Preparação de antígenos para imunização

Unesp - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
CÂMPUS DE JABOTICABAL
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
Departamento de Patologia Veterinária
ROTEIRO DE AULAS TEÓRICO-PRÁTICAS EM

IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA
HÉLIO JOSÉ MONTASSIER

(Professor Titular - Disciplina de Imunologia Veterinária )
JABOTICABAL - SP
- 2017 -
Prof. Hélio José Montassier 1
FCAV – UNESP - Jaboticabal
ÍNDICE
Introdução as técnicas de laboratório em Imunologia...................................................... 3
Preparo de antígenos para imunização de camundongos e cobaias para a obtenção de
soros precipitantes e aglutinantes.................................................................................... 8
Purificação parcial dos anticorpos presentes no soro normal através da precipitação da
fração gama-globulina com sulfato de amônio................................................................ 13
Purificação de IgG através de cromatografia de troca iônica.......................................... 17
Reação quantitativa de soroprecipitação.......................................................................... 20
Caracterização da fração gama globulina precipitada por imunoeletrofores................ 24
Imunohemólise - experiência de Erlich Morgenroth Modificada.............................. 28
Técnica de Imunodifusão Dupla em Gel de Agar para Titulação de Soro Anti-Gama
Globulina..................................................................................................................... 31
Reação de Soroaglutinação para Titulação de Anticorpos Anti-Hemácias de 34
Carneiro.......................................................................................................................
Método indireto de ELISA para detecção e titulação de anticorpos de cobaia anti-
gamaglobulina bovina..................................................................................................... 37
Técnicas de SDS-PAGE e de WESTERN-BLOTTING……………………………... 41
Testes Rápidos de Sorodiagnóstico – Testes Imunocromatográficos 43

INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS DE LABORATÓRIO EM IMUNOLOGIA
São imprescindíveis para o estudo e o desenvolvimento do conhecimento em

Imunologia a experimentação e a manipulação de materiais denominados antígenos, cuja
principal propriedade é a capacidade de induzir respostas imunes (no caso de serem antígenos
completos) e de reagir com os produtos de tais respostas imunes (sejam antígenos completos
ou incompletos/haptenos), particularmente com anticorpos. Os antígenos mais utilizados na
experimentação em Imunologia são provenientes de fontes naturais, como proteínas séricas ou
de ovos de galinha (soro albumina, gama globulina e ovoalbumina, etc.), eritrócitos
(eritrócitos de carneiro, eritrócitos de galinha etc.) e microrganismos (bactérias e vírus). A
maioria desses antígenos naturais possuem muitos sítios antigênicos diferentes, em uma única
molécula; e se forem considerados os antígenos presentes em uma membrana ou parede
celular (eritrócitos e bactérias) há um número muito maior de sítios antigênicos, que fazem
parte da estrutura de cada molécula, a qual faz parte da constituição de tal membrana ou
parede celular. Os exercícios apresentados a seguir descrevem o preparo de dois tipos básicos
de preparações antigênicas: um de natureza macromolecular solúvel (soro albumina bovina) e
o outro de natureza particulada (eritrócitos de carneiro). Deve ser salientado que esses dois
tipos de antígenos representam dois grupos importantes (um de natureza solúvel e o outro de
natureza particulada) e para efeito de estudo e experimentação se constituem em ótimos
modelos de trabalho, substituindo muito bem preparações antigênicas de microrganismos que
podem oferecer riscos quando são manipulados por indivíduos não experientes.
Principais preparações antigênicas usadas em atividades experimentais em

imunologia:
 Antígenos particulados: apresentam dimensão de uma célula e, ao se adicionar
um diluente apropriado, forma-se uma suspensão. Ex: bactérias e células eucariontes, como
hemácias (carneiro, galinha).
 Antígenos solúveis: apresentam dimensão de macro-molécula e, ao se
adicionar um diluente apropriado, forma-se uma solução. Ex: proteínas (ovoalbumina,
gamaglobulina) e polissacarídeos.
Tipos de diluentes
 Solução salina (NaCl 0,15 M)
 PBS ou Tampão Fosfato Bicarbonato
01. Preparo de suspensão de hemácias de carneiro a 2%: (Antígeno Particulado

Indutor de Anticorpos Soroaglutinantes).
Os eritrócitos de uma dada espécie animal revelam propriedades antigênicas marcantes
quando são injetados em animais de uma outra espécie. Os anticorpos anti-eritrocitários são
induzidos diretamente contra determinantes antigênicos presentes nas membranas dessas
células. Essas membranas celulares se constituem, por sua vez, de misturas complexas de
proteínas fibrosas, lipídeos e mucopolissacarídeos, sendo que os lipídeos são ligados mais ou
menos firmemente a algumas dessas proteínas. As variações na estrutura molecular das
proteínas, lipídeos e carboidratos nas membranas celulares dos eritrócitos de diferentes
espécies animais e mesmo entre indivíduos de uma mesma espécie são os principais
responsáveis pelo amplo espectro de determinantes antigênicos diferentes que essas células
apresentam.
Além de serem usados como antígenos particulados para a produção e titulação de
anticorpos específicos aglutinantes, os eritrócitos podem ser empregados na montagem da
técnica de hemaglutinação passiva condicionada e para a detecção de anticorpos contra
antígenos solúveis que, nesse caso, são ligados à superfície de eritrócitos.
As suspensões de eritrócitos podem ser padronizadas volumetricamente e
espectrofotometricamente. A primeira técnica é suficiente para se prepararem suspensões de
hemácias para serem usadas na imunização de animais, mas a técnica de padronização
espectrofotométrica é necessária para preparar suspensões de hemácias que são empregadas
em reações de imuno-hemólise, ou na detecção/titulação de anticorpos hemolíticos, isto é,
fixadores do complemento. Em virtude de sua grande sensibilidade a mudanças do ambiente
físico e químico, os eritrócitos recém-colhidos devem ser manipulados com muito cuidado e
as suspensões preparadas para serem usadas nas titulações de anticorpos não devem ser
armazenadas por mais de um dia, em temperatura de geladeira.
1.- Materiais e Métodos:

1.1. Sangue de carneiro colhido em solução anti-coagulante de Alsever1 (v : v)

(Figura01)
1.2. Filtrar em Algodão hidrófilo.
1.3. Centrifugar a 2500 rpm/4 minutos.
1.4. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 15 volumes de solução
salina 0,l5M. (Figura 02)
1.5. Centrifugar a 2500 rpm/4 minutos.
1.6. Repetir os ítens l.4. e l.5. mais uma vez.
1.7. Preparar a suspensão de hemácias a 2% em solução salina(v:v), aferição e
padronização volumétrica.
1.8. Para aferição ou padronização espectrofotométrica de uma suspensão de
eritrócitos a 1%, proceder como no protocolo abaixo descrito:
1.8.1. Pipete 4 ml de água destilada em 1 tubo e adicione 1 ml de uma suspensão de
eritrócitos a 2%. Misture bem para promover a lise, invertendo o tubo, previamente coberto
com papel filme sobre o polegar.
1.8.2. Leia a densidade óptica (DO) da solução de lisado de eritrócitos contra um
branco de água destilada, no espectrofotômetro, e no comprimento de onda de 550 nm. A
seguir, aplique a fórmula abaixo: Vf = Vi x DO / 0,300 e Vf - Vi = Volume de diluente que
deve ser acrescentado para proporcionar uma suspensão de eritrócitos de carneiro com
concentração padronizada de 1%.
Sangue
+
Anti- Coagulante
Sobrenadante
Após
passos 1.2
e 1.3 Salina
4ml
Figura 01
1
Tipos de soluções anti-coagulantes: solução de Alsever (citrato de sódio + glicose + NaCl + ácido cítrico),
oxalato, EDTA, heparina.
02. Preparo de solução de soroalbumina bovina a l,0% e 5%, considerando que você
vai usar um volume de 5ml para inocular os animais
(Exercício teórico) (Antígeno Solúvel Indutores de Anticorpos Soroneutralizantes)
03. Técnica de diluições seriadas:

3.1. Séries com razão constante e diluições sucessivas. Nesta técnica, transferem-se
volumes sucessivamente de um tubo para outro seguinte, ao qual se adicionou quantidade
adequada de diluente.
Exemplo 1. Diluições sucessivas com razão constante igual a 2 (figura 03)

1) Distribuir numa série de tubos com l ml de diluente.
2) Ao tubo l adicionar l ml do material.
3) Transferir l ml do tubo l para o tubo 2.
1ml
Material
1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
1 2 3 4 5 6
1ml de
salina em
todos
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64
Figura 02
4) Transferir l ml do tubo 2 para o tubo 3.
5) Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série.
As diluições obtidas serão: l:2; l:4; l:8; l:l6; l:32;l:64
Exemplo 2. Diluições sucessivas com razão constante igual a l0 (figura 04)
1) Distribuir 9ml de diluente numa série de tubos.
2) Ao tubo 1 adicionar 1 ml do material não diluído.
3) Transferir 1 ml do tubo 1 para o tubo 2.
4) Transferir 1 ml do tubo 2 para o tubo 3.

5) Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série.
As diluições obtidas serão: 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10.000; e 1:100.000.
Assunto 01- figura 03

1ml
Material 1ml 1ml 1ml 1ml

1 2 3 4 5
1/10 1/100 1/1.000 1/10.000 1/100.000
Figura 03
Problemas:
1. Como você faz para diluir um soro a 1/50;1/100;1/200;1/400 e 1/800?
2. Como você procede para diluir um vírus de 10-3 a 10-8?
Perguntas:
1. Qual o procedimento geral para se preparar uma suspensão antigênica bacteriana a
5%?
2. Como se faz para preparar uma solução antigênica de gamaglobulina bovina a 0,1%,
num volume final de 5ml?
3. Qual das preparações antigênicas acima (exercícios 1 e 2) será usada para a
obtenção de soros:
a) Precipitantes b) Aglutinantes
4. Qual(is) a(s) principal(is) finalidade(s) de se fazer uma escala de diluições seriadas?
5. O que são:
a) Solução anti-coagulante de Alsever
b) Solução salina d) Soro
c) Plasma e) Solução salina tamponanda
PREPARO DE ANTÍGENOS PARA IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS

E COBAIAS PARA A OBTENÇÃO DE SOROS PRECIPITANTES E
AGLUTINANTES
ESTUDAR AS BASES DA IMUNOLOGIA
ESTUDAR MODELOS DE FENÔMENOS IMUNOLÓGICOS
Antígeno + Estímulo do Sistema Imune = Resposta Imune (Resposta Imune

Humoral e/ou Resposta Imune Celular)
Características fundamentais das respostas imunes:

 Reconhecimento
 Especificidade
 Memória
I - PREPARO DE SOLUÇÃO DE GAMA GLOBULINA BOVINA

1. Preparar uma solução de Gama Globulina Bovina (GGB) a 2 ml/ml. (figura01)
2. Após a dissolução misturar 1ml da solução de GGB com 1ml de adjuvante completo
de Freund (ACF) ou com 1ml de adjuvante incompleto de Freund (AIF).(figura 02)
3. Misturar a solução de GGB com a de hidróxido de alumínio a 2,5% na proporção de
7 volumes da primeira para 3 volumes da segunda.(figura 03)
4. Imunizar a cada 15 dias durante 30 dias as cobaias, sendo cada grupo para um
adjuvante diferente. Imunizar um grupo só com a solução de antígeno sem adjuvante. A via de
injeção é subcutânea, devendo-se inocular 0,5ml por animal.
5. Sangrar os animais 2 semanas após o início e, ao final, l semana após a
reimunização. Separar os soros, nos 2 casos e fazer a titulação deles por imunodifusão dupla
em gel de ágar.
GGB a 2mg/ml
5ml da solução
1ml de ACF ou 1ml deAIF
7 volumes de GGB 3 volumes de Hidróxido

de sódio
Figura 04
II - PREPARO DE SUSPENSÃO ANTIGÊNICA DE ERITRÓCITOS DE

CARNEIRO
1. O sangue é retirado previamente com anticoagulante (solução de alsever) de um
carneiro, conforme o descrito no roteiro anterior. (figura 04)
2. Passar o sangue colhido por um funil com algodão hidrófilo.
3. Recolher o sangue filtrado e centrifugá-lo a baixa rotação por 5 minutos.
4. Dispensar o sobrenadante com pipeta pasteur ou com trompa de vácuo.
5. Colocar cerca de l0ml de salina, homogeneizar e centrifugar novamente, para lavar
as hemácias.
6. Repetir os ítens (4) e (5) mais 2 vezes, ou até quando o sobrenadante estiver claro.
7. Preparar a suspensão de hemácias a l0% (v/v) em solução salina. Homogeneizar
bem.
8. Injetar 3 grupos de camundongos de 5 camundongos cada, por via subcutânea
(0,1ml/animal). Em 5 camundongos injetar hemácias de carneiro com adjuvante completo de
Freund, em outros 5 camundongos injetar a mistura de hemácias de carneiro mais adjuvante
incompleto de Freund e nos outros 5 camundongos restantes injetar a suspensão de hemácias
sem adjuvante. (figura 05)
9. Repetir as imunizações depois de l5 dias, e sangrar 20 dias depois da última
imunização. (figura 06)
Sangue
+
Anti- Coagulante
Figura 05
Hemácias Hemácias Hemácias

+ + sem Adjuvante
ACF Grupo 1 AIF Grupo 2 Grupo 3
Figura 06
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3

0,1 ml 0,1 ml 0,1ml
Figura 07
Espera-se que ocorra:
Antígeno Sistema Imunológico Respostas Imunológicas

Estímulo
1ª Etapa
Organismos
Antígeno Inoculados
Macrófagos ou Células
dendríticas
Fragmentos
Lisossoma Peptídicos
2ª Etapa
MHC II + Fragmentos
Peptídicos
Fragmentos
Peptídicos
T
B Lisossoma
Estímulo Secundário
Figura 08
Principais fatores que interferem na imunogenicidade dos Ags:

 Peso molecular
 Complexidade molecular
 Concentração
 Digestibilidade
Adjuvantes
São imunomodeladores, ou seja, substâncias capazes de potenciar, inespecificamente,
as respostas imunes contra os antígenos.
Tipos:
 Minerais – Ex: Al(OH)3, óleo mineral/emulsionante (Adjuvante Incompleto de
Freund – AIF)
 Orgânicos – Ex: Saponina, óleos vegetais e lecitina de soja
 Produtos derivados de microrganismos – Ex: bactérias (Mycobacterium spp.;
Propyonabacterium acnes; bactérias gram negativas - LPS), fungos (Sacharomyces cerevisae
- Glucana)
OBS: O Adjuvante Completo de Freund (ACF) é composto de óleo mineral +
emulsionante + Mycobacterium spp.
Efeitos principais dos Adjuvantes:
 Efeito depósito
 Aumentar resposta inflamatória no local da inoculação
 Ativação de células imunocompetentes ou apresentadoras de antígenos
PERGUNTAS
1. Em quais formas principais podem-se apresentar os antígenos e qual a natureza
química deles?
2. O que são adjuvantes, quais as principais formas e para que eles são usados?
3. Quais as principais vias de administração de um antígeno no organismo normal?
4. Por que são feitas várias inoculações de um antígeno, durante o processo de
imunização?
5. Após o término da imunização, qual a modalidade de Resposta Imune que será
avaliada?
PURIFICAÇÃO PARCIAL DOS ANTICORPOS PRESENTES NO SORO

NORMAL ATRAVÉS DA PRECIPITAÇÃO DA FRAÇÃO
GAMA-GLOBULINA COM SULFATO DE AMÔNIO.
1. INTRODUÇÃO - GENERALIDADES
Para estudar a estrutura dos Acs é necessário purificá-los previamente. Tal purificação
é de grande interesse prático, pois diminui consideravelmente as reações produzidas pelos
soros quando eles são utilizados com finalidades profilática ou terapêutica.
Os métodos usados para purificação dos Acs se filiam a duas modalidades: métodos
não específicos e específicos. Os primeiros se baseiam em técnicas de fracionamento físico ou
físico-químico e não permitem separar as gamaglobulinas normais dos Acs. Os métodos
específicos, por outro lado, baseiam-se na dissociação ou eluição dos imunocomplexos e
permitem obter os Acs em alto grau de pureza, livres de imunoglobulinas (Igs) inespecíficas.
São os métodos de escolha para estudos experimentais, porém, não podem ser aplicados aos
soros terapêuticos em virtude de baixo rendimento inerente ao processo de purificação.
O método de precipitação com sais neutros ("Salting-out") é de uso corrente e utiliza,
sobretudo, o sulfato de amônio e o sulfato de sódio.
De modo geral, quando se deseja precipitar todas as globulinas de um soro sanguíneo,
adiciona-se sulfato de amônio a 50% de saturação ou sulfato de sódio a 22% de saturação (a
37ºC) permanecendo solúvel apenas a fração albumina. Outra maneira é precipitar as frações
Gama e Beta globulina que contêm praticamente a maior parte das proteínas com função de
Acs com sulfato de amônio a 40% de saturação ou com sulfato de sódio a l9% de saturação (a
37ºC).
No nosso caso, será utilizado o método de precipitação das frações gama e beta
globulina com sulfato de amônio a 40% de saturação.
2. MATERIAL
- 5ml de soro sanguíneo
- 5ml solução salina tamponada com fosfatos (PBS)
- solução de sulfato de amônio a l00% de saturação
- becker de 50ml
- pipeta de lml, 2ml, 5ml, l0ml
- tubos cônicos plásticos de centrífugas
- bastões de vidro pequenos e grandes
- provetas de 25, 50ml e 1000ml
- saco de diálise, cordonê
- becker de 2 litros
- pipeta pasteur e tetina
- erlenmeyer de 125 e 250 ml
10ml de
solução
Figura 09
3. MÉTODOLOGIA
3.1. Juntar 5ml de soro com 5ml de P.B.S.
3.2. Calcular o volume de sulfato de amônio a l00% de saturação que deverá ser
acrescentado a mistura de soro mais P.B.S. no volume final de l0ml; volume de sulfato de
amônio a l00% de saturação onde:
V - volume final de soro + PBS

C - A saturação do sulfato de amônio desejado (40%)
VxC
X = -------
l00-C
3.3. Sob agitação cuidadosa, acrescentar gota a gota o volume calculado do sulfato de
amônio a l00% de saturação, para dar uma saturação final de 40%.
Soro + PBS
Proteínas solúveis Proteína /
Globulinas
O Camada de Solvatação
Proteína H H
Figura 10
3.4. Continuar agitando por mais 30 minutos.

3.5. Transferir o volume para os tubos de centrífuga e levar a centrífuga a 3000rpm
por l5 minutos.
+ Sulfato de Amônio
Remoção da Camada de Solvatação
Precipitação das Globulinas
Figura 11
3.6. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com solução de sulfato de amônio a

42% de saturação, isto é deve-se centrifugar e descartar o sobrenadante, ressuspender com
cuidado o sedimento na solução de sulfato de amônio a 42% de saturação.
Obs.: Cálculo da solução do sulfato de amônio a 42% de saturação:

X=VxC X = Vol. de sulfato de amônio a 100% de saturação
100 - C
X = 30 x 42 V = Vol. desejado da solução (30 mL)

100 – 42
C = Saturação final do sulfato de amônio (42% de saturação)
X = 21,72 mL de sulfato de amônio a 100% de saturação + 30 mL de água destilada
Figura 12
3.7. Após a última lavagem, descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em
1 mL de PBS com cuidado e com o uso de pipeta Pasteur.
3.8. O sedimento ressuspenso deve ser colocado dentro do saco de diálise, esse deve
ser fechado e se coloca para dialisar contra salina. Deixa-se dialisar por 2 dias a 4ºC, com
duas trocas de líquido de diálise ao dia.
4. Retira-se a fração precipitada do saco de diálise e guarda-se em congelador a -20ºC
para ser testada por imunodifusão.
PERGUNTAS
1) O que são imunoglobulinas e quais as suas principais propriedades físico-químicas

e biológicas?
2) Qual o objetivo de se purificar anticorpos?
3) Como atua o sulfato de amônio sobre moléculas de imunoglobulinas e por que é
importante se conhecer o grau de saturação sulfato de amônio para fazer a separação das
imunoglobulinas?
4) O que é diálise, e por que esse processo é empregado nesse caso?
PURIFICAÇÃO DE IgG ATRAVÉS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA

IÔNICA
1.- INTRODUÇÃO E GENERALIDADES
São reconhecidos, no mínimo, dois métodos diferentes que podem ser usados,
separadamente ou combinados, para se obter uma preparação de IgG ou de IgM com grau de
elevada pureza. Um desses métodos é a cromatografia de troca iônica e o outro é a filtração
em gel. A cromatografia de troca iônica é um dos métodos mais conhecidos para se fazer a
separação de proteínas séricas e o isolamento de imunoglobulinas. Esse método se
fundamenta no fato de as proteínas apresentarem cargas elétricas e poderem se ligar
eletrostaticamente na matriz de troca iônica, a qual possui uma carga oposta à das proteínas. A
força de interação com que as proteínas se ligam a esse tipo de matriz de troca iônica depende
da densidade de cargas elétricas da proteína bem como do pH e da força iônica do meio onde
a proteína se encontra. Dessa forma, para se eluir (“desligar”) as proteínas adsorvidas
eletrostaticamente a esse tipo de matriz, deve-se aumentar a força iônica do meio,
aumentando-se a concentração dos sais do tampão de eluição, uma vez que os sais
adicionados vão competir com as proteínas pelos sítios carregados dessa mesma matriz. Outra
forma de se promover a eluição é alterar o pH do tampão de eluição, pois, à medida em que o
pH do meio onde se encontra a proteína se aproxima do ponto isoelétrico dessa mesma
proteína, a somatória da carga elétrica da mesma se aproxima de zero, de forma que essa
proteína perde a capacidade de continuar ligada à matriz de troca iônica.
Há dois tipos básicos de matrizes de troca iônica: uma delas é recomendada para a
interação com proteínas carregadas positivamente, sendo a matriz trocadora de cátions, como
é o caso do carboxi-metil-celulose (CM-celulose), enquanto que o outro tipo é recomendado
para a interação com proteínas carregada negativamente, sendo a matriz trocadora de ânions,
como o dietil-amino-etil-celulose (DEAE-celulose). No caso de se fazer a separação de IgG, a
resina ou matriz recomendada é DEAE-celulose.
O método mais indicado para se conseguir um melhor grau de pureza e de rendimento
da fração IgG é se fazer primeiramente a precipitação da fração gama-globulina de um soro
sanguíneo com sulfato de amônio ou sulfato de sódio, tal como foi feito na aula anterior. Essa
fração gama globulina depois de dialisada para se eliminar o excesso de sais usados na
precipitação, depois de ter a sua concentração protéica determinada, é colocada em uma
coluna previamente montada de DEAE – celulose.
2.- Método para preparação da coluna deDEAE–celulose para a separação de Ig G

2.1.- Materiais
2.1.1- DEAE – celulose previamente embebido e carregado por tratamento com
soluções de ácido (HCl) em seguida álcali (NaOH).
2.1.2- Fração gamaglobulina previamente precipitada com sulfato de amônio e
dialisada com o mesmo tampão de eluição a ser usado na coluna de DEAE – celulose. A
concentração protéica dessa coluna deve ser previamente determinada.
2.1.3.- Coluna cromatográfica pequena (seringa de 10ml) já montada e preparada para
ser preenchida com DEAE-celulose e acompanhada de cânulas de pequenas pinças para
regulagem do fluxo da coluna.
2.1.4.- Tampão fosfato 0,01M pH 8,0.
2.1.5.- Frascos pequenos de coleta (frascos do tipo penicilina), rotulados com a
numeração de 1 a .
2.2.- Método
2.2.1.- Deixe o volume de tampão imediatamente acima da coluna abaixar abrindo

cuidadosamente a coluna, e aproveite para regular o fluxo da coluna para 12 gotas por minuto.
Quando não houver mais tampão acima da resina e com a coluna fechada, deve ser adicionada
a solução de gama globulina, com muito cuidado e com o auxílio da micropipeta. Em seguida,
abrir vagarosamente a coluna para deixar o solução de gama globulina entrar na resina,
fechando a coluna quando isso ocorrer. Adicionar, a seguir, com muito cuidado, um volume
de tampão de eluição. Conectar com o frasco de tampão com cânula e sifonado de modo a
permitir um fluxo continuado de tampão para a coluna de resina. Abrir o fluxo da coluna,
começar a colher as frações de 3 ml cada uma, aferindo o fluxo novamente para 12 gotas por
minuto.
2.2.2.- Faça a leitura das frações colhidas em espectrofotômetro UV, no comprimento
de onda de 280nm, contra um branco de tampão fosfato 0,005M pH 8,0.
2.2.3.- Faça um pool das frações com maior concentração proteíca e armazene a -20ºC
para ser testada na próxima aula, por imunoeletroforese.
Gama-Globulina
12 gotas/min
Figura 13 3ml
PERGUNTAS
1.- Qual o fundamento do processo de purificação de IgG por cromatografia de troca
iônica?
2.- A obtenção de IgG em alto grau de pureza poderia contribuir em quais aspectos ou
em que técnicas ?
3.- Que outros métodos são também indicados para a separação de imunoglobulinas
em elevado grau de pureza?
4.- Para a separação de IgG é indicado o uso de coluna cromatográfica trocadora de
ânions (DEAE-celulose). No caso da necessidade de separar uma proteína com cargas opostas
a da IgG, qual resina seria então recomendada?
REAÇÃO QUANTITATIVA DE SOROPRECIPITAÇÃO
Uma das primeiras observações da interação antígeno-anticorpo (Ag-Ac) é a formação

de precipitados que aparecem em um tubo de reação em meio líquido depois que tais
reagentes tenham-se combinado em determinadas proporções relativas.
A reação quantitativa de soro-precipitação se fundamenta nesse fato. Este teste se
constituiu com base de todos os estudos que foram feitos sobre os fenômenos decorrentes da
interação Ag-Ac.
Nesse tipo de reação, via de regra, quantidades crescentes de Ags são adicionadas a
diferentes tubos de ensaio apropriados contendo uma concentração constante de Ac e, ao
final, são determinadas as concentrações do precipitado Ag-Ac formado em cada tubo da
reação.
Nesse experimento, você determinará:
a-) A concentração de Acs de um soro teste
b-) O número de determinantes antigênicos (sítios que ligam os anticorpos) presentes
em uma molécula de Ag.
Materiais:
 Soro de Coelho anti-BSA com um título desconhecido (concentração) - fonte de
Acs.
 Soro Albumina Bovina (4mg/ml) - o Ag.
 Salina tamponada com fosfatos (PBS) pH 7,2.
 NaOH 0,1M.
 8 tubos de ensaio para precipitação.
 Micropipetadores de volume ajustável de 1000, 100 e 10l.
 Banho-Maria
 Geladeira
 Espectrofotômetro UV e cuvetas de quartzo para UV.
Metodologia:
 Marque cada um dos tubos de uma série de 6 com o volume de Ag que será a ele
adicionado.
 Adicone os seguintes volumes de Ag em cada tubo: 0, 5, 20, 35, 50, 100l.
 Adicione PBS a cada tubo para completar um volume de 300 l.
 Adicione 100µl de antissoro a cada tubo e misture bem.
 Incube por 1h a 37ºC em Banho-Maria e a seguir a 4ºC em geladeira por 1h.

 Centrifugue os tubos testes a 4000 (2000g) rpm/10 min.
 Remova o sobrenadante e transfira-o para um outro tubo devidamente identificado
como estava o tubo inicial.
 Conserve o precipitado (pellet).
Para calcular a concentração de Ac no antissoro:
 Lave o precipitado, ressuspendendo-o em PBS e re-centrifugando a 4000 (2000g)
rpm/10 min.
 Remova o PBS do sobrenadante e descarte-o.
 Ressuspenda o pellet colocando cada um dos tubos em um vórtex.
 Adicione 1ml de NaOH 0,1M a cada precipitado e leve para solubilizar no vórtex e
conserve mais 1ml de NaOH 0,1M para servir como branco no espectrofotômetro.
 Faça a leitura da absorbância no comprimento de onda de 280nm (A280) em um
espectrofotômetro UV.
Calcule a quantidade de Acs específicos contra BSA/ml de antissoro:
 A partir do gráfico, anote a quantidade de antígeno no ponto de equivalência, (o
ponto onde a quantidade máxima de precipitado se forma). Vide o exemplo abaixo:
a) A280 = 0,100  0l de Ag.

b) A280 = 0,370  5l de Ag.
c) A280 = 0,850  20l de Ag.
d) A280 = 1,08  35l de Ag***.
e) A280 = 0,740  50l de Ag.
f) A280 = 0,170  100l de Ag.
 Quantidade de Ag usado = 0,035ml (= 35l) x 4 (mg/ml BSA) = 0,140mg.

 Transformar essa quantidade de antígeno em A280nm, considerando que 1,9mg/ml
de BSA dá um A280nm = 1,0, então (0,140 x 1)/1,9= 0,073.
 Subtraia este valor da A280nm total do precipitado para obter a A280 da concentração
de Ac: A280 / Ac = A280(ppt) - A280(Ag). 1,08 – 0,073 = 1,007
 Transformar essa A280nm em quantidade de anticorpo, isto é IgG (mg/ml),
considerando que 0,7 mg de IgG corresponde a uma A280 = 1,0, você pode calcular
a concentração de Acs no ponto de equivalência (não se esqueça de levar em conta

todas as diluições que foram feitas):
 A280 (Ac) = 1,08 (= A280(pptado.) - 0,073 (=A280(Ag) = 1,007.
 1,007 x 0,7 (mg IgG=A280 1,0) = 0,705mg.
 100µl de antissoro foram usados em cada tubo, portanto a concentração de
anticorpos no soro original é 0,705 x 10= 7,05mg/ml.
Estimativa do Número de Determinantes Antigênicos na Molécula de Soroalbumina

Bovina:
O número de determinantes antigênicos em cada molécula de Ag pode ser estimado
quando se considera que em uma condição de extremo excesso de anticorpos todo
determinante antigênico vai estar ligado com pelo menos uma molécula individual de Ac. Se a
quantidade de Ac no precipitado formado sob essas circunstâncias é calculada, então os
números relativos de moléculas de Ac e Ag podem ser calculados, isto é:
Concentração de Ag : Concentração de Ac
P.M. Ag P.M. Ac
Em soros hiperimunes a maior parte dos Acs são do isótipo IgG que tem P.M de cerca
de 150.000 D. O Ag, BSA, apresenta um P.M. de 68.000. A relação entre as concentrações
molares de Ac para a molécula de Ag na sua menor concentração de Ag fornecerá uma
estimativa do número de determinantes antigênicos presentes em uma determinada molécula
de Ag.
Concentração de Ag : Concentração de Ac
P.M. Ag P.M. Ac
= 0,14 : 0,705 .
68.000 150.000
2,058 Moles BSA : 4,693 Moles IgG

Razão = 1 : 2,28, ou
aproximadamente 1 : 2
Portanto há 2 sítios ligantes na molécula de Ag (BSA), considerando um erro

experimental de aproximação de 2,28 para 2.
PERGUNTAS
1.- Como os Ags e Acs interagem?
2.- Responda verdadeiro (V) ou falso (F):

a) A maioria dos Acs reage com estruturas topográficas que dependem da conformação nativa
da molécula do Ag (epítopos conformacionais) ( )
b) Ags e Acs interagem através de ligações covalentes. ( )
c) Cada determinante antigênico em uma molécula de Ag representa um agrupamento de
epítopos dominantes. ( )
d) As forças de ligação que mantém ligado um Ag a um Ac são inversamente proporcionais à
distância entre essas moléculas. ( )
e) A especificidade do reconhecimento do Ac para o Ag é absoluta. ( )
CARACTERIZAÇÃO DA FRAÇÃO GAMA-GLOBULINA PRECIPITADA

POR IMUNOELETROFORESE.
1) REAÇÃO DE DE IMUNOELETROFORESE DE FRAÇÃO PURIFICADA

DE ANTICORPOS
1.1. Introdução e Generalidades

A imunoeletroforese é a combinação de eletroforese e de dupla difusão em gel de ágar;
é uma técnica que permite a discriminação de substâncias com base na carga elétrica, peso
molecular, tamanho, forma, concentração e propriedades antigênicas. O método original de
Grabar e William (l953-54) é feito em gel de ágar, procedendo-se na primeira etapa à
separação eletroforética dos componentes e, a seguir, cada componente se difunde, a partir de
seu centro de difusão, contra o imune-soro, formando, como na dupla imunodifusão, uma
linha ou arco de precipitação.
Somente na eletroforese teríamos:
+ -
Posição do soro antes da eletroforese
+ -
Posição do soro após a eletroforese
Centro
Gama-
Globulina
Albumina Alfa Beta Gama
Figura 15
Assim, este método permite a caracterização de uma substância simultaneamente por 3

parâmetros:
a) Características eletroforéticas (mobilidade em campo elétrico)
b) Velocidade de difusão (coeficiente de Difusão)
c) Especificidade imunoquímica (estrutura e composição dos determinantes
antigênicos).
Este método é atualmente aplicado a todos os ramos da pesquisa biológica, por seu
alto poder resolutivo, bastando mencionar que, enquanto a eletroforese permite a evidenciação
de 5 a 6 componentes no soro sanguíneo, a imunoeletroforese permite distinguir cerca de 30
componentes. Não se trata de maior sensibilidade, mas de maior poder discriminativo.
No micro-método são aplicados 2 a 5ul de soro sanguíneo ou de mistura protéica no
orifício do gel. Ao se passar a corrente elétrica, o soro se separa nos 5 componentes clásicos
da eletroforese de Tiselius: Albumina, Alfa-l, Alfa-2, Beta e Gama-globulinas de acordo com
suas cargas elétricas. Em função de seus coeficientes de difusão e da concentração, cada
componente difunde-se encontrando o Ac que lhe corresponde, forma-se um precipitado em
forma de arco de maior ou menor curvatura dependendo da dispersão dos Ags e cuja
intensidade é função da concentração do Ag e também da relação Ag/Ac.
1.2. Material
a) Solução de Bacto Ágar (Difco) a 1% em tampão Tris-Acetato pH 8,2 e
força iônica = 0,06;
b) Lâminas de Microscopia;
c) Pipetas de 5ml;
d) Micropipetadores e ponteiras para 10ul e 50ul;
e) Molde perfurador para imunoeletroforese;
f) Bomba de vácuo aplicada com kitassato, cânulas e pipetas Pasteur;
g) Placa de Preti com gaze umidecida e suportes para lâminas (Câmara
úmida);
h) Tampão tris-acetato pH 8,2 e força iônica de 0,113;
i) Fonte e cuba para eletroforese;
j) Antissoros anti-proteínas totais séricas de bovinos e de cobaias;
l) Tiras de papel de filtro;
m) "Cotonete" com gaze;
1.3. Técnica
a) Fundir o ágar em água fervente;
b) Aplicar com um cotonete sobre a lâmina uma camada de ágar, esperar secar;
c) Colocar, com pipeta, 2ml de ágar sobre as lâminas previamente revestidas com ágar
e tomar cuidado para não formar bolhas nem deformidades, esperar esfriar e solidificar;
d) Com o molde perfurador adequado, fazer os orifícios no gel e, em seguida, retirar os
fragmentos de ágar com a trompa de vácuo; (figura 03)
e) Cortar tiras de papel de filtro da largura da lâmina para fazer a ponte entre o tampão
e as lâminas;
f) Montar dentro da cuba, previamente preenchida com tampão, as lâminas, fazendo as
pontes entre os polos de cuba com tiras de filtro;
g) Aplicar em cada cavidade do ágar de 5 a 10ul da amostra a ser submetida à
eletroforese;
h) Fechar a cuba, ligar a fonte e regular a corrente para 6ml/lâmina, o que dá cerca de
50v/lâmina. Deixar a corrida prosseguir por 2h; (figura 04)
i) Desligar a fonte e retirar as lâminas. Em seguida, remover, com o auxílio da tampa
de vácuo, a canaleta de gel e adicionar dentro da canaleta o antissoro específico;
j) Levar as lâminas, com cuidado, para a câmara úmida e fazer a leitura 24-48 horas
depois;
IgG Bovina
Soro Total
Bovino
Figura 16
Tampão
de Corrida
Papel

+ -
V
Fonte de Energia
IgG
Soro anti
soro bovino
Soro Total IgG Bovina

Bovino
Albumina alfa beta Gama
Figura 17
PERGUNTAS
1) Como podemos identificar imunologicamente a fração gama-globulina precipitada
e da IgG purificada por cromatografia de troca iônica?
2) Quais os princípios da prova de imunodifusão dupla em gel de ágar e qual a sua
utilidade dentro da imunologia e, nesse caso, em particular?
3) Quais os princípios da prova de imunoeletroforese e qual a sua principal utilidade
dentro da imunologia e, nesse caso, em particular?
4) Qual dessas 2 técnicas (Imunodifusão dupla em gel de ágar e Imunoeletroforese)
fornece respostas mais completas e esclarecedoras, a respeito das características
imunoquímicas de uma mistura antigênica?
IMUNOHEMÓLISE - Experiência de Erlich Morgenroth Modificada
I. OBJETIVOS
Demonstrar os elementos que participam da reação de imunohemólise de hemácias de

carneiro: (figura 01)
(Ag) Antígeno - Hemácias de carneiro (E)
(Ac) Anticorpos - Hemolisina de coelho anti-E
C
(C) Complemento - Soro normal de cobaia
Ac
Ag
Figura 18
II. MATERIAL
l) Estante para tubo de hemólise (l2x75mm)
2) 3 tubos de ensaio l2x75mm
3) 4 pipetas de lml com graduação centesimal
4) Suspensão de hemácias de carneiro a 5%
5) Hemolisina (já diluída)
6) Complemento (soro normal de cobaio) já titulado
7) Solução fisiológica
III. TÉCNICA
l) Numerar os tubos l, 2 e 3
2) Pipetar 0,lml de suspensões de hemácias nos 3 tubos
3) Pipetar 0,lml de hemolisina nos tubos l e 2
4) Pipetar 0,5ml de complemento nos tubos l e 3
5) Pipetar solução fisiológica: (figura 02)
- 0,8ml no tubo l
- l,3ml no tubo 2
- 0,9ml no tubo 3
6) Incubar em B.M. a 37ºC por 30 minutos
Solução Tampão 0,8ml 1,3ml 0,9ml

Complemento 0,5ml 0,5ml
Hemolisina 0,1ml 0,1ml
0,1ml 0,1ml 0,1ml
Hemácia
s 1 2 3
Figura 19
IV - RESULTADOS E INTERPRETAÇÃO
Uma vez realizada a leitura da experiência procedente, prosseguir do seguinte modo:

(figura 03)
7) Centrifugar os tubos 2 e 3
8) Abandonar o sobrenadante do tubo 2
9) Decantar o sobrenadante do tubo 3 sobre as hemácias do tubo 2 e agitar este tubo
para ressuspender as hemácias
10) Sobre o sedimento do tubo 3, colocar hemolisina (0,lml) e solução salina (l,3ml).
Agitar para ressuspender as hemácias
11) Incubar os tubos 2 e 3 em B.M. a 37ºC por 30 minutos (figura 04)
Figura 20 Tubo 1 Figura 21 Tubo 2
Figura 22 Tubo 3
V. RESULTADOS FINAIS E INTERPRETAÇÃO
2 3
Tubo 2 Tubo 3
Figura 23
PERGUNTAS
1) Quais os elementos que participam de uma reação de imunohemólise e qual o papel

de cada um deles nessa reação?
2) O que é Sistema Complemento?
3) Em que circunstâncias o Sistema Complemento é ativado na ausência de
anticorpos?
4) Explique o que ocorreria com a reação de imunohemólise se o soro normal de
cobaia tivesse sido incubado por 30 min a 56ºC?
TÉCNICA DE IMUNODIFUSÃO DUPLA EM GEL DE AGAR PARA

TITULAÇÃO DE SORO ANTI GAMA-GLOBULINA
Imunodifusão: Termo utilizado para designar testes sorológicos realizados em meio

gelificado, no qual os reagentes só se misturam por difusão.
Este teste foi introduzido para substituir o teste de precipitação em meio líquido, que
tem alguns inconvenientes, por um teste de difusão e precipitação em gel de ágar que tem
algumas vantagens.
- Difusão simples em uma dimensão - Oudin
- Difusão dupla em duas dimensões - Ouchterlony
Dupla difusão em gel de ágar: Reação de precipitação entre o Ag e o Ac específico
em meio gelificado, onde ambos os reagentes se difundem um contra o outro, formando uma
linha ou arco de precipitação (figura 01) na área de reação.
Essa técnica permite avaliar com relativa facilidade os "componentes antigênicos"
encontrados em misturas complexas. Permite também revelar se duas ou mais substâncias são
imunologicamente idênticas ou independentes.
Essa prova geralmente é feita sobre lâminas de microscopia ou placas de Petri,
revestida com uma camada de gel de ágar em solução fisiológica ou tamponada. Vários
fatores influem na velocidade da difusão, entre as quais, o tamanho dos poros de gel, a
temperatura, a concentração e pureza do ágar e, os mais importantes, as concentrações das
substâncias reagentes e o tamanho e forma molecular dos reagentes.
Figura 26
Material
1) Solução de ágar a l% em solução fisiológica

2) Lâmina de microscopia
3) Pipeta graduada de 5ml
4) Micropipetadores de 10 e 20 ul
5) Solução do Ag (Gama Globulina a lmg de proteína por/ml)
6) Soros de cobaios imunizados com Gama Globulina e adjuvante completo de Freund
ou com adjuvante incompleto de Freund ou com Al(OH)3 mais saponina e com Al(OH)3
contendo, portanto, Acs anti-Gama Globulina.
7) Molde perfurador de ágar
8) Placas de Petri com algodão umidecido (Câmara úmida)
9) l5 tubos de hemólise e estantes
10) Pipetas de lml
11) Solução salina
Metodologia:
1) Fundir o ágar em banho-maria de água fervente;

2) Aplicar com cotonete sobre a lâmina uma camada de ágar. Esperar secar;
3) Colocar, com a pipeta, 3ml de ágar sobre as lâminas previamenrte revestidas com
cuidado para não formar bolhas, nem deformidades. Esperar esfriar e solidificar. Manter as
lâminas em câmara úmida para não dessecar o gel;
4) Com o molde perfurador adequado, fazer os orifícios no gel e, em seguida, retirar os
fragmentos de ágar com uma agulha hipodérmica. Manter a lâmina em câmara úmida para
evitar o dessecamento do gel;
5) Diluir os soros de cobaio anti-gama globulina a l/2, l/4, l/8, l/l6 e l/32, distribuindo
em cada um dos 5 tubos 0,5ml de solução salina e, depois, no lº tubo colocar 0,5ml de soro.
Homogeneizar bem e passar 0,5ml para o 2º tubo e assim sucessivamente até o último tubo;
6) Aplicar, usando um micropipetador, 10 ul para cada amostra, Ag, gama globulina
(lmg/ml), as diluições do soro de cobaio anti-gama globulina de acordo com o seguinte
esquema (figura 02):
0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml

1/2 1/4 1/8 1/16 1/32
0,5ml salina 0,5 ml salina 0,5ml salina 0,5ml salina 0,5ml salina
0,5ml soro
1/32
Soro puro
1/16 Ag
1/2
1/4
1/8
Figura 27
No centro, colocar o Ag (Solução de gamaglobulina na concentração de 1mg/ml), nos

poços numerados e periféricos, colocar o soro: no nº lº - soro puro, nº 2 - soro diluído 1/2, no 3
- diluído1/4, nº 4 – diluído 1/8, no5 – diluído 1/16 e no no 6 – diluído 1/32. (figura 02)
7) Colocar a lâmina dentro de uma placa de Petri com um algodão molhado dentro
para manter a umidade;
8) Fazer a leitura após 24-48 horas, anotando até que diluição houve reação.
PERGUNTAS
1) Que tipos de antígenos são revelados pela reação de soroprecipitação?
2) Qual o mecanismo da reação de soroprecipitação?
3) Quais as utilidades do emprego da reação de imunodifusão dupla em gel de Agar,
em medicina veterinária?
4) Como se faz para titular anticorpos de um soro precipitante?
REAÇÃO DE SOROAGLUTINAÇÃO PARA TITULAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-

HEMÁCIAS DE CARNEIRO
As reações de aglutinação são reações de floculação celular em que o antígeno é

constituído por suspensão homogênea de células. Estas células podem ser bactérias, hemácias
etc, que normalmente são vistas no microscópio, mas quando aglutinadas, elas formam flocos
ou flóculos que são aglomerados visíveis a olho nu. Um dos requisitos essenciais para se
proceder a reação de aglutinação é que se possua uma suspensão celular estável. É óbvio,
também, que tal reação se verifica somente com antígenos que estão situados na superfície
celular.
Características dos antígenos e anticorpos envolvidos na reação de soroaglutinação:
 Antígenos aglutinantes – de natureza particulada (insolúveis), como células
procariotas e eucariotas.
 Devem ser, no mínimo, bivalentes.
Características dos anticorpos envolvidos na reação de soroaglutinação:

 Depende da classe isotípica – Ig M tem maior atividade aglutinante, enquanto
que a Ig G tem menor atividade.
 Anticorpos devem ser, no mínimo, bivalentes quanto à capacidade de se ligar
aos antígenos específicos.
Explicação do fenômeno da aglutinação:
Duas explicações são mais correntemente aventadas:
1) Revestimento da superfície do antígeno pelo anticorpo o que transformaria a
suspensão celular de hidrófila em hidrófoba e daí a aglutinação. (figura 01)
Perda da camada
de solvatação
Antígenos
particulados
hidrófilos
Hidrófobo Agregação - Aglutinação
Figura 29
2) Teoria "das malhas" da qual os aglomerados seriam constituídos de células ligadas entre si
pelos anticorpos. (figura 02)
Excesso de Anticorpos Excesso de Antígenos
Zona de Equivalência
Figura 30
Técnicas das reações de aglutinação:
As reações de aglutinação podem ser executadas sobre lâminas de microscopia ou
placas de vidro, em tubos de ensaio e em microplacas. Elas podem ser:
1) Reações qualitativas.
2) Reações quantitativas.
Na aula prática, os alunos terão uma demonstração sobre reação de aglutinação
quantitativa feita em placas (micrométodo) usando soros anti-hemácias de carneiro e
suspensão antigênica de hemácias de carneiro.
Material necessário:
1) Microplacas plásticas para hemaglutinação.
2) Soros de camundongos (imunização feita em aula prática pelos grupos 2, 6, 3 e 7).
3) Suspensão de hemácias de carneiro a 1%.
4) Solução salina (0,l5M).
5) Micropipetadores de 25 ul
Técnica da Reação:
1) Adicionar um volume de 25ul de diluente (PBS) em todas as cavidades das fileiras
A e B da microplaca (0,025ml).
2) Colocar na primeira cavidade da fileira A1 e B1 25ul (0,025ml) do soro positivo de
camundongos
3) Com uma micropipeta de 25ul , começar a homogeneizar a primeira cavidade da
fileira A, contendo o soro e, sem tocar na superfície ou na borda da placa, transferir 25ul para
a segunda cavidade da fileira A2. Novamente homogeneizar bem e, com os mesmos cuidados,
transferir 25ul para a terceira cavidade e assim sucessivamente até a 11ª cavidade (A11), pois
para a última não será transferida nenhum volume da diluição dos soros e esta cavidade
servirá como controle da suspensão antigênica de hemácias. No final, portanto, teremos as
seguintes diluições dos soros: l/2, l/4, l/8, l/l6, l/32, l/64, l/l28, l/256, l/5l2, l/l024, l/2048.
4) Repetir a mesma operação para a fileira B.
5) Colocar em todas as cavidades das duas fileiras 25ul (0,025ml) da suspensão de
hemácias de carneiro.
6) Agitar com cuidado a placa e incubar por 40-60 minutos à temperatura ambiente.
7) Fazer a leitura da reação e, comparando os resultados dos soros e fazer a
interpretação dos resultados.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 Controle
A
Figura 31
PERGUNTAS
1) Quais os mecanismos da reação de soroaglutinação?
2) Que tipos de antígenos participam da reação de soroaglutinação?
3) Qual(is) a(s) utilidade(s) da reação de soroaglutinação, no sorodiagnóstico em
medicina veterinária?
4) Como se procede para titular anticorpos de um soro aglutinante?
MÉTODO INDIRETO DE ELISA PARA DETECÇÃO E TITULAÇÃO DE

ANTICORPOS DE COBAIA ANTI-GAMAGLOBULINA BOVINA
Trata-se de um método extensivamente usado para detecção e/ou titulação de

anticorpos específicos presentes em soros sangüíneos. A especificidade desse ensaio
imunoenzimático é direcionada pelo antígeno presente na fase sólida (superfície da
microplaca), o qual pode ser uma preparação altamente purificada, ou então preparações
semi-purificadas, ou até mesmo brutas. Após adição e incubação do antígeno (Ag), as
cavidades da microplaca serão lavadas para eliminar o excesso e os antígenos não ligados à
superfície dessas mesmas cavidades. Os soros contendo os anticorpos contra esse Ag podem
ser então adicionados, diluindo-os em tampão apropriado que impeça a ligação não específica
dos anticorpos a sítios livres presentes na superfície da microplaca, os quais não foram
ocupados pelas molécula de Ag. Os soros podem ser adicionados com diluição única, ou com
diluição seriada. Após incubação das diluições séricas, as cavidades devem ser novamente
lavadas para se eliminar o excesso de anticorpos não ligados.
Os anticorpos combinados ao Ag são então detectados após incubação com o
conjugado imunoenzimático anti-imunoglobulinas ou anti-Ig G da espécie cujos anticorpos se
pretende titular. O conjugado deve ser diluído no mesmo tampão em que foram diluídos os
soros. Após incubação e lavagem das cavidades da microplaca, é adicionada às cavidades uma
solução de substrato imunoenzimático (água oxigenada) e cromógeno (orto-fenilenodiamina),
incubando-se a reação para desenvolvimento de cor e, ao final, depois de bloqueada a reação
enzimática, devem ser lidas as densidades ópticas (DOs),em leitor de microplacas no
comprimento de onda de 490nm.
O esquema básico do método indireto do Elisa é o seguinte:

 Ag + Ac (?) + conjugado I.E. + S leitura de Dos
Ag – preparação antigênica solúvel de gamaglobulina bovina
Ac – soros-teste de cobaia
Conjugado I. E. – conjugado de Ig G de coelho anti-Ig G de cobaia com peroxidase
S – substrato
Observar esquema abaixo (figura 01):
Antígeno Soro Antiglobulina Substrato Reação

Marcada com enzimático de cor
enzima
Lavagem Lavagem Lavagem
Substrato Enzimático
Antiglobulina marcada com
enzima
Anticorpo
Bloqueador
Antígeno
Figura 34
Material
 Preparação antigênica solúvel de gamaglobulina bovina
 Soros-teste de cobaias imunizadas anteriormente com antígeno citado +
adjuvantes distintos (ACF – Adjuvante Completo de Freund; AIF – Adjuvante Incompleto de
Freund; Al(OH)3 – Hidróxido de alumínio)
 Conjugado de Ig G de coelho anti-Ig G de cobaia com peroxidase (enzima)
 Peróxido de hidrogênio (H2O2 – água oxigenada) a 3% (substrato)
 Orto-Fenileno-Diamina – OPD (cromógeno)
 Microplacas para Elisa
 Tampão Carbonato-Bicarbonato pH 9,6 a 0,05M
 Tampão PBS pH 7,4
 Tampão PBST pH 7,4 + 10% de LPD (Leite em Pó Desnatado)
 Solução de HCl concentrado 2N
Procedimento
1. Adicionar volumes de 50L da solução antigênica em sua diluição ideal de uso
(1g/mL) preparada em Tampão Carbonato-Bicarbonato (1:12500). Incubar a reação over-
night, em geladeira. Ao final, lavar as cavidades da microplaca 4 – 5 vezes com PBS.
2. Bloquear as cavidades da microplaca através da adição de LPD a 10% em
TCB, incubar a reação por 45 minutos a 37ºC. Ao final, lavar a microplaca como no item
anterior.
3. Adicionar as diluições das amostras de soros-teste preparadas em tampão
PBST + LPD. Incubar a reação por 60 minutos a 37ºC. Ao final, lavar novamente, conforme
já descrito.
4. Adicionar o conjugado em sua diluição ideal de uso (1:2000) preparada em
tampão PBST + LPD. Incubar por mais 60 minutos a 37ºC. Ao final, lavar novamente.
5. Adicionar a solução de substrato (H2O2) + OPD. Incubar, sob proteção da luz,
por 15 minutos e, então, bloquear a reação com HCl.
6. Fazer a leitura (figura 02) das DOs. Determinar a DO média dos controles para
obtenção dos títulos de Acs presentes nos soros.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800 1/25600 1/51200 1/100240
ACF A
AIF
C
D
AlOH E
F
Sem G
Adjuvante
H
Figura 35
PERGUNTAS
1) Em que se baseia e quais são os mecanismos / passos principais da reação
imunoenzimática de ELISA?
2) Que tipos de antígenos e anticorpos participam da reação imunoenzimática de
ELISA?
3) Qual(is) a(s) utilidade(s) do teste de ELISA, no sorodiagnóstico em medicina
veterinária?
4) Como se procede para titular anticorpos de um soro no teste de ELISA?
SDS-PAGE e Western blotting

Técnicas de SDS-PAGE e de Western-Blotting
Soro normal de bovino, gamaglobulina bovina e IgG bovina
1. Preparo do gel (gel a 12%)

No preparo do gel, são feitos dois géis, um para ser corado com Comassie blue
e outro para ser transferido para a membrana de PVDF, na quais era feito o
western blotting. Obs: Um gel é o espelho do outro.
Gel de separação Gel de empilhamento
Separating gel buffer (pH8,8) – 4 mL Stacking gel buffer (pH6,0) – 3 mL
Acrilamida-bisacrilamida – 3,2 mL Acrilamida-bisacrilamida – 0,5 mL
Água MilliQ – 0,8 mL Persulfato de amônio 10% - 80 µL
Persulfato de amômio 10% - 120 µL TEMED – 8 µL
TEMED – 12 µL
Preparo da amostra
60 µL da amostra (proteína a ser testada) (soro normal bovino, gamaglobulina
bovina e IgG bovina)
20 µL tampão da amostra 4X
8 µL de ß-mercaptoetanol
Ferver por 2 minutos e aplicar no gel 30µg de proteína a ser testada.
2. Eletroforese do gel de poliacrilamida

A corrida é feita em média por 2 horas a 100 V, logo após este período um dos
géis é corado com Comassie blue e o outro é tranferido para a membrana.
3. Transferência para a membrana
Tampão de transferência
100 mL de CAPS 10X
100 mL de metanol
800 mL de Água MilliQ
Cortar 2 papéis Watmann de 3mm nas seguintes medidas: 10X7cm
Cortar a membrana de PVDF: 9X6cm

Para a transferência deve-se montar um “sanduíche” onde todos os materiais
envolvidos (papel Watmann, esponjas, cassete de transferência, membrana de PVDF) devem
ser embebidos no tampão de transferência.
O “sanduíche” deve obedecer a seguinte seqüência:
- placa preta, - esponja, - papel watmann, - gel, - membrana de PVDF, - papel
watmann, - esponja, - placa branca
Após a montagem do sanduíche este é colocado no cassete de transferência, e esta é
feita por 45 minutos, a 4ºC, a 90V.
1. Western blotting
Após a transferência das proteínas do gel para a membrana de PVDF, segue-se o
western blotting:
1. Retirar a membrana e colocar Ponceau sob agitação para detectar a transferência.
2. Lavar com água MilliQ sob agitação, para retirar o Ponceau
3. Bloquear a membrana com PBS-T + 2% BSA (0,5g de BSA + 10 mL de PBS-
T), incubar por 2 horas sob agitação.
4. Adicionar o conjugado anti-IgG bovina, na diluição de 1:1000 (10 µL do
conjugado anti-IgG bovina + 5 mL de PBS-T), incubar por 1 hora sob agitação.
5. Lavar a membrana 4X com PBS-T por 5 minutos
6. Lavar a membrana 1X com PBS por 10 minutos
7. Diluir 3 comprimidos de DAB e 3 comprimidos de uréia em 3 mL de água
MilliQ, sob agitação. Adicionar esta solução a membrana, esperar alguns
minutos até que apareça algum sinal, no máximo 5 minutos, e após este período
bloquear a reação com água MilliQ.
2. Coloração do gel de poliacrilamida

- Retirar o gel da cuba e depois do suporte com a ajuda dos espaçadores. Cortar o
gel de empilhamento.
- Mergulhar o gel na solução descorante-corante sob agitação por 5 minutos.
- Passar para a solução corante (Comassie Blue) sob agitação por 15 minutos.
- Transferir para a solução descorante. Deixar por 3 horas, trocando a solução
quando esta estiver saturada.
PERGUNTAS
1) Em que se baseia e quais são os passos principais das técnicas de poliacrilamida
gel-eletroforese (PAGE) e de Western-blotting (W.B.)?
2) Que tipos de antígenos e anticorpos participam da técnica de Western-blotting?
3) Qual(is) a(s) utilidade(s) das técnicas de PAGE e de W.B., no sorodiagnóstico em
medicina veterinária?
4) Como se procede para caracterizar um antígeno proteico pelas técnicas de PAGE e
de W.B.?
TESTES RÁPIDOS DE SORODIAGNÓSTICO –

TESTES IMUNOCROMATOGRÁFICOS
A ampliação do acesso ao diagnóstico é um desafio aos programas de saúde humana e

veterinária. Os testes laboratoriais convencionais de sorodiagnóstico são operacionalmente
complexos, requerem profissionais especializados e infraestrutura laboratorial apropriada.
Além disso, o prazo para entrega dos resultados desses testes pode ser longo, levando o
indivíduo a se desinteressar pelo resultado do teste e à consequente perda deste pelo sistema
de saúde, ou não atender a demanda por decisões mais rápidas para o estabelecimento de
procedimentos terapêuticos e, principalmente, medidas mais efetivas de controle.
No início da década de 1990, uma nova estratégia diagnóstica surgiu. Chegaram ao
mercado, os testes rápidos. Com o avanço das tecnologias de desenvolvimento e produção,
esses testes revelaram-se eficientes na investigação de doenças infectocontagiosas. Desde
2005, a utilização dos testes rápidos permite atender à crescente demanda pelo diagnóstico de
agravos relevantes à saúde publica, visto que sua utilização aumenta a agilidade da resposta
aos indivíduos e permite seu rápido encaminhamento para assistência médica e início de
tratamento.
Testes rápidos são aqueles cuja execução, leitura e interpretação dos resultados são
feitas em, no máximo, 30 minutos. Além disso, são de fácil execução e não necessitam de
estrutura laboratorial.
Testes rápidos são, primariamente, recomendados para exames presenciais de

sorodiagnóstico. Podem ser feitos com amostra de sangue total obtida por punção venosa ou
da polpa digital, ou com amostras de fluido oral. Dependendo do fabricante, podem também
ser realizados com soro e (ou) plasma. A execução dos testes rápidos, habitualmente, é muito
simples e a capacitação de pessoal pode ser realizada presencialmente, ou por meio de ensino
a distância.
A primeira vantagem significativa dos testes rápidos é que eles possibilitam a

liberação dos resultados e a tomada de decisões sobre o diagnóstico em uma única ocasião em
que se obtém amostras de um paciente ou de um indivíduo suspeito de ter sido acometido por
uma doença infecciosa.
Os testes rápidos não necessitam de estruturas laboratoriais ou de profissionais
graduados para sua execução, assim como dispensam o transporte de amostras e a necessidade
de coleta de sangue venoso. Além disso, a aplicação de testes rápidos auxilia na prevenção da
transmissão vertical de agentes infecciosos, facilita o diagnóstico em populações-chave.
Esses testes, que podem ser realizados durante atendimento ou consulta em qualquer
local, aumentam a probabilidade de solucionar os diagnósticos de doenças infecciosas aos
indivíduos acometidos e também podem fornecer dados importantes sobre a situação
imunológica desses indivíduos.
Dentre os testes rápidos de sorodiagnóstico destaca-se a técnica de testes

imunocromatográficos, que é uma metodologia de detecção baseada na utilização de tiras de
um material de suporte (nitrocelulose) impregnadas com reagentes dessecados / liofilizados
(anticorpos ou antígenos conjugados a partículas coloridas constituídas por ouro ou prata
coloidais) que são ativadas, interagem com os analitos das amostras testes e migram por
cromatografia pelos microcanais da membrana do suporte após a aplicação de amostras testes

fluidas, revelando ao final resultados em locais do suporte sólido nos quais estão imobilizados
anticorpos de captura para cada sistema ou alvo do analito que se busca detectar. Aplicações
desta metodologia incluem testes para detecção de patógenos e/ou de seus anticorpos
específicos, drogas, hormônios e metabolitos presentes em amostras médicas, veterinárias,
alimentos, e de análises ambientais e outros.
Como funciona para a detecção de anticorpos anti-antígenos específicos?
1. A amostra de soro teste é colocada no local indicado, na membrana (área A).

2. A solução tampão é colocada sobre a amostra.
3. Os anticorpos da amostra fluem lateralmente pela membrana, passando pela área I,
onde se inicia a ligação com o conjugado e prosseguem em direção à área de teste (T).
4. Na área T, o complexo anticorpo-conjugado liga-se aos antígenos do agente
infeccioso investigado que está imobilizado em uma linha da membrana do suporte,
formando uma linha (ou banda) colorida.
5. O conjugado não ligado ao anticorpo e o excesso do complexo imune continuam a
migração, ao longo da membrana de nitrocelulose, em direção à área C, onde são capturados
por anticorpos anti-imunoglobulina, formando outra linha (ou banda) colorida.
Detecção de Ag do vírus da cinomose pelo teste imunocromatográfico:-
 Amostra: mucosa nasal, conjuntiva, saliva, urina, soro e plasma;
 Kit: diluente, swab esterilizado, conta-gotas (pipeta) e dispositivo teste;
 Materiais necessários não fornecidos: solução salina e cronômetro.
 Quando o teste começar a reagir , deve-se observar uma cor rosa se movendo através
da janela de resultado no centro do dispositivo de teste.
 Se esta não for visualizada após 1 minuto, adicionar mais uma gota da amostra +
diluente no orifício;
 Interpretar o resultado do teste entre 5 e 10 minutos. Não interpretar o resultado em

um tempo superior a 12 minutos.

Preparação de antígenos para imunização

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Preparação de antígenos para imunização

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Unesp - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

ROTEIRO DE AULAS TEÓRICO-PRÁTICAS EM

HÉLIO JOSÉ MONTASSIER

Testes Rápidos de Sorodiagnóstico – Testes Imunocromatográficos 43

INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS DE LABORATÓRIO EM IMUNOLOGIA

São imprescindíveis para o estudo e o desenvolvimento do conhecimento em

Principais preparações antigênicas usadas em atividades experimentais em

01. Preparo de suspensão de hemácias de carneiro a 2%: (Antígeno Particulado

1.- Materiais e Métodos:

1.1. Sangue de carneiro colhido em solução anti-coagulante de Alsever1 (v : v)

(Exercício teórico) (Antígeno Solúvel Indutores de Anticorpos Soroneutralizantes)

03. Técnica de diluições seriadas:

Exemplo 1. Diluições sucessivas com razão constante igual a 2 (figura 03)

4) Transferir 1 ml do tubo 2 para o tubo 3.

Assunto 01- figura 03

Material 1ml 1ml 1ml 1ml

1/10 1/100 1/1.000 1/10.000 1/100.000

PREPARO DE ANTÍGENOS PARA IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS

ESTUDAR AS BASES DA IMUNOLOGIA

ESTUDAR MODELOS DE FENÔMENOS IMUNOLÓGICOS

Antígeno + Estímulo do Sistema Imune = Resposta Imune (Resposta Imune

Características fundamentais das respostas imunes:

I - PREPARO DE SOLUÇÃO DE GAMA GLOBULINA BOVINA

1ml de ACF ou 1ml deAIF

7 volumes de GGB 3 volumes de Hidróxido

II - PREPARO DE SUSPENSÃO ANTIGÊNICA DE ERITRÓCITOS DE

Hemácias Hemácias Hemácias

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3

Espera-se que ocorra:

Antígeno Sistema Imunológico Respostas Imunológicas

Principais fatores que interferem na imunogenicidade dos Ags:

PURIFICAÇÃO PARCIAL DOS ANTICORPOS PRESENTES NO SORO

3.1. Juntar 5ml de soro com 5ml de P.B.S.

V - volume final de soro + PBS

3.4. Continuar agitando por mais 30 minutos.

Remoção da Camada de Solvatação

Precipitação das Globulinas

3.6. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com solução de sulfato de amônio a

Obs.: Cálculo da solução do sulfato de amônio a 42% de saturação:

X = 30 x 42 V = Vol. desejado da solução (30 mL)

1) O que são imunoglobulinas e quais as suas principais propriedades físico-químicas

PURIFICAÇÃO DE IgG ATRAVÉS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA

1.- INTRODUÇÃO E GENERALIDADES

2.- Método para preparação da coluna deDEAE–celulose para a separação de Ig G

2.2.1.- Deixe o volume de tampão imediatamente acima da coluna abaixar abrindo

REAÇÃO QUANTITATIVA DE SOROPRECIPITAÇÃO

Uma das primeiras observações da interação antígeno-anticorpo (Ag-Ac) é a formação

 Incube por 1h a 37ºC em Banho-Maria e a seguir a 4ºC em geladeira por 1h.

a) A280 = 0,100  0l de Ag.

 Quantidade de Ag usado = 0,035ml (= 35l) x 4 (mg/ml BSA) = 0,140mg.

a concentração de Acs no ponto de equivalência (não se esqueça de levar em conta

Estimativa do Número de Determinantes Antigênicos na Molécula de Soroalbumina

2,058 Moles BSA : 4,693 Moles IgG

Portanto há 2 sítios ligantes na molécula de Ag (BSA), considerando um erro

1.- Como os Ags e Acs interagem?

2.- Responda verdadeiro (V) ou falso (F):

CARACTERIZAÇÃO DA FRAÇÃO GAMA-GLOBULINA PRECIPITADA

1) REAÇÃO DE DE IMUNOELETROFORESE DE FRAÇÃO PURIFICADA

1.1. Introdução e Generalidades

Posição do soro antes da eletroforese

Posição do soro após a eletroforese

Albumina Alfa Beta Gama