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2 ESTABELECIMENTO IN VITRO Cariniana legalis

3 Resumo: O presente trabalho teve como objetivo desenvolver uma metodologia para a
4 estabelecimento in vitro do jequitibá-rosa (Cariniana legalis (Mart.) Kuntze), por meio da técnica
5 de micropropagação, avaliando-se a incidência de contaminação fúngica (CF), incidência de
6 contaminação bacteriana (CB), oxidação (OX) dos explantes em razão de 4 tempos de desinfestação
7 (0 min; 5 min; 10 min e 15min) e duas concentrações de sacarose (15 mg L -1 e 30 mg L-1). Para
8 introdução in vitro no meio de cultura utilizou-se a técnica de cultura de tecidos a partir de
9 segmentos nodais e proliferação de gemas axilares. As variáveis analisadas foram avaliadas após 30
10 dias. A CF teve influência pelo tempo de desinfestação e concentração de sacarose. O tempo de
11 desinfestação teve interferência na CB e para OX as concentrações de sacarose obteve diferenças
12 estatísticas. Conclui-se que o estabelecimento in vitro com segmentos nodais extraídos das
13 minicepas de origem seminal foi eficaz para os tratamentos tempo de desinfestação e concentrações
14 de sacarose. O tempo de 0 minutos e a concentração de 30 mg L-1 apresentaram valores superiores.

15 Palavras chave: Micropropagação; Segmentos Nodais; Gemas Axilares; Jequitibá Rosa.

16 IN VITRO ESTABLISHMENT Cariniana legalis

17 Abatract: The present work aimed to develop a methodology for the in vitro establishment of
18 jequitibá-rosa (Cariniana legalis (Mart.) Kuntze), through the micropropagation technique,
19 evaluating the incidence of fungal contamination (CF), incidence of bacterial (CB), oxidation (OX)
20 of explants due to 4 disinfestation times (0 min; 5 min; 10 min and 15 min) and two concentrations
21 of sucrose (15 mg L-1 and 30 mg L-1). For in vitro introduction into the culture medium, the tissue
22 culture technique was used from nodal segments and proliferation of axillary buds. The analyzed
23 variables were evaluated after 30 days. CF was influenced by disinfestation time and sucrose
24 concentration. The disinfestation time had an impact on CB and for OX, sucrose concentrations
25 obtained statistical differences. It is concluded that the in vitro establishment with nodal segments
26 extracted from ministumps of seminal origin was effective for the treatments disinfestation time and
27 sucrose concentrations. The time of 0 minutes and the concentration of 30 mg L -1 showed higher
28 values.

29 Keywords: Micropropagation; Nodal Segments; Axillary Buds; Jequitibá Rosa.

30 1. INTRODUÇÃO

31 A espécie Cariniana legalis (Mart.) Kuntze pertence à família Lecythidaceae, originário da

32 Mata Atlântica, espécie nativa com altura em torno de 30-50 metros e tronco de 70-100 cm de
33 diâmetro, sendo uma das maiores e mais representativas pela sua dimensão e mais longeva árvore
34 do bioma (SEBBENN et al., 2000). Devido à intensa exploração da madeira, resultando em uma
35 densidade populacional inferior a uma árvore por ha (TAMBARUSSI et al. 2015) a espécie C.
36 legalis está incluída na Lista Vermelha de Espécies Ameaçadas da União Internacional para a
37 Conservação da Natureza (IUCN), sendo classificada na categoria vulnerável (IUCN 2016). Esta
38 ameaça é resultado da fragmentação do habitat e da redução da dispersão de pólen e sementes,
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39 consequentemente, declínio das populações de C. legalis (LEAL et al.
40 2014).
41 No Brasil, o mercado de espécies nobres nativas vem apresentando forte crescimento na
42 demanda de madeiras roliças, ideais para serraria, podendo ser usadas na produção de portas,
43 janelas, forros, laminados, painéis, decks, até construção de navios. Madeiras como de jequitibá-
44 rosa (Cariniana legalis) têm alto valor agregado devido às características de maior resistência a
45 insetos, beleza, durabilidade e resistência ao processamento (MENDONÇA et al., 2017). Entretanto
46 as sementes dessa espécie sofrem perdas significativas de viabilidade durante um ano de
47 armazenamento (SOUSA et al. 2016). Com isso a propagação vegetativa surge como alternativa
48 viável para a produção de mudas dessa espécie, o que permite a implantação de povoamentos
49 comerciais ou para outros fins.
50 Dentre as técnicas de propagação vegetativa mais utilizadas no setor florestal, a
51 micropropagação surge como alternativas para suprir a necessidade do resgate da juvenilidade do
52 material vegetativo (LATOH, et al., 2022). A escolha da micropropagação ocorreu após diversos
53 ensaios e testes com a técnica de miniestaquia que não resultou em enraizamento das miniestacas
54 demonstrando ser uma espécie lenhosa de difícil formação de raiz. Diversos fatores podem afetar o
55 enraizamento de estacas tais como a juvenilidade da planta matriz e do propágulo, estado
56 fisiológico da planta, fatores ambientais e intrínsecos da planta como a totipotência (HARTMANN
57 e KESTER, 2018).
58 A primeira e mais desafiadora fase da micropropagação é o estabelecimento in vitro, onde as
59 brotações são introduzidas do meio externo e permanecem sob condições assépticas em meio de
60 cultura (OLIVEIRA et al., 2013). Na cultura de tecidos, as plantas permanecem em condições
61 mixotróficas, pois não realizam altas taxas de fotossíntese e precisam de alguma fonte de energia
62 imediata, como a sacarose, o que aumenta ainda mais a ocorrência de microorganismos. Assim
63 sendo, o objetivo do presente trabalho foi testar concentrações de sacarose no meio de cultura e
64 tempos de imersão das brotações em hipoclorito de sódio no estabelecimento in vitro de Cariniana
65 legalis, visando a produção de mudas via micropropagação.

66 2. MATERIAL E MÉTODOS

67 O experimento da micropropagação foi desenvolvido no Laboratório de Biotecnologia e

68 Cultura de Tecidos da Universidade Federal de Mato Grosso, localizado em Cuiabá, Mato Grosso,
69 que pertence a Mesorregião Geográfica Centro-Sul Mato-Grossense e a Microrregião Geográfica de
70 Cuiabá. Localiza-se a 15°35’56’’ de latitude sul e 56°06’01’’ de longitude oeste, em uma altitude
71 média de 165 m, com o clima tipo AW (chuvas de verão-outono), segundo a classificação de
72 Köppen. O laboratório apresenta temperatura de 25°C e 60% de umidade controlada
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74 2.2. Delineamento estatístico
75 A micropropagação realizou-se a partir da inoculação in vitro de segmentos nodais axilares
76 das cepas produzidas no jardim clonal. O delineamento foi inteiramente casualizado em todas as
77 fases do processo.
78 A fase de introdução foi conduzida em esquema fatorial 4x2, sendo 4 tempos de desinfestação
79 (0 min; 5 min; 10 min e 15min) e duas concentrações de sacarose (15 mg L -1 e 30 mg L-1). Cada
80 tratamento foi composto por 4 repetições com 10 indivíduos, com uma gema apical por frasco.
81
82 2.2.Condução do experimento
83 Para estabelecimento, a coleta de brotações foi feita nas primeiras horas da manhã com
84 auxílio de uma tesoura de poda. Em seguida, as brotações foram acondicionadas em caixas térmicas
85 contendo água para evitar a perda de turgescência. Em seguida passaram por lavagem superficial e
86 imersão em água corrente por 15 minutos. As brotações que antes possuíam aproximadamente 10
87 cm foram segmentadas em tamanhos menores (±10 cm) e levadas à câmara de fluxo laminar, onde
88 ocorreu a desinfestação dos explantes.
89 Para introdução in vitro os segmentos nodais foram desinfestados em imersão de soluções
90 com etanol 70% e hipoclorito de sódio (2% de cloro ativo) acrescida de uma gota de detergente
91 neutro com adição de Tween 20 para cada 100 ml de solução por quatro tempos 0 min; 5 min; 10
92 min e 15min. A seguir realizou-se o enxague do material em seis ciclos com água destilada e
93 autoclavada. Todo o procedimento de estabelecimento foi realizado em câmara de fluxo laminar
94 previamente esterilizada com álcool 70% e luz UV por 20 minutos.
95 Os segmentos nodais foram inoculados em tubos de ensaio com 10 ml de meio Wood Plant
96 Medium (WPM) (LLOYD; MCCOWN, 1980) com as duas concentrações de sacarose. Após a
97 inoculação, os segmentos nodais foram mantidos no escuro, por uma semana, na sala de
98 crescimento do laboratório, com temperatura controlada de 25°C. Em seguida, foram transferidos
99 para luz, a fim de estimular o desenvolvimento dos segmentos nodais.

100 2.3. Variáveis analisadas e Análises Estatísticas

101 Nesta fase, as avaliações foram realizadas em 30 dias após a inoculação e foram avaliados:
102 incidência de contaminação fúngica (CF), incidência de contaminação bacteriana (CB), oxidação
103 (OX).
104 Os dados foram submetidos aos testes de normalidade de Lilliefors (P<0,05) e
105 homogeneidade de Bartlett (P< 0,05) e transformados quando necessário. Em seguida foi realizada
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106 a análise de variância ANOVA (p<0,01 e p<0,05) e as médias
107 comparadas pelo teste Scott-Knott (p< 0,05) utilizando o software R.

108 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

109 Os fatores concentrações de sacarose e tempo de desinfestação afetaram diferentemente as

110 variáveis analisadas: incidência de contaminação fúngica (CF), incidência de contaminação
111 bacteriana (CB) e a oxidação (OX) de explantes de Cariniana legalis nos 30 dias após o
112 estabelecimento in vitro. A Figura 1 apresenta as características de cada variável.
113 Para a variável contaminação fúngica (CF) houve interação entre os fatores tempo de
114 desinfestação e concentração de sacarose. Considerando o tempo de desinfestação, somente no
115 tempo 0 houve efeito da concentração de sacarose, tendo a menor incidência de fungos na
116 concentração de 30 mg L-1. Considerando a concentração de sacarose, o tempo de desinfestação
117 influenciou somente na dose de 15 mg L-1, tendo a maior contaminação no tempo 0 (Tabela 1).
118 A contaminação por bactéria (CB) foi influenciada apenas pelo tempo de desinfestação dos
119 explantes. O tempo 0 teve a menor CB, os demais tempos foram semelhantes entre si (Tabela 1).
120 A oxidação dos explantes foi influenciada somente pela concentração de sacarose. A menor
121 porcentagem ocorreu no meio de cultura suplementado com 30 mg L-1 de sacarose (Tabela 1).
122 Figura 1: Avaliação dos explantes no estabelecimento in vitro de Cariniana legalis. A- contaminação fúngica (CF); B-
123 contaminação bacteriana (CB); C- oxidação (OX); D- explante estabelecido.
A B
124 D
C
125
126
127
128
129
130
131
132
133 Tabela 1: Porcentagem de contaminação por fungos (CF), por bactérias (CB) e porcentagem de oxidação (OX) de
134 segmentos nodais axilares de Cariniana legalis sob concentrações de sacarose e tempos de desinfestação, aos 30 dias de
135 estabelecimento in vitro

% FUNGOS (CF)
Sacarose Tempo (minutos)
mg L-1 0 5 10 10
15 42,5 Aa 22,5 Ab 25,0 Ab 32,5 Ab
30 2,5 Ba 12,5 Aa 15,0 Aa 12,5 Aa
% BACTÉRIA (CB)
Tempo (minutos)
0 5 10 15
12,5 b 57,5 a 56,3 a 55,0 a
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% OXIDAÇÃO (OX)
Sacarose
mg L-1

15 20,0 A
30 8,1 B

136
137 O estabelecimento in vitro por segmentos nodais de C. legalis extraídas de minicepas
138 apresentou baixa porcentagem de oxidação e contaminação por fungos, e ainda que tenha ocorrido
139 alta taxa de contaminação por bactéria, esta não foi o suficiente para morte e oxidação do explante
140 no meio de cultura. Este resultado é promissor, pois a etapa de estabelecimento e introdução do
141 explante em meio de cultura é uma das etapas mais desafiadoras na micropropagação, devido à alta
142 taxa de contaminação comum às espécies lenhosas com materiais vegetativos retirados do campo.
143 Tais resultados corroboram com os de ALBINO et. al (2019) em que não foi observado nenhuma
144 contaminação do longo do estabelecimento in vitro para sementes de Cariniana estrellensis. O
145 mesmo resultado também foi observado por SANTOS (2016) e ARAGÃO et al., (2017) na
146 germinação in virto de C. legalis.
147 Os tecidos de plantas lenhosas são suscetíveis ao processo de oxidação, resultado direto do
148 estresse e de reações químicas induzidas por polifenol oxidases e outras enzimas. Os compostos
149 fenólicos resultantes reagem com o oxigênio para formar compostos de quinina, geralmente
150 inibidores do crescimento da planta (AHMAD et al. 2013). Entretanto as baixas porcentagens de
151 oxidação, apresentadas em nosso estudo, viabilizam a desinfestação e introdução de segmentos
152 nodais como uma alternativa para uso em cultura de tecidos, considerando que em diversos
153 protocolos de micropropagação de espécies lenhosas, o estabelecimento ocorre com a germinação
154 de sementes.

155 4. CONCLUSÃO

156 O estabelecimento in vitro com segmentos nodais extraídos das minicepas foi eficaz para os
157 tratamentos tempo de desinfestação e concentrações de sacarose. O tempo de 0 minutos e a
158 concentração de 30 mg L -1 apresentaram valores superiores. Novos estudos devem ser realizados a
159 fim de testar as demais etapas da micropropagação para a Cariniana legalis possibilitando a
160 produção de mudas por essa técnica.

161 5. AGRADECIMENTOS
162 À Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Capes pela
163 concessão das bolsas.
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