POTENCIAL ANTIMICROBIANO E ANTIOXIDANTE DE EXTRATOS DE

CULTURA DE FUNGOS PROVENIENTES DE SEDIMENTO DE MANGUE

PIBITI QUOTA IFMA 2022 Solicitação: PIBITI-09643/22.

Protocolo Estado 166646/2022

Vigência: 01/07/2022 à 30/08/2023

SÃO LUÍS – MA 2023

POTENCIAL ANTIMICROBIANO E ANTIOXIDANTE DE EXTRATOS DE
CULTURA DE FUNGOS PROVENIENTES DE SEDIMENTO DE MANGUE

Relatório final apresentado à Fundação de Amparo

à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e
Tecnológico do Maranhão, referente ao edital
PRPGI Nº 21/2022PIBITI ENSINO SUPERIOR.
PIBITI QUOTA IFMA 2022 Solicitação: PIBITI-
09643/22.

Bolsista: Rubem Crisney Salgado da Silva.

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Cristina de Andrade

Monteiro.

SÃO LUÍS – MA 2023

INTRODUÇÃO

Micróbios de solos com condições adversas como os de manguezais podem

fornecer metabólitos únicos que são produzidos e excretados devido à necessidade de
sobrevivência (Kemung et al., 2020; Mohammed et al., 2021). Neste bioma os micro-
organismos representam uma imensa biodiversidade inexplorada e podem ser encontrados
como epífitos, polissaprobianos e patógenos (Cheng et al., 2009). Os manguezais
apresentam condições ambientais hostis de sobrevivência tais como temperatura, alta
salinidade, baixa oxigenação, influência de maré (Alappatt, 2018). Estas condições são
interessantes aos micro-organismos autóctones levando as espécies a produzirem novas
moléculas químicas e enzimas para degradação dos nutrientes do ambiente (Jia et al.,
2020; Mohammed et al., 2021). Os fungos se destacam nestes ambientes produzindo
metabólitos secundários exclusivos e diversificados (Rodrigues et al., 2020; Mohammed
et al., 2021) que podem ser úteis na produção de produtos farmacêuticos. Isto é relevante
devido à preocupante emergência de isolados resistentes o que compromete de forma
significante as opções terapêuticas disponíveis para tratamento das doenças fúngicas e
bacterianas (Mack; Bielicki, 2019). Isto tem levado à procura de novas moléculas que
possam ser usadas como alternativa à produção de formulações que sejam efetivas contra
os micro-organismos resistentes.
No Maranhão, uma grande parte de ambientes de mangue está contaminada e, não há
pesquisas sobre fungos de sedimento e suas potencialidades biotecnológicas. Alguns
estudos são preliminares e superficiais e se referem ou a fungos endofíticos ou a
quantificação de micro-organismos do solo (Teles et al., 2020; Rodrigues et al. 2020;
Silva et al., 2020). Dentro deste contexto, esta pesquisa visa explorar a diversidade
fúngica de manguezais em São Luís-MA caracterizando-os com relação às atividades
biológicas de seus extratos.
1. OBJETIVOS

1.1 Objetivo Geral

 Explorar a diversidade fúngica de manguezais em São Luís-Ma caracterizando-os

com relação às atividades biológicas de seus extratos

1.2 Objetivos Específicos

● Identificar fungos de sedimento de manguezais de São Luís-Ma como potenciais

promissores biotecnológicos.
● Produzir extratos a partir de culturas líquidas de fungos promissores.
● Verificar a atividade antimicrobiana dos extratos fúngicos, determinando as
concentrações inibitórias mínimas e as ações bactericidas e fungicidas
● Determinar a atividade antioxidante dos extratos.
● Explorar os constituintes metabólitos dos extratos promissores por meio de ensaios
cromatográficos (CCDC, CLAE).
2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Isolados de mangue, linhagens testes, manutenção das culturas e padronização

dos inóculos
As linhagens testes usadas foram Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus
faecalis ATCC 29212, Klebsiella pneumonia; Escherichia coli ATCC 25922,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, C. albicans ATCC 90028; C. krusei ATCC 6258
e C. parapsilosis ATCC 22019, todas da Coleção de Culturas do Laboratório de Biologia
do Instituto Federal do Maranhão. As linhagens são mantidas em Meio Brain Heart
Infusion (BHI) com glicerol (20%) à - 20ºC e foram cultivadas em BHI (bactérias) ou
SDA (leveduras) e mantidas em 4ºC durante os experimentos. Os inóculos foram
padronizados em PBS (Tampão Fosfato Salina, pH 7.0) para 1 × 10 6 UFC/mL
(leveduras) ou 1 × 10 8 (bactérias) após crescimento das células em BHI, 24 h, 37ºC e
centrifugação (3000 × g, 10 min) para lavagem com PBS e ressuspensão em PBS. Os
fungos dos manguezais foram isolados em Ágar Batata Dextrose (BDA) a partir de
amostras de sedimentos (total 10, 5 por período seco/chuvoso) coletados de 2 manguezais,
o manguezal do bairro Ipase (2º32’10”S e 44º15’40”W) e o manguezal do bairro Bacanga
(2º32’48”S e 44º18’12”W). Todas as amostras e os fungos pertencem e estão armazenadas
no Laboratório de Biologia do IFMA-MTC.

2.2 Identificação de fungos do sedimento de mangue por microcultivo

Fungos promissores verificados por outras pesquisas correlata foram identificados
por microcultivo em blocos 5 × 5 mm de BDA e após crescimento observado em
microscópio para identificação das estruturas reprodutivas.

2.2 Preparação dos sobrenadantes de cultura e dos extratos fúngicos (De acordo com
Hamzah et al, 2018, mas com adaptações desta pesquisa).
Antes de preparação dos extratos, os fungos passaram por uma triagem. Estes
foram inoculados em meio caldo batata (MCB) e crescidos sob agitação por 48, 96 e 7
dias. O sobrenadante das culturas foi então recolhido por centrifugação (10 000 rpm, 10
min) e testados por microdiluição para verificar o potencial antimicrobiano. Os fungos
cujo sobrenadante tiverem atividade foram então extraídos com acetato de etila para
verificar o perfil cromatográfico, conforme descrito abaixo.
 Os fungos foram cultivados primeiramente em pequena escala para fazer a triagem do
perfil cromatográfico dos extratos por CCDC (Cromatografia em Camada Delgada
Comparativa) e/ou CLAE (Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência). Para satisfazer a
esse objetivo, 5 discos fúngicos foram retirados de uma placa de cultivo em BDA e
inoculados em 37,5 mL de meio de cultura mineral Czapeck Dox, com composição (em
g.L 1- ): NaNO3 (3 g), K2 HPO4 (1 g), MgSO4 ·7H2 O (0.5 g), KCl (0.5 g), FeSO4 ·7H2
O (0.01 g) suplementado com glicose (30 g) e extrato de levedura (20g), para cada litro de
solução preparada, pH 6,5, e incubados sem agitação a 28ºC por 15 dias. A cultura líquida
resultante foi filtrada à vácuo e o filtrado extraído 2× com igual volume de acetato de
etila. O extrato foi rotaevaporizado à vacuo sob pressão reduzida a 40◦C para ficar
concentrado e mantido a -20◦C para uso posterior. Esta etapa ainda está em andamento
visto a quantidade muito grande de micro-organismo isolado e a ser testado e devido à
parceria responsável por etapa.

2.4 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)

As CIMs dos extratos foram determinadas pelo método de microdiluição em placas de
96 (CLSI, 2008; CLSI, 2019). Sobrenadantes de culturas liofilizados (100 uL e em
concentrações de 30000 - 58 ug/mL) foram adicionados em microplacas de 96 poços
juntamente com as linhagens testes (100 uL), incubados 37ºC, 24 h. A CIM foi
determinada como a menor concentração que inibiu o crescimento das linhagens. Para o
extrato, este em pó, foi dissolvido em DMSO e diluído em meios teste (RPMI, para teste
com leveduras e MH para testes com bactérias). Os controles positivos foram
ciprofloxaxina (10 – 0,019 mg / mL) e fluconazol (FLZ, 64 – 0,125 ug/mL). Microplacas
incubadas durante 24 h a 37 ° C. Após 24 h, 30 µL de resazurina 0,02% (p / v) foram
adicionados a cada poço e a placa incubada por mais 2 h e então submetida à observação a
olho nu. A CIM foi definida como a menor concentração do extrato capaz de inibir o
crescimento visível dos micro-organismos.
 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Identificação de fungos do sedimento de mangue por microcultivo

Dentre as linhagens com potencial antimicrobiano com testes dos sobrenadantes de

cultura avaliados por microdiluição, duas, P 813 e P 513 foram identificadas como
pertencentes taxonomicamente ao gênero Penicillium. Já as linhagens P 107 e P 805 foram
identificadas como pertencentes ao grupo Aspergillus. Ainda há isolado que precisa ser
identificado.

3.2 Preparação dos extratos fúngicos e testes realizados (De acordo com Hamzah et al, 2018,
mas com adaptações desta pesquisa)

Foram feitos sobrenadantes de cultura de 23 fungos para testes em ágar difusão.

Destes, 11 sobrenadantes apresentaram atividade e foram liofilizados e testados contra
bactérias e leveduras por microdiluição e poço difusão. A figura 1 mostra os extratos
produzidos pelas linhagens previamente positivas.
P905 P107 P513 P807 P601 P203 P404 P204 P115 P201 P805

Figura 1. Extratos das linhagens fúngicas prontas para teste.

Já se sabe que estudos importantes realizados com fungos do mangue sugerem que
eles são fontes promissoras para triagem de novos produtos considerando a adaptação às
condições extremas do ambiente (Thatoi, Behera, Mishra, 2013). Alguns poucos fungos de
mangue já isolados são produtores de compostos bioativos, a exemplo de Penicillium brocae,
Lasiodiplodia theobromae, Annulohypoxylon sp. CA-2013, Rhytidhysteron rufulum,
Phomopsis longicolla, Stemphylium sp. 33231, entre outros. Saravanakumar et al. (2018)
isolaram diferentes grupos microbianos de sedimentos de mangue na região estuarina na Índia
relatando inclusive o isolamento de bactéria do gênero Lactobacillus, fungos filamentosos do
gênero Trichoderma e alguns Actinomycetales. Os fungos são grandes produtores de
metabólitos secundários como diversos tipos de enzimas e até mesmo antibióticos (VINING,
1986). Aqui, primeiramente, a atividade antimicrobiana dos extratos foi avaliada por método
de poço difusão. Os resultados mostraram ação antimicrobiana principalmente de fungos
filamentosos, corroborando a literatura acerca de estudos que apontam que dentre os
microrganismos analisados por outros autores, os fungos filamentosos se destacam pela
produção de metabólitos secundários (CHEN; HU, 2021; POLETO et. al., 2021). Um dos
isolados desta pesquisa, a linhagem P 107 apresentou atividade de inibição contra Candida

albicans ATCC 90028 (Figura 2). A figura 3 evidencia o gênero do P107

 P115
P601 P513 P807

Figura 2. P 107 com halo de inibição de raio de 15 mm Figura 3. Fotomicrografia do fungo P 107 (400x). Observa-
para C. albicans. se a morfologia que o identifica como pertencente ao gênero
Aspergillus

Cabeça aspergilar

Conidióforo

P 107

Obteve-se também resultados que demonstraram a atividade antimicrobiana de

leveduras do mangue contra cepa Candida albicans (figura 4). E mais uma linhagem de fungo
filamentoso (figura 5) com inibição do crescimento de C. albicans.
Figura 4. Extratos de leveduras de mangue P115 e P601 Figura 5. Halo de inibição do extrato do fungo
apresentando halo de inibição para C. albicans de raio de P203 para C. albicans medindo raio= 12mm.
6mm e 15mm, respectivamente.

P204
P203
Sabe-se que o gênero Candida constitui o principal grupo de leveduras que causam
infecções oportunistas em seres humanos, e que os mecanismos de resistência desses
patógenos tem configurado falha na terapia antifúngica, uma vez que a exposição aos
antifúngicos têm diminuído a sensibilidade das cepas, no sentido de adquirirem cada vez mais
baixa susceptibilidades aos principais agentes terapêuticos, os imidazólicos e triazólicos.
Então, a busca por antibióticos mais eficientes continua, com o objetivo de combater
patógenos emergentes, fungos resistentes e microrganismos previamente suscetíveis que
desenvolveram resistência (DEMAIN; ADRIO, 2008; LUCAS, 2008; TAKAHASHI et al.,
2008).

Neste sentido os resultados desta pesquisa apontam para uma alternativa

biotecnológica a partir da atividade antimicrobiana dos extratos de fungo de mangue tanto
contra patógenos do gênero Candida quanto para bactérias, uma vez que a necessidade por
novos antibióticos tem sido um dos grandes desafios da medicina moderna
(LAXMINARAYAN et al., 2013). As figuras 6 e 7, apresenta-se atividade antimicrobiana a
partir de sobrenadantes liofilizados de fungos de mangue. Tendo em vista que vários
antibióticos atualmente disponíveis para tratamento de infecções, atuam sobre a parede celular
bacteriana e são mais eficazes contra bactérias Gram-positivas, que possuem uma camada
muito mais espessa de peptidoglicano em sua parede celular do que bactérias Gram-negativas
(BLAIR et al., 2015), os estudos aqui demonstram a efetividade de inibição no crescimento
para Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, respectivamente.

.
 Figura 6. Atividade de inibição dos extratos dos fungos Figura 7. Ação inibitória dos extratos dos fungos P905 e
P404, P601 e P107 com halos de 3mm, 3mm e 6mm, P805 com halos de 7mm e 6mm, respectivamente.
respectivamente.

P404
P107
P805

P601

P905

A determinação da Concentração
Inibitória Mínima dos extratos pelo método de
microdiluição em placas de 96 (CLSI, 2008; CLSI, 2019), corroboram com os testes
realizados pelo método de poço difusão. Demonstrando, portanto:

Figura 8. Microdiluição dos extratos dos sobrenadantes dos fungos P203, Figura 9. Aplicação de resazurina para verificação de atividade
P601 e P115. Fluconazol (FLZ) antifúngico padrão para fins de metabólica.
comparação de CIM e controles (+) positivo e (-) negativo.

P203 P601 P115 P203 P601 P115

FLZ FLZ

C+ C FLZ P203 P601 P115

C+ C- FLZ P203 P601 P115
-
O teste de microdiluição acima demonstra a atividade antimicrobiana do extrato da
linhagem fúngica P203 para a cepa Candida albicans A aplicação de resazurina funciona
 como agente revelador que indica metabolismo ativo de microorganismo no poço. Após a
incubação por 2h foi possível verificar que o extrato da linhagem P203 apresentou 250 ug/mL
como a menor concentração capaz de inibir o crescimento da levedura, uma vez que a
concentração inicial foi de 1000 ug/mL e a inibição ocorreu até o 3° poço. Em teste contra
bactérias, temos:

Figura 10. Teste de microdiluição dos extratos P203, P 601 e Figura 11. Aplicação de resazurina (30ul) para fins de
P 404 contra Escherichia coli e Staphylococus aureus. A verificação de atividade metabólica.
ciprofloxacina (CIP) é o antibiótico padrão. S. E. Coli
S. E. Coli aureus
aureus P203 P601 P404 P203 P601 P404
P203 P601 P404 P203 P601 P404 A
B
C

CIP CIP

+S.a +E.coli C- CIP P203 P601 P404 +S.a +E.coli C- CIP P203 P601 P404

Assim como no teste anterior, obtivemos a concentração de 250 ug/mL do extrato

proveniente de metabólitos do fungo de mangue P203 que confere ação inibitória para o
crescimento das bactérias citadas. Neste teste não foi possível identificar a menor
concentração de ciprofloxacina capaz de inibir as bactérias Escherichia coli e Staphylococus
aureus, tendo em vista que a organização do teste não tinha como prioridade estabelecer a
CIM deste antibiótico. Contudo, ainda é possível verificar, nos poços em que há
ciprofloxacina, sua atividade quando observamos que a cor azul significa ausência de
atividade celular viável.
Figura 12. Microdiluição do extrato fúngico P805 com aplicação Figura 13. Teste de microgota. Uma alíquota de
de resazurina. CIP (ciprofloxacina), antibiótico padrão. 10ul foi retirada dos poços e semeada em MH
ágar.
CIP
S. E. Coli E.c S.a
aureus
P805 P601 P201 P805 P601 P201
A A1
B A6
C B1
D B6 C1
E
D1

E1

+E.coli C- CIP +S.a

Por outro lado, nossas análises indicam mais um potencial biotecnológico provindo
de outro extrato, agora do fungo identificado como pertencendo ao gênero Aspergillus, o P805
(já mencionado na figura 7). No teste acima, obtivemos a confirmação da ação antimicrobiana
a partir do sobrenadante liofilizado do fungo P805, que apresenta uma CIM de 12,5ug/mL
para Escherichia coli e 100 ug/mL para Staphylococus aureus, tendo em vista que a
concentração no primeiro poço (A1) e (A6) é de 200ug/mL. Para a primeira bactéria, o
antibiótico padrão inibe o crescimento em 12,5ug/mL e para a segunda temos que a
ciprofloxacina inibiu o crescimento em todos os poços. Na figura 13, observamos mais um
teste que ratifica a ação potencial do extrato, uma vez que em A1, A6, B1, C1, B6, D1 e E1
não há crescimento do microorganismos como demonstra a aplicação da resazurina. A
presença de colônias nesses pontos se deve ao fato de que o inóculo acaba passando de uma
área à outra por uma manipulação não tão precisa no momento de semeadura da microgota.

Consideramos que nossos resultados demonstram que a exploração da diversidade

fúngica de manguezais e seus metabólitos únicos aponta para novas alternativas de cunho
biotecnológico e inovador. No sentido de que as falhas terapêuticas ou mesmo terapias
antibióticas e antifúngicas mais severas causadoras de grandes efeitos colaterais dada a
necessidade de doses de maior concentração pela resistência adquirida desses patógenos
mobiliza cada vez mais a busca por novos tratamentos e, portanto, nossos estudos indicam
que a exploração de constituintes metabólitos dos extratos de linhagens fúngicas de
manguezais poderão ser utilizadas como alternativa à produção de formulações que sejam
efetivas contra os micro-organismos resistentes. Um próximo passo será a utilização das
análises química para o isolamento e identificação dos metabólitos presentes nos potenciais
extratos bem como a identificação molecular das linhagens envolvidas.

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5. METAS E PERSPECTIVAS FUTURAS

5.1 Determinação das ações bactericida e fungicida mínimas (CBM e CFM)

A partir do teste de determinação da CIM, 10 uL do conteúdo dos poços com

concentrações superiores ao valor da CIM serão plaqueados em ágar MH (para bactérias) ou
SDA (leveduras) e incubado 24 h, 37ºC. O valor de CBM ou CFM será aquele onde não
houver crescimento de colônia observável. 9 Todos os experimentos estão sendo feitos em
triplicata e repetido em três ocasiões independentes.

5.2 Atividade antioxidante dos extratos

O efeito antioxidante dos extratos dos fungos que tenham atividade será monitorado
usando o teste de eliminação de radicais 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) de acordo com o
método proposto por Hamzah et al. (2018). O extrato bruto dissolvido em DMSO será diluido
(1.000-31,25 µg / mL), 100 µL de cada diluição serão misturados com 2.900 µL de DPPH
120 µM em DMSO, cada amostra agitada e incubada a 37◦C no escuro por 30 min. A
absorvância será registrada em espectrofotômetro de UV (517 nm) e a inibição do radical
livre por DPPH (A%) será calculada usando a seguinte equação: A% = [(A0-Ai) / A0] ×100;
onde, A0 = absorbância da reação de controle (sem extrato), e Ai = absorvância do extrato.
Ácido ascórbico será usado como controle positivo e todos os testes serão feitos em triplicata.
A ANOVA será realizada p ≤ 0,05.

5.3 Avaliação do perfil cromatográfico por Cromatografia em Camada Delgada

Comparativa (CCDC) e Cromatografia a Liquido de Alta Eficiência (CLAE).
Serão feitos por meio de Instituições parceiras afim de detectar as principais classes de
substâncias presentes nos extratos selecionando as linhagens de fungos promissoras.
Brevemente, para CCDC serão usados 20 µL (1 mg/mL) de cada extrato em cromatoplacas
contendo sílica gel como fase estacionária e diferentes proporções dos solventes hexano,
diclorometano, acetato de etila e metanol como fase móvel. A revelação será por irradiação U.
V a 255 e 317 nm e revelador p-anisaldeído seguido de aquecimento a 100 ºC, 5 min. Em
CLAE com detector de arranjo de diôdos (PDA) será verificado o perfil cromatográfico da
fase acetato de etila oriunda do meio liquido. A coluna phenomenex LUNA C18 de 250 x 4,6
mm I.D. (5 mm de diâmetro do poro) com fluxo de 1 mL/min será usada e a fase móvel terá
água/metanol com 0,1% de ácido fórmico. Será usado 20 uL de cada uma das soluções dos
extratos previamente preparadas (36% de água e 64% de metanol). Os espectros de UV serão
registrados entre 200 a 400 nm com detector de arranjo de diôdos (PDA). Os fungos que
apresentarem metabólitos de importância biotecnológica, futuramente, serão crescidos em
larga escala em meio Czapeck enriquecido com sais halogenados, para aumentar o rendimento
dos metabólitos de interesse e enviá-los para identificação destes metabólitos por Ressonância
Magnética Nuclear (RMN) de prótons e de carbono treze (1H e de 13C), além de técnicas e
bidimensionais (COSY, HMBC, HMQC).

6. APOIO
Este projeto contou com o fomento da Fundação de Amparo à Pesquisa e ao
Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA), como também com o
apoio do Instituto Federal do Maranhão (IFMA) campus Monte Castelo e o Laboratório de
Pesquisa em Microbiologia, Bioprospecção e Biotecnologia (LPBiotec).