ELISA

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Marcelo Augusto – Graduando em Biomedicina| Profª:Carolina Brito| Faculdade Estácio de São Luís
 ELISA
Estudo apresentado pelos alunos do 5º período do curso de Biomedicina a disciplina de
Imunologia, ministrada pela Prof. Caroline Brito

Componentes:
Aline Santos Fontenele
Felipe Baldez
Luisa Helena do Nascimento Pereira
Marcelo Augusto Ferreira Barros
Rosangela
Definição

• É um teste imunoenzimático que permite a detecção de anticorpos

específicos.

• Este teste é usado no diagnóstico de várias doenças que induzem a

produção de imunoglobulinas.

• O complexo que contém o anticorpo é visualizado pelo acoplamento da

enzima ao anticorpo.

• A adição de substrato ao complexo enzima-anticorpo-antígeno resulta num

produto colorido, que é lido por um equipamento específico.
 Princípio

• Existem vários modelos de testes de ELISA; em sua forma mais simples,

chamada ELISA indireto, um antígeno aderido a um suporte sólido (placa de
ELISA) é preparado; a seguir coloca-se sobre este os soros em teste ( ex.
soro humano), na busca de anticorpos contra o antígeno. Se houver
anticorpos no soro em teste ocorrerá a formação da ligação antígeno-
anticorpo, que posteriormente é detectada pela adição de um segundo
anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espécie onde se busca detectar
os anticorpos (humana, no caso), a qual é ligada à peroxidase. Este
anticorpo anti-IgG, ligado à enzima denomina-se conjugado. Ao adicionar-se
o substrato apropriado para a enzima (isto é, H2O2 dissolvida em uma
substancia química que dá uma reação colorida quando H2O2 é
desdobrada). Os orifícios onde ocorreu a reação antígeno-anticorpo
apresentam uma coloração (variável dependendo do substrato).
 Diagnóstico

Geral HIV Imunoradioensaio

• Várias doenças • Este é o teste de primeira • O teste ELISA também pode

linha no diagnóstico da
infecciosas, uma vez
infecção pelo HIV
que a maioria dos • Detectam tanto anticorpos
agentes patológicos quanto um dos antígenos
desencadeia a
do HIV (a proteína p24)
produção de • Um resultado reagente
imunoglobulinas. num teste de HIV por
• Também pode ser ELISA é sempre
confirmado por outros
usado no diagnóstico testes específicos, como é
de o caso do Western blot e
doenças auto-imunes do PCR
ou alergias.
ser utilizado de diversas
outras formas. Utilizando-se
de um método semelhante
ao método de
imunoradioensaio, pode-se
transformar muitas outras
substâncias em antígeno e
obter um anticorpo do
mesmo.
• Assim, é possível utilizar o
teste para se detectar outras
substâncias de interesse
como, por exemplo,
hormônios.
 Método*

• 1 – Sensibilizar as placas de ELISA com o antígeno, previamente diluído, em tampão

carbonato, 100 ul por orifício, e incubar overnight a 4 oC. Isto permitirá a ligação do antígeno à
placa.

• 2- No dia seguinte, remover a solução de antígeno e lavar a placa 3 vezes com líquido de
lavagem de ELISA (PBS-T20), em volume de 100 ul por orifício.

• 3- A placa pode então ser armazenada para uso posterior (em sacos plásticos fechados a – 20
oC, ou utilizada imediatamente.

• 4- Acrescentar os soros a testar em uma diluição previamente determinada ( ½ em nosso

exemplo), preparada em líquido de lavagem, em volumes de 100 ul/orifício. Incubar por uma
hora a 37 oC.

• 5- Remover a diluição dos soros e lavar três vezes com líquido de lavagem.

• 6- Acrescentar 100 ml por orifício de uma diluição apropriada do anticorpo monoclonal (1:1000
em nosso exemplo), preparada em líquido de lavagem. Incubar por uma hora a 37 oC.

*SIMULAÇÃO
 Método*

• 7 - Remover o anticorpo monoclonal e lavar três vezes com líquido de lavagem.

• 8- Acrescentar 100 ml por orifício de uma diluição apropriada do conjugado (anti-IgG de

camundongos; 1:1000 em nosso exemplo), preparada em líquido de lavagem. Incubar por
uma hora a 37 oC.

• 9- Remover a diluição de conjugado e lavar três vezes com líquido de lavagem.

• 10- Acrescentar 100 ml por orifício de uma solução de OPD (ortofenilenodiamina) preparada
em tampão citrato-fosfato acrescentado de 0,001% de H2O2. Incubar por 15 minutos a 37
oC.

• 11- A reação é interrompida pela adição de 50 ml por orifício de uma solução de H2SO4 2M.

• 12- Os resultados são obtidos com base na leitura da densidade ótica (D.O.) em
espectrofotômetro com filtro de 492 nm.

*SIMULAÇÃO
• Outro método é o chamado ELISA de bloqueio ou competição, em que a
presença de anticorpos em determinado soro é revelada pela competição
com um anticorpo específico (mono ou policlonal) dirigido contra o antígeno.
Igualmente, o resultado é dado pela adição de um conjugado, porém
a coloração aparecerá nos poços onde não havia anticorpos.
Leitura do resultado

 Um teste positivo é visível ao olho nu, sendo que a cor, geralmente, é

amarelo ou azul. Mas o resultado não é liberado apenas no “olhômetro”. É
necessário quantificar o resultado, e por isso existem os leitores de ELISA.
Cada tipo de exame tem um protocolo de cálculo diferente. Geralmente, toda
vez que se abre um novo kit, é necessário fazer uma curva de
calibração com todos padrões que vêm juntos. O aparelho pode liberar o
resultado já pronto ou, dependendo do exame, ele irá liberar apenas o valor
da absorbância e o biomédico terá que fazer os cálculos manualmente.