Técnicas Histológicas

FIXAÇÃO
PREVENIR ALTERAÇÕES ESPONTÂNEAS POST-MORTEM

externo (putrefação, fermentação

ou lipólise)

interno (autólise)
 Técnicas Histológicas

FIXAÇÃO

1 - RESPEITAR A GEOMETRIA CELULAR

•Células cheias, não

vacuolarizadas, sem deformação,
com detalhes de estruturas finas
• Evitar retração e dilatação
 Técnicas Histológicas

2 - INSOLUBILIZAR OS CONSTITUINTES
TISSULARES
• evitar perdas de tecido nas etapas
seguintes
3 - INICIAR O ENDURECIMENTO DOS
TECIDOS
• converter a consistência semi-fluída das
células em uma consistência semi-sólida
irreversível (continua na desidratação)
• protege os tecidos para as etapas
seguintes
 Técnicas Histológicas

4 - PREPARAR OS TECIDOS PARA AS

PRÓXIMAS ETAPAS

• Não mascarar sítios enzimáticos ou

antigênicos
5 - AJUDAR NA DIFERENCIAÇÃO ÓPTICA

• Pode interferir na resposta da

coloração
 Técnicas Histológicas

FIXAÇÃO

Etapa crucial para uma boa

preparação histológica
•Fixação completa e
adequada

O QUE É UMA FIXAÇÃO ADEQUADA?

 Técnicas Histológicas

FIXAÇÃO ADEQUADA
MATERIAL FRESCO – TAMANHO (1-5 mm)

 INTERVALO MÍNIMO ENTRE COLETA E FIXAÇÃO

 VolFIXADOR = 20 VEZES VolPEÇA

 CONTACTO PEÇA-FIXADOR
 AGITAÇÃO DA SOLUÇÃO
 REAGENTES DE BOA QUALIDADE
 ESCOLHA DO FIXADOR E TEMPO DE FIXAÇÃO
 EVITAR PINÇAMENTO
 Técnicas Histológicas

TIPOS DE FIXAÇÃO
FIXAÇÃO POR AGENTES FÍSICOS
CALOR: DISSECAGEM
• Muito utilizada por bacteriologistas
• É, normalmente, seguida por uma fixação química
 FRIO: CONGELAMENTO

• Rápido: evitar formação de cristais de gelo que destroem as

membranas REG, mitocôndrias...

• VITRIFICAÇÃO: uso de isopentano resfriado

em N2 líquido ou crio-proteção (DMSO,
sucrose, glicerol...)

• Cortes de criostato = garante aderência,

preserva antigenicidade. A longo prazo a
conservação é ruim
SECAGEM AO AR

• Bom somente para esfregaços sanguíneos

 Técnicas Histológicas

FREEZE-DRYING (SECAGEM A BAIXA TEMPERATURA)

•Eliminação por sublimação da água dos

tecidos congelados.
• Congelamento em N2 líquido, seguido de
secagem a vácuo

•Não causa retração, fixação homogênea, rápida, não extrai

moléculas solúveis, mantém composição química, raras modificações
causadas por cristais de gelo
• Resultados aceitáveis para ML, ruins para ME
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FREEZE-SUBSTITUTION (CONGELAMENTO E SUSTITUIÇÃO)

• O tecido mantém-se congelado (-20

a -60oC) num reagente (etanol ou
acetona) que dissolve os cristais de
gelo
• Substituição da água por solvente
• Vantagens semelhantes ao freeze-
drying
• Aplicável tanto para ML quanto ME
• Técnica difícil e equipamento caro
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TIPOS DE FIXAÇÃO
FIXAÇÃO POR AGENTES QUÍMICOS

• Uso de substâncias químicas que reagem

com determinados sítios de biomoléculas,
estabizam-nas através de uma “amarração”
que as moléculas do fixador fazem sobre as
macromoléculas tissulares, estabelecendo
ligações cruzadas entre os componentes
estruturais, de modo a não distorcer muito a
estrutura original do material.
 Técnicas
Histológicas

FIXADORES
Não existe fixador ideal (vantagens e incovenientes)
Fixadores simples ou misturas

Fixação de proteínas
Fixação de Lipídeos
Fixação de ácidos nucléicos
Fixação de carboidratos
 Técnicas
Histológicas

PRINCIPAIS TIPOS DE FIXADORES

FIXAÇÃO DE PROTEINAS:
As reações mais importantes
são aquelas que estabilizam
as proteínas
As proteínas solúveis são
fixadas como as proteínas
estruturais, tornando
insolúveis
Aumento da força mecânica
à estrutura
Observação: mordente =
fixar as cores
 Técnicas
Histológicas

PRINCIPAIS TIPOS DE FIXADORES

ALDEÍDOS (Formaldeído,
Glutaraldeído, acroleína)
• Reagem com os grupos
amina das proteínas e nos
radicais aminados de
fosfolipídeos da
membranas celulares
(fosfatidilserina e
fosfatidiletanolamida)
•Fixação cruzada por
ligação covalente
 Técnicas
Histológicas
FORMALDEÍDO (Formol, formalina)
• líquido
cristalino, incolor, libera
vapores irritantes
• decompõe facilmente sob a luz
(ácido fórmico, ruim para coloração,
lavar bem depois)
• como evitar: tamponar com fosfato
de sódio mono e dibásico
•Paraformaldeído: polímero linear de
moléculas de formaldeído (CH2O)n
 Técnicas Histológica

Uso na histologia:
• Um dos mais utilizados (barato e de uso simples)
• Penetração fácil nos tecidos (0,7 a 0,8 mm/h)
• Baixa retração
• Fixa parcialmente os lipídeos
• Causa endurecimento (bom para próximas
etapas)
• Não é bom fixador para carboidratos
• Não precipita as proteínas
• Usado principal diluído em 5 ou 10%
• Tempo: 2 a 48 horas
 Técnicas Histológicas

• O formol só, puro ou diluido , é um mal

fixador
-Incha o tecido
-Vacualiza a célula
-Diminui o contraste citoplasma e núcleo

• Nos órgãos muito

vascularizados pode
formar precipitados
negros que podem
passar por pigmentos
 Técnicas Histológicas

•Como eliminar: deixar os cortes

em solução alcóolica saturada de
ácido pícrico por 30 min-2h
Reação lenta e pode ser reversível
com água nas primeiras 24h

• Porém, quando em mistura

ele pode ganhar novas
qualidades e é um dos mais
usados.
 Técnicas Histológicas

Cuidados:
• Manipular em capela
• O vapor irrita os olhos e a mucosa olfatória
(com o tempo pode diminuir a capacidade)
• Evitar contato com a pele: a epiderme se fixa
rapidamente e endurece de forma
desagradável
• Pode causar até dermatites alérgicas
 Técnicas
Histológicas

GLUTARALDEÍDO – CHO-(CH2)3-CHO
• Reage com as proteínas de forma análoga
ao formol
• É mais rápido e eficaz na sua ação do que o
formol
• Causa uma perda de ~30% da estrutura em
hélice das proteínas
• Desnatura um pouco as proteínas e enzimas
• Penetra mais dificilmente
• Reação também mais reversível pela água
• Muito usado na ME
 Técnicas Histológicas

ACROLEÍNA (aldeído acrílico)

• Age também sobre as proteínas, porém
faz mais ligações cruzadas
• Também age com ácidos graxos
• De penetração rápida
• Pouco usado
 Técnicas
Histológicas
Agentes desnaturantes de proteínas:
ALCOOIS (Metanol e etanol)
• Age por precipitação de proteínas (reduz
a constante isoelétrica das ptns, ruptura das
ligações hidrofílicas, que são importantes na
estrutura terciária, mas mantém a
secundária). Causa extração de lipídeos.
 Técnicas
Histológicas
Agentes desnaturantes de proteínas:
 ETANOL
• Usado na pesquisa de glicogênio e
sistema nervoso
• Penetração lenta
• Causa desidratação
• Pode retrair o citoplasma
• Precipita ac. Nucléico
• Dificulta coloração nuclear
 Técnicas
Histológicas

Agentes desnaturantes de proteínas:

ÁCIDO ACÉTICO

• Bom para estudo de detalhes nucleares

(cromossomos) pois precipita
nucleoproteinas.
• Destrói mitocôndrias e Golgi
 Técnicas
Histológicas

Agentes desnaturantes de proteínas:

ÁCIDO ACÉTICO

•Não fixa lipídeos e

carboidratos
• Deixa os tecidos moles
e evita o endurecimento
produzido pelos alcoois
• Vantagem: rápida
penetração, mas reduz
tumefação celular, por
isso nunca o use sozinho
 Técnicas

Agentes oxidantes: Histológicas

TETRÓXIDO DE ÓSMIO
· Forma ligação cruzada com as ptns
· Emprega-se imergindo as peças no líquido ou
submetendo as ao seu vapor (irritante e perigoso)
· Muito fraca penetração (0,5 mm/12h), bom
para mielina
· Muito caro
· Mais usado em M.E.
(concentração de 0,5 a 1%)
 Técnicas

Agentes oxidantes: Histológicas

DICROMATO DE POTÁSSIO

· pouco usado (destroi nucleoproteinas – ruim para

núcleo)
· Mais usado em combinação para fixar lipídeos
· Requer abundante lavagem em água
 Técnicas Histológicas

Agentes de mecanismo desconhecido:

CLORETO DE MERCÚRIO
- sublimado corrosivo, por isso pouco usado
- causa retração tissular
- rápida penetração
- não destrói lipídeos e precipita ptns sem
combinar-se a elas (os precipitados são solúveis
em iodeto de potássio, de modo que devem ser
removidos antes da coloração)
- Realça as cores (mordente)
- Não fixa nem destrói carboidratos
 Técnicas
Histológicas
Agentes de mecanismo desconhecido:
ÁCIDO PÍCRICO

- requer estocagem úmida pois é explosivo

(licença do exército).
- Não pode ser aquecido nem permite que seque
no recipiente
- bom fixador para glicogênio, ruim para lipídeos
- raramente usado isolado pois causa retração
celular
- Boa penetração (0,3 a 0,5 mm/h)
- Deixa os tecidos moles
- Facilita a coloração (mordente)
- Lavar bastante com água
 Técnicas Histológicas
Fixação de Lipídeos:
• Melhor maneira: congelação
• Química: tetróxido de ósmio ou ácido
crômico (ambos alteram a reatividade
do lipídeo)
• Os lipídeos insaturados reduzem o
tetróxido de ósmio formando compostos
negros
 Técnicas Histológicas

Fixação de Ácidos Nucléicos:

• Etanol e metanol fixam bem DNA e RNA

(com pouca alteração apesar de precipitá-
los)
• Carnoy
-Álcool absoluto: clorofórmio(fixa
bem citoplasma): ácido acético
(fixa bem o núcleo) = 6:3:1
- Boa penetração, mas cuidado
com o tempo de fixação, pois
excedendo extrai RNA e depois
DNA (passar logo para álcool
absoluto e incluir)
 Técnicas Histológicas

 Nem todos os fixadores apresentam as

mesmas capacidades. Uns conservam bem
as estruturas do núcleo e outros as demais
organelas do citoplasma. Por vezes, o ideal é
fazer misturas de fixadores.
O fixador ideal seria a mistura de agentes
fixadores em proporções tais que, as
deficiências de um fossem compensadas
pelas virtudes de outro e combinadas as
eficiências de todos.

MISTURA DE FIXADORES
 Técnicas Histológica

• Álcool-éter (1:1)
• Bom para esfregaços (sangue, citologia,…)
• Tempo de fixação: 10 min

• Formalina comum
Formol 37-40%...........100 ml
Cloreto de sódio ………. 9 g
Água destilada………..900 ml
Bastante comum, não causa excessivo endurecimento. Quando não
tamponado pode produzir pigmento de formol.
• Formalina Neutra (Tamponada)
No lugar do cloreto de sódio, usa-se 4 mg de fosfato de sódio
monobásico e 6,5 mg do dibásico
 Técnicas Histológicas
• Fixador de ZENKER
Solução estoque: bicloreto de mercúrio….50 mg
bicromato de potássio……25 mg
sulfato de sódio…………..10 mg
água destilada……………100 ml
No uso: Adicionar 5 ml de ácido acético glacial
para 95 ml de ZENKER
Após a fixação colocar em bicromato de
potássio2,5%/2h
• Fixador compatível com a maior parte dos
corantes
• Muito usado para citologia, micro-anatômico
• Fixa bem núcleos e conjuntivo
 Técnicas Histológicas

• Fixador de BOUIN
Sol. Aq. saturada de ácido pícrico….75
ml
Formalina 37-40%.......................25 ml
Ácido acético glacial…………..5 ml
•A fixação leva de 4-12h podendo ir até
24h (tamanho)
• Importante remover o ac. pícrico, para
uma boa coloração, passando por várias
lavagens em água (18h + álcool 50%
30min) ou álcool 50% (4-6h)
 Técnicas Histológicas

• Fixador de BOUIN
Depois pode ser guardado em 70% álcool
• Se não remover adequadamente o
ácido pícrico, o tecido pode deterioar, até
mesmo em soluções de álcool ou no bloco
de parafina
• Para invertebrados, peixes, anfíbios e
repteis usar na 1hora a 4oC
 Técnicas Histológicas
• Fixador de BOUIN (Variante para rim e fígado)
ácido pícrico………………………………...1 mg
Formalina 37-40%........................................60 ml
Álcool 80%..............………………………150 ml
Dissolver o ácido pícrico em álcool e depois juntar a
formalina. Antes do uso, adicionar 2 ml de ácido
acético glacial para cada 28 ml de solução.
• O Glicogênio do tecido hepático é melhor
conservado, se a fixação for a 0-4oC.
• Fragmentos de rim ou fígado, obtidos por biópsia
com agulha, fixam-se em 2-3 horas
• Tempo mais longo torna a peça dura, os cortes
fragmentados e distorção no tecido, além de pouca
afinidade pelos corantes
 A e C = formalina
B e D = Bouin

Endométrio de égua
Fixação: 24 horas, Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. 56 (1) 2004
 Técnicas Histológicas

• Fixador de DAVIDSON
Glicerina………………..400 ml
Formalina…………….…800 ml
Etanol absoluto ……….1200 ml
água destilada ………...1200 ml
• No momento do uso adicionar 1 parte de ácido
acético glacial para 9 partes da solução
• De penetração baixa, tempo de 8 a 24 horas
• De modo geral, causa pouca retração
 Técnicas Histológicas

Mais algumas considerações

gerais:
• A fixação por agitação, normalmente
acelera o processo
• A temperatura também interfere:
baixas temperaturas (0-4oC) retardam e
altas temperaturas (30-50oC) aceleram
 Técnicas Histológicas

•Após a fixação o resíduo de fixador deve ser

removido, por lavagem em água ou álcool
•cuidado: se o tecido não está muito duro
o melhor é lavar em álcool, pois a água
pode macerá-lo. Em quase todos os casos
o álcool lava melhor que a água
• O fixador não deve encolher o tecido,
escurecê-lo ou torná-lo quebradiço.
• Os fixadores possuem, em geral, uma
acidez inferior a 4,5 (pH). Chegando as vezes
a inferior a 1.
 Técnicas Histológicas

FIXAÇÃO POR PERFUSÃO

 Atua mais diretamente.
 Injeção do líquido fixador nos vasos do
animal
• O tempo deve ser de 15-20 minutos e o
volume deve ser 20 vezes superior ao do
sangue do animal
• O fluxo pode ser controla-
do por gravidade ou utilizando
bomba peristáltica
 Método: Técnicas Histológicas

 Anestesiar o animal
 Abrir o tórax deixando
o coração a descoberto
 Fechar as artérias
mamárias e passar um laço
no pedículo do coração
- Introduzir o catéter no ventrículo esquerdo
penetrando na aorta ascendente
- Cortar a veia cava inferior para aspirar o
sangue e abrir imediatamente a perfusão
(fixador) para que o fluxo substitua o sangue