Biossegurança em Laboratório

O conceito de biossegurança é definido por Costa (2009, p. 108) como “[...] um

conjunto de medidas técnicas, administrativas, educacionais, médicas e psicológicas
empregadas para prevenir acidentes em ambientes biotecnológicos”.
O objetivo principal é a prevenção de acidentes ocupacionais.
Princípios da Biossegurança
Incluem três pontos básicos:
 A prática e a técnica laboratorial.
 O equipamento de segurança (barreiras primárias).
 O projeto e construção das instalações (barreiras secundárias).
Riscos Biológicos
Classificação:
Grupo de Risco I - riscos individual e comunitário baixos. Microorganismos que têm
probabilidade nula ou baixa de provocar doenças para o homem e que não constituem
risco para o meio ambiente. Exemplo: lactobacillus.
Grupo de Risco II - riscos individuais moderado e comunitário limitado. Organismos
patogênicos, porém, que geralmente não apresentam um perigo sério para os
indivíduos. Podem provocar infecções graves, porém já se conhecem medidas
profiláticas adequadas com risco de propagação limitado ou reduzido.
Exemplo: leptospira.
Grupo de Risco III - riscos individuais alto e comunitário limitado. Organismos
patogênicos que costumam provocar doenças graves, propagados de um hospedeiro
infectado ao outro. Existem medidas profiláticas e de tratamento bem estabelecidas.
Exemplos: Bacillus anthracis, HIV, Mycobacterium tuberculosis. (Observação: Muitos
vírus estão incluídos neste grupo).
Grupo de Risco IV - riscos individual e comunitário elevados. Agentes infecciosos
patogênicos que geralmente causam doenças graves, sendo facilmente transmitidos.
Na maioria dos casos, não se conhece tratamento eficaz, e as medidas profiláticas
não estão bem estabelecidas. Ex. vírus Ebola.
Grupo de Risco V - riscos altos de causar doença animal grave e de disseminação no
meio ambiente. Agentes de doença animal que, embora não sejam patógenos de
importância para o homem, podem gerar grandes perdas econômicas e na produção
de alimentos. Exemplo: vírus da gripe aviária e vírus da febre aftosa (gado bovino).
Risco Biológico em Laboratório de Virologia
Como já mencionado, a maioria dos laboratórios de Virologia estão incluídos no grupo
III, porém é importante lembrar que cada um tem sua rotina, e as precauções padrão
devem se adequar à realidade de cada laboratório.
 
Níveis de biossegurança
Trata-se do ambiente laboratorial adequado para a utilização dos procedimentos.
Nível de biossegurança 1 (NB1) - nível de contenção laboratorial que se aplica aos
laboratórios de ensino básico, onde são manipulados os microrganismos pertencentes
à classe de risco I. Não é requerida nenhuma característica de desenho estrutural,
além de um bom planejamento espacial e funcional e a adoção de boas práticas
laboratoriais.
Nível de biossegurança 2 (NB2) - diz respeito ao laboratório em contenção, onde são
manipulados microrganismos da classe de risco II. Aplica-se aos laboratórios clínicos
ou hospitalares de níveis primários de diagnóstico, sendo necessário, além da adoção
das boas práticas, o uso de barreiras físicas primárias (cabine de segurança biológica
e equipamentos de proteção individual) e secundárias (desenho estrutural e
organização do laboratório).
Nível de biossegurança 3 (NB3) - indicado para trabalho com agentes infecciosos
que possam causar doenças graves, potencialmente letais, como resultado da
exposição por via de inalação. Exemplo: Bacillus anthracis.
Nível de biossegurança 4 (NB4) - laboratório de contenção máxima, destina-se à
manipulação de microrganismos da classe de risco 4 e 5. Nele, há o mais alto nível de
contenção, além de representar uma unidade geográfica funcionalmente independente
de outras áreas. Esses laboratórios requerem, além dos requisitos físicos e
operacionais dos níveis de contenção 1, 2 e 3, barreiras de contenção (instalações,
desenho e equipamentos de proteção) e procedimentos especiais de segurança.
Somente alguns tipos de vírus exigem o nível 4 de biossegurança, são eles:
 Agentes de febres hemorrágicas (ex.: hantavírus).
 Vírus da aftosa.
 Vírus Ebola.
 Vírus da gripe aviária H5N1.

Níveis de Biossegurança em Laboratório de Virologia

O nível de biossegurança 2 aplica-se à maioria dos laboratórios de Virologia. Isso vai
depender do agente manipulado.
Métodos de diagnóstico laboratorial em virologia
Na atualidade, os resultados de exames laboratoriais têm influência crucial nas
principais decisões clínicas. Estima-se que cerca de 70% das condutas médicas são
baseadas em exames laboratoriais. Por isso, escolher um método que seja eficaz no
laboratório de análises clínicas é extremamente importante.
Entretanto, na área da Virologia Clínica, os métodos para os diagnósticos bem
escolhidos e adaptados ao tipo de amostra biológica que chega ao laboratório são
igualmente importantes, considerando todo esse contexto.
Tipos de métodos que podem ser aplicados ao diagnóstico laboratorial em Virologia:
Virológico; Sorológico; Molecular; Imuno-histoquímico; Microscópico.
 
Método de Diagnóstico Virológico
No isolamento e identificação dos vírus, o virologista utiliza-se de sistemas vivos nos
quais os vírus são propagados. Na maioria dos laboratórios, os sistemas de
hospedeiros (culturas de células, uso de animais e de ovos embrionados) constituem
os mais utilizados. Veremos detalhes de cada um a seguir.
Cultura de Células Aplicadas ao Diagnóstico Virológico
Embora as partículas virais não possam ser visualizadas, à medida que estão se
replicando nas células em cultura, sua presença é observada por alterações na
aparência das células infectadas. Na identificação correta da espécie viral que se
desenvolveu, utilizam-se soros padrões específicos produzidos em laboratório.
Outras aplicações da técnica:

 Cultivo em células específicas. Ex.: HIV em T CD4.

 Produção de moléculas antigênicas para outros testes (exemplo: testes
sorológicos como Western blot).
Inoculação em Animais de Laboratório e em Ovos Embrionados
A inoculação em animais não tem sido utilizada com frequência devido ao advento das
culturas celulares, as quais fornecem uma opção mais simples e prática. O uso de
camundongos, em geral, está limitado ao isolamento do arbovírus (vírus da raiva) e de
alguns cocksackievírus do grupo A, para os quais camundongos recém-nascidos, com
24 horas de idade, são inoculados por via intercerebral ou intraperitoneal e observados
por volta de duas semanas para verificação de sintomas clínicos antes de serem
sacrificados para a realização de exames histopatológicos dos órgãos afetados.
Animais de grande porte praticamente não são utilizados. Quando usados, são
primatas, em especial chimpazés. Geralmente os ovos mais usados para inocular são
os de galinha.
Métodos de Diagnóstico Sorológico
Técnicas Sorológicas Tradicionais
Podemos utilizá-las para qualquer infecção viral.

Princípio das técnicas sorológicas: interação antígeno (presentes nos reagentes) e

anticorpo (presentes na amostra biológica).
Antígeno: qualquer substância que, sob condições apropriadas, é capaz de estimular
a formação de anticorpos.
 Anticorpo: proteína que é formada em resposta à exposição de um antígeno e reage
especificamente com este, formando imunocomplexos.
Ensaio Imunoenzimático (ELISA)
 Primeiro exame amplamente empregado para diagnóstico.
 Alta sensibilidade (triagem) acima de 98%.
 Uma placa -> 96 amostras.
Método: Baseia-se na ligação do anticorpo (soro) com o antígeno da placa
usando enzimas.
Ensaio Imunocromatográfico (testes rápidos)
 Mesmo principio do ELISA.
 Mesma eficácia do ELISA.
 Não usa enzima.
 É rápido.
 Uma placa -> uma amostra.
Imunoblot (Western Blot)
Nessa metodologia, o agente viral é cultivado em células e as proteínas são
separadas por meio de uma eletroforese de acordo com seu peso molecular. Depois,
as proteínas são transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose. Dessa
forma, quando há anticorpos presentes no soro ou plasma humano, eles são
detectados pela ligação com os antígenos da membrana. A posição das bandas na tira
permite que a reatividade desses anticorpos seja associada com antígenos virais
específicos.
Diagnóstico Sorológico nas Infecções Virais
Marcadores Sorológicos das Hepatites Virais   
O termo “hepatite” significa inflamação do tecido hepático. Esse quadro clínico pode
ser produzido por vários agentes etiológicos, especialmente os vírus.
 As hepatites virais estão classificadas por letras: hepatite A, hepatite B, hepatite C,
hepatite D e hepatite E, além de outras duas menos estudadas: G e TT
Hepatite A
 Os marcadores sorológicos para infecção pelo vírus da hepatite A (HAV) são
anticorpos das classes IgG e IgM de imunoglobulinas: Anti-HAV IgG e Anti-
HAV IgM.
 O primeiro marcador a aparecer no soro é o Anti-HAV IgM , e a positividade
persiste por um período de quatro meses, podendo chegar até seis meses.
 O Anti-HAV IgG aparece logo após o aparecimento de HAV IgM, aumenta com
a evolução da doença e depois permanece por toda a vida.
Hepatite B
 O envoltório externo apresenta o antígeno de superfície do vírus, chamado
HBsAg ou Antígeno Austrália.
 Na porção interna, existe um núcleo que contém o antígeno do núcleo do HBV,
chamado de HBcAg Core.
 Ainda na porção interna, existe uma estrutura que contém material denominado
de antígeno E do HBV, chamado de HBeAg Reprodução.
Hepatite C
Diferentemente dos vírus A e B, o HCV foi identificado em 1989 e, em 1991,
começaram a serem comercializados os primeiros testes para identificação de
anticorpos contra ele (ELISA).

 O HCV possui alta variabilidade genética.

 Existem seis tipos ou genótipos diferentes de HCV e no mínimo 30 subtipos.
 Isso dificulta o isolamento e identificação do antígeno por técnica de ELISA
(pesquisa de antígeno).

A gravidade da infecção pelo HCV é preocupante e a progressão para hepatite crônica

é significativamente mais frequente que no HBV, ocorrendo em torno de 60% a 70%
dos casos em um período de 10 anos. Além disso, cabe ressaltar que existem, pelo
menos, seis genótipos ou cepas diferentes de hepatite C, e isso é importante para o
tratamento.
A genotipagem é um exame laboratorial que utiliza ferramentas da Biologia Molecular.
É realizado para determinar quais os subtipos virais e a resistência a drogas. Podemos
fazer genotipagem em qualquer outra infecção virótica. Falaremos melhor sobre
genotipagem como exame laboratorial importante em Virologia.

Desenho esquemático da morfologia do HCV.

Método de diagnóstico molecular
As técnicas de biologia molecular utilizam a amplificação do material genético para
diagnóstico e acompanhamento das doenças virais.
A principal técnica amplamente utilizada é a PCR (Polymerase Chain Reaction). Há
outras metodologias menos usadas atualmente, por exemplo: NASBA (Nucleic Acid
Based Sequence Amplification), LCR (Ligase Chains Reaction).
Técnicas mais usadas
a) Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
- PCR-RT ou qPCR (Reação em cadeia da Polimerase em Tempo Real).
- PCR-C (Reação em Cadeia da Polimerase Convencional).
b) Ensaio de DNA ramificado (Branched DNA – bDNA).
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) é um método
de amplificação (de criação de múltiplas cópias) de DNA (ácido desoxirribonucleico).
É a principal técnica molecular para o diagnóstico laboratorial em Virologia. Tanto a
PCR-C quanto a qPCR são também usadas em outras áreas.

 A técnica de PCR foi descrita por Kary Mullis no final da década de 1980. Em
1993, ele recebeu o Prêmio Nobel da Química pelo seu trabalho. Em 1989, a
Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou esse processo.
Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) é um
método de amplificação (de criação de múltiplas cópias) de DNA (ácido
desoxirribonucleico).
Processos gerais em PCR-C e qPCR

 Coleta, transporte e armazenamento: devem ser criteriosos e seguir os

rigores das boas práticas como em todo o setor de análises clínicas. Deve-se
considerar a natureza da amostra (sangue, plasma, secreção etc.).
 Extração do material genético do agente etiológico: em setor especializado
(sala de extração). Logo a partir dessa fase, o laboratório deve ter a
infraestrutura que os procedimentos em Biologia Molecular exigem.
 Amplificação do material genético: escolha do método que apresente
robustez e reprodutibilidade. A PCR, dentro dos métodos moleculares, é
preferencial.

Reação em Cadeia da Polimerase Convencional (PCR-C)

É uma PCR qualitativa, ao contrário da PCR em Tempo Real que é quantitativa.
É mais usada devido aos custos em relação à qPCR.
Apresenta as seguintes fases:
a. Pré-amplificação: preparação de um mix de reagentes importantes para a reação
de amplificação e introdução do material genético do agente.
A reação de PCR requer seis componentes essenciais:
 DNA polimerase termoestável: enzima imprescindível para a amplificação do
material genético.
 Um par de oligonucleotídeos iniciadores (primers).
 Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs).
 Cátion divalente: usualmente Mg2+, co-fator da atividade enzimática da
polimerase.
 Tampão para manter o pH.
 DNA molde.
b. Amplificação do material genético propriamente dita: mix + amostra para o
termociclador (equipamento imprescindível para ocorrer a amplificação).
É um processo interativo que consiste em três etapas:
 Denaturação: abertura da dupla fita de DNA por aquecimento.
 Anelamento: ligação dos primers.
 Extensão: produção de novas duplas fitas de DNA a partir da Taq DNA
polimerase que adiciona os deoxinucleotídeos (A, T, C, G) por
complementaridade a à fita molde.
 O processo de amplificação necessita de um equipamento chamado
termociclador.
c. Pós-amplificação: detecção do produto de PCR (amplicons)
Consiste na detecção do produto da reação por meio da eletroforese em gel de
agarose (mais comum). O produto amplificado é revelado pela presença de bandas de
DNA. Usamos marcadores específicos que se ligam ao DNA e emitem fluorescência.
Apesar de se tratar de métodos que apresentam um alto custo para implantação num
laboratório de Análises Clínicas especializado ou não em doenças virais, os resultados
e benefícios são grandiosos. Na era da genômica, esses testes tornaram-se uma
grande ferramenta para a elucidação diagnóstica e de amparo à terapêutica.

Métodos de diagnóstico imuno-histoquimico

Princípio da técnica: conjugação de distintos marcadores com moléculas de
imunoglobulina que, com o auxílio de um substrato específico, localizam o antígeno
tecidual.
Objetivos principais:
 Detecção de estruturas bioquímicas.
 Localização de antígenos em células utilizando anticorpos específicos.
 Produto da reação visível ao microscópio.
Método de diagnóstico microscópico

 Microscopia eletrônica.
 Visualização direta da partícula viral, estudo minucioso da morfologia viral.
 É ideal realizar após crescimento viral em cultura.
 Metodologia de alto custo.

 Microscopia óptica.
 Pode ser útil na visualização das alterações celulares causadas pelos vírus.
Exemplo: vacuolização em células epiteliais da cérvix uterina causada pela ação do
papilomavírus humano (HPV), formando os chamados coilócitos.

Etapas no diagnóstico e monitoramento

laboratorial de uma infecção viral
HIV/AIDS
Critérios para o Exame de Diagnóstico
 Exposição ao HIV -> Exame sorológico.
 Por meio da coleta de sangue (tubo seco) -> soro.
 O teste detecta a presença de anticorpos (ACs) que são produzidos dentro de
até três meses após a infecção pelo HIV.
 Crianças: resultado positivo para o teste anti-HIV tem significado diferente. Até
os 18 meses de idade, o bebê carrega os anticorpos da mãe. Um novo teste
deve ser realizado após esse período -> se permanecer positivo, significa que
a criança se infectou.
Legislação vigente e fluxogramas usados no diagnóstico
É preconizado que pelo menos dois testes sejam realizados para a confirmação da
infecção pelo HIV. O resultado não reagente é liberado com base no teste de triagem.
Entretanto, caso persista a suspeita de HIV, uma nova amostra deverá ser coletada,
30 dias após a data da coleta da primeira amostra. O resultado reagente sempre é
confirmado com um segundo teste diferente. O primeiro teste deve ser sempre o mais
sensível, e o segundo teste mais específico, para evitar resultados de falso-positivos.
A lei que determina como devem seguir as etapas no processo do diagnóstico
laboratorial para HIV/AIDS no Brasil é a Portaria 151/2009 – MS 29/2013.
Abaixo, etapas do diagnóstico laboratorial do HIV preconizadas pela portaria
supracitada.
Etapa de triagem – métodos utilizados para o diagnóstico laboratorial da
infecção pelo HIV
Os métodos recomendados pelo Ministério da Saúde para a etapa de triagem de HIV
estão listados a seguir:
 Ensaio imunoenzimático;
 Ensaio imunoenzimático de micropartículas;
 Ensaio imunológico quimioluminescente;
 Ensaio imunológico com revelação eletroquimioluminescente;
 Ensaio imunológico fluorescente ligado à enzima;
 Ensaio imunológico quimioluminescente magnético;
 Testes rápidos: imunocromatografia, aglutinação de partículas de látex ou
imunoconcentração.
Etapa complementar – métodos utilizados para o diagnóstico laboratorial da
infecção pelo HIV
A seguir, encontram-se os métodos que podem ser utilizados na etapa complementar
nos exames que deram resultado reagente na etapa de triagem:
 Imunoblot;
 Imunoblot rápido;
 Western Blot;
 Quantificação da carga viral.
O Manual Técnico para o Diagnóstico da Infecção pelo HIV do Departamento de DST/
Aids recomenda que se utilize o exame de quantificação da carga viral (qPCR) na
etapa complementar do diagnóstico como opção preferencial para a confirmação do
diagnóstico da infecção pelo HIV. A infecção pelo HIV é confirmada quando o exame
apresenta resultado igual ou superior a 5.000 cópias/mL.

Etapas no diagnóstico e monitoramento laboratorial de

uma infecção viral
Monitoramento Laboratorial
Realizado por dois parâmetros laboratoriais:
 Contagem de Linfócitos T CD4;
 Determinação da carga viral.
Então temos a seguinte conclusão:
Carga viral indetectável + contagem de CD4 estável significa boa evolução clínica.
Sobre a importância dos estudos da Virologia, nessa área temos uma
metodologia que ainda esta em pesquisa, trata-se da Terapia Gênica.
A terapia gênica (TG) é um tratamento para doenças hereditárias que se
caracteriza pela inserção de um gene funcional dentro da célula humana a fim de
conferir uma nova função ou melhorar os efeitos de um gene anormal.
Princípios gerais da terapia gênica
Necessidade de:
 Conhecer o gene terapêutico (clonagem do gene).
 Método para liberar o gene na célula-alvo (precisaria de vetores).
Os métodos mais promissores são a transferência gênica por meio de adenovírus
associado a lentivírus (principais vetores).
Características dos vírus como vetores na terapia gênica:
 A molécula carreadora, denominada vetor, é usada para levar o gene
terapêutico para as células-alvo do paciente. Atualmente, o vetor mais comum
são alguns tipos de vírus, alterados geneticamente para carrear o DNA
humano normal.
 O genoma do vírus é modificado para remover os genes causadores de
doença e inserir os de interesse terapêutico.