Israel Assis – GRR20191611 10/05/2023

Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia – BB051 Prova 1

1. A embriogênese somática é uma técnica de cultivo in vitro de plantas de

alto potencial para aplicação em diversas espécies visando a geração de
um grande número de mudas ao final do processo. Escolha uma espécie
vegetal de interesse, faça uma busca na literatura (sugiro o Google
Scholar e a utilização de língua inglesa) por um artigo que descreva a
metodologia de embriogênese somática dessa determinada espécie e
responda as seguintes questões:

Artigo escolhido:

GARCIA, Claudia et al. Optimization of somatic embryogenesis procedure for

commercial clones of Theobroma cacao L. African Journal of Biotechnology, v.
15, n. 36, p. 1936-1951, 2016.

a) Qual foi o tipo de explante utilizado para a indução da embriogênese somática

neste artigo? Pétalas de flores de cacau imaturas foram usadas para o
procedimento de embriogênese somática.

b) Quantos tipos diferentes e quais as composições de meio de cultura foram

utilizados em cada uma das diferentes etapas desse protocolo?

4 tipos de meio foram utilizados para o processo embriogênes somática nesse

trabalho: Primary Callus Growth (PGC) medium, secondary callus growth
medium (SCG), embryos development-4 medium (ED4), embryos development-
3 medium (ED3).

Meio Componentes Concentrações (em mg/L ou g/L)

Meio PCG padrão DKW sal basal (Driver and Kuniyuki, 1984) 1X

Vitaminas (Driver and Kuniyuki, 1984) 1X

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Meio Componentes Concentrações (em mg/L ou g/L)

2,4-D (Ácido diclorofenoxiacético) 2 mg/L

TDZ (thidiazuron) 5 µg/L

L-glutamina 250 mg/L

myo-inositol 200 mg/L

glucose 20 g/L

Phytagel 2 g/L

pH 5.8

Meio SCG padrão Sais WPM (Lloyd and McCown, 1980) 1X

Solução de vitaminas de Gamborg (Gamborg,

1966) 1X

2,4-D 2 mg/L

BAP 50 µg/L

glucose 20 g/L
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Meio Componentes Concentrações (em mg/L ou g/L)

Phytagel 2 g/L

pH 5.8

Meio ED4 DKW sal basal 1X

Vitaminas DKW (Driver and Kuniyuki, 1984) 1X

sacarose 40 g/L

Phytagel 2 g/L

pH 5.8

Meio ED3 DKW sal basal 1X

Vitaminas DKW (Driver and Kuniyuki, 1984) 1X

sacarose 30 g/L

Phytagel 2 g/L

pH 5.8
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Sal basal DKW:

Solução de vitaminas DKW:

Sal WPM:
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Solução de vitaminas de Gamborg:

Imagens retiradas do site da empresa Duchefa Biochemie, com base em

produtos analíticos comerciais.

c) Os autores conseguiram obter plantas aclimatizáveis ao final do processo?

Sim, com esse processo, 54,57% das plantas inicialmente obtidas in vitro foram
aclimatizadas com sucesso, o que nesse experimento totalizou 4912 plantas
aclimatadas com sucesso.

2. Uma biofábrica deseja fazer o cultivo in vitro e produção de mudas de

abacaxizeiro pela técnica de organogênese direta utilizando gemas axilares
como explante inicial e multiplicando brotos a cada subcultivo. Sabe-se que a
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perda por contaminação no processo de introdução in vitro das gemas axilares

é de 20%. A taxa de multiplicação in vitro é de 1:10, e a perda por contaminação
em cada subcultivo realizado é de 10%. Além disso, na etapa de aclimatização
das mudas, existe uma perda de 5% derivado da desidratação excessiva das
plântulas nessa transição.

O objetivo da biofábrica é produzir 500.000 mudas, ao final de 12 meses de

cultivo a contar da introdução in vitro.

Baseado nessas informações, responda:

a) Indique e descreva quais os procedimentos você escolheria para a etapa

inicial de estabelecimento das culturas in vitro justificando o porquê da
escolha. Considere todos os passos (seleção de plantas matrizes, coleta
do material vegetal, tratamento de desinfestação, introdução do explante
in vitro e composição de meio de cultura); (1,5 pts)

Seleção de plantas matrizes: selecionar plantas em boas condições fisio-

histológicas, sem presença de parasitas e/ou microorganismos infectantes que
possam ser considerados maléficos para a planta, além de selecionar indivíduos
com características desejáveis para a produção de abacaxis, que produzem
frutas de boa qualidade. Pode ser interessante também um pré-tratamento
nutricional e de controle sanitário para selecionarmos as plantas matrizes.

Coleta de material vegetal: Após selecionadas as plantas matrizes, a coleta do

material vegetal deve ser priorizada em partes jovens e com aspecto saudável,
com mais chance de resposta e menor possibilidade de oxidação fenólica.
Podem ser escolhidas regiões como caule, folhas, raízes, embriões,
inflorescências, etc. para retirada dos explantes, mas nesse caso utilizaremos as
gemas axilares. Tomaremos cuidado para não danificar o tecido para evitar
posteriores respostas indesejadas.

Desinfestação: a limpeza superficial pode ser realizada com hipoclorito de sódio

ou cálcio, álcool etílico e/ou água oxigenada. A escolha desse método, de qual
agente utilizar, por quanto tempo e de que maneira, vai depender de futuras
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avaliações de características da espécie. Importante destacar que como

estamos almejando a cultura de meristemas (gema axilar), essa etapa é melhor
servida como um tratamento fraco, para não danificar o tecido.

Introdução do explante in vitro: já com os explantes saindo do processo de

desinfestação em um ambiente estéril (como um fluxo laminar por exemplo),
utilizaremos desse ambiente descontaminado, juntamente com utensílios e
equipamentos na mesma condição para esse processo. Faremos o isolamento
do meristema, com auxílio de microscópio estereoscópio, pinças e bisturis, para
inoculá-lo no meio. Devemos remover o meristema com a menor quantidade de
tecidos adjacentes possível.

Composição do meio de cultura: Uma alternativa de meio, segundo DeWald et

al., 1988, seria a utilização do meio MS (Murashige and Skoog, 1962) adicionado
de 3% de sacarose, 0,8% de Ágar, 0,57mM de inositol, 1,2 uM tiamina HCl, 10,8
uM ANA e 8,8 uM BAP, com pH ajustado para ~5,8.

DEWALD, M. G. et al. Production of pineapple plants in vitro. Plant cell reports,

v. 7, p. 535-537, 1988.

b) Quantos explantes iniciais são necessários serem introduzidos in vitro

para alcançar a meta de produção de mudas estipulado? (1 pt)

Devemos iniciar com aproximadamente 73.100 explantes in vitro.

3. O cultivo de embriões zigóticos pode ser feito utilizando embriões maduros ou

imaturos (resgate de embriões). Baseado nessa premissa, responda:

a) Descreva comparativamente ou faça uma tabela comparativa indicando as

principais alterações necessárias dos componentes de meio de cultura e as
aplicações dessa técnica; (2,0 pts)
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Cultivo de embriões maduros: Cultivo de embriões imaturos (resgate

características do meio de embriões)
Meio simples Meio mais complexo

Fonte de carbono (açúcares + Fonte de carbono (açúcars + simples)

simples) ex:sacarose ex:sacarose

Fonte de sais mineirais diversos Fonte de sais mineirais diversos

Água Água

Aminoácidos (opcional) Aminoácidos

Fonte de Vitaminas diversas Fonte de Vitaminas diversas

Extratos vegetais para promover

microfatores não adicionados

Reguladores de crescimento vegetal

(hormônios sintéticos) ex: ácidos
giberélicos, BAP, entre outros, para
estimular a continuidade do
desenvolvimento dos embriões

b) Escolha um dos dois tipos de explantes mencionados, busque na literatura

(sugiro o Google Scholar e a utilização de língua inglesa) um artigo que tenha
utilizado essa abordagem e descreva brevemente seus resultados. (2,0 pts)

No trabalho “Embryo rescue and plant regeneration in banana (Musa

spp.)” (UMA, S. et al., 2011), os autores desenvolveram um protocolo para cultivo
e resgate de embriões em diferentes estágios de maturidade em espécies de
banana (Musa spp.); a maioria dos embriões testados eram provenientes de
cruzamentos com baixa probabilidade de serem bem-sucedidos naturalmente,
mas que tinham potencial para características de interesse. Isso foi feito visando
principalmente o interesse para produção de novas variedade de banana, com
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características desejáveis. Segundo o estudo, o estágio de maturidade do

embrião coletado exerce uma importante influência na taxa de sucesso do
resgate. O meio basal utilizado foi o meio MS (Murashige and Skoog), adicionado
com diferentes reguladores de crescimento vegetais. Os melhores resultados
foram obtidos utilizando-se 6-benziladenina (BA) e ácido indolacético (AIA), à 4.4
μM e 2.8 μM, respectivamente, como reguladores adicionados.

Esse estudo pode vir a servir como base para o desenvolvimento de

outros protocolos para plantas com características similares, já que os métodos
adotados se mostraram funcionais.

Artigo utilizado:

UMA, S. et al. Embryo rescue and plant regeneration in banana (Musa spp.).
Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), v. 105, p. 105-111, 2011.