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Universidade Estadual de Maringá

Centro de Ciências da Saúde
Departamento de Análises Clínicas e Biomedicina
Programa de Pós-Graduação em Biociências e Fisiopatologia

Aluna: Thalita Manocchi

Disciplina: Biologia Molecular

Desenho de Primers e POP

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Desenho de Primers a partir de um SNP de um gene relacionado à exposição de trabalhadores rurais aos
agrotóxicos.

GSTP1 – Pi-class glutathione-S-transferase: Atua na detoxificação de xenobióticos e como antioxidante

inativa eletrófilos nocivos e cancerígenos. Conta com um SNP que pode afetar diretamente a
funcionalidade do GSTP1, nesse caso, destacou-se o polimorfismo rs1695, onde existe uma mudança em
uma base do exon 5 na posição 313, de adenina para guanina, ocasionando uma mudança de isoleucina
para valina (ATC para GTC) na posição 105. Indivíduos com essa mutação tem uma redução na atividade
enzimática, que os torna susceptíveis ao estresse oxidativo e incapaz de detoxificar os xenobióticos
causadores de câncer.

>NC_000011.10:67583812-67586653 Homo sapiens chromosome 11, GRCh38.p14

Primary Assembly
GCTGGAGTTTCGCCGCCGCAGTCTTCGCCACCAGTGAGTACGCGCGGCCCGCGTCCCCGGGGATGGGGCT
CAGAGCTCCCAGCATGGGGCCAACCCGCAGCATCAGGCCCGGGCTCCCGGCAGGGCTCCTCGCCCACCTC
GAGACCCGGGACGGGGGCCTAGGGGACCCAGGACGTCCCCAGTGCCGTTAGCGGCTTTCAGGGGGCCCGG
AGCGCCTCGGGGAGGGATGGGACCCCGGGGGCGGGGAGGGGGGGCAGACTGCGCTCACCGCGCCTTGGCA
TCCTCCCCCGGGCTCCAGCAAACTTTTCTTTGTTCGCTGCAGTGCCGCCCTACACCGTGGTCTATTTCCC
AGTTCGAGGTAGGAGCATGTGTCTGGCAGGGAAGGGAGGCAGGGGCTGGGGCTGCAGCCCACAGCCCCTC
GCCCACCCGGAGAGATCCGAACCCCCTTATCCCTCCGTCGTGTGGCTTTTACCCCGGGCCTCCTTCCTGT
TCCCCGCCTCTCCCGCCATGCCTGCTCCCCGCCCCAGTGTTGTGTGAAATCTTCGGAGGAACCTGTTTCC
CTGTTCCCTCCCTGCACTCCTGACCCCTCCCCGGGTTGCTGCGAGGCGGAGTCGGCCCGGTCCCCACATC
TCGTACTTCTCCCTCCCCGCAGGCCGCTGCGCGGCCCTGCGCATGCTGCTGGCAGATCAGGGCCAGAGCT
GGAAGGAGGAGGTGGTGACCGTGGAGACGTGGCAGGAGGGCTCACTCAAAGCCTCCTGCGTAAGTGACCA
TGCCCGGGCAAGGGGAGGGGGTGCTGGGCCTTAGGGGGCTGTGACTAGGATCGGGGGACGCCCAAGCTCA
GTGCCCCTCCCTGAGCCATGCCTCCCCCAACAGCTATACGGGCAGCTCCCCAAGTTCCAGGACGGAGACC
TCACCCTGTACCAGTCCAATACCATCCTGCGTCACCTGGGCCGCACCCTTGGTGAGTCTTGAACCTCCAA
GTCCAGGGCAGGCATGGGCAAGCCTCTGCCCCCGGAGCCCTTTTGTTTAAATCAGCTGCCCCGCAGCCCT
CTGGAGTGGAGGAAACTGAGACCCACTGAGGTTACGTAGTTTGCCCAAGGTCAAGCCTGGGTGCCTGCAA
TCCTTGCCCTGTGCCAGGCTGCCTCCCAGGTGTCAGGTGAGCTCTGAGCACCTGCTGTGTGGCAGTCTCT
CATCCTTCCACGCACATCCTCTTCCCCTCCTCCCAGGCTGGGGCTCACAGACAGCCCCCTGGTTGGCCCA
TCCCCAGTGACTGTGTGTTGATCAGGCGCCCAGTCACGCGGCCTGCTCCCCTCCACCCAACCCCAGGGCT
CTATGGGAAGGACCAGCAGGAGGCAGCCCTGGTGGACATGGTGAATGACGGCGTGGAGGACCTCCGCTGC
AAATACATCTCCCTCATCTACACCAACTATGTGAGCATCTGCACCAGGGTTGGGCACTGGGGGCTGAACA
AAGAAAGGGGCTTCTTGTGCCCTCACCCCCCTTACCCCTCAGGTGGCTTGGGCTGACCCCTTCTTGGGTC
AGGGTGCAGGGGCTGGGTCAGCTCTGGGCCAGGGGCCCAGGGGCCTGGGACAAGACACAACCTGCACCCT
TATTGCCTGGGACATCAACCAGCCAAGTAACGGGTCATGGGGGCGAGTGCAAGGACAGAGACCTCCAGCA
ACTGGTGGTTTCTGATCTCCTGGGGTGGCGAGGGCTTCCTGGAGTAGCCAGAGGTGGAGGAGGATTTGTC
GCCAGTTTCTGGATGGAGGTGCTGGCACTTTTAGCTGAGGAAAATATGCAGACACAGAGCACATTTGGGG
ACCTGGGACCAGTTCAGCAGAGGCAGCGTGTGTGCGCGTGCGTGTGCATGTGTGTGCGTGTGTGTGTGTA
CGCTTGCATTTGTGTCGGGTGGGTAAGGAGATAGAGATGGGCGGGCAGTAGGCCCAGGTCCCGAAGGCCT
TGAACCCACTGGTTTGGAGTCTCCTAAGGGCAATGGGGGCCATTGAGAAGTCTGAACAGGGCTGTGTCTG
AATGTGAGGTCTAGAAGGATCCTCCAGAGAAGCCAGCTCTAAAGCTTTTGCAATCATCTGGTGAGAGAAC
CCAGCAAGGATGGACAGGCAGAATGGAATAGAGATGAGTTGGCAGCTGAAGTGGACAGGATTTGGTACTA
GCCTGGTTGTGGGGAGCAAGCAGAGGAGAATCTGGGACTCTGGTGTCTGGCCTGGGGCAGACGGGGGTGT
CTCAGGGGCTGGGAGGGATGAGAGTAGGATGATACATGGTGGTGTCTGGCAGGAGGCGGGCAAGGATGAC
TATGTGAAGGCACTGCCCGGGCAACTGAAGCCTTTTGAGACCCTGCTGTCCCAGAACCAGGGAGGCAAGA
CCTTCATTGTGGGAGACCAGGTGAGCATCTGGCCCCATGCTGTTCCTTCCTCGCCACCCTCTGCTTCCAG
ATGGACACAGGTGTGAGCCATTTGTTTAGCAAAGCAGAGCAGACCTAGGGGATGGGCTTAGGCCCTCTGC
CCCCAATTCCTCCAGCCTGCTCCCGCTGGCTGAGTCCCTGGCCCCCCTGCCCTGCAGATCTCCTTCGCTG
ACTACAACCTGCTGGACTTGCTGCTGATCCATGAGGTCCTAGCCCCTGGCTGCCTGGATGCGTTCCCCCT
GCTCTCAGCATATGTGGGGCGCCTCAGTGCCCGGCCCAAGCTCAAGGCCTTCCTGGCCTCCCCTGAGTAC
GTGAACCTCCCCATCAATGGCAACGGGAAACAGTGAGGGTTGGGGGGACTCTGAGCGGGAGGCAGAGTTT
GCCTTCCTTTCTCCAGGACCAATAAAATTTCTAAGAGAGCTA
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Utilizando Primer-BLAST:

F1 - TGGACATGGTGAATGACGGC
R1 – CCTGGTGCAGATGCTCACATA
IDT OligoAnalyzer
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POP

Finalidade:

Analisar o polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) do gene GSTP1 (rs1695), a partir de

amostras coletadas de agricultores expostos ocupacionalmente aos agrotóxicos. Utilizando a
técnica PCR-RFLP.

Referência:

Glutathione S-Transferase Pi 1 – GSTP1 é uma enzima metabolizadora que realiza o catabolismo

de xenobióticos que produzem radicais livres capazes de induzir o estresse oxidativo. Quando a
detoxificação é ineficiente, estes produtos tóxicos podem danificar moléculas intracelulares.

A amplificação foi realizada usando os seguintes primers:

F - TGGACATGGTGAATGACGGC

R – CCTGGTGCAGATGCTCACATA

A substituição de isoleucina por valina no exon 5 será amplificada sob as seguintes condições:
desnaturação por 30 segundos em 94°C, anelamento em 57.9°C. O tamanho dos primers é de 20
pb.

Metodologia:

Uma amostra de sangue (aprox. 6 ml), coletada de cada participante por punção venosa.
Transferindo 2 ml para tubos contendo EDTA para realizar a extração do DNA. O sangue total é
centrifugado juntamente com uma solução de proteinase K em um microtubo de centrifugação
de 1,5 mL para que ocorra a lise da amostra.

Metodologia da Extração de DNA:

Seguir instruções de uso que acompanham o kit BIOPUR Kit de Extração Mini Spin Plus.
(https://www.biometrix.com.br/wpcontent/uploads/2020/12/IU_Padrao_Biopur_Spin-
Plus_Rev.15.pdf)

1) Adicionar 25 µL de Proteinase K e 200 µL de sangue e centrifugar;

2) Adicionar 200 µL de Tampão de Lise S e homogeneizar vigorosamente em vórtex (10 a 20

segundos).

3) Incubar os microtubos a 56°C por 15 minutos.

4) Adicionar 210 µL de Etanol (96-100%) e homogeneizar em vórtex.

5) Transferir toda a mistura para o Tubo Spin S. Centrifugar por 1 minuto a 11.000 x g.

6) Colocar o tubo-filtro sob um novo Tubo de Coleta e adicionar 500 µL de Tampão de Lavagem
SI.

7) Colocar o tubo-filtro sob um novo Tubo de Coleta e adicionar 600 µL de Tampão de Lavagem
SII.

8) Colocar o tubo-filtro novamente sob o Tubo de Coleta e centrifugar por um minuto a 11.000
x g (o etanol residual é removido durante este passo).
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9) Colocar o tubo-filtro em um Tubo de Eluição S e adicionar 200 µL de Tampão de Eluição S

previamente aquecido (56°C). Dispensar o tampão diretamente sobre a membrana de sílica.
Incubar por 1 minuto à temperatura ambiente. Centrifugar por 1 minuto a 11.000 x g.

Resultados:

A técnica utilizada será a eletroforese em gel de agarose, dissolvido em um tampão condutor na

proporção de 3,5% de agarose. Pentes de plástico das cubas de eletroforese criam poços no gel
onde serão adicionadas as amostras. A amostra é misturada a um corante de carregamento,
nesse caso, o azul de bromofenol, o que torna possível a visualização das moléculas durante a
corrida. A cuba é preenchida com uma solução tampão condutora, para esse procedimento será
usado o Tris-Borato-EDTA.

Um único fragmento de 177 pb representa os homozigotos Ile-Ile, indivíduos homozigotos Val-

Val são mostrados em 92 e 85 pb e indivíduos heterozigotos Ile-Val são demonstrados em três
fragmentos.
Estudos demonstram que a variante Ile-Ile do gene GSTP1 pode levar a diminuição da atividade
enzimática na detoxificação de xenobióticos, ocasionando o acumulo dos mesmos e
aumentando os danos no DNA. Portanto, amostras que chegaram até a linha de 177 pb no gel,
indicam que o individuo pode apresentar maiores danos ao seu DNA(1).

Laudo:
Detecção do SNP rs1695 localizado no exon 5 do gene GSTP1, positivo para variante Ile-Ile.

Bibliografia:

1. Saad-Hussein A, Noshy M, Taha M, El-Shorbagy H, Shahy E, Abdel-Shafy EA. GSTP1 and

XRCC1 polymorphisms and DNA damage in agricultural workers exposed to pesticides. Mutat
Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2017;819:20-5.