pouca interação com a fase
estacionária de caráter polar.

Na segunda parte da prática, foi feita a cromatografia em camada delgada

ou CCD.

Inicialmente foram feitas as separações das duas placas

cromatográficas, cortados no tamanho 5 x 10 mm. Em seguida, foi feito uma
linha horizontal a 1 cm acima da borda nas duas placas. Logo após, foram feitos
2 pontos de marcações de lápis em cada placa.

Posteriormente, com a ajuda de um capilar, foi aplicado a primeira

amostra de hexano em um dos spots. Em seguida, foi lavado esse capilar.
Depois, com o auxílio do mesmo capilar, foi aplicado a segunda amostra de
álcool etílico no outro spots, como mostra a figura 8 a seguir:

Figura 8: Aplicação das amostras na placa

Fonte: Própria (2023)

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 Seguidamente, foi lavado novamente esse capilar, e foi feita a aplicação
da terceira amostra de ácido acético em outra placa. Logo após, foi lavado o
capilar, e feito a aplicação novamente da amostra de ácido acético + álcool
etílico no outro spot, como mostra a figura 9 a seguir:

Figura 9: Aplicação das amostras na placa

Fonte: Própria (2023)

Posteriormente, foi preparado a câmara de eluição contendo

hexano/etanol, como mostra a figura 10. Em seguida, com o auxílio de uma
pinça, foi levado a primeira placa para a câmara de eluição, observando para o
solvente não atingir o topo da plaquinha, tendo que ficar 1,0 cm antes da marca
final da placa. Seguidamente, foi retirado rapidamente a placa da câmara e com
a ajuda de um lápis foi feito a marcação, logo após, com o auxílio de uma régua
foi medido até onde o solvente ficou.

Figura 10: Câmara de eluição

Fonte: Própria (2023)

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 Foi feito esse mesmo procedimento com a segunda plaquinha. Logo
após, foi levado as placas para o ultravioleta, para observar as substâncias,
como mostra a figura 11 a seguir:

Figura 11: Ultravioleta

Fonte: Própria (2023)

Seguidamente, com as plaquinhas secas, foram colocadas na câmara

de iodo, para ser revelado as manchas de outras substâncias não coloridas que
possam estar presentes, como mostra a figura 12 a seguir:

Figura 12: Placas com manchas de outras substâncias

Fonte: Própria (2023)

Posteriormente, com a ajuda de uma régua e um lápis, foram feitas

marcações na placa, para o cálculo do Rf.
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Cálculo do Rf da amostra 2 (Álcool etílico):

Rf: Da/Dm

Rf1: 1,2/3,2 = 0,3750

Rf2: 2,6/3,2 = 0,8125

O Rf1 é menor que o Rf2, isso ocorre, pois, substâncias mais polares
ficam presas a fase estacionaria quando ela também é polar e substâncias
menos polares são mais facilmente eluidas, pois não tem afinidade para
ficarem retidas.

Constituintes das hortaliças

A cenoura, por ser um vegetal, não possui retinol, contém uma grande
quantidade de betacaroteno, uma substância bastante colorida, que está
presente em frutas amarelas, vermelhas e alaranjadas. Segundo Pimentel,
Elias e Philippi (2019), o betacaroteno é um pró-vitamínico A. No ano de 1930
foi descoberto que o betacaroteno podia ser convertido in vivo em retinol
(vitamina A). Ainda segundo Pimentel, Elias e Philippi (2019), nos humanos, a
conversão do betacaroteno em vitamina A ocorre principalmente no intestino,
mas também pode ocorrer no fígado, rins, tecido adiposo e pulmões. A seguir
a fórmula do betacaroteno, na figura 13:

Figura 13: Betacaroteno

Fonte: Pimentel, Elias e Philippi (2019)

Segundo Sigrist (2012), a beterraba é constituída por betacianina, folato,

vitamina (B,C), betacaroteno, ácido fólico, clorofila, potássio e ferro. A
beterraba é uma hortaliça anual herbácea, cuja parte comestível é uma raiz
tuberosa. Ela também é rica em açúcares, destaca-se por seu alto teor de ferro,
tanto nas raízes quanto nas folhas. A seguir a fórmula da Indicaxantina na figura
14:
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 Figura 14: Indicaxantina

Fonte: Pimentel, Elias e Philippi (2019)

A couve, segundo Sigrist (2015) tem como constituintes as fibras,

vitaminas (A, complexo B, C e K), colina, betaína, uteína, zeaxantina, alfa e
betacaroteno. A couve também possui compostos como clorofila, polifenóis,
glucosinolatos e vitaminas, que ajudam a prevenir o câncer. Além de que,
também possui sulforafano e os flavonoides, substâncias que atuam contra os
radicais livres, evitando a formação de células cancerígenas. A seguir a fórmula
da clorofila, na figura 15:

Figura 15: Clorifila

Fonte:

5. Conclusão

Diante dos resultados obtidos, é possível concluir que o experimento

proposto foi realizado com êxito, sendo perceptivo pela análise, observar a
separação de cada substância através da cromatografia em coluna e em
camada delgada, e sendo possível observar que em cada spot ficou diferentes
pigmentos.
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6. Referências Bibliográficas

DEGANI, A. L. G., CASS, Q. B., VIEIRA, P. C. Cromatografia um breve

ensaio. Química Nova na Escola, n° 7, 1998.

ENGEL, et al,. Química Orgânica Experimental: técnicas de escala

pequena. 3. ed. São Paulo: Cengage Learning, 2012.

FONSECA, S.F., GONÇALVES, C.C.S. Extração de pigmentos do espinafre

e separação em coluna de açúcar comercial. Química Nova na Escola, São
Paulo, n.20, p. 55-58, novembro, 2004.

PIMENTE, C.V.M.B., ELIAS, M.F., PHILIPPI, S.T. Alimentos funcionais e

compostos bioativos. 1. ed. Barueri, São Paulo, 2019.

SCHULER, A. Cromatografia a Gás e Líquido. 2009.

SIGRIST, Sergio. Beterraba. Plantas Medicinais, 2012. Disponível em: <

https://www.ppmac.org/content/beterraba >. Acesso em: 05 de março de 2023.

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