UNIVERSIDADE DO VALE DO RIO DOS SINOS - UNISINOS

UNIDADE ACADÊMICA DE GRADUAÇÃO

CURSO DE BIOMEDICINA

NICOLE WESTHÄUSER DA SILVA

GABRIELLE PEREIRA TRISCH
TIFANY TAILA DE OLIVEIRA

RELATÓRIO ATIVIDADE VIVENCIAL: Imunoensaio enzimático ELISA para

detecção de anticorpos IgG anti-CMV

São Leopoldo
2022
 NICOLE WESTHÄUSER DA SILVA
TIFANY TAILA DE OLIVEIRA

RELATÓRIO ATIVIDADE VIVENCIAL: Imunoensaio enzimático ELISA para

detecção de anticorpos IgG anti-CMV

Trabalho apresentado para a disciplina

Imunologia, pelo Curso de Biomedicina da
Universidade do Vale do Rio dos Sinos –
UNISINOS, ministrada pelo(a) professor(a)
Mellanie Fontes Dutra.

São Leopoldo
2022
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1. OBJETIVOS GERAIS

O objetivo do imunoensaio enzimático ELISA realizado na aula prática de Imunologia foi

detectar anticorpos do tipo IgG, ou seja, anticorpos que sinalizam infecção passada, de
citomegalovírus. Com o auxílio da bula do kit ELISA, foram seguidas todas as instruções e
analisados os resultados em amostras de soro de paciente com o auxílio do professor durante a
aula, incluíndo a leitura no espectrofotômetro, diluições e análise dos resultados obtidos.

2. MATERIAIS E REAGENTES

 Pipetas automáticas de precisão

 Ponteiras descartáveis
 Água deionizada
 Vórtex
 Cronômetro
 Vidraria
 Papel absorvente ou toalha de papel
 Leitora de microplaca
 Placa: 01 placa de poliestireno com 96 microcavidades (8x12) destacáveis revestidas
com antígenos purificados de CMV. Manter a placa acondicionada dentro da
embalagem plástica contendo dessecante. Conservar entre 2-8ºC.
 Diluente de Amostras: 01 frasco com 12 mL de Tampão Tris e 0,1% ProClin™300
como preservativo.
 Calibrador 01: 01 frasco com 1 mL de soro humano diluído, não reagente para
anticorpos CMV IgG e 0,1% ProClin™300 como preservativo. Líquido, pronto para
uso.
 Calibrador 02 (CUT-OFF): 01 frasco com 1mL de soro humano diluído, contendo 15
UI/mL de anticorpos CMV IgG e 0,1% ProClin™300 como preservativo. Líquido,
pronto para uso.
 Calibrador 03: 01 frasco com 1 mL de soro humano diluído, contendo 60 UI/mL de
anticorpos CMV IgG e 0,1% ProClin™300 como preservativo. Líquido, pronto para
uso.
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 Calibrador 04: 01 frasco com 1 mL de soro humano diluído, contendo 150 UI/mL de
anticorpos CMV IgG e 0,1% ProClin™300 como preservativo. Líquido, pronto para
uso.
 Conjugado: 01 frasco com 12 mL de anticorpo anti-IgG humano marcado com
peroxidase e 0,1% ProClin™300 como preservativo. Líquido, pronto para uso.
 Substrato A: 01 frasco com 8 mL de Tampão Citrato-Fosfato, contendo peróxido de
hidrogênio e 0,1% ProClin™300 como preservativo.
 Substrato B: 01 frasco com 8 mL de TMB (Tetrametilbenzidina) e 0,1%
ProClin™300 como preservativo.
 Solução de Bloqueio: 01 frasco com 8 mL de Ácido Sulfúrico 0,5M.
 Solução de Lavagem (25X): 01 frasco com 50 mL de Tampão Tris-HCL contendo
0.1% Tween 20 e 0.1% ProClin™300 como preservativo.

3. PRINCÍPIO DA TÉCNICA

O kit CMV IgG Elisa é um teste imunoenzimático em fase sólida, baseada no princípio
indireto para a detecção qualitativa e quantitativa de anticorpos IgG contra CMV em soro ou
plasma humano. A microplaca é revestida com antígenos CMV. Durante os testes, o diluente
de amostra e as amostras são adicionados à microplaca revestida por antígenos, e esta é então
incubada. Se as amostras contiverem anticorpos IgG para a CMV, estes se ligarão aos
antígenos revestidos na microplaca formando complexos antígenos-anticorpos. Se as
amostras não contiverem anticorpos IgG para o CMV, os complexos não serão formados.
Após a incubação inicial, a microplaca é lavada para remoção de materiais não ligados. Um
conjugado enzimático anti-IgG humano é adicionado à microplaca que é incubada
novamente. O conjugado enzimático anti-IgG humano se ligará ao complexo antígeno-
anticorpo previamente formado. Após a segunda incubação, a microplaca é lavada para
remoção de materiais não ligados. Os substratos A e B são adicionados e, em seguida, a
placa é incubada produzindo uma coloração azul que indica a quantidade de anticorpos CMV
IgG presentes na amostra. A solução de ácido sulfúrico 0,5M é adicionada à microplaca para
interromper a reação, produzindo uma mudança de cor de azul para amarelo. A
intensidade da cor, que corresponde à quantidade de anticorpos CMV IgG presentes na
amostra, é medida com um leitor de microplacas em 450/630-700 nm ou 450 nm.
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4. IMPORTÂNCIA DA TÉCNICA ELISA E CONTEXTO AGENTE

INFECCIOSO

O teste de ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) é amplamente utilizado para
realizar diagnóstico de doenças autoimunes bem como infecciosas e alérgicas. Isso porque, a
fisiopatologia das causas supracitadas desencadeia a produção de imunoglobulinas que é a
base do teste. A enzima mais comumente usada nesta prova á a peroxidase, responsável por
catalisar a reação de desdobramento da água oxigenada (H 2O2) em H2O mais O2. Dessa
forma, esse método possibilita tanto a identificação de antígenos, quanto a de anticorpos
específicos no plasma sanguíneo. Por apresentar baixo custo e alta especificidade e
sensibilidade esse método tornou-se imprescindível para um bom diagnóstico, como por
exemplo na atual pandemia do Coronavírus. Existem inúmeras patologias que podem ser
diagnosticadas através desse método, dessa forma é fundamental o conhecimento das técnicas
bem como a interpretação do resultado oferecido.
O citomegalovírus (CMV) é um membro da família do herpes vírus. Hoje, é reconhecido
como um patógeno que afeta a todas as faixas etárias, tendo caráter endêmico em todo o
mundo e levando a graves lesões congênitas. A infecção pelo CMV causa um grande espectro
de manifestações clínicas, variando de evoluções assintomáticas e infecções subclínicas a
quadros de maior gravidade, dependendo da condição imunológica do paciente. Quando
sintomática em pacientes imunocompetentes, geralmente evolui com um quadro semelhante
ao de mononucleose, com febre, linfadenopatia, alterações hematológicas (leucopenia e
trombocitopenia) e, muitas vezes, com sinais e sintomas hepáticos, pulmonares,
gastrintestinais ou neurológicos.
A transmissão do vírus pode ocorrer por via transplacentária, saliva, contato sexual,
transplante de órgãos e transfusão sanguínea. O antígeno já pode ser detectado a partir da 4ª
semana que se segue à infecção (período de incubação). Na fase aguda, o vírus pode ser
identificado em diferentes secreções corporais. Os anticorpos da classe IgM aparecem logo no
início da fase aguda, e os da classe IgG, uma semana mais tarde. A infecção pelo CMV
apresenta maior significado clínico nas mulheres grávidas, em recém-nascidos (infecção
congênita), nos imunossuprimidos, como os casos de pacientes transplantados, portadores de
neoplasias, pós-operatório de cirurgia cardíaca, em curso de grandes agressões infecciosas e
nos indivíduos com AIDS. Para a maioria dos recém-nascidos, infecções de CMV podem ser
adquiridas antes do nascimento, durante o parto e mais tarde na vida. A infecção pode causar
graves anomalias congênitas, como microcefalia, deficiência motora e retardo mental.
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5. PROCEDIMENTOS

Todos os reagentes deverão estar em temperatura ambiente antes do uso (18-25C).

Preparo da Solução de Lavagem: Prepare a solução de lavagem diluindo a solução de
lavagem concentrada 1:25 (despeje o conteúdo do frasco contendo a solução de lavagem
concentrada em uma proveta graduada e preencha com água destilada ou deionizada até 1250
mL). Quantidades menores devem ser preparadas de acordo com o volume desejado. Esta
solução preparada (diluída) é estável por 1 mês de 2-8°C. Homogeneizar antes do uso.
Nota: Se houver cristais, aquecer a solução a 37°C.
Dosagem: Destacar o número de microcavidades necessárias para os testes, incluindo Branco,
Amostras, Calibradores e Controles, colocá-las no suporte apropriado e proceder como a
seguir:
1. Deixar o primeiro poço para o Branco.
2. Adicionar 100 µL dos Calibradores.
3. Adicionar 100 µL de Diluente de Amostras somente nas microcavidades destinadas às
amostras.
4. Adicionar 5 µL de Amostra e homogeneizar através de movimentos circulares por 30
segundo se incubar a 37˚C por 30 minutos.
Nota: Após adicionar a amostra, observar a mudança de cor verde para azul.
5. Lavar 5 vezes com Solução de Lavagem previamente preparada.
Atenção: Lavagens insuficientes podem gerar falsos resultados.
6. Adicionar 100 µL de Conjugado em cada um dos poços, EXCETO NO BRANCO.
7. Incubar a 37˚C por 30 minutos.
8. Lavar 5 vezes com Solução de Lavagem previamente preparada.
9. Adicionar 50 µL de Substrato A e 50 µL de Substrato B em todas microcavidades,
inclusive no branco.
10. Homogeneizar e incubar a 37˚C por 10 minutos.
11. Adicionar 50 µL de Solução de Bloqueio em todas microcavidades.
12. Efetuar as leituras espectrofotométricas em 450 nm (filtro secundário em 630-700 nm) em
leitora apropriada, no máximo 30 minutos após a adição da Solução de Bloqueio.

6. RESULTADOS E CONCLUSÕES
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QUALITATIVO
Calcular o valor do índice para se obter um resultado qualitativo.
1. Se o teste for válido, calcular o valor do cut-off subtraindo a absorbância do branco da
absorbância do Calibrador 2 (Calibrador cut-off). Veja abaixo um exemplo de cálculo
do cut-off:
Cut-off = Absorbância Cal 2 – Absorbância branco
Absorbância do branco = 0.009 Absorbância Cal 2 = 0.261
Cut-off = 0.261 – 0.009 / Cut-off = 0.252

2. Calcular o Valor do Índice dividindo a absorbância da amostra pelo valor do cut-off.

Valor do Índice = Absorbância amostra + Valor Cut-off
Absorbância da amostra= 0.836
Cut-off = 0.252
Valor Índice = 0.8360.252 = 3.317

QUANTITATIVO
Traçar a curva de calibração para obtenção de resultados quantitativos da amostra.
Subtrair a absorbância do branco de cada calibrador e lançá-las no eixo Y do gráfico
contra suas concentrações correspondentes em UI/mL no eixo X de um papel de gráfico
linear e desenhar a curva de calibração.
Nota: As amostras com absorbâncias maiores que a absorbância do calibrador 4 devem
ser previamente diluídas e testadas novamente. A concentração deve ser multiplicada
pelo fator de diluição. Leitura automatizada e cálculo podem ser realizados utilizando a
função de regressão linear.

CRITÉRIOS DE VALIDAÇÃO DO TESTE

Verifique os requisitos de validação abaixo para determinar se os resultados dos testes
estão válidos.
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Nota: Os resultados dos testes são considerados inválidos se os requisitos de validação

acima não forem cumpridos. Repita o teste ou entre em contato com seu distribuidor
local.

VALORES DE REFERÊNCIA

*Nota: Para resultados indeterminados a amostra deve ser retestada. Amostras

indeterminadas após o reteste devem ser confirmadas por um método alternativo. Para
amostras que permanecerem com resultados indeterminados, efetuar uma nova coleta em
duas semanas e se a nova amostra for positiva, este resultado deve ser o considerado.

Os seguintes resultados de absorbância foram obtidos no espectrofotômetro:

B = Branco
C1, C2, C3, C4 = Calibradores em duplicatas, concentrações de anticorpos conhecidos
A1 = Amostras em duplicatas
A2 = Amostra única

B) Branco, não considerado

C1) Abs = 0,097 média
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C2) Abs = 0,261 média

C3) Abs = 0,793
C4) Abs = 1,492
A1) Abs = 0,100 média
A2) Abs = 0,187

Analisando os resultados obtidos, é possível observar que o resultado do exame do

paciente foi negativo, tendo em vista que a amostra apresentou resultado qualitativo com
concentração menor do que 13,5 UI/mL como é possível observar no gráfico acima.

7. QUESTÕES PARA DISCUSSÃO

a) Qual é a relevância deste teste? Triagem ou confirmatório?

É um teste confirmatório, sendo responsável pela detecção de diferentes doenças
infecciosas, uma vez que a maioria dos agentes patológicos leva à produção de
imunoglobulinas. Podendo ser utilizado no diagnóstico de doenças autoimunes ou
alergias.
b) O que um resultado positivo quer dizer? O paciente está doente?
O resultado positivo não quer dizer que o paciente esteja doente e sim que ele já teve
contato/exposição ou infecção prévia pelo vírus.
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c) O que um resultado negativo quer dizer? O paciente certamente nunca se

infectou pelo vírus?
Quando obtemos o resultado negativo se assente que nunca houve contato com o
vírus, portanto deve-se ter medidas de prevenção para evitar uma possível infecção.

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

MELDAU, Débora Carvalho. Teste ELISA. 2009. Disponível em:

https://www.infoescola.com/medicina/teste-elisa/. Acesso em: 13 set. 2022.

FRANCO, V. L. de M.; MARQUES, L. de O. C.; DINIZ, S. G. S.; ASSUNÇÃO, V. I. de S.;

NOGUEIRA, A. B. L.; BRAGAGNOLO, J. C. B.; BAREZANI, A. F. B.; PAIM, M. J. A. A
técnica de elisa e a sua importância para o diagnóstico clinico / The elisa technique and its
importance for clinical diagnosis. Brazilian Journal of Development, [S. l.], v. 7, n. 9, p.
89877–89885, 2021. DOI: 10.34117/bjdv7n9-243. Disponível em:
https://brazilianjournals.com/ojs/index.php/BRJD/article/view/35988. Acesso em: 16 sep.
2022.

INTERKIT (org.). BULA KIT CITOMEGALOVITUS IgG. 2017. Disponível em:

https://labpedia.com.br/produto/citomegalovirus-igg-elisa. Acesso em: 16 set. 2022.

FIGUEIRÓ-FILHO, Ernesto Antonio et al. Freqüência das infecções pelo HIV-1, rubéola,
sífilis, toxoplasmose, citomegalovírus, herpes simples, hepatite B, hepatite C, doença de
Chagas e HTLV I/II em gestantes, do Estado de Mato Grosso do Sul. Revista da Sociedade
Brasileira de Medicina Tropical, v. 40, p. 181-187, 2007.

ORSATO, Ana Carla Nath; MANDELLI, Jéssica Zolim Andreatto; EHRHARDT, Alexandre.
PREVALÊNCIA DE ANTICORPOS IgG E IgM PARA CITOMEGALOVIRUS EM
GESTANTES. Revista de Iniciação Científica da ULBRA, v. 1, n. 15, 2
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