Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho”

Faculdade de Ciências Farmacêutica

Produção e Separação de Biofármacos

PRODUÇÃO E RECUPERAÇÃO DE PROTEÍNA VERDE FLUORESCENTE

(EGFP) EM Escherichia coli BL21 (DE3)

Prof.ª Dr.ª Valéria de Carvalho Santos Ebinuma

Prof. Dr. Heitor Buzetti Simões Bento
Técnico: Flávio Pereira Picheli
Estágio Docência: Me. Caio de Azevedo Lima

Bruno Coelho da Fonseca

Isadora Arcanjo Gori
Izadora Barreto Alves dos Santos
Mariana Ribeiro de Castro

Araraquara
2023
 Resumo

A produção de proteínas recombinantes é uma técnica de manipulação genética que

permite a clonagem de um gene específico em um vetor de expressão e sua posterior inserção
em um organismo hospedeiro capaz de sintetizar a proteína recombinante desejada, podendo
citar a Escherichia coli (E. coli) como um dos hospedeiros mais utilizados para tal produção,
devido à sua facilidade, velocidade de crescimento e baixo custo. Entre as proteínas
recombinantes, destaca-se a proteína verde fluorescente aprimorada (EGFP), amplamente
utilizada como marcador em experimentos de biologia molecular e em pesquisas
biotecnológicas. A EGFP é uma variante da proteína de fluorescência verde (GFP)
originalmente isolada da medusa Aequorea victoria, caracterizada por sua forte emissão de
fluorescência verde quando exposta à luz ultravioleta ou azul. A diferença mais notável entre
a GFP e a EGFP é a maior fluorescência da versão aprimorada e maior estabilidade. O
presente projeto visará a produção de EGFP a partir do cultivo de E. coli BL21 (DE3) pLysS
e pET28(a). Para tal, deverá ser realizada a reativação do microrganismo congelado, a etapa
de pré-inoculo e o cultivo em Luria-Bertani (LB) feito em triplicata, com agitação constante à
200 RPM. Após nove horas do inóculo haverá indução por IPTG, onde a temperatura do
processo anterior a indução deverá ser de 37 °C e 30 °C após a indução. Como método
analítico, foi realizada a curva de crescimento celular, para determinar a densidade óptica
(OD) inicial e o momento ideal para a indução do cultivo. Ao longo de todo processo serão
realizadas análises da OD à 600 nm (OD600) e com o término do cultivo, as células deverão
ser separadas do meio LB por centrifugação a 5000 G, por 20 minutos a 4 ºC, para que possa
ser feita a quantificação do produto por análise de fluorescência com excitação em 488 nm e
emissão em 507 nm. O meio será esterilizado e propriamente descartado, enquanto as células
serão preservadas e armazenadas para futura extração da EGFP.
 Sumário

1. Introdução 4
2. Objetivos 6
3. Materiais e métodos 7
3.1. Fluxograma do processo 7
3.2. Materiais 7
3.2.1. Preparo de caldo LB (10:10:5) 7
3.2.2. Preparo da solução tampão Tris-HCl 8
3.2.3 Preparo canamicina (50 mg/mL) 8
3.2.4. Preparo cloranfenicol (50 mg/mL) 8
3.2.5. Reativação 9
3.2.6. Pré-inóculo 9
3.2.7. Solução estoque IPTG (1 M) 10
3.2.8. Cultivo 10
3.2.9. Separação 10
3.2.10. Quantificação do crescimento 11
3.2.11. Quantificação do produto 11
3.2.12. Armazenamento 11
3.2.13. Descontaminação e descarte dos resíduos 11
3.3. Metodologia 11
3.3.1. Preparo de caldo LB (10:10:5) 11
3.3.2. Preparo da solução tampão Tris-HCl 12
3.3.3 Preparo canamicina (50 mg/mL) 12
3.3.4. Preparo cloranfenicol (50 mg/mL) 12
3.3.5. Preparo solução estoque IPTG (1 M) 13
3.3.6. Reativação 13
3.3.7. Pré-inóculo 13
3.3.8. Cultivo 14
3.3.9. Análise de dados 15
3.3.9.1. Curva de crescimento celular 15
3.3.9.2. Quantificação do crescimento 16
3.3.9.3. Quantificação do produto 16
3.3.10. Descarte de materiais 17
3.3.11. Armazenamento 17
4. Resultados esperados 18
4.1. Densidade ótica celular 18
4.2. Concentração de proteína produzida 19
5. Cronograma 21
6. Referências bibliográficas 22
 1. Introdução

Os sistemas heterólogos são frequentemente empregados na biotecnologia para

produzir proteínas recombinantes, enzimas e outras moléculas biológicas de interesse. Esses
sistemas envolvem a transferência de genes de uma espécie para outra, o que permite a
expressão de proteínas heterólogas em hospedeiros não naturais. Essa abordagem possibilita a
produção de proteínas complexas, como anticorpos e hormônios, que seriam difíceis ou
impossíveis de obter por meio de métodos convencionais (WATTS et al., 2021). Um dos
sistemas mais empregados para a produção de proteínas recombinantes é a Escherichia coli
(E. coli) devido à sua facilidade, velocidade e baixo custo (KAUR; KUMAR; KAUR, 2018).
Proteínas recombinantes são proteínas produzidas por meio de manipulação genética,
que envolve a clonagem de um gene específico em um vetor de expressão. O vetor de
expressão é então inserido em um organismo hospedeiro – como bactérias, leveduras, células
de insetos ou células de mamíferos – capaz de sintetizar a proteína recombinante desejada. A
técnica de clonagem permite a produção de grandes quantidades de proteínas específicas em
escala industrial, tornando-as uma fonte importante de biomoléculas para uso em pesquisas,
diagnósticos e terapias. A produção de proteínas recombinantes envolve várias etapas, como
a otimização do vetor de expressão, a seleção de células hospedeiras adequadas e a
otimização das condições de cultivo para a produção de proteínas em grande escala
(HACKER, 2018). Sua produção tem sido amplamente utilizada em diversos campos da
ciência, como biotecnologia, medicina e agricultura onde podem ser utilizadas como
medicamentos, vacinas, enzimas industriais, reagentes de diagnóstico e marcadores em
experimentos de biologia molecular (MATTANOVICH, 2012). A produção de proteínas
recombinantes tem sido cada vez mais aprimorada, com novas técnicas e estratégias sendo
desenvolvidas para melhorar a qualidade, a pureza e a eficiência da produção de proteínas em
grande escala (HACKER, 2018).
Dentre as proteínas recombinantes, tem-se a proteína de fluorescência verde
aprimorada (EGFP), amplamente utilizada como marcador em experimentos de biologia
molecular e em pesquisas biotecnológicas, além de poder ser utilizada como uma ferramenta
para o estudo de processos celulares complexos, como a transdução de sinal, a endocitose e a
exocitose (CHEN et al., 2017). A EGFP é uma variante monomérica e que não precisa de
agentes adicionais para exibir atividade de fluorescência (SOUSA, 2019) da proteína de
fluorescência verde (GFP) originalmente isolada da medusa Aequorea victoria e é
caracterizada por sua forte emissão de fluorescência verde quando exposta à luz ultravioleta

4
ou azul (SHANER et al., 2007). A diferença mais notável entre a GFP e a EGFP é a maior
fluorescência da versão aprimorada, além de possuir maior estabilidade, pois a versão nativa
da proteína demonstra indícios de desnaturalização por volta da temperatura de 37 °C,
condição esta não apresentada na EGFP (LOPES et al., 2019). A aplicação desta proteína
tem sido fundamental em diversas áreas de pesquisa, como em um estudo recente, por
exemplo, no qual foi desenvolvido um biossensor à base de EGFP que pode ser usado para
monitorar a presença de compostos esteróides, como o hormônio estradiol, em amostras
ambientais, que podem ter efeitos prejudiciais na saúde humana e no meio ambiente; sendo a
detecção precisa desses compostos importante para a segurança pública (LI et al., 2022).
Além disso, tem sido utilizada em estudos de câncer para entender o comportamento de
células tumorais e sua interação com o ambiente tumoral. A compreensão dos processos
celulares e moleculares mediados pela EGFP tem permitido avanços significativos em
diversas áreas da biologia e da medicina (TSUBOI; JIN, 2022).

Figura 1: Estrutura terciária da EGFP.

Fonte: Cellerna Bioscience, 2023.

A proteína EGFP é frequentemente produzida em Escherichia coli (E. coli) devido à

sua capacidade de sintetizar proteínas em grande escala e a baixo custo. Esta produção é
realizada por meio da clonagem do gene da proteína em um vetor de expressão adequado,
como o vetor pLyss, que contém o promotor bacteriano T7 para a indução da expressão da
proteína recombinante. Ademais, a produção da proteína EGFP em E. coli é frequentemente
acompanhada pela fusão da proteína com um sinal de exportação para o periplasma ou para o
meio extracelular, facilitando sua purificação e aumentando a eficiência da produção
(SANTOS, 2022).

5
 No cultivo de células, os indutores (moléculas que ativam a expressão de um gene
específico em um organismo) são frequentemente usados para induzir a expressão de
proteínas recombinantes em células hospedeiras (WEAKE; WORKMAN, 2010). Em E. coli,
por exemplo, a expressão de uma proteína de interesse pode ser induzida adicionando um
indutor à cultura bacteriana. Na produção de EGFP em E. coli, o indutor mais comumente
utilizado é o isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG). O IPTG é um análogo da lactose
que atua como um indutor de genes do sistema operon lactose (operon lac) em E. coli.
Quando adicionado a uma cultura contendo um plasmídeo que codifica a proteína EGFP, o
IPTG induz a expressão desta a partir do promotor do sistema operon lac. A quantidade de
IPTG necessária pode variar dependendo das condições de cultivo, como a densidade celular
e a taxa de crescimento. Portanto, a otimização da concentração de IPTG é necessária para
garantir uma produção máxima de EGFP. Além disso, o momento da adição do indutor à
cultura também pode afetar a expressão da proteína e o momento ideal deve ser determinado
empiricamente (FAUST; STAND; WEUSTER-BOTZ, 2015).

2. Objetivos

Produção da Proteína Verde Fluorescente Aprimorada (EGFP) produzida em Escherichia

coli BL21 (DE3) pLysS e pET28(a).

2.1. Objetivos específicos

● Reativar as células de E. coli BL21 (DE3) pLysS e pET28(a) e realizar o pré-inóculo

adequadamente;
● Inocular as amostras com a DO inicial de estipulada e realizar os cultivos nas
condições previamente determinadas;
● Alcançar a DO estimada para os momentos finais do cultivo, com formação de EGFP;
● Separar as células do meio e quantificar a produção de EGFP.

6
3. Materiais e métodos

3.1. Fluxograma do processo

Fonte: Próprio Autor, 2023.

3.2. Materiais

3.2.1. Preparo de caldo LB (10:10:5)

● Proveta de 1 L;
● 1 litro de água destilada;
● 10 g de triptona;
● 10 g de NaCl;
● 5 g de extrato de levedura;
● Balança analítica;
● Agitador magnético;
● Barra magnética cilíndrica;
● NaOH 1M (para ajustar o pH para 7,0);

7
● Peagâmetro;
● Frasco reagente graduado de 1 L;
● Autoclave.

3.2.2. Preparo da solução tampão Tris-HCl

● 3,03 g de sal Tris (Tris(hidroximetil)amino metano) (MM = 121,14 g/mol);

● 500 mL de água Milli-Q;
● Ácido clorídrico 37%;
● Peagâmetro;
● Solução tampão fosfato equimolar 0,25 M pH 7;
● Solução tampão borato de sódio pH 8,8 a 0,1M;
● Agitador magnético;
● Barra magnética cilíndrica;
● Frasco tipo béquer 100 mL;
● Balão volumétrico 500 mL;
● Frasco reagente graduado de 500 mL;
● Autoclave.

3.2.3 Preparo canamicina (50 mg/mL)

● 0,10 g de canamicina (sulfato de canamicina) (MM = 582,6 g/mol);

● 2 mL de água destilada;
● Agitador magnético;
● Barra magnética cilíndrica;
● Seringa de 5 mL estéril;
● Filtro 0,22 µm estéril;
● 1 microtubo estéril para centrífuga de 2 mL;
● Cabine de fluxo laminar;
● Freezer -20°C.

3.2.4. Preparo cloranfenicol (50 mg/mL)

● 0,10 g de cloranfenicol (sulfato de canamicina) (MM = 323,1 g/mol);

● 2 mL de etanol 95%;

8
● Agitador magnético;
● Barra magnética cilíndrica;
● 1 microtubo estéril para centrífuga de 2 mL;
● Freezer -20°C.

3.2.5. Reativação

● Criotubo com Escherichia coli BL21 (DE3) com os plasmídeos pLysS e pET28(a)
criopreservada em glicerol 10%;
● Cabine de fluxo laminar;
● Ponteira estéril;
● 1 placa de Petri contendo 20 mL de meio LB ágar (composição: 10 g de peptona, 5 g
de extrato de levedura, 5 g cloreto de sódio e 12 de ágar para 1 litro de água destilada)
estéril, suplementado com 50mg/L de canamicina e cloranfenicol (previamente
preparados e estéreis como prevê esta metodologia).

3.2.6. Pré-inóculo

● 3 frascos tipo erlenmeyer de 100 mL estéreis;

● 30 μL de solução estoque de canamicina (50 mg/mL) previamente preparada e
esterilizada;
● 30 μL de solução estoque de cloranfenicol (50 mg/mL) previamente preparado e
esterilizado;
● Micropipeta de 10 μL;
● Pipetador automático;
● 2 pipetas sorológicas estéreis de 10 mL;
● Caixa de ponteiras de 10 μL estéreis;
● 30 mL de meio de cultura LB previamente preparado e esterilizado;
● Colônia de Escherichia coli BL21 (DE3) com os plasmídeos pLysS e pET28(a)
derivada da reativação;
● Agitador rotativo;
● Cabine de fluxo laminar.

9
3.2.7. Solução estoque IPTG (1 M)

● Balança analítica;
● 0,0476 g de IPTG (MM = 238,31 g/mol);
● 200 μL de água destilada;
● Micropipeta de 200 μL;
● Seringa de 1 mL estéril;
● Filtro 0,22 µm estéril;
● 1 microtubo estéril de 1 mL;
● Cabine de fluxo laminar;
● Freezer a 4 °C;
● Ponteiras de 10 μL e 200 μL;
● Micropipeta de 10 μL.

3.2.8. Cultivo

● 3 frascos tipo erlenmeyers de 500 mL estéreis;

● 300 μL de canamicina (50 mg/mL) previamente preparada e esterilizada;
● 300 μL de cloranfenicol (50 mg/mL) previamente preparado e esterilizado;
● Micropipetas de 100 μL;
● Pipetador automático;
● 2 pipetas sorológicas estéreis de 25 (ou 50 mL preferencialmente);
● Caixa de ponteiras de 200 μL;
● 300 mL de meio de cultivo LB;
● Agitador orbital;
● 15 μL de IPTG (1 M) estéril;
● 3 cubetas de plástico de espectrofotometría de 1 mL;
● Espectrofotômetro;
● Cabine de fluxo laminar.

3.2.9. Separação

● Centrífuga;
● Vortex;
● Micropipeta de 1000 μL;

10
 ● Microtubos para centrífuga;
● Banho de gelo.

3.2.10. Quantificação do crescimento

● Espectrofotômetro;
● Cubetas de plástico de 1 mL para espectrofotômetro;
● Micropipeta de 1000 μL;
● Ponteiras descartáveis para micropipeta;
● Microtubos para centrífuga.

3.2.11. Quantificação do produto

● Micropipetas de 10 μl, 50 μl e 1000 μl;

● Ponteiras descartáveis para as respectivas micropipetas;
● Espectrofotômetro;
● Microtubos para centrífuga;
● Cubetas de plástico de 1 mL;
● Peagâmetro;
● Solução tampão Tris-HCl (50 mM, pH 8).

3.2.12. Armazenamento

● Freezer a -20 °C.

3.2.13. Descontaminação e descarte dos resíduos

● Saco de lixo branco leitoso para descarte de material biológico;

● Autoclave.

3.3. Metodologia

3.3.1. Preparo de caldo LB (10:10:5)

O meio de cultura utilizado o longo do processo, tanto para o pré-inóculo quanto para
o cultivo da E.coli será o meio de cultura Luria-Bertani (LB) contendo 10 g/L de triptona, 5
g/L de extrato de levedura e 10 g/L de cloreto de sódio (NaCl) (DU et al., 2021) em 1 L de

11
água destilada. Deverá ser feita a medição do pH da solução formada utilizando peagâmetro e
ajustada, caso necessário, para 7,0 com NaOH 1M (SEZONOV; JOSELEAU-PETIT; D’ARI,
2007), não há necessidade de assepsia no preparo do cultivo, pois o meio deverá ser
transferido para um frasco reagente graduado e então esterilizado por autoclave por 25
minutos a 120 °C (SEZONOV; JOSELEAU-PETIT; D’ARI, 2007).

3.3.2. Preparo da solução tampão Tris-HCl

Já para o preparo do tampão, serão feitos 500 mL de tampão Tris-HCl 50 mM pH 8

para serem utilizados ao longo de todo o projeto. Para tal, serão dissolvidos 3,03 g de sal
Tris(hidroximetil)amino metano em 50 mL de água Milli-Q. A solução deverá então ter seu
pH corrigido para 8 utilizando ácido clorídrico (HCl) 37%, a análise do pH será feita a partir
de leitura em peagâmetro, em que serão utilizados soluções tampão de calibração solução
tampão pH 7 de fosfato equimolar 0,25 M e borato de sódio pH 8,8 a 0,1 M. Após a correção,
o tampão deverá ser passado para um balão volumétrico, onde seu volume será completado
até os 500 mL. Por fim, a solução será transferida para um frasco reagente, o qual deverá
passar pela esterilização por autoclave a 120 °C por 15 minutos.

3.3.3 Preparo canamicina (50 mg/mL)

Para o preparo da solução estoque do antibiótico canamicina em concentração de 50

mg/mL, serão pesados 0,1 g de sulfato de canamicina, que posteriormente serão adicionados
em 2 mL de água destilada e agitados com agitador magnético até completa dissolução. Após
isso, a solução deverá ser transferida para uma seringa de 5 mL e filtrada em filtro de 0,22
µm estéril em ambiente asséptico. Por fim, será armazenada em microtubo para centrífuga de
2 mL em freezer -20°C (GOLD BIOTECHNOLOGY, 2018).

3.3.4. Preparo cloranfenicol (50 mg/mL)

Para o preparo da solução estoque do antibiótico cloranfenicol em concentração de 50

mg/mL, serão pesados 0,1 g de cloranfenicol, que posteriormente serão adicionados em 2 mL
de etanol 96% e agitados com agitador magnético até completa dissolução (GOLD
BIOTECHNOLOGY, 2019). Como o etanol já garante a assepsia e pode vir a dissolver o
filtro, a filtração não será realizada (MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY,

12
2023). Por fim, será armazenada em microtubo para centrífuga de 2 mL em freezer -20°C
(GOLD BIOTECHNOLOGY, 2019).

3.3.5. Preparo solução estoque IPTG (1 M)

Para o preparo da solução estoque, serão pesados 0,0476 g de IPTG e dissolvidos em

200 µL de água destilada, de modo que a concentração final na solução seja de 1 M. Em
seguida, a solução será filtrada em membrana de 0,22 µm (em ambiente asséptico) e
armazenada em microtubo de 2 mL a 4 °C (GOLD BIOTECHNOLOGY).

3.3.6. Reativação

Para a promover o crescimento e adaptação do microrganismo que se encontra

criopreservado em glicerol a -80 °C, uma pequena quantidade de células de Escherichia coli
BL21 (DE3) com os plasmídeos pLysS pET28a será transferida através de esgotamento, de
maneira asséptica, utilizando uma ponteira estéril, para uma placa de Petri contendo 20 mL
de meio LB ágar (composição previamente descrita nos Materiais) acrescido de 20 μL de
cada uma das soluções de estoque previamente preparadas dos antibióticos canamicina e
cloranfenicol de maneira que ambos fiquem na concentração final de 50 mg/L, assim como
será feito para o cultivo. Em seguida, a placa será incubada overnight a 37 °C.

3.3.7. Pré-inóculo

A fim de realizar o cultivo para produção de EGFP com densidade óptica (OD600)
padronizada e controlada será realizada a etapa de pré-inóculo.
O pré-inóculo será realizado com o microrganismo já reativado, em triplicata,
utilizando 3 frascos tipo erlenmeyers de 100 mL contendo 10 mL (THALITA FONSECA DE
ARAUJO, 2017) (cada) de meio de cultura Luria-Bertani (LB) previamente. O meio de
cultura será suplementado (cada um dos frascos) com 10 μL das soluções de estoque
previamente preparadas dos antibióticos canamicina e cloranfenicol, de maneira que ambos
fiquem na concentração final de 50 mg/L (LOPES et al., 2019). Esta etapa será realizada na
véspera da execução do cultivo, os frascos serão alocados overnight em agitador orbital com
agitação de 200 rpm e a 37 °C (LOPES et al., 2019).

13
 3.3.8. Cultivo

Semelhantemente ao pré-inóculo, para a produção da EGFP será realizado um cultivo

em triplicata em 3 frascos do tipo erlenmeyers de 500 mL com 100 mL de meio de cultura
LB previamente esterilizado. O meio de cultura será suplementado com 100 μL das soluções
de estoque previamente preparadas dos antibióticos canamicina e cloranfenicol, de maneira
que ambas possuam concentração final de 50 mg/L (LOPES et al., 2019).
O cultivo será iniciado às 12:45 horas e deverá apresentar OD600 inicial de
aproximadamente 0,05 quando medida em espectrofotômetro. As condições padrão do
cultivo serão de agitação de 200 rpm e 37 °C, já a indução por IPTG (1 M) será realizada
entre as 18:00 e 19:00 horas, com 5 μL, de maneira que a concentração final seja de 0,05 mM
(SOUSA et al., 2018), o que, de acordo com a curva de crescimento que nos foi fornecida e
pode ser verificada na Figura 2, representa o meio da fase de crescimento exponencial do
microrganismo utilizado, próximo à OD600 de 3,7.
O procedimento será conduzido por 23 horas e 15 minutos, sendo finalizado às 12:00
horas do dia seguinte ao inicial. Todos os três cultivos estarão sob agitação constante de 200
rpm durante todo o processo, utilizando o agitador orbital, enquanto a temperatura inicial será
de 37 °C para que favoreçam o crescimento, sendo ajustada para 30 °C após a adição do
indutor IPTG ao meio para favorecer a produção da proteína-alvo.

Figura 2: Curva de crescimento de Escherichia coli BL21 (DE3) contendo os plasmídeos pLysS e pET28(a)
fornecida pelos responsáveis pela disciplina.

Fonte: Responsáveis pela disciplina, 2023.

14
 3.3.9. Análise de dados

3.3.9.1. Curva de crescimento celular

A densidade óptica celular (DO) é uma medida da concentração de células em uma

suspensão, com base na absorção de luz em uma determinada faixa de comprimento de onda,
essencial para análise e quantificação do crescimento celular (MYERS; CURTIS, 2013).
Realizou-se então a curva de crescimento celular através da espectrofotometria de amostras
do cultivo de E. coli BL21 (DE3) [pLysS e pET28(a)] com intuito de analisar o
comportamento do microrganismo nas condições impostas, de tal forma a pré-determinar a
densidade óptica inicial para o inóculo, além do momento em que deverá ser realizado a
indução do cultivo para formação de EGFP.
O processo ocorreu em triplicata, sendo assim, foram preparados três meios de
cultura, todos sob as mesmas condições para o cultivo do microrganismo a 35 °C e agitação
constante de 200 rpm. Ao todo foram dispostas 30 horas para análise do crescimento celular,
divididos em 25 pontos, tempo suficiente para observar as diferentes fases do crescimento.
Para cada ponto foram retiradas três alíquotas de cada cultivo, com intuito de medir a
absorbância dos meios em triplicatas. Como a absorção de luz pela biomassa de E. coli é
maior na faixa dos 600 nm (MYERS; CURTIS, 2013), as medidas de absorbância por
espectrofotometria foram todos neste comprimento de onda.
Após a coleta de todos os pontos, realizou-se as médias aritméticas e desvios padrões
para cada um deles. Dessa forma foi possível montar a curva de crescimento celular, tendo a
absorbância (nanômetros) em função do tempo (horas).

3.3.9.2. Quantificação do crescimento

Serão retiradas 3 alíquotas de 1 mL de cada cultivo, utilizando micropipeta de 1000

μL em dois momentos do processo, quantificando o crescimento celular pela análise de OD600
em leituras no espectrofotômetro, fazendo uso de cubetas e tendo meio LB como branco
amostral. O primeiro ponto será retirado durante a etapa de adição do IPTG como indutor
(seis horas após o inóculo inicial), certificando-se que o cultivo esteja em sua fase
exponencial, como previsto pela curva de crescimento. Já o segundo momento será ao
término do processo, após 23 horas e 15 minutos do início, conferindo se os dados obtidos
estão de acordo com os resultados esperados.

15
 3.3.9.3. Quantificação do produto

Para determinar a concentração de EGFP, assim como mostra a pesquisa de Lopes et

al. (2019), após o término do cultivo o meio contendo as células será centrifugado a 5000 G
por 20 minutos a 4 ºC. O sobrenadante será descartado e o pellet ressuspendido em tampão
Tris-HCl (50 mM) em pH 8. Em seguida, para calcular a concentração de EGFP produzida
(mg/L), será utilizada uma curva de calibração padrão disponibilizada pelo técnico do
laboratório. A quantidade de EGFP é determinada a partir da comparação entre a
fluorescência da amostra e do padrão utilizando excitação a 488 nm e emissão a 507 nm.

Sabendo que a absorbância é diretamente proporcional à concentração, calcula-se esta

última a partir dos dados da curva de calibração padrão (Absorbância x Concentração) e dos
dados obtidos pela leitura das amostras em espectrofotômetro a 600 nm. Assim sendo, uma
das maneiras de quantificar a produção proteica é através do fator de calibração (Equação 1),
como segue:

CEGFP = A EGFP x Fc (Equação 1)

Em que CEGFP é a concentração de EGFP; AEGFP é a absorbância de EGFP medida na

amostra e Fc é o fator de calibração (média dos valores entre Cp/Ap, sendo Cp a concentração
do padrão e Ap a absorbância do padrão).

Outra maneira de obter a concentração de EGFP produzida é plotando os pontos de

absorbância obtidos em cada amostra, na curva padrão. Em seguida, calcula-se a equação da
reta (Equação 2) substituindo os valores, como mostra a Equação 3 a seguir.

y = a⋅x + b (Equação 2)

AEGFP = a⋅CEGFP + b (Equação 3)

𝐴𝐸𝐺𝐹𝑃 – 𝑏
Logo, a concentração de EGFP pode ser calculada como CEGFP = .
𝑎

3.3.10. Descarte de materiais

De acordo com a RDC Nº 306, de 7 de dezembro de 2004, os materiais biológicos

pertencentes ao grupo denominado A1, tais como culturas microbianas/estoques de

16
microrganismos; meios de cultura e instrumentais utilizados para transferência, etc.
necessitam passar por um tratamento prévio para que sejam descartados.
Portanto, todos os materiais utilizados no presente projeto serão inicialmente
autoclavados em sacos de acondicionamento adequado para tal, visando a inativação
microbiana; e, se necessário, armazenados temporariamente somente para facilitar a coleta –
conforme descrito na RDC supracitada. Após passar pelo tratamento, os materiais deverão ser
colocados em sacos brancos leitosos resistentes a vazamentos e rupturas, e então descartados
na coleta externa.

3.3.11. Armazenamento

Após quantificação e análise dos resultados obtidos, o homogenato celular da etapa

anterior será congelado a -20° C no mesmo recipiente em que se encontra (LOPES et al.,
2019).

4. Resultados esperados

4.1. Densidade ótica celular

A curva utilizada como base para determinação do crescimento celular foi fornecida
pelos docentes, apresentada anteriormente como Figura 2, construída sob 200 rpm de
agitação a 35 °C. De acordo com o gráfico, se espera que o início da fase log seja de
aproximadamente 3 horas a partir do início do cultivo, tendo seu pico cerca de 15 horas após
a inoculação. Dessa forma, a 200 rpm, é esperado que a densidade ótica a 600 nm no final da
fase log, 9 horas após o momento da indução (no tempo correspondente a 15 horas totais)
seja por volta de 5 UA. Similarmente, Larentis et al. (2014), observaram uma densidade ótica
de cerca 4,5 UA para ambas temperaturas de 28 °C e 37 °C, sob agitação de 200 rpm em E.
coli BL21 (DE3), indicando que os valores máximos de crescimento obtidos foram
semelhantes. Da mesma maneira, Lopes et al. (2019) verificaram uma OD600 de quase 5 UA
em E. coli BL21 (DE3) [pLysS; pET28(a)] para 200 rpm a 30 °C após 13 horas de
crescimento total, utilizando IPTG (0,05 mM) como indutor adicionado depois de cerca de 5
horas e meia de cultivo. Robichon et al. (2011) obtiveram uma OD600 para o mesmo
microrganismo supracitado de aproximadamente 5 UA após 8 horas de incubação em meio
LB a 30 °C.

17
 É necessário ressaltar que a velocidade de agitação é um fator determinante no que se
refere ao crescimento celular, uma vez que limitações da quantidade de oxigênio dissolvido
no meio interferem diretamente no metabolismo do microrganismo utilizado (ROSANO et
al., 2014), bem como relatado por Lopes et al. (2019), onde o crescimento celular diminuiu
proporcionalmente com a redução da velocidade de agitação. Bates et. al., (2016) verificaram
que o diâmetro orbital do agitador, o mesmo a ser utilizado nos experimentos, possui uma
relação linear com a taxa de transferência de oxigênio. Da mesma maneira, também foi
observado por Meier et al. (2016) que altas velocidades de agitação acarretam uma maior
quantidade de oxigênio disponível para as células, otimizando assim, seu crescimento.
Foi observado que a utilização da lactose como indutor, além de provocar a expressão
da proteína recombinante, também promove o crescimento celular (NEUBAUER et al.,
1991). Por outro lado, apesar de alguns autores observarem que a indução por IPTG tenha
afetado negativamente o crescimento celular (OMOYA et al., 2004; WYRE; OVERTON,
2014), Lopes et al. (2019) obteve perfis parecidos de crescimento celular induzidos por IPTG
quando comparado com culturas que não foram induzidas. Jesuíno et al. (2020) descreveram
um comportamento de crescimento celular relativamente maior quando utilizado a lactose
como indutor em detrimento do IPTG em ambos ensaios com frasco agitado e em biorreator.
Lopes et al. (2019) também relatou que as diferentes concentrações de IPTG não tiveram
influência significativa no crescimento celular da E. coli BL21(DE3) [pLysS; pET28(a)].
Sendo assim, não se pode fazer uma previsão sucinta de qual indutor utilizado
promoverá um maior crescimento celular, porém, baseado no previsto pela Literatura, se
espera que a lactose apresente um crescimento relativamente maior do que o IPTG quando
usados como indutores. É esperado que a velocidade de agitação utilizada (200 rpm)
influencie positivamente no crescimento celular, conforme já citado, bem como a temperatura
selecionada (37 °C antes da indução), uma vez que corresponde à temperatura ótima de
crescimento do microrganismo em questão (NEIDHARDT et al., 1990). Também se espera
que, por promover a indução aproximadamente no meio da fase exponencial, o crescimento
se dê de maneira mais rápida, visto que nesse período a maioria das células se encontram
vivas e saudáveis, já que essa etapa corresponde ao estágio mínimo de duplicação celular
(LOPES et al., 2019).

18
 4.2. Concentração de proteína produzida

Com relação a concentração de proteína produzida, é esperado que a velocidade de

200 rpm provavelmente não seja a mais eficiente em comparação com as outras utilizadas
pelos demais grupos, conforme descrito por Lopes et al., (2019), em decorrência da
possibilidade de dobramento incorreto da proteína de interesse ocasionado pelas altas taxas
de expressão gênica proporcionadas pelo elevado crescimento decorrentes da alta velocidade
de agitação em questão. Por outro lado, as menores velocidades de agitação também podem
não ser correspondentes a uma maior produção de proteína, visto que a EGFP ainda passa por
uma etapa final para sua formação completa, a qual é um processo dependente da taxa de
oxidação.
Os mesmos autores também verificaram a influência de diferentes concentrações do
indutor a 150 rpm, e concluíram que pouquíssimo interferem na produção de EGFP, embora o
momento de indução afeta substancialmente na produção. De acordo com os autores, a
realização da indução no início da fase log apresentou um desempenho produtivo
desvantajoso em comparação com a indução realizada no meio e no final dessa fase, que por
sua vez maximizou a produção da proteína de interesse. Além disso, foi observado que
mesmo utilizando concentrações muito baixas de IPTG, como por exemplo 0,005 mM, a
produção de EGFP pôde ser mantida da mesma maneira, sem variações significativas. Sendo
assim, a concentração de 0,05 mM, mínima estudada por Lopes et al., (2019), foi selecionada
para a indução com IPTG uma vez que altas concentrações do mesmo podem ocasionar um
efeito tóxico para as células (DVORAK et al., 2015).
A utilização de dois tipos diferentes de indutores também pode influenciar na
produção da proteína recombinante em questão. Divitiis et al. (2023) ao analisar a produção
de GFP utilizando IPTG (0,1 g/L) e lactose (10 g/L) introduzidos no início da fase
exponencial durante 24 horas, observaram um efeito similar de ambos indutores. Neubauer
et. al (1992) também relataram um desempenho parecido entre os dois indutores
mencionados quando utilizados para expressar uma proteína de interesse em Escherichia coli
BL21 (pET3). Dvorak et al. (2015) verificaram em seus estudos que o uso da lactose como
indutor acarreta uma carga metabólica menor que o IPTG, indicando a lactose pode ser um
indutor mais adequado para a expressão de vias heterólogas inteiras em E. coli BL21 (DE3).
Ainda, Kilikian et al. (2000) declararam, através de estudos, que embora a indução por IPTG
tenha produzido maiores concentrações proteicas, a indução por lactose gerou menos
metabólitos, favorecendo a estabilidade do plasmídeo. Lopes et al. (2019) resume as

19
vantagens e desvantagens de ambos indutores, pontuando que o IPTG é considerado um
indutor forte por promover uma rápida indução, representando uma vantagem com relação a
lactose, que por sua vez, oferece custos e toxicidade menores que o primeiro devido a sua
lenta indução (DVORAK et al., 2015). Por outro lado, a lactose pode ocasionar uma auto
indução indesejada, comprometendo a eficiência do processo produtivo. Portanto, para os
experimentos propostos e de acordo com os estudos expostos, o tipo de indutor não pode ser
o único fator levando em consideração nas análises de crescimento celular e produção de
EGFP, uma vez que diversos fatores influenciam esses parâmetros, fatores esses que serão
selecionados e administrados por cada grupo de maneira diferente. Consequentemente, não se
pode prever com uma certa eficácia, qual indutor será mais adequado para o processo.
Além disso, um fator de relevância corresponde à temperatura pós-indução, pois, ao
mesmo tempo que altas temperaturas favorecem o crescimento celular, podem prejudicar a
expressão da proteína de interesse, uma vez que maiores taxas de crescimento tendem a
estimular a partição incorreta de um vetor de expressão. Ahmad et al. (2018) afirma que a
temperatura também pode influenciar o nível de expressão e a estabilidade conformacional da
proteína recombinante. Vera et al. (2007) também verificaram que a diminuição da
temperatura provocou uma redução da formação das proteínas insolúveis, sugerindo que
temperaturas de crescimento abaixo da ótima característica de E. coli produzem um efeito
benéfico na solubilidade da GFP, além de indicar um melhor enovelamento da proteína e
otimização da formação do cromóforo. Consequentemente, assim como proposto no presente
projeto, a diminuição da temperatura após o momento de indução (de 37 para 30° C) pode
evitar a formação de corpos de inclusão decorrentes da redução da taxa de síntese proteica
(PAPANEOPHYTOU; KONTOPIDIS, 2013).
Dessa forma, com base no estudo de Lopes et al. (2019), que apresenta condições
semelhantes ao projeto em questão, se espera que a produção de EGFP do presente grupo
(200 rpm e 0,05 mM de IGTP) se encontre acima de 150 mg.L−1 após aproximadamente 18
horas de experimento total.

20
5. Cronograma

Fonte: Próprio Autor, 2023.

21
 6. Referências bibliográficas

AHMAD, I.; NAWAZB, N.; DARWESHC, N. M.; UR RAHMAND, S.; MUSTAFAE, M. Z.; KHANF, S. B.;
PATCHINGA, S. G. Overcoming challenges for amplified expression of recombinant proteins using Escherichia
coli. Protein Expression and Purification, v. 144, p. 12-18, 2018. Disponível em:
<https://sci-hub.se/10.1016/j.pep.2017.11.005>. Acesso em: 11 mar. 2023

BATES, M. K. et al. Shaker Agitation Rate and Orbit Affect Growth of Cultured Bacteria. © 2016 Thermo
Fisher Scientific Inc. Disponível em: <https://www.labshop-online.com/H179/DWN/d02594_.pdf>. Acesso em:
11 mar. 2023.

BRASIL. Resolução da Diretoria Colegiada - RDC Nº 306, de 7 de dezembro de 2004. Dispõe sobre o
Regulamento Técnico para o gerenciamento de resíduos de serviços de saúde. Disponível em:
<http://www.fiocruz.br/biosseguranca/Bis/manuais/legislacao/residuos/lei%20federal/RDC%20N%20306,%20
DE%207%20DE%20DEZEMBRO%20DE%202004.pdf>. Acesso em: 10 mar. 2023.

CHEN, C. et al. Unveiling Structural Motions of a Highly Fluorescent Superphotoacid by Locking and
Fluorinating the GFP Chromophore in Solution. The Journal of Physical Chemistry Letters, v. 8, n. 23, p.
5921–5928, 2017. Disponível em: <https://doi.org/10.1021/acs.jpclett.7b02661>. Acesso em: 09 mar. 2023.

CELLERNA BIOSCIENCE. PureBoostTM EGFP mRNA. Disponível em:

<https://www.cellerna.bio/product-page/pureboost-egfp-mrna>. Acesso em: 14 mar. 2023.

DU, F. et al. Regulating the T7 RNA polymerase expression in E. coli BL21 (DE3) to provide more host
options for recombinant protein production. Microbial Cell Factories, v. 20, n. 1, 26 set. 2021.

DVORAK, P. et al.. Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3) carrying a
synthetic metabolic pathway. Microb Cell Fact. 2015 Dec 21;14:201. doi: 10.1186/s12934-015-0393-3. PMID:
26691337; PMCID: PMC4687329. Disponível em:
<https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687329/>. Acesso em: 11 mar. 2023.

FAUST, G.; STAND, A.; WEUSTER-BOTZ, D. IPTG can replace lactose in auto-induction media to enhance
protein expression in batch-cultured Escherichia coli. Engineering in Life Sciences, v. 15, n. 8, p. 824–829,
2015. Disponível em: <https://doi.org/10.1002/elsc.201500011>. Acesso em: 09 mar. 2023.

GOLD BIOTECHNOLOGY. 50 mg/ml Kanamycin Stock Solution. St. Louis, Mo: Gold Biotechnology, 2018.
Disponível em: https://goldbio.com/uploads/documents/09f0860faec44a90b46d742fd8a735bd.pdf. Acesso em:
19 mar. 2023.

GOLD BIOTECHNOLOGY. 25-50 mg/ml Chloramphenicol Stock Solution. St. Louis, Mo: TD-S Revision
2.0, 2019. Disponível em: https://goldbio.com/documents/1037/Chloramphenicol+Stock+Solution.pdf. Acesso
em: 19 mar. 2023.

GOLD BIOTECHNOLOGY. IPTG - 100mM (100 x) Stock Solution. Disponível em:

<https://goldbio.com/uploads/documents/8c80eb3c5bf9760ea332618f77069b71.pdf>. Acesso em: 19 mar. 2023.

HACKER, D. L. (ED.). Recombinant Protein Expression in Mammalian Cells. New York, NY: Springer
New York, 2018. Disponível em: <https://link.springer.com/book/10.1007/978-1-4939-8730-6>. Acesso em 09
mar. 2023.

JESUINO, Aylime Castanho Bolognesi Melchior. Diferentes estratégias de cultivo de Escherichia coli
recombinante para produção de proteína verde fluorescente (Green Fluorescent Protein-GFP). Tese
(Doutor em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista
"Júlio de Mesquita Filho”. Araraquara, 2020. Disponível em:
https://repositorio.unesp.br/bitstream/handle/11449/191825/jesuino_acbm_dr_arafcf_int.pdf?sequence=3.
Acesso em 14 mar. 2023.

KAUR, J.; KUMAR, A.; KAUR, J. Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli :
Roadblocks and reinforcements. International Journal of Biological Macromolecules, v. 106, p. 803–822,
2018. Disponível em: <https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2017.08.080>. Acesso em: 09 mar. 2023.
KILIKIAN, B. V.; SUÁREZ, I. D.; LIRIA, C. W.; GOMBERT. A. K. Process strategies to improve heterologous
protein production in Escherichia coli under lactose or IPTG induction. Process Biochemistry. v. 35, p.
1019-1025, 2000. Disponível em: <https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/20000313432>. Acesso em: 14
mar. 2023.

LARENTIS, A. L. et al. Evaluation of pre-induction temperature, cell growth at induction and IPTG
concentration on the expression of a leptospiral protein in E. coli using shaking flasks and
microbioreactor. BMC Res Notes 7, 671, 2014. https://doi.org/10.1186/1756-0500-7-671. Disponível em:
<https://bmcresnotes.biomedcentral.com/articles/10.1186/1756-0500-7-671#citeas>. Acesso em: 11 mar. 2023.

LI, Z. et al. Steroid hormone-inducible biosensor based on EGFP-tagged and environmental application.
Environmental Research, v. 215, p. 114303, 2022. Disponível em:
<https://doi.org/10.1016/j.envres.2022.114303>. Acesso em: 09 mar. 2023.

LOPES, C. et al. Improving the cost effectiveness of enhanced green fluorescent protein production using
recombinant Escherichia coli BL21 (DE3): Decreasing the expression inducer concentration. Biotechnology
and Applied Biochemistry, v. 66, n. 4, p. 527–536, 2019. Disponível em:
<https://iubmb.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/bab.1749>. Acesso em: 09 mar. 2023.

LOPES, C. Da produção da proteína verde fluorescente à sua extração utilizando sistemas aquosos
bifásicos. 2018. 64 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Biociências e Biotecnologia Aplicadas À Farmácia,
Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Araraquara, 2018. Disponível em:
<https://repositorio.unesp.br/bitstream/handle/11449/153390/lopes_c_me_arafcf_int.pdf?sequence=6&isAllowe
d=y>. Acesso em: 13 mar. 2023.

MAIER, U.; BÜCHS, J. Characterization of the gas-liquid mass transfer in shaking bioreactors. Biochemical
Engineering Journal. 2001, Vol. 7. Disponível em: <https://doi.org/10.1016/j.bej.2016.01.014>. Acesso em: 11
mar. 2023.

MATTANOVICH, D. et al. Recombinant protein production in yeasts. Methods in molecular biology

(Clifton, N. J.), v. 824, p. 329–58, 2012. Disponível em: <10.1007/978-1-61779-433-9_17>. Acesso em 09 nov.
2023.

MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY. STOCK SOLUTION. Provo, Ut: Byu, 2023. Disponível
em: https://mmbio.byu.edu/griffitts-lab/stock-solution. Acesso em: 19 mar. 2023.

MYERS, J. A.; CURTIS, B. S.; CURTIS, W. R. Improving accuracy of cell and chromophore concentration
measurements using optical density. BMC Biophysics, v. 6, n. 1, p. 4, 2013. Disponível em:
<https://doi.org/10.1186/2046-1682-6-4>. Acesso em: 07 mar. 2023.

NEIDHARDT, F. C.; INGRAHAM, J. L.; SCHAECHTER, M. Physiology of the bacterial cell – a molecular
approach. Sunderland: Sinauer Associates, 1990. Disponível em:
<https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1016/0307-4412(92)90139-D>. Acesso em: 13 nov. 2023.

NEUBAUER, P. et al. Maximizing the expression of a recombinant gene in Escherichia coli by manipulation of
induction time using lactose as inducer. Appl Microbiol Biotechnol. v. 36, n. 6, p. 739-44, 1992. Disponível
em: <https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/1369364/>. Acesso em: 13 nov. 2023.

OMOYA, K. et al. Systematic optimization of active protein expression using GFP as a folding reporter.
Protein Expr Purif. 2004 Aug;36(2):327-32. doi: 10.1016/j.pep.2004.04.023. PMID: 15249057. Disponível em:
<https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15249057/>. Acesso em 14 nov. 2023.

Papaneophytou CP, Kontopidis G. Statistical approaches to maximize recombinant protein expression in

Escherichia coli: a general review. Protein Expr Purif. 2014 Feb; 94:22-32. doi: 10.1016/j.pep.2013.10.016.
Epub 2013. PMID: 24211770.

ROBICHON, C. et al. Engineering Escherichia coli BL21(DE3) derivative strains to minimize E. coli protein
contamination after purification by immobilized metal affinity chromatography. Appl Environ Microbiol. 2011
Jul;77(13):4634-46. doi: 10.1128/AEM.00119-11. Epub 2011 May 20. PMID: 21602383; PMCID:
PMC3127686. Disponível em: <https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21602383/>. Acesso em: 11 mar. 2023.
ROSANO, G. L; CECCARELLI, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and
challenges. Front Microbiol. 2014 Apr 17;5:172. doi: 10.3389/fmicb.2014.00172. PMID: 24860555; PMCID:
PMC4029002. Disponível em: <https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24860555/>. Acesso em: 11 mar. 2023.

SANTOS, S. P. O. et al. Engineering an optimized expression operating unit for improved recombinant
protein production in Escherichia coli. Protein Expression and Purification, v. 199, p. 106150, nov. 2022.

SEZONOV, G.; JOSELEAU-PETIT, D.; D’ARI, R. Escherichia coli Physiology in Luria-Bertani Broth.
Journal of Bacteriology, v. 189, n. 23, p. 8746–8749, 28 set. 2007.

SOLA, M. C. Manutenção de Microrganismos: Conservação e Viabilidade. Enciclopédia Biosfera, Centro

Científico Conhecer: Goiânia, v. 8, n.14, p. 1398, 2012. Disponível em:
<http://www.conhecer.org.br/enciclop/2012a/biologicas/manutencao.pdf>. Acesso em: 13 mar. 2023.

SEZONOV, G.; JOSELEAU-PETIT, D.; D’ARI, R. Escherichia coli Physiology in Luria-Bertani Broth.
Journal of Bacteriology, v. 189, n. 23, p. 8746–8749, 2007.

SOUSA, A. P. A. et al. AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO CELULAR E DA EXPRESSÃO DE GFP (GREEN

FLUORESCENT PROTEIN) POR Escherichia coli RECOMBINANTE FRENTE A ADIÇÃO DE LACTOSE,
GLICOSE E IPTG. Blucher Chemical Engineering Proceedings, 2018.

SOUSA, A. P. A. Aumento de escala para produção de Proteína verde fluorescente melhorada (Enhanced
Green Fluorescent Protein – EGFP) a partir de Escherichia coli recombinante em biorreator
convencional. 2019. 84 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Pósgraduação em Ciências Farmacêuticas, Área de
Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita
Filho”, Araraquara - Sp, 2019. Disponível em:
<https://repositorio.unesp.br/bitstream/handle/11449/181957/sousa_apa_me_arafcf_int.pdf?sequence=5&isAllo
wed=y>. Acesso em: 11 mar. 2023.

ARAUJO, T. F. de. PRÁTICA DE INDUÇÃO DA EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS EM

Escherichia coli. Santana do Livramento: Universidade Federal do Pampa, 2017. Disponível em:
https://guri.unipampa.edu.br/uploads/evt/arq_trabalhos/13035/seer_13035.pdf#:~:text=A%20pr%C3%A1tica%2
0de%20indu%C3%A7%C3%A3o%20de,conhecimentos%20que%20contribuir%C3%A3o%20para%20sua.
Acesso em: 14 mar. 2023.

TSUBOI, S.; JIN, T. In Vitro and In Vivo Fluorescence Imaging of Antibody–Drug Conjugate-Induced Tumor
Apoptosis Using Annexin V–EGFP Conjugated Quantum Dots. ACS Omega, v. 7, n. 2, p. 2105–2113, 2022

VERA, A.; GONZÁLEZ-MONTALBÁN, N.; ARÍS, A.; VILLAVERDE, A. The Conformational Quality of
Insoluble Recombinant Proteins is Enhanced at Low Growth Temperatures. Biotechnology and
Bioengineering. v. 96, n. 6, p. 1101-1106, 2007. Disponível em: <https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17013944/>.
Acesso em: 14 mar. 2023.

WATTS, A. et al. Optimizing protein expression in heterologous system: Strategies and tools. Meta Gene, v. 29,
p. 100899, set. 2021. Disponível em: <https://doi.org/10.1016/j.mgene.2021.100899>. Acesso em 09 mar. 2023.

WEAKE, V. M.; WORKMAN, J. L. Inducible gene expression: diverse regulatory mechanisms. Nature
Reviews Genetics, v. 11, n. 6, p. 426–437, 27 abr. 2010. Disponível em:
<https://www.nature.com/articles/nrg2781>. Acesso em: 09 mar. 2023.

WYRE, C.; OVERTON, T. W. Use of a stress-minimisation paradigm in high cell density fed-batch Escherichia
coli fermentations to optimise recombinant protein production. J Ind Microbiol Biotechnol, v. 41, n. 9, p.
1391-404, 2014. Disponível em: <https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25056840/>. Acesso em: 14 mar. 2023.