BIOLOGIA Sessão Prática Laboratorial e de Orientação Tutorial Semana 5

I – Metabolismo: Fotossíntese; Características dos pigmentos

fotossintéticos; Doseamento de clorofila.

Introdução

Nas plantas, as folhas são o principal órgão onde ocorre a fotossíntese. A figura 1 resume o
que acontece à energia luminosa que atinge uma folha.

Figura 1. Partição da energia luminosa que alcança uma folha. Cerca de 78% da energia é absorvida, enquanto
a restante é ou refletida ou transmitida pela folha. A energia absorvida é sobretudo utilizada na fotossíntese,
mas alguma é dissipada como calor e uma pequeníssima parte é emitida como fluorescência pelas moléculas
clorofila. Retirado de ESA bulletin. European Space Agency, 11/2003; 116: 34-37.

A absorção de energia é feita por um conjunto de pigmentos fotossintéticos (clorofilas e

carotenoides), organizados em fotossistemas (PSI e PSII). A figura 2 mostra os respetivos
espectros de absorção.

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Figura 2. Espectros de absorção de vários pigmentos fotossintéticos. Os pigmentos ficoeritrina e ficocianina

estão presentes em certas algas e bactérias fotossintéticas, mas não nas plantas superiores.

Um fotossistema é um arranjo de clorofila com outros pigmentos, integrado nos tilacóides.

Um fotossistema possui várias centenas de moléculas de clorofilas, mas só as moléculas de
clorofila a (P700 e P680), são capazes de promover a transferência de eletrões.
Quando uma molécula de clorofila a no PSII absorve um fotão de energia, um dos seus
eletrões passa para um estado de energia mais elevado. Neste estado excitado é capturado
por um pool aceitador de eletrões, a partir do qual é transportado através de uma cadeia de
transporte eletrónico até ao PSI, onde ocorre um processo similar (ver Figura 3). Durante
este processo fotoquímico são geradas moléculas de ATP e NADPH que fornecem energia
para converter CO2 em açúcar, no que é conhecido como “Ciclo de Calvin”.
Por diversas razões muitos dos eletrões excitados da clorofila a (na figura 3, Chl ) no PSII
não são capturados pelo pool aceitador e decaem para o seu estado estacionário (ground
state). A energia perdida neste processo de decaimento é emitida como luz fluorescente.
Esta emissão de fluorescência, a par com a produção de calor, são formas de dissipar a
energia absorvida que não é convertida em energia química, evitando danos para a folha.

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Figura 3. Diagrama simplificado da fase fotoquímica (“reação luminosa”) da fotossíntese. A fluorescência é

emanada pela clorofila a do PSII. Retirado de:
https://www.researchgate.net/publication/272817906_National_proceedings_forest_and_conservation_nurser
y_associations-2005/figures?lo=1)

A energia absorvida é, por conseguinte, dissipada (quenched) por três vias, o que se designa
por quenching de energia. Os três tipos de quenching (ver também figura 1) são:
- Quenching fotoquímico (qP) – em que a energia luminosa é convertida em energia
química e utilizada mais tarde para a fotossíntese; isto é, a energia luminosa absorvida que
é dissipada através do fluxo eletrónico na reação luminosa.
- Quenching não fotoquímico (qN) – uma vez que as necessidades de luz por parte da
planta para realizar a fotossíntese são muitas vezes inferiores à luz absorvida, muita desta
energia extra é dissipada sob a forma de calor. É o chamado quenching não fotoquímico,
isto é, a energia luminosa absorvida que é dissipada através da perda de calor sensível e
outros mecanismos não-fotoquímicos.
- Quenching de fluorescência (qF) – finalmente uma pequena, mas importante, porção de
energia em excesso é libertada, como referido antes, como emissões fluorescência a partir
das moléculas de clorofila; é o chamado quenching de fluorescência.
A determinação da concentração da clorofila é uma forma de avaliação de biomassa vegetal.
Esta avaliação pode ser realizada com metodologias destrutivas da amostra foliar, como o

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procedimento experimentar descrito neste protocolo, e que expressam a concentração da

clorofila por unidade de peso.
Metodologias não destrutivas como a determinação da concentração da clorofila através da
emissão de fluorescência pelas clorofilas na radiação vermelha (700 nm) e na radiação
vermelha-longínqua (730 nm). Nesse caso a concentração de clorofila vem expressa em mg
por unidade de área foliar. Este método não destrutivo possibilita determinar variações da
concentração de clorofila nas plantas e na sua atividade fotossintética, motivadas por
alterações das condições ambientais, por situações de stress, pela deficiência de nutrientes,
por doenças, etc. Pela simplicidade e rapidez da sua utilização, pode ser utilizado no campo
e realizar um grande número de determinações em pouco tempo.

Palavras-chave: absorvância/absorvência; clorofilas; energia; fase dependente da luz;

fluorescência; fotossíntese; fotossistemas I e II (PSI, PSII); pigmentos; quenching.

Procedimento Experimental

Objetivos
Extração de pigmentos fotossintéticos e determinação do conteúdo em clorofila de uma
amostra foliar.

Enquadramento
O método usado neste procedimento para a determinação da concentração da clorofila em
folhas é um método destrutivo, que se baseia na solubilidade da clorofila em acetona e na
relação entre as absorvâncias e as concentrações de clorofila nas amostras foliares.

Equipamento e Material
Espectrofotómetro.
1g de folhas de espinafre
Acetona a 80%
Almofariz
Proveta
Funil
Papel de filtro
Gelo
Papel de alumínio
Segurança
É necessário tomar os cuidados relativos à utilização de um equipamento elétrico e de
reagentes químicos (não ingerir e evitar o contacto com a pele e olhos).

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Procedimento

A - Extração de pigmentos fotossintéticos:

- Colocar o almofariz em gelo no cristalizador e proteger com papel de alumínio.

- Homogeneizar 1g de folhas de espinafres (lavadas, escorridas e sem as nervuras
principais) com 30ml da acetona a 80%.
- Filtrar o homogenato através de papel de filtro e recolher em proveta refrigerada e envolvida
em papel de alumínio.
- Lavar o almofariz com 15 ml de acetona a 80% e filtrar usando o mesmo sistema.
- Retificar o volume final para 50 ml.

NOTA: todos os procedimentos devem ser executados, tanto quanto possível, ao abrigo da luz e do
calor, uma vez que os pigmentos são foto e termo sensíveis.

B - Determinação do conteúdo em clorofila

Após a extração de pigmentos fotossintéticos efetuar a leitura num espectrofotómetro nos

comprimentos de onda de 645 e 663 nm, utilizando como branco a solução de acetona a
80%. Calcular as concentrações das clorofilas a, b e total utilizando as seguintes
expressões, apresentando os resultados em mg/g (mg por unidade de peso fresco da folha):

Clorofila a = (0,0127.DO663 – 0,00269.DO645) mg/ml solução

Clorofila b = (0,0229.DO645 – 0,00468.DO663) mg/ml solução

Clorofila total = (0,0202.DO645 + 0,00802.DO663) mg/ml solução

onde DO = densidade ótica = absorvância.

Registo de Resultados

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Bibliografia
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Morgan, D., Raff, M., Roberts, K. & Walter, P. (2014).
Molecular Biology of the Cell, 6th ed.. Garland Science, 1464 pp..

Azevedo, C. & Sunkel,C. (2012). Biologia Celular e Molecular, 5ª ed.. Lidel- Edições
Técnicas, 629 pp.

Orientação Tutorial
1. Qual a função do pilão do almofariz e da acetona a 80%?

2. Qual a razão de filtrar o macerado da folha em acetona?

3. O facto de o procedimento ser efetuado no frio e na ausência de luz revela algumas das
características das clorofilas. Quais?

4. Qual a razão para a escolha dos comprimentos de onda de 645 e 663 nm?

5. Qual a razão para que os pigmentos carotenoides somente sejam visualizados durante
a senescência nas plantas?

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II - Diversidade de Células Vegetais

Introdução
A capacidade das plantas fixarem o CO2 atmosférico, durante a fotossíntese, e de
produzirem uma parede celular, marca a diferença entre dois grupos de seres vivos
celulares: as plantas e os animais.
A parede celular é uma forma particular de matriz extracelular, intimamente associada à face
exoplasmática da membrana plasmática da célula vegetal.
Numa planta, as células jovens são de tamanho reduzido, quando comparadas com células
adultas. As células vegetais, durante as fases iniciais do desenvolvimento, apresentam uma
parede celular primária (Figura 5) constituída por longas fibras de celulose unidas por uma
matriz constituída por proteínas e polissacáridos. Os polissacáridos da matriz são
essencialmente pectinas e hemiceluloses.

Figura 5. Apresentação esquemática da composição e estrutura da parede celular primária. Adaptado de

https://www.todamateria.com.br/parede-celular/

Quando a célula atinge a sua forma definitiva, regista-se a deposição de mais materiais da
parede celular primária (celulose), ou, em muitos casos, a deposição de novas camadas de
composição diferente (lenhina, suberina, cutina), dando origem à parede celular secundária.
A deposição da parede celular secundária ocorre entre a membrana plasmática e a parede
celular primária e faz-se, normalmente, em camadas sucessivas com diferentes orientações.
A forma e a composição da parede celular determinam a função de cada tipo especializado
de célula vegetal e, consequentemente, dos tecidos vegetais (Figuras 6 e 7).

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Figura 6. Corte transversal de um caule de Ranunculus repens, mostrando células com morfologia de parede
variada, em diferentes tipos de tecido. Retirado de Lincoln, T. et al., 2017.

Apicais
Primários
Meristemas Intercalares
Secundários ou
laterais

P. clorofilino
Parênquimas
P. de reserva
Tecidos vegetais Essencialmente
elaboradores
T. resinífero
Tecidos secretores
T. lacticífero

Epiderme
Tecidos definitivos
Endoderme e
Exoderme

Súber ou cortiça
De proteção

Essencialmente Colênquima
mecânicos De suporte
Esclerênquima

Xilema ou tecido
lenhoso
Condutores
Floema ou tecido
liberino

Figura 7. Tecidos Vegetais (desenvolvido por Quedas, F., 2020).

Palavras-chave
Célula vegetal; parede celular primária; parede celular secundária; tipos celulares.

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Bibliografia
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Morgan, D., Raff, M., Roberts, K. & Walter, P. (2016).
Molecular Biology of the Cell, 8th ed.. Garland Science, 1464 pp. Ver Parte IV, Capítulo 20.
Lincoln, T., Zeiger, E., Moller, I.A. & Murthy, A. (2017). Fisiologia e desenvolvimento vegetal.
Tradução: Mastroberti, A.A., et al. 6ª Ed. Artmed.

Procedimento

Objetivo
Relacionar os diferentes tipos de células vegetais com as respetivas funções.
Enquadramento
A forma e a composição da parede estão relacionadas com a função da célula no tecido. As
células da epiderme possuem paredes celulares laterais e basal de natureza celulósica mais
ou menos delgada. Durante a diferenciação, a parede celular celulósica externa destas
células torna-se mais espessa e cobre-se por uma cutícula que é constituída,
essencialmente, por cutina, um polímero insolúvel, e por ceras, facilmente extraídas por
solventes orgânicos. A suberificação consiste na deposição de camadas sucessivas de
suberina na face interna da parede celular e tem um papel protector e impermeabilizador.
Podemos encontrar exemplos de suberificação nas células da endoderme. No floema, por
exemplo, tecido responsável pelo transporte dos produtos da fotossíntese, sobretudo a
sacarose, das células fotossintéticas para os restantes órgãos da planta, a sua diferenciação
envolve a deposição de grande quantidade de celulose e hemiceluloses na parede. No
xilema, tecido especializado no transporte de água e iões da raiz para o resto da planta, as
células, de forma tubular, possuem parede celular secundária extremamente espessa e rica
em lenhina. Já o colênquima, tecido vivo de suporte, localizado à periferia dos órgãos
vegetais, possui uma parede celular primária espessa, de natureza pectocelulósica, muito
rica em água (Figueiredo et al., 2014).

Material
Observação e reprodução de imagens de preparações definitivas com cortes histológicos de
material vegetal.
Seguir a apresentação do docente responsável pela sessão de ensino prático e laboratorial
orientada pela ordem seguinte de tipos de células:

1º - Células da epiderme;
2º - Células de parênquima;
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3º - Células de colênquima;
4º - Células de esclerênquima;
5º - Células de floema;
6º - Células de xilema.

Orientação Tutorial

1. Nas imagens seguintes identifique a localização das células e tecidos observados.

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2. Observe as Figuras A, B e C.

a) Faça a legenda A - Assinale com x a opção

correta
Legenda:
___ 1. Parênquima cortical; 2. Parênquima
medular; 3. Endoderme; 4. Floema; 5. Xilema.
___ 1. Parênquima medular; 2. Parênquima
cortical; 3. Endoderme; 4. Floema; 5. Xilema.
___ 1. Parênquima cortical; 2. Parênquima
medular; 3. Esclerênquima; 4. Xilema; 5. Floema.
b) Complete a frase: “Tendo em consideração
que o cilindro central apresenta uma endoderme
com espessamentos em U, feixes condutores
simples e alternos e presença de parênquima
A
medular, a Figura A é um corte histológico de
uma ____ _____ de uma planta Monotiledónea”.

c) Faça a legenda B - Assinale com x a opção correta

Legenda:
___ 1. Parênquima cortical (córtex); 2. Xilema; 3. Floema; 4.
Epiderme; 5. Parênquima medular.
___ 1. Xilema; 2. Parênquima cortical (córtex); 3. Floema; 4.
Epiderme; 5. Parênquima medular.
___ 1. Parênquima medular; 2. Xilema; 3. Floema
4. Epiderme; 5. Parênquima cortical (córtex).
d) Complete a frase: “Tendo em consideração que os feixes
condutores estão dispostos num único anel, os feixes são
B colaterais, ou seja o xilema está junto do floema, junto dos feixes
condutores existem tecidos de suporte; a Figura B é um corte
histológico de um ______________ de uma planta
Dicotiledónea”.

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3 e) Faça a legenda C - Assinale com x a opção correta
Legenda:
___ 1. Parênquima em paliçada; 2. Parênquima lacunoso; 3.
Esclerênquima; 4. Xilema; 5. Floema; 6. Parênquima medular.
C
___ 1. Xilema; 2. Parênquima cortical (córtex); 3. Floema; 4.
Epiderme; 5. Parênquima medular; Parênquima medular.
___ 1. Epiderme; 2. Parênquima lacunoso; 3. Colênquima; 4.
Floema; 5. Xilema; 6. Parênquima em paliçada.
f) Complete a frase: “Tendo em consideração que estomas apenas
se encontram na página inferior, o mesófilo é assimétrico, com
6 parênquima clorofilino lacunoso e em paliçada, com nervura
2
principal bem evidente. a Figura C é um corte histológico de uma
_________ de uma planta Dicotiledónea”.

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