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GigaCiência, 9, 2020, 1–12

doi: 10.1093/gigascience/giaa071
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Avaliação de protocolos de extração de DNA fecal para

Baixado de https://academic.oup.com/gigascience/article/9/7/giaa071/5870561 por convidado em 27 de janeiro de 2024

estudos metagenômicos
Fangming Yang1,2,†,Jihua Sol3,4,†,Huainian Luo3, Huahui Ren2,4,
HongchengZhou5, Yu Xiang Lin2, Mo Han2,4, BingChen2, Hai Long Liao5,
Susanne Brix6, Junhua Li2,7, HuanmingYang2,8, Karsten Kristiansen e Huanzi 2,4,*

Zhong2,4,*
1Escola de Tecnologia do Futuro, Universidade da Academia Chinesa de Ciências, Pequim 101408, China;
2BGI-Shenzhen, Área Industrial Bei Shan, Yantian, Shenzhen 518083, China;3BGI Europe A/S, COBIS, 2200 Copenhague,
Dinamarca;4Laboratório de Genômica e Biomedicina Molecular, Departamento de Biologia, Universidade de
Copenhague, 2100 Copenhague, Dinamarca;5Banco Nacional de Genes da China, Jinsha Road, Distrito de Dapeng,
Shenzhen 518120, China;6Departamento de Biotecnologia e Biomedicina, Universidade Técnica da Dinamarca, 2.800
Kgs. Lyngby, Dinamarca;7Escola de Biologia e Engenharia Biológica, Universidade de Tecnologia do Sul da China,
Guangzhou 510006, China e8Instituto James D. Watson de Ciências do Genoma, Hangzhou 310058, China

∗Endereço correspondente. Karsten Kristiansen, E-mail:kk@bio.ku.dk http://orcid.org/0000-0002-6024-0917; Huanzi Zhong, e-mail:

zhonghuanzi@genomics.cn
†Contribuinte igual.

Abstrato
Fundo:O sequenciamento metagenômico shotgun melhorou nossa compreensão da microbiota intestinal humana. Vários métodos de extração de
DNA foram comparados para encontrar protocolos que reflitam de forma robusta e precisa as estruturas originais da comunidade microbiana. No
entanto, estas recomendações podem ser ainda mais refinadas considerando as exigências de tempo e custos no tratamento de amostras de
coortes humanas muito grandes. Além disso, o desempenho da extração de DNA fúngico tem sido pouco investigado até agora.Resultados:
Comparamos 6 protocolos de extração de DNA, MagPure Fast Stool DNA KF Kit B, Macherey NagelMTNucleoSpinMT©
RKit de solo, Zymo Research Quick-DNAMTKit de micróbios fecais/do solo, kit MOBIO DNeasy PowerSoil, o
protocolo manual não comercial MetaHIT e o protocolo Q recentemente publicado usando 1 comunidade simulada microbiana (MMC) (contendo 8
cepas bacterianas e 2 fúngicas) e amostras fecais. Todas as amostras foram extraídas manualmente e submetidas ao sequenciamento
metagenômico shotgun. A extração de DNA revelou alta reprodutibilidade em todos os 6 protocolos, mas as eficiências de extração microbiana
variaram. Os resultados da MMC demonstraram que o tamanho das esferas foi um fator determinante para os rendimentos de DNA fúngico e
bacteriano. Em amostras fecais humanas, a extração bacteriana MagPure teve um desempenho tão bom quanto o protocolo Q padronizado, mas
foi mais rápida e econômica. A extração usando o protocolo PowerSoil resultou em uma proporção significativamente maior de bactérias gram-
negativas para gram-positivas do que outros protocolos, o que pode contribuir para diferenças microbianas intestinais relatadas entre adultos
saudáveis.Conclusões:Enfatizamos a importância da seleção do tamanho do grânulo para extração de DNA bacteriano e fúngico. Mais importante
ainda, o desempenho do novo protocolo MP correspondeu ao recomendado

Recebido:13 de janeiro de 2020;Revisado:24 de março de 2020;Aceitaram:11 de junho de 2020

©
CO(s) autor(es) 2020. Publicado pela Oxford University Press. Este é um artigo de Acesso Aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution (
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), que permite reutilização, distribuição e reprodução irrestritas em qualquer meio, desde que a obra original seja
devidamente citada.

1
 2 Avaliação de protocolos de extração de DNA fecal para estudos metagenômicos
o protocolo Q padronizado, mas consumiu menos tempo, foi mais econômico e é recomendado para estudos metagenômicos
intestinais humanos em larga escala.
Palavras-chave:Extração de DNA; microbiota intestinal; amostra fecal humana; sequenciamento metagenômico shotgun
Fundo
O intestino humano adulto abriga comunidades microbianas
altamente complexas e diversas, incluindo bactérias, arquéias, fungos,
vírus e protozoários.1]. Foi demonstrado que a composição da
comunidade bacteriana intestinal exibe associações com múltiplas
doenças humanas, incluindo diabetes tipo 2.2–4], obesidade [5–7] e
câncer colorretal [8,9]. No entanto, muitos estudos mostraram como
diferentes pipelines de processamento experimental afetam os
resultados [10,11] e como especialmente a extração de DNA afeta a
caracterização quantitativa de componentes bacterianos [11–13],
enfatizando a necessidade de um protocolo padronizado e robusto
para traçar o perfil da microbiota intestinal para permitir uma
comparação verdadeira entre os estudos.
Durante as últimas duas décadas, o sequenciamento de amplicon
baseado em PCR, um método flexível e econômico para determinar a
composição microbiana, melhorou muito a nossa compreensão do
microbioma humano. No entanto, considerando os efeitos conhecidos das
condições de PCR nos vieses de amplificação, como primers, regiões
hipervariáveis específicas e temperatura de recozimento [14, 15], o
sequenciamento do amplicon é insuficiente para avaliar com precisão o
desempenho quantitativo dos protocolos de extração de DNA bacteriano.
Em comparação, o sequenciamento metagenômico shotgun é uma
ferramenta mais precisa para analisar a microbiota. Um recente estudo de
referência baseado em sequenciamento shotgun investigou exaustivamente
o desempenho de extração bacteriana de 21 protocolos de extração de DNA
fecal, incluindo kits de extração amplamente utilizados e protocolos não
baseados em kits [11]. Através da avaliação da quantidade e qualidade do
DNA, da diversidade da comunidade e da eficiência de extração de bactérias
gram-positivas e gram-negativas, este estudo propôs o protocolo Q, um
protocolo manual baseado em uma versão modificada do QIAamp da
Qiagen.© RDNA Stool Mini Kit, como protocolo padrão
para extração de DNA bacteriano fecal humano [11]. No entanto, ainda há
espaço para melhorias no estabelecimento de protocolos padronizados
alternativos menos trabalhosos e mais econômicos, especialmente para
estudos de microbioma intestinal em larga escala. Além disso, a avaliação do
desempenho da extração de DNA fúngico em amostras fecais, os atores
importantes muitas vezes negligenciados no microbioma intestinal geral [
16–18], ainda é escasso.
No presente estudo, avaliamos o desempenho de extração de DNA de 6
protocolos em uma comunidade simulada microbiana (MMC) composta por
8 cepas bacterianas e 2 de levedura, e em amostras fecais de 6 indivíduos
humanos saudáveis, utilizando o protocolo Q como método de referência.
Com base nas extrações do MMC, estabelecemos uma correlação positiva
entre o tamanho do grânulo e a eficiência de extração do DNA de levedura,
fornecendo informações para a seleção de protocolos apropriados de
extração de DNA para estudos relacionados a fungos. Com base em
extrações de amostras fecais humanas, descobrimos que um protocolo
baseado em kit, com boa relação custo-benefício e tempo, o protocolo MP,
exibiu desempenho de extração de DNA bacteriano semelhante ao
protocolo Q em relação ao rendimento de DNA, diversidade da comunidade
bacteriana e abundância relativa de gramas. -bactérias positivas e gram-
negativas.
descrição de dados
Protocolos de extração de DNA (Tabela Suplementar S1) em 2 tipos de
amostras biológicas, incluindo MMC de 10 espécies e humano
amostras fecais de 6 indivíduos saudáveis (Fig.1, Métodos). O MMC
(Nº de Catálogo D6300), contendo células de 8 espécies de bactérias
(cada uma representando 12%) e 2 cepas de levedura (cada uma
contribuindo com 2%), foi adquirido da Zymo Research (Fig.1). Entre os
6 protocolos, 3 métodos baseados em kit, incluindo MagPure Fast Stool
DNA KF Kit B (MP, Guangzhou, China), Macherey NagelMT
NucleoSpinMT© RKit de solo (MN, Düren, Alemanha) e Zymo Re-
Baixado de https://academic.oup.com/gigascience/article/9/7/giaa071/5870561 por convidado em 27 de janeiro de 2024
pesquisar Quick-DNAMTO kit Fecal/Soil Microbe (ZYMO, Freiburg,
Alemanha) não foi completamente avaliado nos estudos anteriores [19,
20]. Além disso, também incluímos 3 protocolos usados no estudo de
benchmark [11], incluindo o protocolo Q (Hilden Alemanha), o kit
MOBIO DNeasy PowerSoil (PS, Hilden, Alemanha) e um protocolo
manual não baseado em kit adotado pelo MetaHIT (Metagenomics of
the Human Intestinal Tract Consortium) para avaliar a
reprodutibilidade dos protocolos de extração de DNA . O DNA de todas
as amostras foi extraído manualmente no laboratório da BGI Europe A/
S, COBIS, Copenhagen, Dinamarca. Todos os 6 protocolos utilizados
neste estudo incluíram uma etapa de ruptura mecânica das células por
batimento de esferas (ver procedimento operacional padrão completo
[SOP] de cada protocolo no Arquivo Suplementar F1). Para cada
protocolo, foram geradas 6 réplicas técnicas a partir do MMC e de cada
amostra fecal humana. No total, 233 amostras de DNA qualificadas (36
extrações de MMC e 197 extrações de DNA fecal humano) foram
submetidas ao sequenciamento shotgun e análises quantitativas
adicionais (Tabela Suplementar S2).
Análises
Avaliação do tempo de processamento e rendimento de DNA
Entre os 6 protocolos, 4 protocolos baseados em kit (MP, MN, ZYMO e PS)
foram muito mais eficazes em relação ao tempo de processamento de DNA
do que os 2 protocolos manuais (Q e MetaHIT) (40–100 minutos vs 156–380
minutos por extração) (Tabela Suplementar S1). Em seguida, comparamos os
rendimentos de DNA entre os protocolos. Usando a quantidade de material
de partida fornecida na seção de Métodos, a extração de MMC rendeu em
média 0,77μg de DNA por amostra, enquanto a extração de amostras fecais
humanas rendeu em média 4,31μg DNA por amostra (Tabela Suplementar
S2). O kit PS deu rendimentos de DNA significativamente mais baixos do que
os protocolos MN e ZYMO no MMC. O kit PS também mostrou rendimentos
de DNA significativamente mais baixos do que todos os outros protocolos
em amostras fecais humanas, exceto o protocolo ZYMO (Dunn ajustado por
Benjamin-Hochberg [BH]).P<0,05, Tabela Suplementar S3, Figura
Suplementar S1), em linha com observações anteriores [12,21–23]. Por outro
lado, encontramos desempenhos inconsistentes do protocolo Q na
recuperação de DNA do MMC e de amostras fecais humanas. O Protocolo Q
proporcionou rendimentos de DNA significativamente mais baixos do que os
protocolos MP, MN e ZYMO no MMC (Dunn ajustado por BHP<0,05, Figura
Suplementar S1A), mas mostrou rendimentos de DNA semelhantes em
amostras fecais humanas quando comparado com os protocolos MP, MN e
ZYMO (Dunn ajustado por BHP >0,05, Figura Suplementar S1B).
Avaliação de protocolos de extração de DNA na
comunidade simulada
Primeiro estimamos as abundâncias relativas das cepas bacterianas e
de levedura obtidas usando os 6 protocolos e com base no
 Yang et al. 3

Comunidade simulada microbiana Indivíduos saudáveis Comunidade simulada microbiana

Espécies Tamanho do genoma (Mb) Conteúdo de GC (%) Composição de coloração de Gram

Mistura de bactérias
e células fúngicas
Staphylococcus aureus 2,93 32,7 Google+ 12%
Enterococcus faecalis 3.01 37,5 Google+ 12%
Listeria monocytogenes 2,95 38,0 Google+ 12%
Bacillus subtilis 3,98 43,8 Google+ 12%
Amostras fecais
Lactobacillus fermentum 2.08 52,8 Google+ 12%
6 técnico Salmonella enterica 4,83 52.2 G- 12%
réplicas Escherichia coli 5,47 56,8 G- 12%
6 técnico Pseudomonas aeruginosa 6,77 66,2 G- 12%
réplicas Saccharomyces cerevisiae13.3 38,4 Levedura 2%
Extração de DNA Cryptococcus neoformans18,9 48,2 Levedura 2%

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P Deputado MN ZYMO MetaHIT PS

Protocolos de extração de DNA

Espingarda m etagenômico Protocolo Abreviação Diâmetro do cordão

sequência ncing
Protocolo Q* P 0,1 mm

MagPure Fast Stool DNA KF Kit B Deputado 0,1 mm

Comunidade simulada Gene Integrado Solo Macherey Nagel™ NucleoSpin™ Minnesota 0,6-0,8mm
genomas de referência Catálogo (IGC)
Zymo Research Quick-DNA™
Micróbio Fecal/Solo ZIMO 0,1 e 0,5 mm

Protocolo MetaHIT MetaHIT 0,1 mm

Perfil taxonômico Perfil genético MOBIO DNeasy PowerSoil PS Contas irregulares

Figura 1:Fluxo de trabalho esquemático do desenho do estudo. Comparação de 6 protocolos de extração de DNA usando uma comunidade simulada microbiana (MMC) e amostras fecais de 6 indivíduos por
meio de sequenciamento metagenômico shotgun. As tabelas apresentam informações de cepas do MMC (8 cepas bacterianas e 2 de levedura) (canto superior direito) e 6 protocolos de extração de DNA
(canto inferior direito). G+: Gram-positivo; G−: gram negativo.

genomas de referência do MMC (ver detalhes na seção Métodos).
Focando nas 8 cepas bacterianas, descobrimos que, exceto para o
protocolo MetaHIT, 6 réplicas de cada um dos 5 protocolos restantes
tenderam a subestimar consistentemente as bactérias gram-positivas,
incluindoStaphylococcus aureus,Enterococcus faecalis,Listeria
monocytogenes, eBacillus subtilismas superestimou todos os 3
membros gram-negativos (Salmonella entérica,Escherichia coli, e
Pseudomonas aeruginosa) (Figo.2A). Ao combinar os resultados de
todas as 8 cepas bacterianas, observamos que o protocolo MP mostrou
uma precisão média relativamente maior nas estimativas de
abundância bacteriana do que os outros protocolos (erro médio de
estimativa [MEE]: 0,22, Fig.2C), seguido do protocolo MetaHIT e
protocolo MN (MEE<0,5, fig.2C). Todos os 6 protocolos forneceram
recuperação quase completa do genoma das 8 cepas bacterianas
(cobertura do genoma, média±DP: 98,90%±1,5%, fig.2E). No entanto, a
recuperação dos 2 genomas de levedura (Saccharomyces cerevisiaee
Cryptococcus neoformans) foi muito inferior ao dos genomas
bacterianos e variou consideravelmente entre os protocolos (cobertura
do genoma, média±DP: 62,11%±31,52%, fig.2F). É digno de nota que 2
protocolos usando esferas relativamente grandes (MN com esferas de
0,6 a 0,8 mm de diâmetro e ZYMO com esferas de 0,5 mm de diâmetro)
garantiram maiores abundâncias relativas e coberturas genômicas das
2 cepas de levedura do que protocolos com esferas de 0,1 mm de
diâmetro (MP, MetaHIT, e Q) (Fig.2B, D e F). Além disso, também
observamos variabilidades intra-protocolo muito baixas no
desempenho na estimativa da abundância microbiana (Fig.2A e B) e
recuperação do genoma (Fig.2E e F), indicando alta reprodutibilidade
de cada protocolo.
Perguntando se havia uma correlação positiva robusta entre o tamanho do
grânulo e o rendimento de DNA fúngico, posteriormente conduzimos um
experimento de extração dependente do tamanho do grânulo. Resumidamente,
testamos o protocolo MP usando 3 tipos de condições de cordão (500μL de
- 0,1mm; 250μL de-0,1 mm mais 250μL de-0,6–0,8mm; 500 μL de-0,6–
0,8 mm) em culturas de células deE. coliK-12 MG1655 (E. coli MG1655),
S. cerevisiaeBY4741, e uma mistura deE. coliMG1655 e
S. cerevisiaeBY4741 (2:1, v/v), com 10 réplicas de extração por condição. Ao
quantificar e comparar os rendimentos de DNA entre os grupos (Tabela
Suplementar S4), descobrimos que o protocolo MP usando esferas de 0,6-0,8
mm de diâmetro, isoladamente ou em combinação com esferas de 0,1 mm
de diâmetro, proporcionou rendimentos de DNA significativamente maiores.
S. cerevisiaedo que o protocolo usando esferas de 0,1 mm de diâmetro
(teste de soma de postos de Wilcoxon,P<0,05, Figura Suplementar S2). Por
outro lado, o protocolo utilizando esferas de 0,1 mm de diâmetro mostrou
rendimentos de DNA significativamente maiores deE. colido que o protocolo
contendo apenas esferas de 0,6–0,8 mm de diâmetro ou a combinação
destas esferas com esferas de 0,1 mm de diâmetro (teste de soma de postos
de Wilcoxon,P<0,05, Figura Suplementar S2), indicando a dificuldade de
extração simultânea imparcial de DNA bacteriano e fúngico.
Avaliação dos protocolos de extração de DNA em amostras fecais
humanas
Em seguida, avaliamos o desempenho intra e interprotocolo em amostras
fecais humanas. A análise de correlação de postos de Spearman revelou
altos valores de coeficiente entre réplicas técnicas em
 4 Avaliação de protocolos de extração de DNA fecal para estudos metagenômicos

(A) (B)
0,03
0h30
Abundância de 8 bactérias

Abundância de 2 leveduras
0,20 0,02

0,12 0,01
0,10

0,00 0,00
Staphylococcus Enterococcus Listeria Bacilo Lactobacilos Salmonela Escherichia Pseudomonas Saccharomyces Cryptococcus
Espécies
áureo faecalis monocitogenes sutilis fermento entérica coli aeruginosa cerevisiae neoformans
Coloração de Gram Google+ Google+ Google+ Google+ Google+ G- G- G-
GC% 32,7 37,5 38 43,8 52,8 52.2 56,8 66,2 38,4 48,2

(C) (D) (E) (F)

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1,0 1,0 1,00 1,00
Erro de estimativa de 8 bactérias

Erro de estimativa de 2 leveduras

Cobertura de 8 bactérias

Cobertura de 2 leveduras
0,5 0,5 0,75 0,75

0,0 0,0 0,50 0,50

−0,5 −0,5 0,25 0,25

− 1,0 − 1,0 0,00 0,00

Deputado

MetaHIT

Minnesota

ZIMO

PS

Deputado

MetaHIT

Minnesota

ZIMO

PS

Deputado

MetaHIT

Minnesota

ZIMO

PS

Deputado

MetaHIT

Minnesota

ZIMO

PS
Figura 2:Desempenho dos 6 diferentes protocolos de extração de DNA em um MMC.A, B,Gráfico de barras mostrando a abundância relativa média observada de 8 bactérias (A) e 2
leveduras (B) usando os 6 protocolos de extração.CD,Erro de estimativa (EE) de 8 bactérias (C) e 2 leveduras (D) em todas as repetições técnicas de cada protocolo.E, F,Cobertura do
genoma de 8 bactérias (E) e 2 leveduras (F) utilizando os 6 protocolos de extração. A cobertura do genoma é calculada como a proporção da referência do genoma coberta por≥1 li. As
barras de erro mostram o erro padrão da média em todos os painéis.

ambos os genes (Fig. Suplementar S3A, média de Spearmanρ= 0,875) e espécies individuais entre protocolos, limitando nossas análises a 210
nível de espécie (Fig.3A, Spearman médioρ= 0,964). Da mesma forma, espécies comuns de≥Ocorrência de 20% entre amostras (ver detalhes
as dissimilaridades médias de Bray-Curtis entre as replicações na seção Métodos). É digno de nota que 72,38 (152 de 210) diferiram
intraprotocolo foram de 0,142 no nível do gene (Fig. Suplementar S3B) significativamente em abundância relativa entre≥2 protocolos (teste de
e 0,046 no nível da espécie (Fig.3B). Estes resultados sugerem alta Kruskal-Wallis, ajustado por BHP<0,05, Tabela Suplementar S6). De
reprodutibilidade intraprotocolo na quantificação da abundância acordo com o estudo de referência [11], as abundâncias relativas de
relativa de genes e espécies microbianas intestinais humanas. múltiplas espécies gram-positivas foram significativamente maiores
Não houve diferenças significativas na riqueza microbiana entre nas amostras extraídas com Q do que aquelas extraídas usando o
protocolos em nível de gene e de espécie (teste de Kruskal-Wallis,P > protocolo PS, incluindo espécies dos gênerosBifidobactéria, Collinsella,
0,05, Figura Suplementar S4A e B, Tabela Suplementar S5). No entanto, Streptococcus,eParvimonas(Figo.4C, B Dunn ajustadoP<0,05). Por
observamos uma diversidade microbiana significativamente menor em outro lado, as abundâncias relativas de múltiplas espécies gram-
amostras extraídas pelo protocolo Q em comparação com os negativas anotadas nos gênerosBacteroides,Prevotella,eHaemophilus
protocolos MN e ZYMO, os dois grandes protocolos baseados em foram consistentemente e significativamente menores nas amostras
esferas (BHadjusted DunnP<0,05, Figura Suplementar S4C e D, Tabela extraídas com Q e MP em comparação com aquelas extraídas usando
Suplementar S5). As análises interprotocolos demonstraram ainda os outros protocolos (Fig.4B, Dunn ajustado por BHP<0,05).
valores menores dos coeficientes de classificação de Spearman (Fig.
Suplementar S3C,3C)Fig.e maiores dissimilaridades microbianas de Bray- Além disso, descobrimos que as amostras extraídas de PS exibiram
Curtis (Fig. Suplementar S3D, Fig.3D) de perfis microbianos entre abundâncias significativamente menores de espécies gram-positivas,
amostras extraídas pelo PS e protocolo Q em comparação com aqueles mas maiores abundâncias de espécies gram-negativas do que as
entre outros protocolos e protocolo Q. Por outro lado, amostras extraídas usando os outros 5 protocolos (Fig. Suplementar
independentemente dos protocolos de extração de DNA, conjuntos de S5, Dunn ajustado por BHP<0,05). Ao traçar as distribuições de
dados do mesmo indivíduo foram agrupados em uma análise de abundância de espécies intestinais abundantes selecionadas, incluindo
componentes principais (PCA) enredo (fig.3E) e mostraram maiores 6 espécies gram-positivas (Bifidobacterium adolescentis,
dissimilaridades entre si do que entre replicações intra ou Bifidobacterium longum, Faecalibacterium prausnitzii,Collinsella
interprotocolo (Fig.3F). Isto está de acordo com a noção anterior de intestinalis,Streptococcus anginoso, eStreptococcus cristatus) e 6
que a variação interindividual excede a variação resultante de espécies gram-negativas (Alistipes putredinis,Bacteroides coprocola,
diferentes protocolos [13,22,24–26]. Bacteroides dorei, Bacteroides dorei/vulgatus,Bacteroides ovatus, e
Com base na análise de agrupamento, revelamos ainda maiores Prevotella copri), descobrimos que os vieses quantitativos relacionados
diferenças na composição das espécies entre amostras extraídas de PS às espécies entre o PS e os outros protocolos eram consistentes entre
e amostras extraídas usando os outros protocolos (Fig.4A). Além disso, todos os indivíduos (Figura Suplementar S6). Replicamos ainda um
encontramos composição de espécies comparável comparando enriquecimento consistente e significativo de 52 espécies comparando
amostras extraídas pelos protocolos MP e Q, e entre amostras conjuntos de dados metagenômicos de amostras extraídas de PS e os
extraídas usando os protocolos MN e ZYMO, respectivamente (Fig.4A). 3 protocolos baseados no kit Qiagen do estudo de benchmark (Fig.
Avaliamos diferenças no desempenho de quantificação de Suplementar S7, BHadjusted DunnP<0,05) [11].
 Yang et al. 5

(A) (B) (C) (D)

Réplicas técnicas Réplicas técnicas

Dissimilaridade de Bray-Curtis

Dissimilaridade de Bray-Curtis
versus protocolo Q versus protocolo Q

1,00 0,5 1,00 0,5

Rho de lanceiro

Rho de lanceiro
0,4 0,4
0,95 0,95
0,3 0,3

0,2 0,2
0,90 0,90
0,1 0,1

0,85 0,0 0,85 0,0

P

Deputado

Minnesota

ZIMO

MetaHIT

PS

Deputado

Minnesota

ZIMO

MetaHIT

PS

Deputado

Minnesota

ZIMO

MetaHIT

PS

Deputado

Minnesota

ZIMO

MetaHIT

PS
(E) (F)

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20
versus indivíduo A versus indivíduo B versus indivíduo C versus indivíduo D vs indivíduo E versus indivíduo F
Dissimilaridade de Bray-Curtis

0,5
10
0,4
PC2(12,67%)

0 0,3
Protocolo Individual
Deputado A
0,2
− 10 MetaHIT
Minnesota
B
C
ZIMO D 0,1
P E

− 20 PS F
0,0
− 20 − 10 0 10 BCDEF ACDEF ABDEF ABCEF ABCDF ABCDE
PC1(14,93%)

Figura 3:Consistência intra e interprotocolo na quantificação de espécies utilizando amostras fecais humanas.A, B,Lanceiroρ(A) e dissimilaridades de Bray-Curtis (B) entre 6 réplicas
técnicas dentro de cada protocolo.CD,Lanceiroρ(C) e dissimilaridades de Bray-Curtis (D) entre o protocolo Q e os outros 5 protocolos.E,Análise de componentes principais (PCA) baseada no
perfil das espécies. As cores indicam diferentes protocolos: verde claro, protocolo Q; verde, protocolo MP; azul, protocolo MN; roxo, protocolo ZYMO; laranja, protocolo MetaHIT; amarelo,
protocolo PS. Diferentes formas indicam amostras de DNA de diferentes indivíduos.F,Box plots mostrando as diferenças interindividuais de Bray-Curtis usando o mesmo protocolo. Cada
painel indica diferenças de Bray-Curtis entre amostras de um determinado indivíduo e de outros. As caixas representam o intervalo entre o primeiro e o terceiro quartil e a linha vertical
dentro da caixa representa a mediana.

Nos atuais conjuntos de dados metagenômicos shotgun, detectamos adultos (Fig.5D). Comparações mais detalhadas de amostras de diferentes
apenas níveis muito baixos de espécies de fungos (0,03-2,32%) em amostras países precisam ser examinadas usando protocolos idênticos de extração e
fecais de indivíduos C e F usando MetaPhlAn2 [27] (Tabela Suplementar S7). sequenciamento para determinar até que ponto essas diferenças refletem
No entanto, através da extração de amostras fecais humanas, não verdadeiramente as diferenças dependentes do país/etnia. Estas
observamos a mesma relação clara entre o tamanho do grânulo e o observações enfatizam que devem ser tomadas precauções na interpretação
rendimento de extração de DNA fúngico como observado usando o MMC, dos resultados microbianos intestinais observados utilizando diferentes
ressaltando ainda mais as dificuldades na escolha de um protocolo de métodos de extracção de ADN, e que são necessários protocolos de
extração que forneça uma representação robusta e precisa tanto de extracção padronizados para uma comparação fiável de amostras de
bactérias quanto de DNA fúngico. diferentes grupos étnicos.

Vieses na extração de DNA podem contribuir para assinaturas Discussão

específicas de cada país relatadas
Neste estudo, 6 protocolos de extração de DNA foram avaliados usando
Para investigar até que ponto as diferenças entre o desempenho dos protocolos amostras de MMC e fecais humanas submetidas ao sequenciamento
de extração de DNA podem influenciar os resultados relatados nas assinaturas metagenômico shotgun. Experimentos usando MMC revelaram que
microbianas intestinais específicas do país, comparamos conjuntos de dados protocolos com tamanho de esfera menor produziram maior recuperação
metagenômicos shotgun disponíveis de adultos chineses saudáveis (n = 60) e de DNA bacteriano, enquanto protocolos com tamanho de esfera maior
dinamarqueses (n = 100) (protocolo MetaHIT ) [28] para adultos saudáveis dos produziram maior recuperação de DNA fúngico. No entanto, este último não
EUA (n = 167) do Human Microbiome Project (HMP, protocolo PS) [29]. As amostras pôde ser replicado utilizando amostras fecais humanas. A avaliação de
dos 3 países foram claramente separadas umas das outras nos gráficos de análise amostras fecais humanas mostrou uma eficiência de extração variada de
de coordenadas principais (PCoA) (Fig.5A). Ainda assim, notamos que os perfis de espécies gram-positivas e gram-negativas entre os protocolos,
espécies de adultos chineses e dinamarqueses, cujas amostras fecais foram especialmente entre o PS e os demais protocolos. Propomos que tais
extraídas usando o protocolo MetaHIT, exibiram menos dissimilaridade de Bray- diferenças dependentes do protocolo possam contribuir para as diferenças
Curtis do que a observada entre adultos norte-americanos (Fig.5B). Além disso, microbianas intestinais relatadas entre coortes de diferentes países e de
descobrimos que as amostras dos EUA extraídas com PS exibiram abundâncias diferentes etnias. Relatamos que o protocolo MP, um método econômico e
significativamente maiores de múltiplas espécies gram-negativas e menores de tempo, em comparação com os outros protocolos avaliados neste
abundâncias de espécies gram-positivas do que aquelas de amostras extraídas estudo, exibiu um desempenho de extração na caracterização e
pelo MetaHIText de adultos chineses e dinamarqueses (BHadjusted DunnP<0,05, quantificação de comunidades bacterianas semelhante ao protocolo padrão
fig.5C). Tais diferenças quantitativas podem contribuir para uma proporção recentemente proposto Q [11]. Portanto, propomos o protocolo MP como
significativamente maior de Bacteroidetes para Firmicutes em adultos dos EUA, em um protocolo padrão robusto e alternativo para extração de DNA fecal
comparação com adultos chineses e dinamarqueses. humano em futuros estudos metagenômicos em larga escala. No entanto,
enfatizamos
 6 Avaliação de protocolos de extração de DNA fecal para estudos metagenômicos

(A) (C)

(B)

Baixado de https://academic.oup.com/gigascience/article/9/7/giaa071/5870561 por convidado em 27 de janeiro de 2024

Figura 4:Diferenças dependentes do protocolo na abundância relativa de espécies bacterianas intestinais.A,Agrupamento de amostras extraídas pelos diferentes protocolos com base nas
dissimilaridades de Bray-Curtis em nível de espécie.B, C,Mapa de calor mostrando espécies gram-negativas (B) e gram-positivas (C) que diferem significativamente em abundância entre o
protocolo Q e os outros protocolos. A chave de cores indica a classificação média da abundância relativa de cada espécie entre as comparações no teste de Kruskal-Wallis. As comparações
pareadas pelo teste de Dunn foram seguidas pelo teste de Kruskal-Wallis.∗Dunn ajustado por BHP<0,05;∗∗Dunn ajustado por BHP<0,01;∗∗∗Dunn ajustado por BHP<0,001. A barra colorida
indica a atribuição do filo de cada espécie: laranja, Actinobacteria; amarelo, Firmicutes; roxo, Bacteroidetes; verde, Proteobactérias; rosa, Fusobactérias. Uma lista de todas as espécies que
diferem significativamente em abundância entre os 6 protocolos é apresentada na Tabela Suplementar S6.

tamanho que o desempenho dos protocolos de extração testados em
amostras fecais no presente estudo precisa ser avaliado para uso em
outras amostras humanas (por exemplo, saliva e pele) porque a
composição microbiana, bem como as propriedades físicas e químicas
de tais amostras , é bastante distinto daqueles de
amostras fecais. Futuros projetos de metagenômica em grande escala
precisarão usar extração automatizada de DNA. Assim, uma limitação
deste estudo é que o desempenho do kit MagPure em relação a um
sistema de extração robotizado não foi avaliado, sendo necessários
esforços adicionais para avaliar a estabilidade e a consistência.
 Yang et al. 7

(A) PCoA baseado na dissimilaridade de (B) Dissimilaridade de espécies de Bray-Curtis (D)Proporção de Bacteroidetes para Firmicutes
perfil de espécies de Bray-Curtis perfil entre coortes
1,25
0,4 *** ***

Razão Bacteroidetes/Firmicutes (razão log2)

*** ***

*** ***
1,00 8

Diferenças de Bray-Curtis
0,2
pcoa2(6,49%)

0,75
4
0,50
0,0
0
0,25

Baixado de https://academic.oup.com/gigascience/article/9/7/giaa071/5870561 por convidado em 27 de janeiro de 2024

−0,2
0,00
−0,2 0,0 0,2 0,4 MetaHIT-CHN MetaHIT-DAN MetaHIT-CHN MetaHIT-CHN MetaHIT-DAN PS-EUA
pcoa1(10,08%) contra contra contra

PS-EUA PS-EUA MetaHIT-DAN

(C)
Coloração de Gram
Filo
Coloração de Gram
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
* * * MetaHIT-CHN
* *
*
* * * * * * *
* * * * *
* * * * * * *
* * *
* * * * * *
* * *
* * * * * * *
* * * * * *
* * * * * * *
* * * * * *
*
*
* * * *
* *
*
* * *
* * * * * Gram-positivo
Gram-negativo
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * MetaHIT-DAN
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
Filo
PS-EUA Firmicutes
Bacteroides
Ruminococcus champanellensis
Faecalibacterium prausnitzii
hidrogenotrófica
Eubacterium cylindroides Blautia
[Clostridium] difficile
Butyrivibrio crossotus
Clostridium saccharolyticum
[Ruminococcus] obeum
Streptococcus salivarius
Blautia hansenii
Coprococcus catus
Anaerotruncus colihominis
Clostridium leptum
Eubacterium rectal
Eubacterium siraeum
[Ruminococcus] gnavus
Ruminococcus bromii
Clostridium bolteae
Eubacterium ventriosum
Torques [Ruminococcus]
Clostridium symbiosum
Roseburia intestinalis
Eubacterium eligens
Holdemania filiformis
Coprococcus eutactus
Ruminococcus lactaris
Dorea formicigenerans
Roseburia inulinivorans
Dorea longicatena
Coprococo vem
Eubacterium biforme
Eubacterium hallii
Bacteroides ovatus
Bacteroides xylanisolvens
Bacteroides dorei/vulgatus
Bacteroides finegoldii
Bacteroides dorei
Fluxo Bacteroides
Alistipes shahii
Bacteroides thetaiotaomicron
Alistipes putredinis
Bacteroides stercoris
Bacteroides fragilis
Bacteroides caccae
Parabacteroides distasonis
Bacteroides uniformis
Bacteroides intestinalis
Odoribacter splanchnicus
Bacteroides coprophilus
Bacteroides clarus
[Bacteroides] pectinófilo
Parabacteroides merdae
Bacteroides coprocola
Bacteroides plebeius
Prevotella bivia
Prevotella copri
Classificação ruim

100

150

200

250
Figura 5:Ligações entre assinaturas microbianas intestinais específicas de cada país e os protocolos correspondentes de extração de DNA fecal.A,Análise de coordenadas principais (PCoA) baseada nas
dissimilaridades de Bray-Curtis em nível de espécie entre as 3 coortes. Vermelho, adultos chineses (protocolo MetaHIT); azul, adultos dinamarqueses (protocolo MetaHIT); verde, adultos dos EUA (protocolo
PS). B, Comparação das dissimilaridades de Bray-Curtis em nível de espécie entre as 3 coortes. Adultos cinzentos, chineses vs. norte-americanos; adultos pardos, dinamarqueses vs. norte-americanos; laranja,
adultos chineses vs dinamarqueses.C,Mapa de calor mostrando as espécies gram-negativas significativamente diferentes de Bacteroidetes e espécies gram-positivas de Firmicutes entre adultos chineses,
dinamarqueses e norte-americanos. A chave de cores indica a classificação média da abundância relativa de cada espécie entre as comparações no teste de Kruskal-Wallis. D, Razão Bacteroidetes para
Firmicutes (relação B/F) entre adultos chineses, dinamarqueses e norte-americanos. Eixo Y indica log2-valores transformados da relação B/F. ParaB—D,comparações pareadas pelo teste de Dunn foram
realizadas após o teste de Kruskal-Wallis.∗Dunn ajustado por BHP<0,05;∗∗Dunn ajustado por BHP<0,01;∗∗∗Dunn ajustado por BHP <0,001.

Tendência entre extração de DNA manual e automatizada usando o kit eficiência de extração de DNA fúngico usando amostras fecais humanas
MagPure. devido aos baixos níveis de detecção de táxons fúngicos dos 6 voluntários
Com uma composição de espécies conhecida, o MMC permitiu investigar nos atuais conjuntos de dados metagenômicos shotgun. Foi demonstrado
a eficiência de extração de DNA de bactérias e fungos. Todos os 6 protocolos que o número de fungos nas fezes humanas é muito menor do que o de
deste estudo incluíram uma etapa de batimento de esferas, o método de lise bactérias.1,33–36], com 105–106células fúngicas por grama de fezes em
mecânica mais eficaz [13,24,30–32], com diferentes tamanhos e comparação com 1011células bacterianas por grama [36]. Além disso, o
composições de miçangas. Independentemente das diferenças técnicas tamanho do genoma dos fungos é muito maior que o das bactérias. Assim,
entre os protocolos, descobrimos que 2 protocolos (MN e ZYMO) com seria necessária uma quantidade muito maior de dados de sequenciamento
esferas grandes (0,5–0,8 mm) apresentaram desempenho significativamente do que os gerados no presente estudo para avaliar o desempenho da
melhor na recuperação de genomas fúngicos e abundâncias teóricas do que extração de micobioma fecal entre protocolos. Abordagens baseadas em
outros protocolos com esferas de 0,1 mm de diâmetro. É digno de nota que amplicons (baseadas em RNA ribossômico 18S ou baseadas em espaçadores
nossos experimentos em uma comunidade simulada deE. coliMG1655,S. transcritos internos) ainda parecem ser mais econômicas e apropriadas para
cerevisiaePOR4741,e uma simples mistura deE. coliMG1655 eS. cerevisiae avaliar e interpretar o micobioma em amostras fecais humanas, e essas
BY4741 mostrou que um método baseado em contas grandes (-0,6–0,8 mm) abordagens baseadas em amplicons foram aplicadas com sucesso em vários
garantiu alta eficiência de extração de levedura, mas simultaneamente estudos [35,37,38].
sacrificou a eficiência de extração de bactérias. Portanto, métodos de Outra observação foi a inconsistência em relação à eficiência de
extração com combinações de esferas de tamanhos diferentes parecem extração de espécies gram-positivas e gram-negativas utilizando MMC
justificados para estudos futuros com o objetivo de alcançar uma e amostras fecais humanas extraídas pelos mesmos protocolos. Por
representação precisa e confiável de comunidades microbianas com exemplo, exceto o MetaHIT, todos os outros protocolos, incluindo o
bactérias e fungos, mesmo que as combinações de tamanhos de esferas protocolo Q, subestimaram a abundância relativa de 4 cepas gram-
pequenos e grandes usadas no presente estudo não tenham sido capazes positivas (S. aureus,E.faecalis,L. monocytogenes, eB. subtilis) e
de melhorar a recuperação simultânea de DNA bacteriano e fúngico. Não superestimou a abundância relativa das 3 cepas gram-negativas
conseguimos avaliar o testadas (S. entérica,E. coli,
 8 Avaliação de protocolos de extração de DNA fecal para estudos metagenômicos
eP. aeruginosa) nas amostras MMC. Da mesma forma, o estudo de
referência [11] mostraram que, independentemente de o DNA ter sido
extraído de uma comunidade simulada ou de uma amostra fecal com
uma comunidade simulada, o protocolo Q subestimou a abundância
de bactérias gram-positivas, incluindoClostridium perfringens,
Clostridioides difficile, eLactobacillus plantarume superestimou a
abundância de 3 membros gram-negativos, incluindo
S. entérica,Prevotella melaninogenica, eFusobacterium nucleatum. Por outro
lado, amostras de DNA fecal humano extraídas pelo protocolo Q
apresentaram melhor desempenho na quantificação de espécies
grampositivas do que os demais protocolos. Além disso, as comunidades
simuladas de ambos os estudos eram compostas por bactérias patogénicas
humanas ou bactérias isoladas de um ambiente não humano, que não
reflectem a composição microbiana do intestino humano. Além disso, essas
misturas simples de bactérias e fungos não contêm outros compostos nas
fezes, como ácidos húmicos, polissacarídeos, ácidos biliares e lipídios, o que
pode potencialmente inibir a atividade de enzimas usadas para subsequente
construção e sequenciamento de bibliotecas baseadas em PCR.39]. Assim, o
desempenho de extração baseado em MMC pode não refletir de forma
precisa e imparcial o desempenho de extração em amostras fecais
humanas. Finalmente, para ambos os estudos, o desempenho quantitativo
na extração do microbioma intestinal humano entre protocolos foi
interpretado com base nas abundâncias bacterianas relativas, mas não nas
abundâncias absolutas, que medimos no MMC. Ainda são necessários
esforços adicionais para quantificar abundâncias microbianas absolutas em
materiais simulados fecais com uma mistura de micróbios intestinais
abundantes e compostos fecais adicionais, e em amostras fecais reais para
avaliar com precisão os vieses de quantificação de diferentes protocolos.
Implicações potenciais
Os protocolos de extração de DNA afetam o resultado dos estudos
metagenômicos, e protocolos padronizados, validados e com boa
relação custo-benefício são necessários para projetos metagenômicos
em grande escala. Comparamos 6 protocolos de extração de DNA
comumente usados usando 1 MMC e amostras fecais. A avaliação dos
resultados com base no sequenciamento metagenômico shotgun
revelou a importância dos tamanhos das esferas para a extração de
DNA bacteriano e fúngico. As eficiências de extração microbiana
variaram entre os protocolos. O desempenho do novo MagPure Fast
Stool DNA KF Kit B correspondeu ao do protocolo padronizado
recomendado Q, mas consumiu menos tempo, foi mais econômico e é
recomendado para estudos em larga escala.
Métodos
Coleta e preparação de amostras
Comunidade simulada microbiana
O padrão de comunidade microbiana ZymoBIOMICS, número de
catálogo D6300 (Microbial Mock Community, MMC), foi obtido da Zymo
Research. O MMC contém 8 bactérias com a mesma abundância:
Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes,
Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Lactobacillus fermentum,
Escherichia coli,ePseudomonas aeruginosae 2 espécies de leveduras,
também com a mesma abundância:Saccharomyces cerevisiaee
Cryptococcus neoformans. A abundância relativa teórica de cada cepa
bacteriana é de 12% e a de cada cepa fúngica de 2% (Fig.1).
Coleta de amostras fecais humanas
Seis voluntários saudáveis, incluindo uma criança de 4 anos e 5 adultos
(32±3 anos) foram recrutados entre funcionários da BGI Europe ou
familiares, Copenhague, Dinamarca (ver informações detalhadas na Tabela
Suplementar 2). Todos os voluntários ou o responsável forneceram
consentimento informado para fornecer amostras fecais para este estudo.
Aproximadamente 10 a 15 gramas de fezes foram coletadas recentemente
pelos participantes em casa, usando um tubo cônico estéril de 50 mL, e
cópias de instruções impressas foram usadas para orientar os voluntários
adultos ou o responsável legal da criança na autocoleta de amostras fecais.
Após a coleta, as amostras foram armazenadas a -20◦C e transportado ao
laboratório no segundo dia com bolsas de gelo em 40 minutos. Em seguida,
cada amostra foi diluída com 1–1,5 volumes (15 mL) de tampão Tris-EDTA
(Tris 10 mM pH 8,0 e EDTA 1 mM, Thermo Fisher Scientific), homogeneizada
e dividida em 36 alíquotas (500 μL por alíquota). Todas as alíquotas de fezes
foram armazenadas em
Baixado de https://academic.oup.com/gigascience/article/9/7/giaa071/5870561 por convidado em 27 de janeiro de 2024
− 80◦C antes da extração de DNA.
Extração de DNA, preparação de biblioteca e sequenciamento
Todas as experiências de extracção de ADN que examinaram os 6 protocolos
diferentes foram realizadas manualmente pelo mesmo técnico no
laboratório BGI Europe, Copenhaga, Dinamarca, e as experiências de
tamanho de esferas foram realizadas no BGI-Shenzhen. A extração de DNA
foi conduzida de acordo com as instruções ou protocolos fornecidos pelo
fabricante (ver POP completo de cada protocolo no Arquivo Suplementar F1).
Para amostras fecais comunitárias simuladas e humanas, foram geradas 6
réplicas técnicas usando cada protocolo. A concentração de DNA foi
detectada pelo Qubit© R
Fluorômetro 2.0 (Invitrogen). Considerando os diferentes volumes
iniciais utilizados em cada protocolo, normalizamos o rendimento do
DNA para o volume do material inicial.
Todas as 36 amostras de DNA do MMC foram extraídas com sucesso
pelos 6 protocolos de extração, e a construção e sequenciamento da
biblioteca foram bem-sucedidas para todas as 36 amostras de DNA. Seis
amostras fecais extraídas pelo protocolo PS (indivíduo E) e 13 amostras
fecais extraídas pelo protocolo ZYMO (6 do indivíduo A, 6 do indivíduo C e 1
do indivíduo F) que renderam<500 ng e que falharam na preparação da
biblioteca foram removidos do processamento adicional. A preparação da
biblioteca e o sequenciamento metagenômico shotgun foram realizados na
plataforma BGISEQ-500 usando o modo paired-end 100 [40]. Leituras de
baixa qualidade e leituras derivadas de humanos foram filtradas para gerar
leituras não humanas de alta qualidade, conforme descrito anteriormente [
40], resultando em uma proporção média de leituras não humanas de alta
qualidade de 94,33% por amostra (incluindo MMC e amostras fecais
humanas, coeficiente de variação [CV] = 6,63%) (Tabela Suplementar S2). No
total, 233 conjuntos de dados metagenômicos shotgun de 36 extrações de
DNA MMC e 197 extrações de DNA fecal humano foram gerados e avaliados
quanto ao desempenho dos 6 protocolos (Tabela Suplementar S2).
Comparação de kits de extração de DNA usando
comunidades simuladas
Os 10 genomas de referência microbianos do MMC estão disponíveis
online (ver Disponibilidade de Dados e Materiais de Apoio). Para
minimizar os impactos potenciais da profundidade de sequenciamento
na avaliação quantitativa e qualitativa da composição do MMC,
reduzimos aleatoriamente cada amostra para 20 milhões de leituras
pareadas de alta qualidade e alinhamos as leituras aos genomas de
referência usando SOAP 2.22 (m = 0, x = 1000 , r = 1, l = 30, M =
4, S,p=6, v = 5, S, c = 0,95).
Para todos os protocolos, a proporção total de mapeamento,
definida como a razão entre o número total de leituras mapeadas e o
número total de leituras de alta qualidade, atingiu 98,32% em média
(CV = 0,27%). A abundância relativa de cada cepa foi calculada como a
razão entre o número de leituras mapeadas no genoma de referência
e o número total de leituras mapeadas em todos

genomas de referência. A cobertura do genoma de cada cepa foi
calculada como a proporção da referência do genoma coberta por ≥1
leitura (cobertura SOAP 2.7.7). Para cada espécie, o erro de estimativa
(EE) foi utilizado para representar o viés de extração, definido como
Abundância relativa observada - Abundância relativa teórica
EE =
Abundância relativa teórica
Para cada protocolo, o MEE foi proposto para representar a
precisão da extração, ou seja,
MEE = |EE|,
onde |EE|é o valor absoluto médio do EE para todas as espécies
em todas as repetições técnicas de cada protocolo.
Um experimento de extração de DNA de segunda rodada foi realizado
para validar a correlação positiva entre tamanhos de esferas de protocolos
de extração de DNA e rendimento de DNA de levedura. Três tipos de
condições de cordão foram avaliados, incluindo (i) 500μL de-Contas de 0,1
mm, (ii) 250μL de-Contas de 0,1 mm misturadas com 250μL de-Grânulos de
0,6–0,8 mm e (iii) 500μL de-Grânulos de 0,6–0,8 mm baseados no Mag-Pure
Fast Stool DNA KF Kit B (MP). Três culturas celulares simples foram
preparadas para teste de extração, cada uma em um volume de 1 mL,
incluindo (i) apenasE. coliK-12 MG1655 (E. coliMG1655), (ii)S. cerevisiae
BY4741, e (iii) uma combinação de dois terços do volume de
E. coliMG1655 e um terço do volume deS. cerevisiaePOR4741. As
extrações foram realizadas com 10 repetições técnicas para cada tipo
de condição de pérola em cada tipo de amostra. No total, os
rendimentos de DNA de 90 extrações foram medidos e comparados
entre as diferentes condições das esferas (Tabela Suplementar S4).
Comparação de kits de extração de DNA usando amostras fecais
humanas
Perfil taxonômico de dados de sequenciamento metagenômico shotgun de
amostras fecais humanas
Leituras não humanas e de alta qualidade foram primeiramente
alinhadas ao Catálogo Integrado de Genes (IGC) (SOAP 2,22 m = 0, x =
1000, r = 2, l = 30, M = 4, S,p=6, v = 5, S, c = 0,95) [28]. Na média,
79,67% (CV = 2,03%) leituras de alta qualidade poderiam ser alinhadas a≥1
gene do IGC. Leituras mapeadas exclusivamente foram então reduzidas
para 20 milhões de pares para cada amostra para calcular a abundância
relativa do gene. A abundância relativa de cada espécie foi calculada com
base na soma da abundância relativa de genes anotados para uma
determinada espécie, conforme descrito anteriormente [28]. Um total de
477 espécies de bactérias e arqueas foram identificadas neste estudo. Em
seguida, limitamos nossas análises de comparação baseadas em espécies a
espécies comuns, que foram definidas como espécies com>100 genes
anotados em todas as amostras e com ocorrência em>20% das amostras.
Perfil taxonômico usando MetaPhlAn2
O pipeline de anotação taxonômica baseado no IGC foi desenvolvido
anteriormente com base em 3.449 táxons de bactérias e arqueas [28],
faltando a informação dos táxons fúngicos. Com o objetivo de avaliar o
desempenho quantitativo de fungos em amostras fecais humanas, em
seguida realizamos anotação taxonômica e quantificação usando
MetaPhlAn2 (versão 2.7.0) [27] e gerou perfis microbianos, incluindo
bactérias, eucariotos, arquéias e vírus para todas as 197 amostras
fecais humanas.
Yang et al. 9
αanálises de diversidade e riqueza
Para estimar a riqueza e uniformidade da comunidade microbiana em
amostras fecais, calculamosαdiversidade usando o índice de Shannon
em nível de gene e espécie usando a diversidade de função no pacote
R vegan (R versão 3.4.1). A riqueza foi definida como o número de
genes ou espécies observados em cada amostra.
.
Conjuntos de dados metagenômicos shotgun disponíveis de
estudos publicados
Para validar a confiabilidade da diferença observada entre espécies
gram-positivas e gram-negativas entre diferentes protocolos,
Baixado de https://academic.oup.com/gigascience/article/9/7/giaa071/5870561 por convidado em 27 de janeiro de 2024
selecionamos 28 conjuntos de dados de amostras fecais humanas de
um estudo de referência publicado [11], incluindo 8 conjuntos de
dados de DNA extraídos pelo protocolo PS e 20 conjuntos de dados de
DNA extraídos por 3 Qiagen ©
QIAampbaseados
RProtocolos no DNA Stool Mini Kit (8
conjuntos de dados de Q-6, 8 conjuntos de dados de Q-9 e 4 conjuntos de dados de
Q-15) (Tabela Suplementar S8).
Para investigar se existem ligações potenciais entre assinaturas
microbianas intestinais específicas de cada país e os protocolos de extração
de DNA fecal correspondentes, conjuntos de dados metagenômicos shotgun
de DNA fecal foram recuperados de 60 adultos chineses saudáveis e 100
adultos dinamarqueses saudáveis extraídos usando o protocolo MetaHIT [
28] e de 167 adultos saudáveis dos EUA (HMP) extraídos usando o
protocolo PS [29]. Informações detalhadas desses 327 conjuntos de dados
metagenômicos são fornecidas na Tabela Suplementar S9. A atribuição
taxonómica baseada no IGC e a quantificação de todos os conjuntos de
dados publicados foram realizadas conforme descrito acima, mas sem
redução do tamanho dos 327 conjuntos de dados de comparação de
assinaturas específicos do país.
Análise estatística
Análise de correlação
O coeficiente de correlação de Spearman foi calculado usando a função
cor.test do pacote R stats para estimar uma medida de associação
baseada em classificação.
Dissimilaridade de Bray-Curtis e PCoA
As dissimilaridades de Bray-Curtis em nível de gene e espécie foram
calculadas usando a função vegdist (método = “bray”) do pacote R
vegan.PCoA foi realizado para visualizar as dissimilaridades de Bray-
Curtis usando o pacote R ade.
Teste de Kruskal-Wallis
Para determinar quais espécies diferiram significativamente em
abundância entre amostras extraídas por diferentes protocolos de
extração e amostras de diferentes países, o teste de Kruskal-Wallis foi
realizado usando a função kruskal.test do pacote R stats. O método
Benjamini-Hochberg (BH) foi aplicado para ajuste deP-valores dos
testes Kruskal-Wallis, usando a função p.adjust (método = “BH”) das
estatísticas do pacote R.Um Kruskal-Wallis ajustado por BHP-valor<0,05
foi considerado estatisticamente significativo entre vários grupos (≥3).
Os testes pareados para comparações múltiplas foram seguidos pelo
teste de Kruskal-Wallis, utilizando a função posthoc.kruskal.dunn.test
do pacote R PMCMR. DunnP-os valores foram calculados para cada
comparação pareada e um Dunn ajustado por BHP-valor< 0,05 foi
considerado estatisticamente significativo entre cada 2 grupos.
 10 Avaliação de protocolos de extração de DNA fecal para estudos metagenômicos
Disponibilidade de dados e materiais de apoio
Os dados da sequência metagenômica das 36 amostras de MMC e 197
amostras de DNA fecal foram depositados no CNSA [41] do China
National GeneBank Database (CNGBdb) com número de acesso
CNP0000497 e no European Nucleotide Archive (ENA) sob BioProject
ERP121404. Vinte e oito conjuntos de dados de sequenciamento
metagenômico shotgun publicados do estudo de benchmark estão
disponíveis na ENA sob o BioProject ERP016524. Conjuntos de dados
de sequenciamento metagenômico shotgun publicados de 60 adultos
chineses e 100 dinamarqueses estão disponíveis na ENA com
BioProject ID ERP004605 e ERP003612, respectivamente. Conjuntos de
dados de sequenciamento metagenômico shotgun publicados de 167
adultos dos EUA estão disponíveis na SRA [42] e o Banco de Dados de
Genótipos e Fenótipos (dbGaP [43]) no âmbito dos 2 estudos
SRP002163 (Bio-Project PRJNA48479) e SRP056641 (BioProject
PRJNA275349). Os 10 genomas microbianos de referência do MMC
estão disponíveis emhttps://s3.amazonaws.com/zymo-files/BioPool/
ZymoBIO MICS.STD.genomes.ZR160406.zip. Outros dados que apoiam
ainda mais este trabalho estão disponíveis abertamente noGigaCiência
banco de dados, GigaDB [44].
Arquivos Adicionais
Tabela Suplementar S1.Parâmetros-chave dos 6 protocolos de
extração de DNA utilizados neste estudo.
Tabela Suplementar S2.Resumo dos dados de sequenciamento
metagenômico das 36 amostras da comunidade microbiana simulada (MMC)
e 197 amostras fecais humanas.
Tabela Suplementar S3.Diferenças estatísticas de rendimentos de DNA de
MMC e amostras fecais humanas entre protocolos.
Tabela Suplementar S4.Rendimentos de DNA de bactérias e leveduras usando
diferentes condições de esferas.
Tabela Suplementar S5.Diferenças estatísticas do índice de Shannon e
riqueza em nível de gene e espécie entre protocolos de extração de
DNA.
Tabela Suplementar S6.Lista de 152 espécies comuns que diferem
significativamente em abundância entre os 6 protocolos de extração de
DNA.
Tabela Suplementar S7.Resumo das atribuições taxonômicas das 197
amostras fecais humanas usando MetaPhlAn2.
Tabela Suplementar S8.Lista de amostras recuperadas de um estudo de
benchmark publicado para comparação de protocolos PS e protocolos
baseados em 3 Q.
Tabela Suplementar S9.Lista de amostras metagenômicas recuperadas de
estudos publicados para comparação de assinaturas específicas de cada
país.
Arquivo Suplementar F1.POP completo de 6 protocolos de extração de
DNA.
Figura Suplementar S1.Comparação dos rendimentos de DNA de MMC (a) e
amostras fecais humanas (b) entre protocolos. Foram utilizados trinta e seis
conjuntos de dados MMC disponíveis (6 conjuntos de dados por protocolo) e
107 conjuntos de dados metagenômicos fecais humanos disponíveis
(indivíduo B, n = 36; indivíduo D, n = 36; e indivíduo F, n = 35). Comparações
entre o protocolo Q versus os outros protocolos e o protocolo PS versus os
outros protocolos são mostradas nesta figura.∗Dunn AjustadoP <0,05;∗∗
ajustado DunnP<0,01;∗∗∗ajustado DunnP<0,001. Resultados detalhados dos 6
protocolos são fornecidos na Tabela Suplementar S3.
Figura Suplementar S2.Comparação de rendimentos de DNA bacteriano e
fúngico usando diferentes condições de esferas. O desempenho da extração
de DNA foi avaliado usando 3 culturas celulares incluindo apenasEscherichia
coliK-12 MG1655 (E. coliMG1655) (Bactérias, esquerda),Saco-
charomyces cerevisiaePOR4741 (S. cerevisiaeBY4741) (Levedura, à
direita) e uma combinação de dois terços do volume deE. coliMG1655 e
um terço do volume deS. cerevisiaeBY4741 (Mistura, meio). As barras
coloridas indicam as condições do grânulo com base no MagPure Fast
Stool DNA KF Kit B (MP); verde, 500μL de-Contas de 0,1 mm; roxo, 250μ
L de-Contas de 0,1 mm misturadas com 250μL de-Contas de 0,6–0,8
mm; laranja, 500μL de-Contas de 0,6–0,8 mm. Para cada grupo
experimental foram realizadas extrações com 10 repetições técnicas.
Teste de soma de postos de Wilcoxon,P<0,05.∗P<0,05;∗∗P<0,01;∗∗∗P <
0,001.
Figura Suplementar S3.Consistência intra e interprotocolo em nível de
gene usando amostras fecais humanas para extração e análise.
Lanceiroρ(a) e diferenças de Bray-Curtis (b) entre 6 réplicas técnicas
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dentro de cada protocolo. Lanceiroρ(c) e diferenças de Bray-Curtis (d)
entre o protocolo Q e os outros 5 protocolos.
Figura Suplementar S4.Comparação da contagem de genes (a), contagem
de espécies (b), diversidade de Shannon baseada em genes (c) e diversidade
de Shannon baseada em espécies (d) entre o protocolo Q e os outros 5
protocolos. Cento e sete conjuntos de dados metagenômicos fecais
humanos disponíveis (indivíduo B, n = 36; indivíduo D, n = 36; e indivíduo F, n
= 35) foram utilizados.∗Dunn AjustadoP<0,05;∗∗ajustado DunnP <0,01;∗∗∗
ajustado DunnP<0,001. NS, não significativo. Resultados detalhados entre 6
protocolos são fornecidos na Tabela Suplementar S5.
Figura Suplementar S5.Mapa de calor mostrando espécies gram-
negativas (a) e gram-positivas (b) que diferem significativamente em
abundância entre o protocolo PS e outros protocolos. A chave de cores
indica a classificação média da abundância relativa de cada espécie
entre as comparações no teste de Kruskal-Wallis. Os testes post hoc de
Dunn foram seguidos pelo teste de Kruskal-Wallis e teste de DunnP-os
valores foram ajustados pelo método BH.∗Dunn AjustadoP<0,05;
∗∗ajustado DunnP<0,01;∗∗∗ajustado DunnP<0,001. A barra colorida
indica a atribuição do filo de cada espécie: laranja, Actinobacteria;
amarelo, Firmicutes; roxo, Bacteroidetes; verde, Proteobactérias; rosa,
Fusobactérias. Uma lista de todas as espécies que diferem
significativamente em abundância entre os 6 protocolos é fornecida na
Tabela Suplementar S6.
Figura Suplementar S6.Distribuições de abundância relativa de
espécies bacterianas intestinais representativas em nível individual. (a)
Espécies Gram-positivas, (b) espécies Gram-negativas. Cada ponto
indica a abundância relativa de uma determinada espécie em uma
amostra individual. Verde claro, protocolo Q; verde, protocolo MP; azul,
protocolo MN; roxo, protocolo ZYMO; laranja, protocolo MetaHIT;
amarelo, protocolo PS. O eixo X indica 6 indivíduos (A – F); Eixo Y indica
log2-abundância relativa transformada de uma determinada espécie.
Figura Suplementar S7.Mapa de calor mostrando espécies que diferem
significativamente em abundância entre os protocolos PS e protocolos
baseados em 3 Q. As comparações foram realizadas em 28 conjuntos de
dados metagenômicos publicados (protocolo PS, n = 8; protocolo Q-6, n = 8;
protocolo Q-9, n = 8; protocolo Q-15, n = 4) de um estudo de referência
publicado [11]. A chave de cores indica a classificação média da abundância
relativa de cada espécie entre as comparações no teste de Kruskal-Wallis. Os
testes post hoc de Dunn foram seguidos pelo teste de Kruskal-Wallis.∗Dunn
AjustadoP<0,05;∗∗ajustado DunnP<0,01;
∗∗∗ajustado DunnP<0,001. A barra colorida indica a atribuição do filo de
cada espécie: laranja, Actinobacteria; amarelo, Firmicutes; roxo,
Bacteroidetes; verde, Proteobactérias; rosa, Fusobacteria e as
características de coloração de Gram das espécies: vermelho, gram-
positivo; azul, gram-negativo. Azul indica espécies com a mesma
direção de enriquecimento entre os protocolos PS e Q no presente
estudo.

Abreviações
BH: Benjamini-Hochberg; CV: coeficiente de variação; EE: erro de
estimativa; GC: guanina-citosina; HMP: Projeto Microbioma Humano;
IGC: Catálogo Integrado de Genes; Mb: pares de megabases; MMC:
comunidade simulada microbiana; MetaHIT: Consórcio Metagenômica
do Trato Intestinal Humano; MP: Kit B MagPure Fast Stool DNA KF;
Minnesota: Macherey NagelMTNucleoSpinMT© RConjunto de solo; POP:
procedimento operacional Padrão; MEE: erro médio de estimativa; ACP:
análise de componentes principais; PCoA: análise de coordenadas principais;
PS: Kit MOBIO DNeasy PowerSoil; SRA: Arquivo de Leitura de Sequência;
ZYMO: Zymo Research Quick-DNAMTKit de micróbios fecais/do solo.
Interesses competitivos
Os autores declaram não ter interesses conflitantes.
Financiamento
Esta pesquisa foi financiada pelo Projeto Nacional de Ciência e
Tecnologia da China (Nº 2017ZX10303406) e pelo Governo Municipal de
Shenzhen da China (Nº JCYJ20170817145809215).
Contribuições dos Autores
H. Zhong, JS e KK conceberam o estudo. JS e H. Luo realizaram coleta
de amostras fecais e experimentos de extração de DNA na comunidade
simulada ZYMO e em amostras fecais humanas. FY, H. Zhou, MH, BC e
H. Liao projetaram e realizaram experimentos independentes de
extração de DNA com condições variadas de esferas em comunidades
simuladas comE. colie/ouS. cerevisiae. H. Zhong e JS projetaram e
supervisionaram as análises de dados. FY, HR e YL realizaram as
análises de dados metagenômicos. FY e JS escreveram a primeira
versão do manuscrito. H. Zhong, JL, SB e KK revisaram o manuscrito.
Todos os autores participaram das discussões e contribuíram para
moldar o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o
manuscrito final.
Aprovação Ética e Consentimento para Participar
O estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional do BGI
sob o documento ético BGI-R039–1. Os participantes deste estudo
forneceram consentimento informado por escrito antes da coleta da
amostra.
Agradecimentos
Agradecemos a todos os voluntários que participaram deste estudo.
Agradecemos a Yang Li e Ying Dai pela assistência técnica nos
experimentos de extração. Agradecemos a Chao Fang e Zhun Shi pelas
discussões e pelas sugestões de análise úteis. Agradecemos ao Dr. Dan
Wang pelas discussões e sugestões úteis sobre o manuscrito revisado.
Este trabalho foi apoiado pelo China National GeneBank (CNGB).
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