Cromatografia em camada fina

A Cromatografia em camada fina (TLC) a passou a ser uma técnica

instrumental como as demais formas de cromatografia, pois contém baixos
custos e muitas vantagens.
Embora a técnica permaneça fundamentalmente a mesma, o uso de
instrumentação na aplicação da amostra, no desenvolvimento, na densitometria
e no registro dos resultados ampliou em muito a utilidade da cromatografia em
camada fina.
A Cromatografia em camada fina (TLC) tem várias vantagens sobre outras
formas de cromatografia:
- Usualmente, a preparação da amostra é simples.
- As amostras podem ser comparadas diretamente, frequentemente durante a
corrida.
- O desenvolvimento paralelo de amostras relacionadas e não relacionadas
pode ser feito simultaneamente.
- Vários procedimentos de detecção podem ser aplicados, frequentemente na
mesma placa.
- A separação pode ser acompanhada todo o tempo e interrompida quando
desejado ou quando se troca o sistema de solventes.
- O volume de solventes e outros reagentes é muito pequeno.
A diferença importante entre a cromatografia em camada fina e outras formas
de cromatografia é o lado prático e não o fenômeno físico envolvido (adsorção,
partição etc.). Assim, na cromatografia em camada fina a fase estacionária é
uma fina camada de um adsorvente (por exemplo, sílica gel, celulose em pó ou
alumina) colocada sobre um material rígido e inerte, como uma placa de vidro
ou uma folha de alumínio ou de plástico. Isto significa que o processo de
separação ocorre em uma superfície plana e essencialmente em duas
dimensões.
As Técnicas de Cromatografia em camada fina são:
- Preparação da placa
As placas de TLC devem ser manuseadas cuidadosamente pelas bordas. Não se deve
tocar a superfície da placa para evitar contaminação.
É aconselhável limpar a placa antes de usá-la, de modo a remover eventuais
impurezas do adsorvente

- Aplicação das amostras

É muito importante, quando se deseja fazer análise quantitativa, aplicar as “manchas”
de amostra com acurácia e precisão.
Usar volumes adequados, medidos em um instrumento de precisão, isto é, uma
seringa ou uma micropipeta. Deve-se ter cuidado para não perturbar a superfície da
camada de adsorvente porque isto distorce a forma das manchas no cromatograma
desenvolvido e atrapalha a análise quantitativa.

- Desenvolvimento das placas

Colocam-se fitas de papel de filtro nas paredes da cuba, mergulhadas no solvente,
para garantir que a cuba fique saturada com vapor de solvente (Fig. 7.2). Permite-se o
desenvolvimento até que a frente de solvente atinja a distância necessária
(usualmente 10 a 15 cm), remove-se a placa e marca-se a posição da frente de
solvente com um objeto pontudo. Seca-se a placa em capela ou em estufa. Na
secagem, deve-se levar em consideração a sensibilidade da amostra ao calor e à luz

- Medida e identificação de solutos

- Medidas Quantitativas

TLC em duas dimensões

Em muitos casos, mesmo usando diversas etapas de separação com solventes
diferentes, a separação de misturas por TLC com o desenvolvimento em uma
só direção não permite uma boa resolução dos componentes. Este problema
pode ser superado com o uso da cromatografia em camada fina em duas
dimensões. A técnica pode ser aplicada até mesmo para compostos
estruturalmente muito relacionados. Neste procedimento, a separação é feita
usando-se uma placa de TLC quadrada. A aplicação da amostra é feita perto
de um dos vértices da placa e um primeiro desenvolvimento é feito usando um
sistema de solventes . Quando o desenvolvimento se completar, a placa é
retirada da cuba e seca. Gira-se a placa de 90° de modo a fazer com que a
coluna de manchas separadas passe a ser a linha de partida. O cromatograma
é desenvolvido novamente usando-se um segundo sistema de solventes. O
resultado é uma separação efetiva que cobre uma boa área da placa de TLC.
Uma das grandes vantagens da cromatografia em camada fina em duas
dimensões é que é possível se obter separações efetivas de materiais
estruturalmente muito semelhantes com placas quadradas de apenas 10 cm ×
10 cm.
Cromatografia em camada fina com alta resolução (HPTLC)
A melhoria da qualidade dos adsorventes de TLC e dos procedimentos de
aplicação das amostras aumentou de tal modo o desempenho da cromatografia
em camada fina na separação de misturas, que a expressão “cromatografia em
camada fina com alta resolução (HPTLC)” foi cunhada para descrever as
separações em alta resolução que passaram a ser possíveis.
Qualidade da camada adsorvente
As camadas de adsorvente para HPTLC são preparadas com sílica gel
especialmente purificada, com partículas de diâmetro médio de 3 a 5 μm e
distribuição estreita de diâmetros. A sílica gel pode ser modificada, se
necessário. As camadas feitas com estes adsorventes especiais têm cerca de
5000 pratos teóricos e são muito mais eficientes do que a cromatografia em
camada fina convencional. Isto permite conseguir separações muito mais
difíceis em menor tempo.
Métodos de aplicação da amostra
Como a camada de HPTLC tem menor capacidade, a quantidade de amostra
aplicada é menor. Tipicamente, as amostras têm volume da ordem de 100 a
200 nl, com manchas de 1,0 a 1,5 mm de diâmetro inicial. Após o
desenvolvimento por 3 a 6 cm, observam-se manchas compactas separadas
cujo limite de detecção é cerca de 10 vezes melhor do que o da cromatografia
em camada fina convencional. Outra vantagem é que manchas iniciais
pequenas permitem o aumento do número de amostras que podem ser
aplicadas na mesma placa.
A colocação da amostra na camada adsorvente é um processo crítico em
HPTLC. Para o trabalho quantitativo, o instrumento mais conveniente para
colocar a amostra é um capilar de platina-irídio de volume constante (100 ou
200 nl), selado em um capilar de vidro de diâmetro maior como suporte.
A cromatografia em camada fina pode ser uma técnica de análise muito
trabalhosa porque muitas etapas estão necessariamente envolvidas: a
preparação da amostra, frequentemente seguida por extração com solvente e
concentração do extrato, a aplicação da amostra, o desenvolvimento do
cromatograma e a revelação das manchas por fluorescência ou reação
química. A análise quantitativa exige, ainda, outras etapas como a raspagem e
a dissolução ou a leitura ótica
Densitômetros de varredura
Instrumentos comerciais para análise quantitativa in situ baseada em medidas
fotométricas diretas são hoje muito usados em TLC. Existem instrumentos de
feixe simples e de feixe duplo que são particularmente importantes em HPTLC
devido à alta qualidade e homogeneidade da superfície das placas. Os
densitômetros varrem as manchas uma a uma por reflexão ou absorção de um
feixe de luz.