Unidade 2

PREPARAÇÃO DE LÂMINAS PERMANENTES E SEMIPERMANENTES

FIXAÇÃO IMOBILIZA OS COMPONENTES CELULARES

A fixação é o primeiro passo importante, quando se pretende estudar ou
observar a morfologia celular, bem como detectar componentes celulares, tais
como o DNA, RNA e proteínas, os quais poderão ser evidenciados por meio de
métodos de coloração geral ou por métodos citoquímicos.
A fixação apresenta as seguintes finalidades:
1) Evita a autólise, destruição da célula por suas próprias enzimas;
2) Impede a proliferação e a atividade bacteriana;
3) Enrijece células e tecidos para que resistam a outras etapas da
preparação histológica;
4) Por preservar os macrocomponentes celulares auxilia, de forma
indireta, na etapa de coloração.
A figura 01 apresenta a carne não fixada sobre a qual bactérias iniciaram a sua
colonização.

Fonte: http://www.foodpoisonblog.com/ground%20beef.jpg

Figura 01. Carne moída sobre a qual observar-se a proliferação bacteriana.

O mecanismo envolvido na fixação é complexo e ainda muito

desconhecido, mas seu emprego permitiu muitos avanços na Biologia Celular e
histologia. Os fixadores podem ser divididos em:
 1) químicos: um exemplo de solução fixadora deste grupo é o formaldeído
(formol). Este fixa por reagir, de forma covalente, com os grupamentos
amínicos de proteínas.
2) físicos: emprega-se o calor ou frio como agentes imobilizadores.

O nível de preservação do tecido pode variar em função do fixador

empregado, pois este pode causar algum tipo de inconveniente, que pode ser
sanado com a adição de um segundo fixador, que suprirá o efeito indesejado.
Mesmo preservando o tecido, muitos fixadores levam à formação de artefatos
de fixação, que correspondem a pequenas alterações nos tecidos que não
existiam quando as células estavam vivas. Os melhores fixadores são aqueles
que produzem distorções que não possam ser detectadas durante a
visualização microscópica, estando abaixo do limite de resolução do aparelho
utilizado para a observação.
Visando-se a preparação de material para o microscópio óptico sugere-se
que a peça a ser fixada, apresente uma espessura em torno de 1,0 cm e o uso
de um volume de fixador que exceda em 30 vezes o volume do material. O
tempo e a temperatura, em que ocorrerá este processo dependerão do fixador e
do material a ser preservado.
Os tecidos calcificados, como ossos e dentes, devem ter o cálcio extraído
por descalcificadores, concomitantemente à fixação, para este fim emprega-se
ácido lático ou fórmico e formaldeído. Este processo poderá ser realizado à
temperatura ambiente ou no máximo a 30°C, sendo observado o progressivo
amolecimento da peça, que é um reflexo da retirada do cálcio.

PREPARAÇÃO DE LÂMINAS PERMANENTES

A PEÇA DEVE SER DESIDRATADA, DIAFANIZADA E INCLUÍDA

A desidratação consiste na retirada lenta e gradual da água existente
nos tecidos, que serão imersos em soluções contendo concentrações
crescentes de etanol. Rotineiramente, empregam-se as seguintes
concentrações: 70, 80, 90 e 100% com a peça permanecendo por vinte minutos
em cada uma das concentrações.
A água deve ser retirada por não ser miscível em xilol ou óleo de cedro
que são empregados para a diafanização (clarificação) do material. O xilol deve
ser usado por 10 minutos e o óleo de cedro por no mínimo 8 dias.
Após a diafanização o material é banhado em parafina, no interior de
uma estufa a 60°C, esta penetra o material e facilitará o seu corte na etapa de
microtomia. O tempo de cada banho também varia de acordo com o material
que estiver sendo trabalhado. Na seqüência, o é tecido e emblocado em
parafina, que consiste na colocação da parafina líquida no interior de um
pequeno recipiente, que recebe em seguida a peça histológica. Esta etapa
ocorre fora da estufa, assim a parafina resfria e se solidifica, gerando o bloco de
parafina (figura 02).

http://www.pathus.com.br/imagens/inclusao2.jpg

Figura 02. Blocos de parafina, já solidificados e prontos

para a etapa de microtomia.

O bloco de parafina contendo o material, passa para a fase de

microtomia, na qual o tecido será cortado em secções muito finas, em um
aparelho chamado de micrótomo (figura 03), imediatamente após obtidas estas
secções são colocadas em banho-maria a uma temperatura de 37° C, para que
o corte sofra uma leve distensão, quando então é coletada diretamente sobre a
lâmina histológica, a qual foi previamente limpa, e desengordurada.
 http://www.opatologista.com.br/loja/images/mrp.jpg

Figura 03. Micrótomo usado na confecção de cortes

histológicos.

A fase seguinte consiste na desparafinização, na qual o corte passa por

banhos de xilol, retirando toda a parafina, permanecendo sobre a lâmina apenas
a secção do tecido, que deverá ser hidratado por meio de banhos sucessivos
em concentrações decrescentes de etanol. Rotineiramente emprega-se a
seguinte seqüência: 100, 90, 80, 70% e água. Após isto, o material está pronto
para ser corado. A figura 04 resume os procedimentos necessários, desde a
retirada do órgão até a obtenção do corte histológico, para a confecção de uma
lâmina permanente.

http://www.icb.ufmg.br/mor/biocelch/metodos_estudo/Figura%202.jpg

Figura 04. Figura esquemática exibindo algumas etapas do processo de confecção de uma
lâmina permanente.
 A COLORAÇÃO ACENTUA A ABSORÇÃO DE LUZ PELO MATERIAL
Os corantes são moléculas orgânicas que apresentam em sua estrutura
duplas ligações, as quais interagem com a luz dotando os corpos de
capacidades absortivas. Esta região do corante é denominada de grupo
cromofórico, sendo a responsável pela absorção da luz. Estes compostos são
empregados na coloração de cortes histológicos facilitando sua visualização.
Quanto à carga elétrica os corantes podem ser classificados como
básicos (catiônicos) ou corantes ácidos (aniônicos) (Figura 05).
Os corantes básicos apresentam carga elétrica positiva, e apresentam
afinidade por moléculas carregadas negativamente, esta interação recebe o
nome de basofilia. O azul de metileno e o azul de toluidina são exemplos de
corantes catiônicos, podendo evidenciar a presença do RNA, DNA e de
polissacarídeos carregados negativamente. A hematoxilina cora, principalmente,
moléculas com carga elétrica negativa, sendo classificada como um corante
básico. Na realidade trata-se de uma molécula carregada negativamente, a
hemateína, a qual é ligada a cátions como o ferro ou alumínio estes são
denominados de mordentes, carreando a ligação para moléculas carregadas
negativamente.
Os corantes aniônicos apresentam carga elétrica negativa ligando-se de
forma eletrostática a substratos com carga positiva. Esta interação é
denominada de acidofilia. Neste grupo pode-se citar a eosina.

A B
http://pcserver.iqm.unicamp.br/~wloh/cursos/qf952/estrutura.gif http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/9/9c/Eosin_Y.png/200px-Eosin_Y.png

Figura 05. Azul de metileno (A) e a eosina (B). As setas cheias apontam para as cargas elétricas
dos corantes, e as interrompidas para as insaturações, presentes no grupo cromofórico.
 OS MÉTODOS DE COLORAÇÃO GERAL
A hematoxilina/eosina é um método amplamente empregado, devido à
sua simplicidade de aplicação e interpretação. A hematoxilina faz papel de
corante básico, corando estruturas carregadas negativamente, e interagindo
com os grupamentos fosfatos presentes no DNA e RNA. As regiões da célula
ricas nestas moléculas coram-se em roxo como é o caso do núcleo e de certas
regiões do citoplasma. A eosina apresenta carga negativa corando o citoplasma
com uma tonalidade rósea. O corante se liga à cargas positivas dos amino-
ácidos lisina, histidina ou arginina.

OS MÉTODOS DE COLORAÇÃO CITOQUÍMICA

Os métodos citoquímicos apresentam alta especificidade para as
moléculas que serão coradas, havendo técnicas que permitem a quantificação
após a coloração. Dentre os vários métodos pode-se destacar a utilização do
reativo de Shiff, um leucoderivado da fucsina básica, que pode ser utilizado para
a coloração do DNA empregando-se a reação de Feulgen. A observação de
polissacarídeos neutros, tais como: a celulose, o amido, o glicocálix e o
glicogênio por meio da reação de P.A.S., ácido periódico e reativo de Shiff.
A reação de Feulgen envolve duas etapas. A primeira consiste na
hidrólise do material com ácido clorídrico, cuja concentração e a temperatura
variarão em função do material em estudo. Nesta fase ocorre a remoção das
bases púricas, adenina e guanina, do DNA, deixando exposta a função aldeídica
da desoxirribose. Na segunda etapa estes radicais ligam-se ao reativo de Shiff
restaurando o grupo cromofórico da molécula produzindo um composto corado.
A reação de Feulgen é específica para o DNA e ocorre de forma
quantitativa, pois a intensidade da coloração varia de acordo com a quantidade
de DNA presente. Por meio dela é que se determinou a quantidade de DNA nos
mais diferentes seres vivos, e que este duplica-se na fase S do ciclo celular.
A reação de P.A.S., também consiste de duas etapas. Na primeira o
material é oxidado, à temperatura ambiente, com ácido periódico. Este irá atuar
sobre os carboidratos que tenham hidroxilas vizinhas, levando à produção de
aldeídos que, durante a segunda fase, se ligarão ao leucoderivado da fuccina
básica restaurando o grupo cromofórico, gerando um composto corado.

MONTAGEM
Após a coloração, o material deve ser novamente desidratado e incubado
em xilol para a montagem, que consiste na fixação de lamínula sobre a secção
tecidual, para isto as lâminas são retiradas do xilol, uma a uma, e com esta
ainda úmida coloca-se uma pequena quantidade de bálsamo do Canadá , sobre
o qual aplica-se a lamínula.
Algumas características presentes nos tecidos, auxiliam na decisão do
método a ser utilizado para sua preparação, assim, nem sempre a inclusão e o
corte em parafina são empregados na preparação de lâminas. Outros métodos
que podem ser utilizados são: o esfregaço, o espalhamento e a montagem total,
por exemplo.
ESFREGAÇO
Células presentes em fluídos tais como: linfa, sêmen, hemolinfa e sangue
podem ser distribuídas sobre uma lâmina formando uma fina camada permitindo
assim, a observação de células inteiras ao microscópio óptico. O método
consiste na colocação de uma gota, ou pequena quantidade do material a ser
preparado na extremidade de uma lâmina. Com o auxílio de uma segunda
lâmina puxar o fluído que foi colocado sobre a primeira (Figura 06). Com este
procedimento obtêm-se células suficientemente isoladas, permitindo assim uma
melhor análise. Na figura 6B pode ser visualizado um esfregaço feito a partir de
sangue humano.
 H

A B
http://www.wcs.org/media/image/image-972324391.gif http://www.colegiosaofrancisco.com.br/alfa/corpo-humano-sistema-
cardiovascular/imagens/sangue-4.jpg
Figura 6. (A) Figura esquemática demonstrando a forma correta de confecção do esfregaço. (B) Esfregaço de
sangue humano mostrando as células de linhagem branca. H = hemácia.

ESPALHAMENTO
O espalhamento consiste na raspagem de membranas mucosas, tais
como a bucal, nasal, anal ou vaginal, por meio de um palito, espátulas ou
cotonetes, que na seqüência é deslizado sobre uma lâmina histológica. Por
meio deste método se realiza o exame preventivo do câncer do colo uterino
denominado de Papanicolau. A técnica também permite a visualização de
células inteira, muito embora o formato celular não seja preservado. Na figura
07 pode ser observadas lâminas preparadas por meio desta técnica.

N LC

LC C
C
N

A B
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/3/3f/
Pap_test_abnormal.JPG/180px-Pap_test_abnormal.JPG

Figura 07. Espalhamento de mucosa vaginal (Papanicolau) (A) e de mucosa bucal corado com
azul de metileno e eosina. LC = limite celular; N = Núcleo e C = Citoplasma
 MONTAGEM TOTAL
Esta técnica é empregada com tecidos sólidos, mas finos o suficiente
para permitirem a passagem da luz, como por exemplo, o mesentério de
mamíferos e o epitélio de Allium cepa (cebola) (Figura 08). O tecido é retirado
do organismo, distendido sobre a lâmina e observado, com ou sem coloração.
Como não há fixação, o material biológico dever ser descartado após a
observação.

C
PC

A B
http://img.olhares.com/data/big/3/34771.jpg

Figura 08. Fragmento de Allium cepa (A). A seta aponta o local de onde o epitélio é coletado. (B)
Montagem total do epitélio, observado ao microscópio óptico sem a utilização de corantes. PC =
parede celular; C = Citoplasma.

Os exercícios referentes a esta unidade poderão ser encontrados na

plataforma Moodle.