CENTRO UNIVERSITÁRIO DO NORTE PAULISTA

CURSO DE ENGENHARIA QUIMICA

SABRINA CIANE CONDI

FERMENTAÇÃO DE ALTO DESEMPENHO

AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MÁXIMA DE ETANOL EM CÉLULAS
DE LEVEDURA

SÃO JOSÉ DO RIO PRETO, SP.

2013
 CENTRO UNIVERSITÁRIO DO NORTE PAULISTA

CURSO DE ENGENHARIA QUÍMICA

SABRINA CIANE CONDI

FERMENTAÇÃO DE ALTO DESEMPENHO

AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MÁXIMA DE ETANOL EM CÉLULAS
DE LEVEDURA

Monografia apresentada ao Centro

Universitário do Norte Paulista - UNORP,
como requisito parcial à obtenção do título de
bacharel em Engenharia Química.

Orientador: Eng. Milena H. P. Bicudo Tognete

SÃO JOSÉ DO RIO PRETO, SP

2013
 CENTRO UNIVERSITÁRIO DO NORTE PAULISTA - UNORP

CURSO DE ENGENHARIA QUÍMICA

SABRINA CIANE CONDI

FERMENTAÇÃO DE ALTO DESEMPENHO

AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MÁXIMA DE ETANOL EM CÉLULAS
DE LEVEDURA

Monografia aprovada em ____/____/____ para obtenção do título de Bacharel em

Engenharia Química.

Banca Examinadora:

_______________________________________
Eng. Milena Heloísa Pozenatto Bicudo Tognete

_______________________________________
Prof. MS. Selma Cristina Fernandes

_______________________________________
Prof. MS. Rodrigo Verona
DEDICATÓRIA

Aos dois exemplos de mulheres que tive durante toda vida,

minha mãe e minha avó, mulheres fortes e guerreiras que
desde pequena me mostraram o caminho do bem e a seguir
a vida sempre de cabeça erguida. A elas dedico esse
trabalho e todas as conquistas que tive em minha vida.
 AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por sempre cuidar tão bem da minha vida e por me encaminhar a essa tão
importante profissão.

À minha família, em especial a minha mãe Noeli e meus avós Maria e Cirino, pelo exemplo,
amor, compreensão e incentivo. E aos meus tios, Varlí e Lucas pela contribuição que tiveram
na minha educação. Foi fundamental o auxílio deles para que esse sonho fosse realizado.

À minha orientadora Milena pela amizade de sempre e pela valiosa contribuição para a minha
vida e formação profissional que me proporcionou desde que a conheci.

À microbiologista Mariana Virgili e todos os analistas da Usina Virgolino que contribuíram

com os experimentos e ensaios deste projeto.

Aos meus amigos de faculdade pela compreensão e auxílio quando precisei e pelos momentos
de descontração, tão necessários nessa jornada.
PENSAMENTO

Desistir? Eu já pensei seriamente nisso, mas nunca me levei

realmente a sério.
É que tem mais chão nos meus olhos do que cansaço em
minhas pernas, mais esperança nos meus passos, do que
tristeza nos meus ombros, mais estrada no meu coração do
que medo na minha cabeça.
Cora Coralina
 RESUMO

O objetivo deste estudo é encontrar a concentração máxima de etanol/ g de açúcares totais

recuperáveis - ART no mosto (Pmáx) para as células de leveduras. Desejamos encontrar as
mais altas concentrações de etanol em vinhos de fermentação de caldo de cana-de-açúcar, ou
seja, obter o maior volume de produção de etanol possível, com a mesma quantidade de açúcar
disponibilizado no meio.
Como metodologia foi utilizado o teste de potencial fermentativo em micro escala de
laboratório que simula as condições industriais, utilizando como agentes de transformação
leveduras selecionadas PE-2, CAT-1 e Nativa (em processo) de uma unidade produtora de
Etanol da cidade de José Bonifácio e como substrato mosto sintético padrão preparado no
próprio laboratório.

Palavras-Chave: Levedura, Etanol, Fermentação, Rendimento.

 ABSTRACT

The aim of this study is to find the maximum concentration of ethanol / g of total recoverable
sugars - TRS in the mash (Pmax) for yeast cells. We wish to find the highest concentrations of
ethanol in wine fermentation broth cane sugar, i.e. to obtain the largest amount of ethanol
possible, with the same amount of sugar available in the middle.
The methodology was used to test potential fermentative micro-scale laboratory that simulates
industrial conditions using as processing agents selected yeasts PE-2, CAT-1 and Native (in
process) of an ethanol production facility in the city of Jose Bonifacio and as synthetic
substrate wort prepared standard in the laboratory.

Key-Words: Yeast, Ethanol, Fermentation, Income.

 SUMÁRIO

1 Introdução 13
2 Revisão Bibliográfica 14
2.1 As Leveduras 15
2.2 Características das linhagens de leveduras utilizadas nas destilarias 17
brasileiras
2.3 Leveduras Selecionadas para o Processo no início da Safra 19
2.4 Floculação 20
2.5 Bioquímica da Fermentação do Etanol 21
3 Parte Experimental 23
3.1 Materiais e Métodos 23
3.2 Resultados 27
3.3 Cálculos 28
3.3 Conclusão 34
4 Referências Bibliográficas 35
 LISTA DE TABELAS

1 Resultados das fermentações realizadas com Saccharomyces Cerevisae e 14

Zymomonas Mobilis descrito por KARSCH et Al.(1983)
2 Composição elementar da massa seca de Saccharomyces Cerevisae. 17
3 Características fermentativas das cepas 18
4 Cariotipagem 20
5 Composição Química do Mosto Sintético 23
6 Composição do mosto utilizado em cada ensaio. 27
7 Resultados das análises de vinho levedurado 27
8 Rendimentos 28
9 Acompanhamento dos Rendimentos da Fermentação da Unidade José 29
Bonifácio (Levedura Nativa)

10 Ganho de produção em uma safra 33

11 Valor gasto a mais com insumos em fermentação floculada 33

12 Custos com compra de leveduras na partida de fermentação 33

LISTA DE SIGLAS
1 ART Açúcares Totais Recuperáveis
2 PE-2 Levedura Selecionada na Usina da Pedra
3 CAT-1 Levedura Selecionada na Usina Catanduva
4 NATIVA Levedura Natural da Unidade (encontrada no processo)
5 BG-1 Levedura Selecionada na Usina Barra Grande
6 SA-1 Levedura Selecionada na Usina Santa Adélia
7 FT-858 Levedura Selecionada na Fermentec
8 C1 Identificação dada à levedura nativa encontrada no estudo de
ANDRIETTA
9 C2 Identificação dada à levedura selvagem encontrada no estudo de
ANDRIETTA
10 Yxs Rendimento em células (g de células produzidas em massa seca/g
ART consumido)
12 Yps Rendimento em etanol (g de etanol produzido/g ART consumido)
11 Prod. Produtividade (g de etanol/Volume de meio x hora)
13 VCS Velocidade de consumo de ART (g de ART/ volume de meio x
hora)
14 Conv. Nível de conversão do ART entrado (g de ART consumido x 100/g
de ART inicial)
15 Prod. Esp. Produtividade (g de etanol/Volume de meio x hora x g de massa
seca)
16 VCS Esp. Velocidade de consumo do substrato específica (g de ART
consumido/volume de meio x hora x g de células em massa seca)
17 ATP Adenosina Tri-Fosfato
18 Shaker Incubadora e agitadora para simulação de processos
19 ARRT Açucares Redutores Recuperáveis Totais
20 ETOH Etanol

LISTA DE FIGURAS
1 Fluxograma simplificado da conversão de glicose a etanol 21
2 Diferença de aspecto entre as leveduras selecionadas e NATIVAS 25

3 Pesagem dos frascos contendo material fermentativo 26

4 Frascos em atividade fermentativa na incubadora e agitadora (shaker) 26
5 Gráfico de Velocidade de Fermentação PE-2 30
6 Gráfico de Velocidade de Fermentação CAT-1 30
7 Gráfico de Velocidade de Fermentação NATIVA 31
8 Gráfico de Produção de CO2 Levedura PE-2 31
9 Gráfico de Produção de CO2 Levedura CAT-1 32
10 Gráfico de Produção de CO2 Levedura NATIVA 32

1. INTRODUÇÃO
 O Etanol brasileiro enfrenta uma situação complicada atualmente, os custos de
produção estão cada vez maiores e o preço tem que ser mantido baixo para torná-lo competitivo
no mercado devido o preço da gasolina ser subsidiado.
De acordo com a revista Veja, a venda do etanol nas bombas vem caindo e 41
unidades de produção já deixaram de funcionar desde 2008. A crise do combustível
verde já levou à demissão de 45 000 trabalhadores. (DASTRO, 2013, pg.1).
Segundo dados da revista Veja, o etanol de cana-de-açúcar do Brasil é o
biocombustível de maior produtividade no mundo. Cada hectare plantado do vegetal
gera 6.000 litros de etanol, número que pode dobrar em poucos anos devido ao avanço
tecnológico do setor. Entre engenheiros, agrônomos, produtores e cortadores de cana
(os chamados bóias-frias) o setor canavieiro emprega mais de 3,5 milhões de pessoas
no Brasil. O Etanol Brasileiro é considerado fonte de energia limpa - Por conter
oxigênio em sua composição, sua combustão (reação que normalmente retira oxigênio
da atmosfera) é mais fácil do que a da gasolina e libera menos poluentes. Isso não
significa, porém, que seja inofensiva. A exemplo de outros combustíveis, o etanol
lança no ar monóxido de carbono (CO), óxidos nitrosos (NO e NO2) e
hidrocarbonetos (compostos de hidrogênio e carbono). No entanto, a queima do
Etanol produz em média 25% menos monóxido de carbono. (MARTINS, 2013, pg.1).

Portanto, como Futuros Engenheiros Químicos, devemos defender esse combustível

que é 100% nacional, é limpo e renovável e buscar o aperfeiçoamento da sua produção. Entre
as ações para fortalecer o setor, estão, minimizar os custos e maximizar os rendimentos,
garantindo a maior produção possível. Neste trabalho, podemos observar ações para otimizar a
produção de etanol e minimizar custos com a eliminação da compra de leveduras na partida de
safra.
Para tal, foram realizados três ensaios de potencial fermentativo em bancada com
três repetições cada, no laboratório industrial da Usina Virgolino de Oliveira, unidade José
Bonifacio. O procedimento e metodologia para determinação da concentração inibitória do
etanol (Pmáx), foi proposta e escrita por ANDRIETTA na década de 90.
Dos três testes realizados, será apresentado neste trabalho o resultado do último experimento, o
que nos trouxe uma confirmação do resultado obtido nos ensaios preliminares.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

13
 Vários são os microorganismos capazes de produzir etanol a partir de diferentes
fontes de carboidratos. Entre esses, as leveduras são a maioria, destacando-se a Saccharomyces
Cerevisae. Entre as bactérias destaca-se a Zymomonas Mobilis, que é uma bactéria gram
negativa não formadora de esporos. Esta bactéria apresenta boa tolerância ao etanol e
rendimentos próximos ao teórico. KARSCH ET AL. (1983) discutiram as vantagens e
desvantagens da utilização da Saccharomyces Cerevisae e da Zymomonas Mobilis para a
produção de etanol. Os ensaios foram conduzidos em laboratório com meio sintético a base de
glicose em processos batelada. A tabela I mostra os resultados obtidos.

Tabela 1. Resultados das fermentações realizadas com Saccharomyces Cerevisae e

Zymomonas Mobilis descrito por KARSCH et Al.(1983)
Outros
Rendimento Biomassa Ácidos
Microorganismo pH Produtos
(%) (g/l) mMol/l
(mg/l)
S. Cerevisae 3,3 88 280 6,5 12
Z. Mobilis 6,3 94 330 2,5 16

Pelos resultados contidos na Tabela 1, pode-se afirmar que a Zymomonas Mobilis

possui como característica favorável o alto rendimento em etanol. No entanto, sua utilização
industrial encontra alguns fatores limitantes, sendo a principal a necessidade de se utilizar
mosto estéril, o que é praticamente impossível no meio industrial.
Sendo assim, apesar de possuir um custo metabólico mais elevado por ser um
organismo mais complexo, ou seja, possuir um menor rendimento em etanol, a Saccharomyces
Cerevisae permite sua utilização em processos menos sofisticados, com meio não estéril o que
acaba compensando a perda no rendimento pela diminuição dos custos de produção, sendo,
portanto o microorganismo mais adequado para a utilização em processos industriais de
produção de etanol (ANDRIETTA, 2010).

2.1. As leveduras

14
 As leveduras são organismos eucarióticos e caracterizam uma das mais importantes
classes dos fungos. As Saccharomyces cerevisiae são as mais utilizadas na produção de etanol
e apresentam-se normalmente na forma unicelular e com 2 a 8 micrômetros de diâmetro. Estes
microorganismos reproduzem-se normalmente por gemação (brotamento), onde a célula mãe,
após um período de união entre os citoplasmas, dá origem a uma nova célula
(STECKELBERG, 2001).
A levedura é um ser vivo independente que necessita de energia química para sua
sobrevivência, portanto, realiza a fermentação dos açúcares redutores para conseguir essa
energia, sendo o etanol apenas um subproduto desse processo. As células possuem
compartimentos para adequação de sua atividade metabólica. A fermentação etanólica também
chamada de glicólise anaeróbia ocorre no citoplasma, enquanto que a oxidação total do açúcar,
ou respiração, se dá na mitocôndria (AMORIM et al, 1996).

2.1.1. Morfologia
As células de levedura são esféricas, elípticas ou cilíndricas, variando grandemente
suas dimensões. As Saccharomyces Cerevisae apresentam forma esférica ou elíptica com
largura entre 2 a 8 µm e comprimento entre 3 a 15 µm. As leveduras não possuem órgão de
locomoção (ANDRIETTA, 2004).

2.1.2. Estrutura Celular

As leveduras são organismos eucarióticos. O protoplasma da célula é envolvido por
uma membrana celular e esta por uma parede. Neste estão contidos, o núcleo, o vacúolo e
outras organelas. A parede celular é composta por uma densa camada externa de cerca de 0,05
µm de espessura e camadas menos densa de 0,02 µm. A parte interna é subdividida em três
camadas, compostas de polímeros de glicose e manose, com pequenas quantidades de
proteínas, lipídios e quitina. A distribuição destes polímeros é variável com as condições de
cultivo e representam papel importante no comportamento da levedura no que se refere, por
exemplo, à floculação. A parede celular confere rigidez à célula e pode representar 30% de sua
massa seca. A Saccharomyces Cerevisae apresenta de 6,0 a 8,0% de proteína na parede celular,
sendo estas, na sua maioria, enzimas tais como: invertase, fosfatase, amino-peptidase e
glucoamilase e de 8,5 a 13,5% de lipídios (CANEVAROLO, 2010).

15
2.1.3. Membrana Citoplasmática
As leveduras apresentam uma membrana citoplasmática com permeabilidade
seletiva, regulando a entrada e saída de materiais celulares. Com espessura de 8nm é
constituída principalmente de fosfolipídios com inclusões eventuais de proteína,
polissacarídeos e de outros lipídeos como os esteróis. O tipo e a quantidade destas inclusões
dependem das condições de cultivo e determinam propriedades importantes como resistência
ao efeito tóxico de diversas substâncias como o próprio etanol e diversos biocidas. Atribui-se a
quantidade de ácidos graxos insaturados C16:1 e C18:1 à resistência da levedura ao etanol
(STECKELBERG, 2001).

2.1.4. Citoplasma
No interior da membrana celular está o citoplasma, onde estão contidos os açúcares,
sais, aminoácidos, lipídeos e outras substâncias necessárias ao metabolismo, bem como a
organela celular (CAMPOS, 2011).

2.1.5. Núcleo
O núcleo das leveduras é uma organela bem definida circundada por uma
membrana nuclear semipermeável com funções metabólicas e reprodutivas. Os cromossomos
da levedura estão contidos no núcleo (CAMPOS, 2011).

2.1.6. Composição Química

Os elementos principais presentes numa análise elementar da matéria seca da
levedura são: carbono, hidrogênio, oxigênio e nitrogênio. A tabela 2 mostra uma concentração
media destes elementos na matéria seca de Saccharomyces Cerevisae (REHM, 1995).

Tabela 2. Composição elementar da massa seca de Saccharomyces Cerevisae.

16
 Elemento Concentração (%) Elemento Concentração (%)
Carbono 47,0 Cálcio 0,4
Hidrogênio 6,0 Magnésio 0,2
Oxigênio 32,5 Alumínio (Al2O3) 0,005
Nitrogênio 8,5 Enxofre 0,4
Cinzas Totais 6,0 Cloreto 0,02
Fósforo 1,1 Ferro (Fe2O3) 0,007
Potássio (K2O) 2,0 Cobre 0,002
Zinco 0,0042 Sílica (SiO2) 0,08
Manganês 0,0004 Chumbo 0,00025
Iodo 0,00016 Sódio 0,2
Fonte: OLIVEIRA apud REHM 2005
Observa-se pelos dados da tabela 2 que o carbono corresponde a quase 50% da
massa seca da levedura.

2.2. Características das linhagens de leveduras utilizadas nas destilarias brasileiras

Como os processos fermentativos das destilarias brasileiras em geral são abertos do
ponto de vista microbiológico, ou seja, não possuem unidades de esterilização de mosto e
equipamentos, esse processo se torna passível de receber outros tipos de leveduras presentes no
ambiente, água, matéria-prima, assim trabalhando com populações mistas, as linhagens de
levedura presentes nestes processos podem ser classificadas como sendo: Selecionadas, Nativas
ou Selvagens. As selecionadas são leveduras que foram obtidas por isolamento e seleção de
plantas industriais por possuírem desempenho fermentativo acima do esperado. O primeiro
isolamento e seleção foram feitos pelo Instituto Zimotécnico da ESALQ-USP e vem evoluindo
até os dias atuais. As leveduras selecionadas são comercializadas e utilizadas como inóculo no
início do processo de fermentação (AMORIM, 2001).
Neste trabalho serão utilizados dados de 2 tipos de leveduras selecionadas: PE-2 e
CAT-1. Existem no mercado ainda as leveduras BG-1 e SA-1 e mais recentemente a FT-858.
As linhagens nativas são aquelas encontradas no processo e que apresentam características
fermentativas satisfatórias, mas ainda não foram isoladas e selecionadas. Neste estudo, iremos
avaliar o desempenho de uma levedura nativa presente no processo desta Unidade recorrente
há algumas safras. O surgimento, predominância e permanência até o fim da safra é
espontâneo o que se acredita ser uma seleção natural devido às características do processo.

17
 As linhagens selvagens são aquelas presentes nos processos que apresentam
características fermentativas não adequadas aos processos industriais. Essas leveduras são
normalmente não Saccharomyces e são consideradas “oportunistas”, pois, somente são capazes
de dominar o processo em condições anormais, tais como: operação com baixa concentração de
etanol, paradas prolongadas ou seqüenciais, etc. Durante as paradas, a introdução de linhagens
presentes no caldo ao processo é facilitada, pois, o tratamento de caldo não opera de forma
eficiente e o caldo pode não atingir a temperatura mínima necessária para eliminar as leveduras
contaminantes presentes no mesmo. Outro problema é que durante as paradas, as linhagens
utilizadas no processo sofrem com o longo tempo de estocagem, ainda mais se este não for
realizado de forma adequada. Na repartida do processo é que as linhagens selvagens
normalmente se instalam, pois, como a linhagem de processo está em péssimas condições, as
repartidas são realizadas com baixas concentrações de ART (Açúcares Totais Recuperáveis) no
mosto, gerando um vinho com baixa concentração de etanol. Essas leveduras comumente têm
baixa tolerância ao etanol, exigem baixas concentrações desta substancia para se multiplicar,
por isso em fermentações com alto teor etanólico são menos freqüentes, o que torna esta
condição de processo melhorada, pois a presença destes microorganismos afeta severamente a
produção e o rendimento dos processos (ANDRIETTA, 2010).
Na tabela abaixo se pode observar as características fermentativas e comparar o
rendimento de leveduras selecionadas CAT-1 e PE-2, nativa, identificada como C1 e selvagem,
que chamaremos de C2, ambas encontradas em caldo de cana de uma unidade da região do
nordeste:

Tabela 3. Características fermentativas das cepas:

Parâmetro Referência CAT-1 PE-2 C1 C2
Yxs 0,0400 0,0409 0,0479 0,0387 0,1299
Yps 0,4600 0,4694 0,4637 0,4552 0,3583
Prod. 2,5000 2,5674 2,5113 2,5313 0,2768
VCS 5,8000 5,8369 5,7802 5,9339 0,8246
Conv. 90,00 90,48 89,82 91,87 13,45
Prod. Esp. 0,4500 0,4799 0,4042 0,4908 0,1154
VCs Esp. 1,0500 1,0288 0,8772 1,0850 0,3240
Fonte: CPQBA/UNICAMP
Onde:
Yxs é o rendimento em células (g de células produzidas em massa seca/g ART consumido)
18
Yps é o rendimento em etanol (g de etanol produzido/g ART consumido)
Prod. é a produtividade (g de etanol/Volume de meio x hora)
VCS é a velocidade de consumo de ART (g de ART/ volume de meio x hora)
Conv. é o nível de conversão do ART entrado (g de ART consumido x 100/g de ART inicial)
Prod. Esp. é a produtividade (g de etanol/Volume de meio x hora x g de massa seca)
VCS esp. é a velocidade de consumo do substrato específica (g de ART consumido/volume de
meio x hora x g de células em massa seca)

Em relação às selecionadas, podemos observar que as duas linhagens apresentam

rendimento em etanol superior à referência. Outro fator importante, diz respeito à linhagem PE-
2, que apesar de apresentar um rendimento em célula muito superior ao valor de referência, não
teve o valor de rendimento em etanol afetado. Este fato mostra que uma linhagem pode
produzir muita massa celular sem que seu rendimento em etanol seja afetado.
Em relação às linhagens C1 e C2, observa-se que a linhagem C1 possui
características de uma levedura fermentativa, apesar de apresentar rendimento em etanol abaixo
do valor de referência. Já a linhagem C2, apresentou uma velocidade de fermentação
extremamente baixa, com níveis de conversão próximos a 14% e rendimento em etanol de
0,35g de etanol/g de ART consumido. Essas leveduras além do baixo rendimento têm a
característica de dominar o processo, e diversos devem ser os cuidados para impedir sua
entrada no processo, como: utilizar altas temperaturas no processamento do caldo de cana,
assepsia adequada das linhas de produção e temperatura alta das águas de processo, pois, uma
vez que esse microorganismo adentra o processo, sua retirada é praticamente impossível e a
tendência é a multiplicação (CANEVAROLO, 2010).

2.3. Leveduras selecionadas para o processo no início da safra

As linhagens selecionadas para esta unidade no início desta safra foram: PE-2,
CAT-1 e FT-858, como se pode observar, outras linhagens vem sendo incorporadas ao
processo, que se tratam da levedura que iremos analisar neste trabalho, a quem chamamos de
NATIVA. Ainda são encontrados outros microorganismos com características não
identificadas, denominadas outras Saccharomyces. Na tabela 4, podemos observar a
predominância da levedura NATIVA ao longo da safra:
Tabela 4. Cariotipagem

19
 Leveduras Proporção na Amostra (%)
Observadas Abril Maio Junho Julho Agosto
PE-2 32 - - - -
CAT-1 22 - - - -
FT858L 46 83 - - -
NATIVA - 10 91,2 73 91
Outras
- 7 8,8 27 9
Saccharomyces
Fonte: Fermentec 2013

Podemos observar também que no mês de Julho, houve um aumento na proporção

de outras Saccharomyces, o que indica uma provável contaminação do processo devido a um
descontrole em alguma das etapas do processo e paradas prolongadas por chuvas.

2.4. Floculação
A floculação é descrita como um fenômeno em que as células de levedura aderem-
se umas as outras, formando aglomerados (flocos) que se sedimentam rapidamente no meio em
que estão suspensos. Este fenômeno é considerado um dos maiores problemas operacionais dos
processos de fermentação alcoólica com reciclo de células por centrifugação.
A floculação para as células de levedura pode ser considerada como uma estratégia
de sobrevivência, sendo que as células localizadas na periferia do floco protegem as que estão
no centro contra as condições desfavoráveis do meio.
A floculação das células pode ser induzida por aspectos físico-químicos, como
aumento de temperatura acima de 30ºC segundo KAMADA & MURATA (1984).
STRATFORD (1989) verificou que a agitação mecânica é requerida para superar a repulsão
eletrostática entre as células. A mudança de pH acarreta um profundo efeito na floculação,
sendo que o pH ótimo é dependente da cepa do microorganismo CALLEJA (1987). O efeito
dos sais na floculação é dependente do tipo de cátion presente como manganês, magnésio e
cálcio (SOUZA et al., 1992).
Também podemos citar aspectos microbiológicos na formação de flocos de
leveduras. ACARDE (2001) verificou a ocorrência da floculação de leveduras causada por
algumas espécies de bactérias contaminantes do processo de produção de etanol.
Até bem pouco tempo, acreditava-se que a floculação ocorria mais freqüentemente
na presença de algum tipo de bactérias na dorna. Hoje são conhecidas algumas linhagens de
levedura do gênero Saccharomyces que apresentam propriedades de floculação. Estas linhagens
possuem, em sua composição genômica, genes que expressam proteínas conhecidas como

20
 floculinas que permitem que essas leveduras cresçam de forma floculada (STECKELBERG e
ANDRIETTA, 2006).

2.5. Bioquímica da Fermentação do Etanol

A fermentação etanólica ocorre através da ação de leveduras sobre açúcares
fermentescíveis contidos em uma solução (LIMA E MARCONDES, 2002).
A principal rota metabólica envolvida na fermentação etanólica é a glicólise, na
qual uma molécula de glicose é metabolizada e duas moléculas de piruvato são produzidas. Sob
condições anaeróbias, o piruvato é convertido a etanol com desprendimento de CO 2.
Teoricamente, o rendimento é de 0,511 para etanol e 0,489 para CO 2 em base mássica,
utilizando como substrato uma hexose. Dois ATPs produzidos na glicólise são utilizados na
condução da biossintese das leveduras, que envolve diversas biorreações que requerem energia.
Portanto, a produção de etanol está fortemente relacionada com o crescimento das leveduras, o
que significa que leveduras devem ser produzidas como subproduto. Sem o consumo contínuo
de ATP pelo crescimento celular, o metabolismo glicolítico seria interrompido imediatamente,
em razão do acumulo intracelular de ATP, que inibe a fosfofrutoquinase, uma das mais
importantes enzimas reguladoras da glicólise (BAI, ANDERSON, e MOO-YOUNG, 2008).
O objetivo principal da levedura ao metabolizar anaerobiamente o açúcar, é gerar
uma forma de energia (ATP, adenosina trifosfato) que será empregada na realização de diversas
funções fisiológicas (absorção, excreção e outras) e biossínteses necessárias à manutenção da
vida, crescimento e multiplicação. O etanol e o CO 2 resultantes se constituem somente em
produtos de excreção, sem utilidade metabólica para a célula em anaerobiose (LIMA, BASSO e
AMORIM, 2001).

Figura 1 – Fluxograma simplificado da conversão de glicose a etanol (GALASSI G.R.; 2005)

21
 De acordo com ANDRIETTA (2004), frente ao número elevado de reações
catalisadas enzimaticamente no metabolismo celular, fatores como pH, temperatura, pressão,
concentração de reagentes, concentração de nutrientes, etc., afetam os parâmetros cinéticos que
definem as taxas de reprodução celular, consumo de substrato e produção de etanol.

As leveduras são o mais importante grupo de microorganismos explorados

comercialmente (RUSSEL et al., 1987).
 3. PARTE EXPERIMENTAL

3.1. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1.1 MICROORGANISMOS
22
Foram utilizados como agentes de transformação leveduras do gênero
Saccharomyces cerevisiae selecionadas PE-2, CAT-1 que foram adquiridas comercialmente e
Nativa obtida do processo da Unidade José Bonifácio;

- Preparo do Inóculo: As leveduras selecionadas foram adquiridas de forma

liofilizada e, portanto, foram diluídas e ativadas por uma hora na incubadora à 34ºC. Após
esse período foi realizada contagem microbiológica das células de levedura, os resultados
indicaram 86,6% de viabilidade para a CAT-1 e 86% para a PE-2, o que indicou que as
células estavam prontas para entrar em ciclo fermentativo. A Levedura NATIVA foi retirada
do processo no dia dos experimentos e foi lavada e centrifugada por seis vezes para
eliminação do vinho contido na amostra. O intuito de retirar o vinho era obter o menor teor
alcoólico inicial possível, igualando-se às condições iniciais das leveduras selecionadas.

3.1.2. SUBSTRATO UTILIZADO

O Mosto sintético utilizado para a obtenção do substrato foi preparado no próprio

laboratório na composição indicada conforme tabela 5:

Fosfato de potássio KH2PO4 5g

Cloreto de amônio NH4Cl 1g
Cloreto de potássio KCl 1g
Extrato de levedura 6,0g
Sulfato de Magnésio MgSO4.7H2O 1g
Sacarose P.A. 200 g para o brix de 20,0
Sacarose P.A. 500 g para o brix de 50,0

Esse substrato é padrão por não possuir em sua composição os contaminantes ou

inibidores do processo industrial, o que permite uma avaliação exclusiva do comportamento
das leveduras diante do açúcar disponibilizado para conversão em etanol.

23
3.1.3. MATERIAIS UTILIZADOS

Foram utilizados como biorreatores, frascos erlenmeyer de 1000 ml dotados de

rolhas com suspiros, que tem por função eliminar o CO2 produzido no processo fermentativo.

3.1.4. EQUIPAMENTOS UTILIZADOS

Foram utilizados os seguintes equipamentos:

- Micro Centrífuga de laboratório. Utilidade: Separação para descarte do vinho

contido no levedo a ser utilizado nos experimentos.

- Balança Semi-Analítica. Utilidade: Pesagem dos frascos.

- Incubadora com agitação (shaker). Utilidade: Manter a agitação e a temperatura

controladas simulando as condições dos biorreatores utilizados nas plantas industriais.

- Microdestilador de Etanol. Utilidade: recuperar o etanol contida na amostra

através do processo de destilação e condensação.

- Densímetro Digital. Utilidade: Determinar a quantidade de etanol presente no

vinho.

3.1.5. METODOLOGIA APLICADA

A metodologia utilizada consiste em pesar os nove frascos erlenmeyer de 1000 ml

que foram identificados como: frascos 1, 2 e 3 para a levedura PE-1, frascos 4,5 e 6 para a
levedura CAT-1 e frascos 7,8 e 9 para a levedura nativa.

Os frascos foram pesados vazios e com suas devidas rolhas. A cada frasco foram
adicionados 60 ml de fermento tratado equivalentes ao “pé-de-cuba” industrial e pesados os
frascos novamente, obtendo o peso equivalente em volume de fermento.

Em seguida foram adicionados ao frasco 140 ml de mosto contendo

aproximadamente 200 g/l de ART e pesados, caracterizando o biorreator e tendo o necessário
para iniciar a fermentação em batelada.

Os frascos foram levados à incubadora à 34ºC (shaker) com agitação em 130 rpm
e acompanhada a perda de peso de hora em hora.

24
 24

A perda de peso indica o CO2 desprendido na fermentação e pela estequiometria

da reação, aproximadamente uma unidade de CO2 é equivalente a uma unidade de etanol
produzido. Um outro substrato foi preparado contendo aproximadamente 500 g/l de ART para
ser adicionado assim que a diferença entre as pesagens não fosse significativa, o que indica o
final da fermentação pela falta ou ausência de substrato no primeiro ciclo.

Ao se perceber que a variação do peso do frasco estava diminuindo, tendendo a

estabilizar, 20 ml da solução concentrada de mosto 500 g/l foi adicionada a cada frasco e
pesado em seguida. A perda de peso dos frascos foi acompanhada a cada hora até a
estabilização, o que pode indicar a inatividade da levedura pelo término do substrato ou
inibição pelo substrato. A cada estabilização entre as pesagens, mais 20 ml do mosto
concentrado era adicionado e pesado.

Foi repetida a operação até que a adição de mosto concentrado não fizesse mais
com que a fermentação voltasse a ser reativada. Neste ponto, recolhemos uma amostra e
analisamos a concentração de etanol, ART e viabilidade celular de cada frasco. A presença de
ART indicou que a fermentação não cessou por falta de fonte de carbono. Nestas condições a
concentração de etanol no meio passou a ser considerada a concentração limite de etanol,
acima da qual o metabolismo celular cessou.

Figura 2. Diferença de aspecto entre as leveduras selecionadas e NATIVA

25
Figura 3. Pesagem dos frascos contendo material fermentativo

Figura 4. Frascos em atividade fermentativa na incubadora e agitadora (shaker)

26
 3.2. RESULTADOS

A tabela 6 apresenta a composição do mosto utilizado em cada ensaio.

LEVEDURA PE-2 CAT-1 NATIVA
Mosto FR 01 FR 02 FR 03 FR 04 FR 05 FR 06 FR 07 FR 08 FR 09
ART (%p/v) 21,00 21,00 21,00 21,00 21,00 21,00 21,00 21,00 21,00
INICIAL
54,00 54,00 54,00 54,00 54,00 54,00 54,00 54,00 54,00
ART (%p/v) FINAL
20,00 20,00 20,00 20,00 20,00 20,00 20,00 20,00 20,00
Brix Inicial
50,00 50,00 50,00 50,00 50,00 50,00 50,00 50,00 50,00
Brix Final
ART (%p/p) 92,05 92,11 92,16 92,12 92,14 92,19 71,13 71,11 71,11
ENTRADO
ART (%p/p) 22,88 21,8 21,16 21,41 21,04 21,70 1,87 0,53 2,41
RESIDUAL
ART (%p/p) 69,18 70,31 71,00 70,72 71,10 70,48 69,26 70,58 68,70
CONSUMIDO

Pode-se verificar na tabela, que o ART consumido foi praticamente igual para todos
os frascos.
O ART analisado está em peso/volume. Através do brix medido, obtém-se a
densidade que nos permitiu encontrar o ART (%p/p) - ART_ENTRADO.

O ART_RESIDUAL é obtido através de análise de açúcar residual no vinho bruto.

O ART_CONSUMIDO é o açúcar real utilizado pela levedura para conversão. É a

diferença entre o entrado e o residual.

A quantidade de açúcar (entrado) dos frascos de 1 a 6 foi maior que nos frascos 7
a 9, pois foram alimentados mais 2 ciclos devido o peso ter repetido sem atividade
fermentativa, ou seja, já se encontrava em ação inibitória.

A Tabela 7 apresenta os resultados das análises de vinho levedurado

Vinho FR 01 FR 02 FR 03 FR 04 FR 05 FR 06 FR 07 FR 08 FR 09
% ETANOL (ºGL) 13,1 13,0 12,8 11,6 12,1 11,4 13,8 16,8 16,2
ARRT (%p/v) 7,4 7,0 6,8 6,8 6,7 6,9 0,7 0,2 0,9
Etanol Produzido
32,76 32,74 32,09 29,51 30,74 29,09 28,83 34,79 33,93
(%p/p)

Observa-se que a produção de etanol com a levedura NATIVA foi maior em

relação às outras leveduras, utilizando a mesma massa de ART consumido (tabela 6).

27
 O teor alcoólico do frasco 07 apresenta desvio em relação à triplicata e por isso,
será desconsiderado na análise do rendimento da tabela 03.

Tabela 8: Rendimentos
FR 01 FR 02 FR 03 FR 04 FR 05 FR 06 FR 07 FR 08 FR 09
Yp/s 0,4736 0,4657 0,4531 0,4173 0,4324 0,4127 - 0,4930 0,4939
Média Yp/s 0,46377 0,42084 0,49348
Rendimento Ind. (%) 92,67 91,42 88,46 81,67 84,63 80,77 - 96,49 96,66
Média Rend. Ind. (%) 90,85 82,36 96,57
Rendimento real (%) 86,94 86,84 85,05 78,25 81,50 77,07 - 95,77 93,38
Média Rend. Real (%) 86,28 78,94 94,57

Em conseqüência da produção maior de etanol (tabela 7) e praticamente o mesmo

consumo de ART, os rendimentos em Yp/s foram maiores para a levedura NATIVA.

3.3. CÁLCULOS

O Yp/s representa o rendimento em produto (etanol), ou seja:

Yp/s = grama de etanol produzido

grama de ART consumido

Através do Yp/s obtém-se o rendimento industrial usando o fator estequiométrico,

em peso, 0,511 g ETOH/g ARTcons.

Rend. Industrial = Yp/s * 100

0,511

E o rendimento real é a razão entre o etanol produzido (%p/p) pelo etanol teórico
(%p/p), sendo:

Etanol teórico = 0,511 * ART_EN

Rend. Real = Etanol produzido * 100

Etanol teórico

28
 O etanol produzido é a diferença entre o etanol analisado no vinho bruto do etanol
contido na cuba, em %p/p.

Etanol produzido = Etanol Vinho Bruto – Etanol cuba

Esse é o rendimento por balanço de massa usado atualmente pelas unidades do

Grupo Virgolino de Oliveira para avaliar o processo diariamente.

3.3.1. AVALIAÇÃO DO PROCESSO COMO VALIDAÇÃO DOS EXPERIMENTOS

Tabela 9. Acompanhamento dos Rendimentos da Fermentação da Unidade José

Bonifácio (Levedura Nativa)

Dados obtidos no balanço de massas utilizado pela Usina José Bonifácio na safra 13/14

O rendimento fermentativo para esta unidade que produz etanol a partir de mel+água está
estimado em torno de 88%. Na tabela acima, podemos notar que o rendimento fermentativo desta
unidade sempre esteve acima do esperado, o que proporciona uma eficiência relativa da fermentação
superior a 100%.

A partir do resultado dos testes (Yp/s 0,49) pode-se estimar que o rendimento
fermentativo esperado para esta unidade é maior, em função do bom desempenho fermentativo da
própria levedura.

29
Figura 5. Gráfico de Velocidade de Fermentação PE-2

Figura 5. Gráfico de Velocidade de Fermentação CAT -1

30
Figura 6. Gráfico de Velocidade de Fermentação NATIVA

Figura 7. Gráfico de CO2 produzido PE-2

31
Figura 8. Gráfico de CO2 produzido CAT-1

Figura 9. Gráfico de CO2 produzido NATIVA

32
 Pelos gráficos, pode-se notar que a levedura Nativa termina os ciclos mais cedo
que as outras, ou seja, tem velocidade de fermentação maior. Com relação à massa de CO2
produzida pode-se observar que a levedura CAT-1, a partir da hora 22, teve a produção de
CO2 minimizada, chegando à no máximo 24g, enquanto as leveduras PE-2 e NATIVA
produziram 26,5g e 28g respectivamente.

Tabela 10: Ganho de produção em uma safra

Ganho em litros
Levedura Ganho em Reais (R$)
(l)

NATIVA em relação à PE-2 (6,4% 6.123.158 8.042.155,48

em volume de etanol produzido)

Considerando o volume de produção da safra 13/14 (95.583.366,8l) e o valor atual de

mercado do etanol (R$ 1,3134)
Fonte: UDOP 22/10/2013

Tabela 11: Valor gasto a mais com insumos em fermentação floculada

Índice de Consumo Consumo Consumo Valor

Custo em
Floculação Específico Médio Estimado Produto
Insumo Período Reais
(%) (g H2SO4/l (kg/ dia) (Safra (R$/kg)
(R$/safra)
ETOH) 250 dias)

01/04 à 5 6,11 2596 649.005 0,39 253.111,96

Ácido 05/06
Sulfúrico 06/06 à 67 11,05 4256 1.064.000 0,39 414.960,00
20/10

Custos a mais com ácido considerando trabalhar a safra toda floculada R$161.848,00

Dados da safra 13/14 da Usina Virgolino de Oliveira S.A. (Unidade José Bonifácio)

Tabela 12: Custos com compra de leveduras na partida de fermentação

* Volume Custo
Custo da partida
Leveduras Recomendado (R$/kg)
(R$)
para partida

CAT-1 e PE-2 300 kg R$ 49,81 14943,00

Dados da safra 13/14 da Usina Virgolino de Oliveira S.A. (Unidade José Bonifácio)
Volume Adotado como padrão nas usinas VO, o recomendado pelas consultorias é acima de
1000 kg, ou seja, R$49810,00.
32
 3.4. CONCLUSÃO

A partir dos resultados dos testes, temos:

33
 Foi possível produzir mais etanol com a mesma quantidade de ART consumido
em meio padrão quando a linhagem NATIVA foi utilizada.

 O bom desempenho industrial da planta José Bonifácio observado nesta safra

tem como uma das causas o rendimento fermentativo, uma vez que a quantidade de etanol
produzido é maior do que o esperado quando comparado ao rendimento da Cepa padrão.

 É viável trabalhar com esta levedura, mesmo com as dificuldades operacionais

que a característica floculante que ela apresenta traz, principalmente na unidade de separação
das células, aumentando o volume de vinho fermentado reciclado ao processo, que aumenta o
consumo de ácido.

 Os ganhos observados com o aumento de produção de etanol compensam o

aumento no consumo de ácido sulfúrico. Esta estimativa foi realizada comparando-se o
rendimento da linhagem NATIVA 0,4935 com a linhagem PE-2 - Yps 0,4637
(ANDRIETTA,2010).

 A levedura CAT-1 teve seu rendimento (Yps 0,4208 indicado na literatura

como 0,4694 (ANDRIETTA, 2010)) afetado pelas altas concentrações de etanol, pois
segundo os gráficos a partir da 25ª hora, deixou de produzir CO 2, que está diretamente
relacionado com a produção de etanol, na proporção de 1:1. Este fato pode indicar um desvio
da rota metabólica desta linhagem nas condições de cultivo, o que aumenta a produção de
secundários e diminui a produção de etanol.

 Como sugestões para esta unidade, podemos citar:

 Isolar a CEPA para multiplicação no início da safra, sem o uso das leveduras
selecionadas, que além de apresentarem custo elevado, tem o rendimento menor que a
levedura NATIVA e não conseguem se manter no processo.

 Aumentar a meta de insumos para o início da safra, pois se sabe que o consumo
será elevado devido a iniciarmos a fermentação floculada. Consumo este que será totalmente
compensado pela produção maior.

34
 3.5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

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