UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA
CURSO DE GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
DISCIPLINA: TECNOLOGIA DE PROCESSOS FERMENTATIVOS

Docente: Profa. Dra. Juliana de Souza Ferreira (FEQ/UFU)

PRÁTICA 1. FERMENTAÇÃO ALCÓOLIDA

✓ Determinar o teor de açúcar de soluções açucaradas

✓ Avaliar o crescimento celular e determinar os parâmetros cinéticos (taxa de crescimento, tempo de
duplicação, bem como rendimento – YP/S e em %, e Produtividade (Prod)) durante processo
fermentativo utilizando Saccharomyces cerevisae.

Os meios podem ser líquidos e sólidos. Os líquidos são usados quando se deseja um grande número de
células, sendo muito utilizado para iniciar uma fermentação ou como inóculo para grandes escalas. Quanto à
produção de meio de cultivo (líquido) para propagação de leveduras vale destacar que as células de levedura,
durante o processo de fermentação alcoólica, possuem necessidades nutricionais sendo a multiplicação, o
crescimento celular e a eficiência da transformação do açúcar em álcool diretamente influenciados pelos
nutrientes presentes no meio (AMORIM, 2005; RIBEIRO et al., 1987). Como fonte nutricional, estudos
mostram a necessidade do nitrogênio, visto que ele é essencial para o crescimento e multiplicação de
leveduras, a utilização dos açúcares na geração de biomassa e produção de carboidratos de reserva, o fósforo
para integrar as moléculas de ATP, o enxofre como constituinte dos aminoácidos e a influência dos íons
minerais (Zn, Co, Mn, Cu) na atividade enzimática das células (AMORIN, et al., 1996; BELLUCO, 2001).
Segundo Camili et al. (2006), a concentração adequada de nutrientes tem uma importante relevância, e
podem impactar de forma negativa o processo fermentativo. A falta de nutrientes pode reduzir o rendimento
alcoólico e a viabilidade celular da levedura.
Para acompanhar a evolução de um processo fermentativo, faz-se necessário a determinação da
concentração de açúcares ao longo do tempo. Uma técnica para tal análise utiliza-se da refratometria (Índice
de refração ou Brix). A refração é o fenômeno segundo o qual, quando um raio luminoso passa obliquamente
de um meio para outro, de densidade diferente, percorre uma direção diferente. Destaca-se o uso de tal
propriedade na identificação de compostos e na determinação de concentrações, em misturas binárias
homogêneas, de compostos conhecidos. Já o Brix (símbolo °Bx) é uma escala numérica que mede a
quantidade de sólidos solúveis em uma solução de sacarose. A escala Brix é utilizada na indústria de
alimentos para medir a quantidade aproximada de açúcares em sucos de fruta, vinhos e na indústria de
açúcar. A escala de brix, criada por Adolf F. Brix (1798 - 1870) foi derivada originalmente da escala de
Balling, recalculando a temperatura de referência de 15,5 °C. A quantidade de sólido solúvel é o total de
todos os sólidos dissolvidos em água, começando com açúcar, sal, proteínas, ácidos e etc. Os valores de

1
leitura medidos é a soma de todos eles. Uma solução de 25 °Bx tem 25 gramas do açúcar da sacarose por 100
gramas de líquido. Ou 25 gramas do açúcar da sacarose e 75 gramas da água nos 100 gramas da solução.
Em termos gerais, a fermentação implica na utilização de microrganismos na transformação da
matéria orgânica catalisada por enzimas (MENEZES, 1980). As leveduras são os microrganismos mais
importantes na obtenção do álcool por via fermentativa. O gênero Saccharomyces é um dos grupos de
microrganismos mais estudados pela comunidade científica. Esse interesse é função da ampla aplicação
desses microrganismos na indústria de biotecnologia. Essa levedura tem sido relatada como agente de
transformação desde 1800 (ANDRIETTA, STECKELBERG, ANDRIETTA, 2006).
A Saccharomyces cerevisiae é uma levedura fortemente empregada em processos de fermentação
alcoólica, apresentando a capacidade de converter o açúcar presente na matéria-prima (sacarose) em açúcares
simples e facilmente fermentescíveis, como a glicose. A reação de conversão do açúcar (glicose) em etanol é
representada de forma generalizada pela expressão abaixo.

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2

Glicose 32 0C etanol dióxido de carbono

Através desta expressão pode-se observar que para cada mol de açúcar (glicose) consumido, dois
moles de etanol e dióxido de carbono são produzidos. Em condições ideais, o rendimento de produto (etanol)
através do consumo de substrato (glicose) é de 0,511 g/g.
Na fermentação alcoólica, os substratos (açúcares) são transformados em produtos (etanol), e parte
da energia (ATP) gerada é usada para a produção de biomassa (células). Assim, as concentrações de
substrato (açúcar), produto (etanol) e células (levedura) variam com o tempo da fermentação. Hiss (2001)
define a variação dessas concentrações como cinética química do sistema.

3.1 Prática a ser realizada na residência pelos alunos

✓ 2 colheres de Açúcar
✓ 1 colher de farinha de trigo
✓ Água
✓ 2 saches (10 g) de Fermento biológico
✓ Colheres
✓ Fogão
✓ 4 Garrafas PET de 500 Ml
✓ 4 balões de borracha (de festa)
✓ Vídeo auxiliar 1 - https://www.youtube.com/watch?v=b5bTW2NEpQ4
✓ Vídeo auxiliar 2 - https://www.youtube.com/watch?v=GVQ8zj-
7vzc&list=PL8BOzvS_VU4vMdOJKmx6BXYKIl3uYV4nk&index=14

2
 3.2 Determinação do teor de açúcar (refratômetro) (Material utilizado para a obtenção de dados em
laboratório)
✓ Algodão higroscópico;
✓ Amostras de fermentação alcoólica;
✓ Banho termostático;
✓ Refratômetro de bancada do tipo ABBE;
✓ Sacarose (ou glicose);
✓ Vidraria diversa.

3.3 Fermentação alcoólica (Material utilizado para a obtenção de dados em laboratório)

✓ Agitador magnético
✓ Álcool 70 %;
✓ Balança analítica
✓ Centrífuga
✓ Espectrofotômetro a 650 nm;
✓ Levedura Saccharomyces cerevisae;
✓ Meio de cultivo para propagação de leveduras
✓ Refratômetro
✓ Vidraria em geral (erlenmeyer, béquer, bastão de vidro, etc).

4.1 Prática a ser realizada na residência pelos alunos

Enumerar as garrafas PET sabendo qual será o conteúdo. Em seguida, dissolver o fermento em 300
mL de água morna, sendo que esta solução (água + fermento) que serão igualmente distribuídos em 3
garrafas PET. A uma delas, adicione 1 colher de açúcar e em outra adicione 1 colher de farinha de trigo. No
4º frasco, coloque 100 mL de água e adicione 1 colher de açúcar. Logo após, coloque um balão de borracha
em cada frasco. Observe os 4 frascos com o tempo e aguarde até não haver mais variação de volume.

4.2 Determinação do teor de açúcar (refratômetro) (Realizado em laboratório e disponibilizado os

resultados)
a. Calibração: Preparar as soluções de glicose, descritas na Tabela 1, para um volume total de 10 mL.
Atenção a importância do número de casas decimais considerados. Na leitura dos valores
experimentais, como no coeficiente angular da reta, verificar que o respectivo intervalo de variação é
de cerca de 0,01.

Tabela 1 – Solução de glicose para construção da curva de calibração (Barroso et al)

Solução 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Glicose 0 15 30 45 60 75 90 100 218 320 436 544
(g/L)

3
 n20D 1,3320 1,3355 1,3370 1,3395 1,3415 1,3440 1,3455 1,3465 1,3645 1,3785 1,3945 1,4085

b. Medição
i. Acoplar o refratômetro a um banho termostático, na temperatura de 20°C.
ii. Abrir o prisma e limpar a superfície usando um lenço de papel umedecido com água destilada;
iii. Adicionar algumas gotas de água destilada sobre o prisma e fechar lentamente para que não ocorra
formação de bolhas de ar;
iv. Girar o botão até que a linha de contato entre a área escura e a clara vista pela ocular estivesse na
marca ‘0’;
v. Abrir o prisma limpando-o com papel e com o auxílio da uma pipeta, colocar algumas gotas de
amostra sobre o prisma;
vi. Aguardar alguns minutos para que o líquido entre em equilíbrio térmico com o prisma;
vii. Procurar lentamente na ocular a linha de separação entre a região iluminada e a escura, usando para
isto o botão de variação de ângulo;
viii. Com a linha de separação bem nítida posiciona-se a divisão entre as duas regiões exatamente no centro
do retículo;
ix. Procede-se à leitura do índice de refração e do °BRIX.

4.3 Fermentação (Realizado em laboratório e disponibilizado os resultados)

a. Microrganismo: Será utilizada uma cepa industrial Y-904 da levedura S. cerevisiae, na forma granulada,
produzida pela AB Brasil, na concentração de inóculo (X0) de 10 g/L. A hidratação das leveduras será
realizada por até duas horas em água à temperatura ambiente, sendo utilizado 100 mL de água para cada
10 g de células.
b. Meio de cultura: O meio de cultura para as leveduras será composto de glicose (150 g/L), KH2PO4 (5
g/L), MgSO47H2O (1 g/L), NH4Cl (1,67 g/L), KCl (1 g/L) e extrato de levedura (6 g/L). Ajustar o pH
para 4,5 com solução 1 M ácido clorídrico (HCl). Os reagentes a serem utilizados serão todos de grau
analítico.
c. Unidade experimental: O processo fermentativo será conduzido em um reator cônico de bancada
(erlenmeyer), munidos de rolhas de borracha perfuradas, contendo um tubo de conexão acoplado a
microtubos de centrifugação em cada uma de suas extremidades, sendo o microtubo externo
preenchidos com glicerol para permitir a exaustão de CO2, evitando entrada de ar. Será utilizado
erlenmeyer com volume total de 250 mL e volume útil de 150 mL, operado em batelada. O volume de
inóculo representará 10 % do volume útil e o meio de cultura 90 %. Após a inoculação de uma
suspensão de levedura (X0 = 10 g/L), este sistema será inicialmente pesado e mantido sob agitação em
agitador magnético à ~32 ºC. A cada 30 minutos será avaliado a concentração celular, de substrato e de
etanol conforme procedimentos descritos a seguir.
d. Determinação da concentração celular: A concentração celular será avaliada por turbidimetria. Uma
alíquota de 1 mL da amostra (suspensão celular) será diluída 50x (utilizar balão volumétrico) e sua

4
 absorbância mensurada a 650 nm. A concentração celular será determinada com o auxílio de uma curva
de calibração (concentração celular versus Absorbância) previamente construída (Anexo 1).
e. Determinação da concentração de glicose: A determinação de glicose será realizada através da curva de
calibração (índice de refração versus concentração de glicose) estabelecida a partir dos resultados
obtidos do procedimento experimental descrito no item 4.2. Serão aliquotados 10 mL do caldo de
fermentação e centrifugados (5000 rpm por 15 min). Após isso, o índice de refração do sobrenadante
obtido da centrifugação será determinado e correlacionado com a concentração de glicose (g/L).
f. Determinação da concentração de etanol: A concentração de etanol formado será determinada por
gravimetria, avaliada a partir do volume de CO2 liberado durante o processo fermentativo com auxílio
de uma balança analítica. Observa-se pela estequiometria da reação de fermentação (Eq. 1) que a
quantidade de etanol produzida está diretamente relacionada com a quantidade de CO2 liberada. Logo,
avaliando-se a evolução de CO2 (variação da massa do reator em grama) e dividindo este valor pelo
volume de caldo (em L) em um dado instante (Vn), pode-se estimar o valor da concentração de CO2 pela
Eq. (2) e a de etanol Eq. (3).

PCO2(g/L)=variação da massa /Vn (2)

Petanol (g/L) = 92* PCO2 /88 ou 46 * PCO2 /44 (3)

g. Cálculo dos fatores de conversão de substrato em produto (YP/S): O fatorde conversão de substrato em
produto será calculado através da Equação 4. Na qual Pf é a concentração final de etanol (g/L) e P0 é
concentração inicial de etanol (g / L). Sf é a concentração de substrato final (gsubstrato/L), S0 é a
concentração de substrato inicial (gsubstrato/L).

(4)
h. Determinação da velocidade específica máxima de crescimento (μmáx): A taxa específica máxima de
crescimento (µmáx) será obtida por regressão linear da Equação 5 em que X0 e X representam a
concentração de células no tempo inicial e no tempo t, respectivamente. O tempo de geração (tg) será
calculado pela Equação 6 (Bailey e Ollis, 1986).

(5)

ln ( 2 )
tg =
 máx (6)

i. Cálculo da produtividade volumétrica (Produtividade): A produtividade do etanol será calculada

através da Equação 7. Na qual Pf é a concentração final de etanol (g/L) e P0 é concentração inicial de
etanol (g / L). Vmeio é o volume útil, ou seja, do meio de fermentação (L), t é o tempo de
fermentação (h).
5
 (7)

a) Fazer registros (foto/vídeo) do ensaio realizado em casa. Analisar qualitativamente os resultados obtidos
e discutir os fenômenos observados.
b) Construir curvas de calibração para determinação do teor de açúcar utilizando o refratômetro a partir de
dados disponibilizados pela professora (Tabela 1) (Parte quantitativa).
c) Construir a curva mostrando a variação na concentração de glicose, de etanol e de células com o tempo
e e analisar quanto às fases de crescimento celular e à classificação do produto de acordo com Garden e
Equação de Ludecking-Piret.
d) Determinar a velocidade máxima específica de crescimento (µmax) e o tempo de duplicação celular (tg),
assim como o fator de conversão de biomassa em etanol (YP/S), rendimento (%) e produtividade.
e) Avaliar a produção de etanol total, além de comparar com dados da literatura

6. Bibliografia
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11-14, 2005.
AMORIM, H.V., BASSO, L.C., ALVES, D.M.G. Processos de produção de álcool – Controle e monitoramento,
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BAILEY J. E.; OLLIS D. F. Bichemical Engineering Fundamentals. Second edition. New York, 1986.
BARROSO, M., PINEIRO, M., SILVA SERRA, E., SEIXAS DE MELO, J. Refractometria na determinação do teor de
açúcar e de aspartame em bebidas comerciais. Departamento de Química da Universidade de Coimbra, Rua Larga,
3049-535 Coimbra, Portugal, p.61-64.
BELLUCO, A. E. S. Alterações fisiológicas e de composição em Saccharomyces cerevisiae sob condições não
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Piracicaba, Brasil, 2001.
BORZANI, W., SCHMIDEL, W., LIMA, U.A., Aquarone, E. Biotecnologia Industrial – Fundamentos. Vol. 01. Editora
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CAMILI, E. A.; CABELLO, C.; CARDOSO, M. G. Produção de etanol de tratada com processo de flotação. 2.ed.
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HISS, H. Cinética de processos fermentativos In: SCHMIDELL, W.; LIMA, U.A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W.R
(Coord.) Biotecnologia Industrial. São Paulo: Edgard Blücherp, 93-122, 2001.
MENEZES, T. J. B. Etanol, o combustível do Brasil. São Paulo: Editora Agronômica Ceres Ltda., p. 141-178, 1980.
Refratometria, Intituto de Química – UFG.
RIBEIRO, E. J., LOPES, J.J.C., FERRARI, S.E. Complementação de nitrogênio de forma contínua no processo de
fermentação alcoólica, Brasil Açucareira, v.105, n.1, p. 26-30, 1987.

ANEXO 1: Curva de calibração para a determinação da concentração celular.

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