Universidade Federal de São Carlos

Departamento de Morfologia e Patologia

Bacharelado em Biotecnologia

Bioprospecção de Microrganismos Degradadores de Biomassa em Plantação de

Cana-De-Açúcar e Caracterização Enzimática Para Produção de Biocombustíveis

Prof. Dr. Paulo Teixeira Lacava

Grupo 1:

Ana Gabriela Campos - 770664

Ana Laura Sanchez - 770667

Gabriel Arantes Silva - 743679

Guilherme Romualdo Silva - 770676

Lívia Bertoni - 770683

Lucas de Araujo Montalvão - 770684

Matheus Severich - 770687

São Carlos

2023
 Sumário

1. Introdução 3
1.1. O Bioetanol 3
1.2. A enzima β-glicosidase 4
1.3. A biomassa lignocelulósica e suas aplicações 5
2. Objetivos 7
2.1. Objetivos gerais 7
2.2. Objetivos específicos 7
3. Metodologia 8
3.1 Materiais e pré-tratamento de biomassa vegetal 8
3.2. Isolamento e caracterização de microrganismos degradadores de biomassa vegetal 8
3.3. Extração e sequenciamento de DNA 9
3.4. Análises bioinformáticas da beta glicosidase: 9
3.5. Clonagem 9
3.6. Produção enzimática 10
3.7. Caracterização bioquímica da β-glicosidase 11
3.7.1. Análise de estabilidade térmica - Thermofluor® 11
3.7.2. Determinação de pH e temperatura ótima 11
3.7.3. Painel de substratos 11
3.7.4. Atividade específica 12
3.7.5. Atividade residual 12
3.7.6. Cinética enzimática 12
3.7.7. Inibição por glicose 12
3.7.8. Painel de íons 13
3.8. Pré tratamento da biomassa 13
3.9. Hidrólise da biomassa 13
4. Conclusão 13
5. Referências bibliográficas 14
 1. Introdução

1.1. O Bioetanol

Biocombustíveis são combustíveis elaborados a partir da transformação de

diferentes materiais orgânicos disponíveis de uma maneira renovável, por exemplo:
produtos agrícolas, produtos florestais, resíduos agrícolas e florestais, resíduos industriais,
algas e resíduos animais, entre outros (CASCONE, 2007). Os biocombustíveis mais
comuns são biodiesel, bioálcoois - incluindo bioetanol e biobutanol - e biogás.
Devido ao seu elevado valor energético, o bioetanol é o biocombustível que
apresenta expectativas mais promissoras para o futuro, pois para cada tonelada de álcool
combustível utilizado, cerca de 2,3 toneladas de CO2 fóssil deixam de ser emitidos. A
produção mundial de etanol aproxima-se dos 62 bilhões de litros, dos quais os EUA (32
bilhões de litros) é o maior produtor, seguido pelo Brasil com produção anual de 23 bilhões
de litros.
Além disso, o bioetanol apresenta outras inúmeras vantagens. Primeiramente,
não apresenta dependências de reservas petrolíferas; é obtido de fontes renováveis; gera
dez vezes mais energia do que consome em sua produção; apresenta baixos níveis de
emissões de gases relacionados ao efeito estufa como o monóxido de carbono (redução de
4% para o E10 e 37% para o E85), óxidos de enxofre e compostos orgânicos tóxicos como
o benzeno e chumbo (Demirbas e Demirbas, 2007).
O Brasil possui o menor custo de produção de bioetanol do mundo, visto que o
mesmo pode ser obtido a partir de diversas formas de biomassa, destacando-se os
materiais lignocelulósicos. Estes consistem em subprodutos de atividades agrícolas,
resíduos industriais ou resíduos domésticos e, enormes são as possibilidades a partir
destes para a produção e consumo global como combustível renovável (Cardona e
Sánchez, 2007).
O aproveitamento dos resíduos agroindustriais se sobressai como substrato em
processos biotecnológicos para a produção de bioetanol. Estes são abundantes, renováveis
e de baixo custo, além de não liberarem gás carbônico e possuem pequeno conteúdo de
enxofre. O bioetanol celulósico apresenta potencial para produzir pelo menos duas vezes
mais combustível da mesma área de terra plantada e disponibilidade da biomassa
(Demirbas e Demirbas, 2007; Shreeve, 2006). Dessa forma, esta tecnologia permite agregar
valor no que outrora era considerado resíduo sólido, como o bagaço e palha da cana, e
aumentar a produção de bioetanol sem expandir a área agrícola cultivada.
 As etapas de produção do bioetanol a partir da biomassa lignocelulósica envolve
quatro principais etapas. A primeira consiste no pré tratamento da matéria prima, no qual
vários tipos de pré-tratamentos podem ser aplicados com o objetivo de diminuir o teor de
lignina e facilitar a posterior hidrólise enzimática por celulases (Martin et al., 2002; Reyes et
al., 1998). A segunda etapa consiste no processo de sacarificação, que degrada o material
celulósico por meio de hidrólise, produzindo o substrato necessário para início da via
fermentativa (Reguly, 1996). Esta fase, com 12 reações em sequência ordenada, envolve a
transformação dos açúcares em etanol e dióxido de carbono, com algumas variações entre
os processos. Por fim, separa-se o etanol do substrato fermentado.
Uma das mais importantes etapas da produção do biocombustível consiste na
hidrólise das celuloses e hemiceluloses em açúcares fermentescíveis, que pode ser ácida
ou enzimática. Dentre estas, a hidrólise enzimática apresenta grande potencial em virtude
das características como especificidade da reação; não gera compostos tóxicos; ausência
da formação de produtos secundários como inibidores da fermentação alcoólica; a reação
ocorre em condições suaves e não requer altas pressões, temperaturas e equipamentos
anticorrosivos (Bastos, 2007). A utilização de enzimas nas indústrias tem viabilizado
economicamente diferentes processos tecnológicos sob condições amenas de temperatura
e pressão, além de diminuir a poluição ambiental.
Neste tipo de hidrólise, a degradação do polímero é feita pela ação de três grupos
de enzimas que atuam sinergicamente. Esses grupos de enzimas compreendem as
endo-1,4-βglucanases, as exo-1,4-β-glucanases e as 1,4-β-glucosidases. A Figura 8
apresenta um esquema simplificado da hidrólise utilizando celulases. Os diferentes grupos
de enzimas atuam de forma cooperativa, causando a hidrólise completa da celulose até
glicose.

1.2. A enzima β-glicosidase

A β-Glucosidase é uma enzima produzida por todos os domínios da vida: bactérias,

fungos, plantas e animais, até mesmo por humanos. Ela foi purificada e caracterizada em
animais e plantas (Yun Li et al., 2005). As β-Glucosidases são de interesse do ponto de
vista fitopatológico (Davis et al., 1953). São enzimas comuns do solo e catalisam a hidrólise
de vários β-glucosídeos presentes em resíduos de plantas que se decompõem no solo
(Hayano et al., 1977).
A β-glucosidase desempenha importantes papéis em diversos processos fisiológicos
Em microrganismos, desempenha papéis na hidrólise da celulose, reciclagem de carbono e
indução de genes de celulase (Ahmed et al., 2017). A produção de bioetanol é um dos
muitos processos biotecnológicos em que as β-glucosidases, especialmente aquelas
derivadas de fontes microbianas, podem ser usadas, também pode ser aplicada na melhoria
do aroma na indústria de vinhos e sucos de frutas por meio da liberação de compostos
aromáticos de glicosídeos insípidos (Yun Li et al., 2005).
A maioria das β-glucosidases microbianas relatadas mostra ampla especificidade de
substrato (Singhania et al., 2013). Ela libera glicose a partir de sua extremidade não
redutora através do processo de hidrólise das ligações β-D-glicosídicas de compostos como
β-D-glicosídeos alquilos, β-D-glicosídeos, glicosídeos cianogênicos, dissacarídeos e
oligossacarídeos de cadeia curta. Além disso, sob circunstâncias específicas, ela também
catalisa reações sintéticas de oligossacarídeos/glicosídeos por hidrólise reversa ou
transglicosilação (Krisch et al., 2010).
A reação de hidrólise reversa ocorre por um deslocamento de equilíbrio da reação
em direção à síntese, devido à redução da atividade da água, a captura do produto ou a alta
concentração de substrato (Ahmed et al., 2017). Já na reação de transglicosilação, o
glicosídeo doador é hidrolisado pela β-glucosidase, resultando em um intermediário
enzima-glicosídeo, o qual é atacado por um nucleófilo que não seja a água, como um
monossacarídeo, dissacarídeo, arilamino, álcool alquil ou álcool monoterpênico, para
produzir um novo produto alongado. A transglicosilação é controlada cineticamente.
(Singhania et al., 2013).
Embora apresentem aplicações diversas no âmbito da biotecnologia, as
β-glucosidases produzidas por microrganismos são obtidas em pequenas quantidades e
também são inibidas pelo seu produto final, a glicose, resultando no acúmulo de celobiose
durante a celulólise (Yun Li et al., 2005). A β-glucosidase é, portanto, considerada a
enzima-chave na determinação da eficiência da celulase e no gargalo na produção de
bioetanol a partir da conversão de biomassa (Sorensen et al., 2013).Hoje, muitas das
pesquisas estão voltadas para o desenvolvimento ou encontrar microrganismos com alta
produtividade de β-glucosidase e/ou β-glucosidase com alta tolerância à glicose,
termoestabilidade e eficiência catalítica. (Ahmed et al., 2017)

1.3. A biomassa lignocelulósica e suas aplicações

Os materiais lignocelulósicos são compostos principalmente por três tipos de

polímeros associados entre si: celulose, hemicelulose e lignina. A hemicelulose é um
complexo de carboidratos formado por pentoses (xilose e arabinose), hexoses (galactose e
manose) e ácidos urônicos [Hendriks et al., 2009]. Ademais, é a segunda classe de
polissacarídeos mais abundante na natureza, representando cerca de 30 a 20% da massa
seca da biomassa lignocelulósica [Malgas et al., 2015]. A hemicelulose ainda apresenta
notáveis propriedades de interesse industrial, como antimicrobiana, inibição do crescimento
de tumores, aditivos na fabricação de papel e aplicação na produção de biocombustíveis
[Farhat et al., 2017].
A hemicelulose é classificada de acordo com o principal resíduo de açúcar que
compõe o seu esqueleto, como por exemplo xilanas, compostas por unidades de
β-D-xilopiranose, mananas, compostas por unidades de β-D-manose e galactanas,
compostas por unidades de β-D-galactose. Dependendo da espécie vegetal, estágio de
desenvolvimento e tecido, vasta diversidade estrutural pode ser encontrada, como
arabinoxilanas, mananas lineares, glucomananas, galactomananas, galactoglucomananas,
etc. [Ogeda and Petri, 2010].
É conhecido que oligossacarídeos derivados de biomassa possuem uma variedade
de aplicações sendo importantes fontes de açúcares que podem ser aproveitados para
produção de biocombustíveis. A bioconversão de biomassa em açúcares monoméricos para
subsequente fermentação em produtos como etanol pode ser eficientemente conduzida
utilizando múltiplas enzimas [Yamabhai et al., 2016].
Tendo em vista suas propriedades relativas a produção de biocombustível, a
hidrólise de açúcares vegetais, para a produção de oligossacarídeos e monossacarídeos,
têm sido alvo de estudos científicos no sentido de buscar ferramentas mais eficientes e
processos mais ecologicamente viáveis. O primeiro passo para obtenção dos açúcares é o
pré-tratamento da biomassa, processo de conversão da fonte de biomassa hemicelulósica
em uma forma em que a hidrólise enzimática é eficaz, uma vez que a recalcitrância do
complexo lignocelulósico fica reduzida [Agbor et al., 2011]. Há uma variedade de métodos
de pré-tratamento como a hidrólise ácida, pré-tratamento alcalino, auto hidrólise, explosão a
vapor e hidrotermólise [Mosier et al., 2005, Bensah and Mensah, 2013, Santo et al., 2015].
Pré-tratamento alcalino causa a hidrólise das ligações éster entre a lignina e a
hemicelulose, liberando assim a hemicelulose da matriz e permitindo sua extração.
Produtos químicos como hidróxido de sódio, hidróxido de cálcio e hidróxido de potássio são
comumente empregados. Em comparação com outros métodos, a extração alcalina requer
condições de temperatura e pressão menos intensas, entretanto seu emprego pode levar a
formação de compostos indesejados, como sais que são recuperáveis ou incorporados à
biomassa [Naidu et al., 2018].
Pré-tratamento ácido, no geral, permite a extração da hemicelulose, entretanto,
devido a sua agressividade, uma fração celulósica pode ser degradada no processo,
gerando produtos indesejados como furfural e hidroximetilfurfural (HMF) [Neto et al., 2020].
O pré-tratamento hidrotérmico faz uso de água quente pressurizada para aumentar a
solubilização do material. Ele é uma alternativa barata e ecologicamente limpa, pois não
necessita de aditivos, como catalisadores ácidos. Ele provoca a auto-ionização da água em
H3O- e OH- , que por sua vez faz com que a ela atue como um catalisador que induz a
liberação de acetato, dessa forma a diminuição do pH do meio atua como um catalisador
para as reações de hidrólise. Esses eventos combinados estimulam a despolimerização da
hemicelulose [Santo et al., 2015, Ruiz et al., 2020]. Uma vez pré-tratada, a biomassa pode
seguir para a etapa de hidrólise enzimática para a obtenção de manose e MOS de forma
eficiente.
Enzimas capazes de degradar glicose fazem parte de um grande arsenal de glicosil
hidrolases produzidas por fungos e bactérias degradantes de biomassa [Van Zyl et al.,
2010].
O presente estudo visa produção bioprospecção de microrganismos degradadores
de biomassa e a prospecção e caracterização de uma β-glicosidase envolvida no processo
bem como suas aplicações visando a obtenção de substratos para o processo de produção
de etanol de segunda geração a partir de cana de açúcar. O desenvolvimento de uma
metodologia eficiente para a produção de açúcares a partir de resíduos agroindustriais,
pode ajudar a impulsionar e consolidar o uso destes substratos de forma eficiente e
funcional.

2. Objetivos

2.1. Objetivos gerais

O objetivo geral deste trabalho é identificar enzimas em microrganismos

degradadores de biomassa, produzir, purificar e caracterizar bioquimicamente enzimas com
atividade de β-glicosidase que possuam potencial de aplicação biotecnológica para
obtenção de produtos de alto valor agregado, focando no processo de produção de etanol
de segunda geração. Buscaremos compreender os mecanismos bioquímicos e estruturais
bem como as propriedades enzimáticas de maneira a otimizar seu emprego em processos
que sejam ao mesmo tempo eficientes e sustentáveis.

2.2. Objetivos específicos

● Identificar e isolar os microrganismos degradadores de biomassa vegetal.

● Identificar neles as enzimas de interesse e suas sequências.
● Realizar amplificação e clonagem dos genes de uma das enzimas em E. coli.
● Realizar a produção heteróloga e purificação da enzima de interesse.
● Realizar a caracterização bioquímica dessa enzima.
● Realizar testes de aplicabilidade da enzima em processos de produção.
 3. Metodologia

3.1 Materiais e pré-tratamento de biomassa vegetal

Serão coletadas amostras de solo provenientes do Horizonte O, a camada mais

superficial, de plantações pós colheita de cana-de-açúcar dos campos de plantio do Centro
de Ciências Agrárias da UFSCar (CCA-UFSCar). Além disso, também serão coletadas
amostras de plantas de cana-de-açúcar, as quais serão trituradas até chegar em pedaços
menores que três centímetros e serão lavados com água destilada apropriadamente.
Posteriormente será feito um pré-tratamento alcalino, com solução 1% de NaOH em
água destilada, por um período de 24 horas e em seguida para realização dos testes de
degradação posterior.

3.2. Isolamento e caracterização de microrganismos degradadores de

biomassa vegetal

O isolamento dos microrganismos será realizado pela técnica de enriquecimento

(Martinus, 1901), onde 1 grama da amostra de solo é derramado sobre um Erlenmeyer,
contendo 100 mL de meio basal, composto de 5 g/L de Peptona e 3 g/L de extrato de
levedura, à um pH de 7, além de uma grama do material pré-tratado descrito anteriormente.
Os frascos serão incubados por 15 dias em em estufa com temperatura de 30 °C,
nesta primeira etapa de enriquecimento. Em seguida 10 mL deste caldo de cultura
enriquecido serão transferidos para um meio sintético pobre em açúcares, contendo a
biomassa pré-tratada descrita anteriormente, com o objetivo de induzir o crescimento
apenas de microrganismos capazes de degradar as fibras lignocelulósicas ali disponíveis
para seu crescimento, sendo a única fonte de carbono. Esta etapa durará aproximadamente
dez dias, sendo repetida mais duas vezes, com o objetivo de se obter predominantemente
os organismos degradadores de biomassa de interesse.
Após estes períodos de enriquecimento os microrganismos, como bactérias e
fungos, serão isolados a partir de espalhamento em placa de Petri, em meio Ágar Nutriente
seguido de estria de esgotamento em placa de Petri para obtenção dos isolados.
A identificação dos fungos será realizada a partir de coloração com azul de algodão
lactofenol, para verificar a coloração das colônias, seu formato, forma, borda e esporos,
(caso tenham), por análise em microscópio, permitindo a classificação até nível de gênero.
 Já no caso das bactérias, será realizada uma coloração de Gram, e além disso
realizar testes bioquímicos Hi Assorted, para identificação destas bactérias através de
mudanças na coloração dos meios de cultura.

3.3. Extração e sequenciamento de DNA

Será realizada uma extração de DNA genômico bacteriano e fúngico, e também o

sequenciamento deste para posteriormente análise bioinformática.
A extração de DNA bacteriano será realizada com o uso de kits de extração, a partir
de um pré-inóculo de 5 mL de meio ágar nutriente, com crescimento overnight em shaker à
30°C e 250 RPM.
Já a extração de DNA genômico dos fungos, deverá passar por uma etapa de
maceração e liofilização do micélio cultivado, para então utilização de kit de extração de
DNA genômico.
Após a obtenção das amostras de DNA, estas serão enviadas para laboratório
parceiro, como o CNPEM, para efetuar o processo de sequenciamento e assim, efetuar os
testes seguintes.

3.4. Análises bioinformáticas da beta glicosidase:

Após o isolamento do microrganismo e o sequenciamento do genoma, será

realizado um alinhamento múltiplo utilizando a plataforma CLUSTALW. Para isso, serão
selecionadas previamente sequências gênicas já conhecidas da enzima beta galactosidase
de diferentes espécies por meio do banco de dados NCBI e suas sequências fasta serão
recuperadas. Com os dados obtidos, tanto as sequências potenciais isoladas dos
microrganismos do solo, quanto as obtidas por meio do banco de dados, serão inseridas na
plataforma CLUSTALW para a realização do alinhamento. O alinhamento será utilizado para
garantir que a sequência isolada é, de fato, uma sequência da enzima beta galactosidase,
comprovando que o isolamento foi eficiente.

3.5. Clonagem

Primers serão desenhados de forma específica para se hibridizar com as

extremidades da sequência de interesse para a amplificação do gene da enzima de
interesse, a qual será realizada por PCR. Para verificar o produto da amplificação, será
realizada uma eletroforese em gel de agarose. Com o produto amplificado, será realizada a
ligação ao vetor de clonagem pGEM, que será transformado em E.coli DH5𝞪 para. Após a
clonagem, será realizada a seleção dos clones recombinantes. Como o vetor possui um
marcador de resistência antibiótica, os clones serão expostos a antibiótico e, desse modo,
somente as cepas que tiverem incorporado o vetor irão sobreviver.
Em seguida será feita a subclonagem em vetor de expressão pET-28a(+), o qual
será transformado em linhagem de E. coli BL21 para expressão da proteína recombinante,
induzida por IPTG, a qual será monitorada a partir da técnica de eletroforese em gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE).

3.6. Produção enzimática

Para começar o processo de caracterização, é necessária a produção das enzimas

que serão estudadas. Para este fim, será utilizada a linhagem E. coli DH5-α para a
replicação dos plasmídeos modificados para a produção das GH97. Após a replicação de
plasmídeos, eles serão utilizados nas transformações em células E. coli Rosetta para a
expressão.
Pré-culturas serão iniciadas em meio LB feito com triptona 10 g/L, NaCl 10 g/L e
extrato de levedura 5 g/L, sendo ajustado para que seu pH permaneça em 7. Nesse cultivo
serão adicionados os antibióticos canamicina 50 µg/mL e cloranfenicol 34 µg/mL para a
seleção.
A expressão será induzida com IPTG, que será adicionado ao meio de cultura
quando as células atingirem o nível ótimo de crescimento, avaliado através de medidas de
densidade óptica a 600 nm (D.O.) enquanto elas permanecem a 37 °C sob agitação de 200
RPM em shaker.
O nível de expressão e solubilidade das proteínas de interesse será confirmado
através de um processo de SDS-PAGE 15% em condições desnaturantes.
A cauda de histidina presente na proteína será clivada através de uma
ressuspensão da mesma em 50 mL de tampão (50 mM Tris-HCl pH = 7,5 + 150 mM NaCl),
com adição de TEV protease, que será a responsável pela clivagem, em conjunto com 1
mM de dTT.
A purificação da proteína de interesse será realizada por matriz de cromatografia de
afinidade com metal imobilizado (IMAC) Ni-NTA Agarose, seguida por uma cromatografia
por exclusão de tamanho realizada em sistema Äkta Purifier (GE). O sucesso dessa etapa
também será avaliado via SDS-PAGE 15%, finalizando com a aferição da concentração da
enzima, através de espectrofotometria a 280 nm a ser feita no equipamento NanoDrop. A
concentração poderá ser Público 6 ajustada caso convenha, por meio de diluição ou
concentração utilizando um concentrador de membrana de celulose com ponto de corte
apropriado.
 3.7. Caracterização bioquímica da β-glicosidase

3.7.1. Análise de estabilidade térmica - Thermofluor®

O método de fluorimetria diferencial de varredura, também conhecido como

Thermofluor, tem como objetivo determinar uma faixa de condições na qual a proteína deve
apresentar maior estabilidade, por meio da triagem de diferentes tampões. Assim, a técnica
consiste em aumentar gradativamente a temperatura até que ocorra a desnaturação
proteica, a qual será detectada empregando-se a sonda SYPRO® Orange (Invitrogen),
capaz de se ligar a porções hidrofóbicas da proteína (expostas após a desnaturação) e
emitir sinais de fluorescência. A temperatura será variada entre 25 °C e 90 °C, a uma taxa
de 1 °C a cada 30 segundos para determinação da temperatura de melting.

3.7.2. Determinação de pH e temperatura ótima

Ensaios bioquímicos para determinação da temperatura e pH ótimos para a

atividade das enzimas serão conduzidos com as enzimas de interesse, utilizando como
substrato pNP-β-Gli (p-nitrofenil-beta-D-glicopiranosídeo), que é um dissacarídeo sintético,
o qual possui uma glicose ligada à um p-nitrofenil, que quando clivado será liberado e
utilizado para teste colorimétrico. Inicialmente, a temperatura será mantida em 30 °C e o pH
será variado dentro do intervalo entre 2 e 10 com adição do tampão ABF. Após
determinação do pH ótimo, a temperatura será variada em um gradiente entre 20 °C a 95 °C
em um termociclador (Bio-Rad). Os ensaios bioquímicos serão realizados em quintuplicatas
e contendo branco, que consiste em um parâmetro para medição montado da mesma forma
que a reação, porém sem adição da enzima, para subtração da absorbância basal. A
atividade enzimática será determinada pela quantificação do produto p-nitrofenol liberada
em cada condição, após a reação ser inativada com adição de Na2CO3 a 2 M, com medida
de absorbância em 405 nm em espectrofotômetro Multiskan® Spectrum (Thermo Scientific).
A quantificação será possível graças a uma curva-padrão a ser determinada com
diversas concentrações conhecidas de p-nitrofenol.

3.7.3. Painel de substratos

A especificidade da enzima pelo substrato será determinada testando diferentes

substratos, a saber: celobiose, sacarose, maltose, lactose e xilose em pH e temperatura
ótimos previamente determinados, conforme anteriormente descrito. Os hidrolisados serão
analisados utilizando o método ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), para detecção de grupos
terminais redutores de sacarídeos [Miller, 1959].

3.7.4. Atividade específica

A avaliação da atividade específica será realizada com pNP-β-Gli e com os

substratos que apresentaram hidrólise sob a presença da enzima. A atividade específica
caracteriza a amostra em termos atividade enzimática sobre o substrato específico. As
enzimas serão incubadas em pH e temperatura ótimos em termociclador (BioRad).

3.7.5. Atividade residual

A atividade residual nos orienta a respeito da estabilidade térmica da enzima em

suas condições ótimas. Dessa forma, a avaliação será conduzida em pH e temperatura
ótima. As enzimas serão incubadas e, regularmente, alíquotas serão removidas e testadas
para a avaliação da atividade enzimática. O experimento será conduzido até que a enzima
não apresente mais atividade.

3.7.6. Cinética enzimática

A avaliação da cinética enzimática será conduzida com os substratos nos quais as

enzimas mostrarão maior afinidade, de acordo com o painel de substratos. As enzimas
serão incubadas com concentrações variadas de substrato (1 g/L a 14 g/L) em temperatura
e pH ótimos. Será realizado um fitting de Michaelis-Menten utilizando o software de análise
de dados Origin®2018, desenvolvido pela Originlab®.

3.7.7. Inibição por glicose

A atividade hidrolítica da enzima avaliada será testada contra pNP-β-Gli, na

presença de concentrações variadas de glicose (0 a 2500mM). Assim, será calculada a
atividade relativa, com base nos medições de absorbâncias (405nm) feitas das reações
realizadas em termociclador (Bio-Rad), de cada concentração, elucidando se há ou não
inibição enzimática na presença do produto liberado na reação.
 3.7.8. Painel de íons

A atividade enzimática será avaliada na presença de íons distintos. Para a

realização do teste as enzimas serão incubadas em suas condições ótimas com a presença
dos íons; LiCl, CuCl, CaCl2, MnCl3, CoCl2, NiSO4, MgCl2, ZnSO4, FeCl3, SrCl2 nas
concentrações finais de 1 e 10 mM, em termociclador (Bio-Rad). Os testes serão
conduzidos em quintuplicata contendo brancos como parâmetro de comparação. A
atividade enzimática será avaliada por meio da quantidade de p-nitrofenol liberada, a qual
será medida por espectrofotometria a 405 nm.

3.8. Pré tratamento da biomassa

Serão coletadas amostras de solo provenientes do Horizonte O, a camada mais

superficial, de plantações pós colheita de cana-de-açúcar dos campos de plantio do Centro
de Ciências Agrárias da UFSCar (CCA-UFSCar). Além disso, também serão coletadas
amostras de plantas de cana-de-açúcar, as quais serão trituradas até chegar em pedaços
menores que três centímetros e serão lavados com água destilada apropriadamente.
Posteriormente será feito um pré-tratamento alcalino, com solução 1% de NaOH em água
destilada, por um período de 24 horas seguido de três lavagens com água destilada, para
realização dos testes de degradação posterior.

3.9. Hidrólise da biomassa

As reações serão realizadas em pH e temperatura ótima, sob agitação de 130 rpm

até que as enzimas atinjam 20% de atividade de acordo com a atividade residual. As
reações de hidrólise serão interrompidas submetendo-as por 10 minutos a banho térmico a
95°C. A caracterização dos produtos de hidrólise será feita por cromatografia de troca
aniônica de alta performance (HPAEC) no aparelho Dionex ICS-5000 (Thermo Scientific,
Waltham, EUA), pelo qual é possível realizarmos triagem dos produtos da hidrólise
enzimática e identificação dos açúcares formados.

4. Conclusão

Pode-se concluir, com base em tudo que foi elucidado, que a bioprospecção de
microrganismos constitui uma alternativa real e promissora para a produção de
combustíveis de uma maneira mais ecológica e moderna que muitas das atuais
metodologias existentes, com o presente caso de microrganismos degradadores de
biomassa que podem ser encontrados, por exemplo, nas próprias plantações de
cana-de-açúcar que servem de matéria prima para alimentar não apenas a indústria do
combustível, mas também a de bebidas alcoólicas e mais. Apesar disso, a caracterização
da atividade enzimática de tais organismos mostra-se um processo trabalhoso, e não
necessariamente essas formas de vida terão o desempenho demandado para seu uso na
prática, em uma escala comercial/industrial. Para tanto, as ferramentas da Biotecnologia,
com destaque para a modificação genética, trazem maior resolução a essas questões,
podendo-se aumentar de maneira artificial a capacidade desses microrganismos produzirem
as enzimas de interesse.

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