Universidade Federal Rural do Semiárido -

UFERSA
Programa de Pós-Graduação em Fitotecnia
Disciplina: Métodos Laboratoriais Avançados em Fisiologia Vegetal
Docentes: Adriano do Nascimento Simões
Fred Augusto Lourêdo de Brito
Discente: Ivanice da Silva Santos

RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS

MOSSORÓ, 2022
1ª PRÁTICA: Pigmentos hidrossolúveis e lipossolúveis em tecidos vegetais

Maceramos 2 gramas de folha vegetal de coloração roxa, em 50 ml de acetona

80%. Para a filtragem utilizamos oito camadas de gases e após, duas camadas de filtro de
papel. 10 ml da solução filtrada foi inserida em um funil separador, onde adicionamos
ainda, 10 ml de água destilada e 10 ml de éter etílico.

Ao adicionarmos o éter etílico foi possível observar a separação da solução em

duas camadas, onde a camada superior apresentou a coloração verde e a inferior uma
coloração rósea (Imagem 1).

Coletamos então 5 ml da camada inferior em uma proveta e adicionamos mais 5

ml de água destilada. Realizamos o mesmo procedimento para a parte superior.
Adicionamos então, algumas gotas de hidróxido de sódio (NaOH) 0,1N à parte inferior e
observamos que a solução mudou sua coloração de rósea para verde. Ao adicionarmos
algumas gotas de Ácido clorídrico (HCl) 0,1N, a coloração voltou ao rósea. Esse processo
ocorre porque as antocianinas apresentam a capacidade de mudar de cor de acordo com
o pH do meio. As antocianinas podem apresentar diferentes estruturas e estas, diferentes
colorações. Essas formas podem sofrer alterações de acordo com o pH, sendo assim, a
depender da acidez ou alcalinidade do meio, as antocianinas apresentaram diferentes
formas e por consequência, diferentes colorações.

Para a camada superior adicionamos ainda, 5 ml de hidróxido de potássio (KOH)

3N , e dessa forma, foi possível observar a separação de uma camada de coloração verde
escura e uma amarelada. Isso ocorre porque o KOH tem a capacidade de quebrar a
mólecula da clorofila e sendo assim, ocorre a separação entre clorofila (camada verde) e
carotenóides (camada amarela).
Imagem 1: Solução em funil de separação com camadas separadas de pigmentos
lipossoluvéis e hidrossoluvéis

QUESTÕES:

 Onde se localizam, na célula, os pigmentos lipossolúveis das plantas verdes?

Quais são esses pigmentos? E quais são os pigmentos hidrossolúveis e em
que parte da célula se encontram?

Os pigmentos lipossolúveis das plantas verdes encontram-se na membrana lipídica

dos tilacóides, haja vista o seu teor lipossolúvel, sendo eles as clorofilas e os carotenóides.
Já os pigmentos hidrossolúveis, flavonóides e xantofilas, são localizados dentro do
vacúolo onde há uma solução de solutos orgânicos, sendo possível já que os mesmos são
hidrossolúveis.

 Podemos afirmar que as antocianinas não participam da fotossíntese? Por

quê?

Sim! Devido sua ausência nos cloroplastos, principal organela responsável pela
síntese fotossintética. As antocianinas estão mais ligadas à proteção térmica do aparato
celular.
2ª PRÁTICA: Determinação do espectro de absorção dos pigmentos dos cloroplastos.

Maceramos com 50 ml de acetona 80% 2 gramas de folhas vegetais verdes e 2

gramas de raspas de cenoura (Daucus carota). Filtramos em 8 camadas de gases e 2
camadas de papel filtro (Imagem 2). Os extratos foram levados ao espectrofotômetro e
realizado a leitura de ambos em todos os comprimentos de onda.

Imagem 2: Filtragem da solução para posterior leitura em espectrofotômetro

Com base nos gráficos gerados é possível observar que para a clorofila (Figura 1)
houve picos de absorção nos comprimentos de onda nas faixas do violeta azul e do
vermelho correspondendo a 440 e 675 nm, respectivamente. No entanto, entre a faixa de
500 a 600 nm a absorbância foi menos acentuada, pois é justamente nessa faixa de
comprimento de onda que se encontra a coloração verde, o que demonstra que nessa faixa
a coloração verde das clorofilas não é absorvida, mas refletida.
 3500

3000

2500

2000
Absorbâncias

1500

1000

500

0
400 450 500 550 600 650 700
Comprimentos de onda λ

Figura 1: Espectro de absorção das clorofilas extraídas de folhas vegetais verdes

Para os carotenóides (Figura 2) , o pico de absorção foi observado nos

comprimentos de onda de 430 a 480 nm, na região do azul-violeta. A partir do
comprimento de onda 525 nm a absorção dos carotenóides foi baixa, pois é justamente o
comprimento de onda que reflete a coloração do amarelo, laranja e vermelho.

400

350

300
Absorbâncias

250

200

150

100

50

0
400 450 500 550 600 650 700
Comprimento de onda λ

Figura 2: Espectro de absorção dos carotenóides extraídos da casca da cenoura

QUESTÕES:

 Quais as faixas dos comprimentos de onda que os extratos de pigmentos dos

cloroplastos mais absorvem?

Comprimentos de onda nas faixas do violeta azul e do vermelho correspondendo a

440 e 675 nm, respectivamente, no caso das clorofilas e, comprimentos de onda de 430 a
480 nm, na região do azul-violeta, para os carotenóides.

 Por que a absorbância é menor na região da luz verde?

Nessa faixa, a clorofila, principal pigmento fotossintetizante absorve os
comprimentos de onda na faixa do vermelho e do azul, que é a região do espectro efetiva
na fotossíntese, e por consequência reflete a coloração verde.

 Quais os comprimentos de onda mais absorvidos pelos carotenoides?

Comprimentos de onda de 430 a 480 nm, na região do azul-violeta.

3ª PRÁTICA: Síntese de amido: Efeito da clorofila e da luz

Em uma placa de petri colocamos um pedaço de banana (Musa) e adicionamos

algumas gotas de lugol. Foi possível observar o aparecimento de uma coloração escura
intensa. O lugol é um indicador da presença de amido através do aparecimento dessa cor
escura.

A prática que seria realizada com folhas variegadas, que são plantas que
apresentam além dos cloroplastos, outros plastídeos chamados leucoplastos, não
funcionou. Os leucoplastos não apresentam clorofila, o que confere às folhas uma
coloração branca em algumas partes, e praticamente inibe o processo de fotossíntese
nessas partes foliares, mesmo assim ocorre a síntese de amido. Esperava-se, após a
descoloração de toda a folha por meio de imersão por um minuto em água fervente e
banho maria com álcool etílico, adicionar algumas gotas de lugol para identificar a
produção de amido pelos leucoplastos, e assim, observar o aparecimento de uma
coloração escura indicando então, a síntese de amido por estes. Provavelmente esse efeito
não foi possível de ser visualizado devido ao tempo em que as folhas passaram em
ambiente sombreado, fazendo com que as mesmas consumissem sua reserva de amido.
QUESTÕES:

 Se houvesse dado certo a prática com folhas variegadas, onde você esperaria
que haveria mais amido na folha, na porção verde ou branca? Qual o papel
da luz e dos cloroplastos na síntese de amido?

Provavelmente, a porção verde da planta apresentaria mais amido, pois este açúcar
de reserva é sintetizado nos cloroplastos durante o dia, com o auxílio da luz, já que este é
um dos produtos da fotossíntese, e consumido durante a noite. No caso da porção branca
da folha, a síntese de amido ocorre pelos leucoplastos, no entanto, isso basicamente
ausenta a fotossíntese nessa porção foliar, reduzindo então, a síntese de amido. O papel
do cloroplasto e da luz na síntese de amido se dá pelo próprio processo fotossintético.
Durante o dia, na presença da luz, a folha realiza fotossíntese, produz amido e como sua
translocação não acompanha a taxa de produção, ele acaba aumentando, e diminuindo
apenas durante a noite quando, na ausência de luz e sem fotossíntese, ele é consumido.

4ª PRÁTICA: Fatores que afetam a fotossíntese

As plantas aquáticas apresentam mecanismos de captação de CO2. Este reage com

a água e forma carbono que se difunde na folha até o cloroplasto. No Ph celular ele é
convertido em CO2 novamente e então, entra no Ciclo de Calvin continuando o processo
de fotossíntese.

Nesta prática, colocamos em uma proveta de 1000 ml um ramo de Elodea

canadenses em água gaizeficada (Imagem 3). A água forneceu à planta o CO2 necessário
para ela realizar a sua fotossíntese nesse ambiente artificial. Foi possível observar esse
processo através das bolhas que eram liberadas pelo ramo na parte em que foi cortado, o
que representa o oxigênio proveniente da quebra da molécula da água no fotossistema II.
Imagem 3: Elodea canadenses em água gaizeficada liberando gás oxigênio

QUESTÕES:

 Que gás forma as bolhas que se desprendem do ramo de Elodea quando se

coloca água gaseificada?

Oxigênio

 O que você pode afirmar se houvesse dado certo a prática com intensidade
luminosa? Haveria aumento da produção de bolhas quanto mais perto da
lâmpada?

Quanto mais próximo a fonte de luz, maior o número de bolhas que sairiam do
ramo da Elodea, pois quanto maior a intensidade luminosa, maior a energia disponível
necessária para a realização da fotossíntese, aumentando então a liberação do oxigênio
proveniente do processo fotossintético e assim, de forma representativa, o número de
bolhas.
5ª PRÁTICA: Demonstração da respiração pelo método do indicador

Enumeramos 7 tubos de ensaio e adicionamos cinco gotas de azul de bromotimol

em todos. No primeiro adicionamos apenas 5 gotas de azul de bromotimol, no segundo
adicionamos ainda, uma solução de levedo com solução de sacarose a 10%, no terceiro
uma solução de levedo com água, no quarto uma solução de levedo com água fervida, no
quinto cinco sementes de milho (Zea mays) embebidas em água, no sexto cinco sementes
secas e no sétimo uma folha vegetal e o embrulhamos com papel alumínio (Imagem 4).

Imagem 4: Tubos de ensaio com os tratamentos aplicados

Como resultados deveriamos observar a mudança de coloração do azul de

bromotimol para o amarelo, se o ambiente se tornasse ácido, para o verde se o ambiente
se tornasse neutro e para o azul se o ambiente se tornasse alcalino.

Para comprovar a prática realizamos três testes: o primeiro adicionamos HCl no

indicador azul de bromotimol e o mesmo ficou amarelo, indicando acidez, após
adicionamos NaOH e o indicador ficou azul, indicando alcalinidade. No teste 2
adicionamos algumas gotas de água gaizeficada e no teste 3 apenas sopramos, com o
axílio de uma pipeta de vidro, dentro do tubo. Nesses dois últimos testes o indicador ficou
amarelo, comprovando que na presença de gás carbônico o meio se torna ácido.
QUESTÕES:

 Compare e justifique os resultados obtidos nos tubos 2, 3 e 4. O que havia em

comum nos tubos onde houve mudança de cor?

Nossos resultados se apresentaram da seguinte forma: tubo 2 coloração amarela

escura, pois o levedo utilizou a sacarose como substrato para produzir CO2 e assim,
acidificando o meio; tubo 3 amarelo, onde não havia substrato para a respiração de
acidificação do meio, mas foi utilizado o CO2 proveniente do nosso “sopro”, e tubo 4
verde, onde não houve atividade da levedura. Os tubos que apresentaram alteração na cor
apresentavam em comum, CO2 em seu meio.

6ª PRÁTICA: Atividade da catalase em tubérculo de batata

Fervemos um pedaço de batata inglesa (Solanum tuberosum) em água por cinco

minutos e a colocamos em seguida, em uma placa de petri, assim como também um
pedaço in natura. Adicionamos algumas gotas de peróxido de hidrogênio diluido em água
destilada na proporção de 30:1 em cada pedaço. Na batata cozida não foi possível
observar nenhuma reação, enquanto na batata in natura houve o aparecimento de
pequenas bolhas indicando a atividade da enzima catalase (Imagem 5).

Imagem 5: Batatas com peróxido de hidrogênio para observação da atividade da

enzima catalase
QUESTÃO:

 Cobrindo fatias de batatinha com água oxigenada, observa-se maior

evolução de bolhas de oxigênio nos tecidos da periferia do que nos tecidos
internos. Por quê?

O peróxido de hidrogênio é uma espécie reativa de oxigênio (EROS). Em

concentrações normais atua na sinalização celular além de em outras funções. No entato,
quando sua concentração se eleva pode causar danos oxidativos á celula. Dessa forma,
precisa ser convertido em água e oxigênio através da atividade da enzima catalase. A
catalase é encontrada nos tecidos mais ativos dos vegetais, no caso da batata, nos tecidos
periféricos onde ocorre a expansão celular. Devido a isso, conseguimos visualizar a
ativiade da catalase na parte periférica do corte da batata. Porém, em temperaturas
elevadas, assim como boa parte das enzimas e proteínas, a catalase se desnatura perdendo
sua estrutura e função, sendo assim, após a fervura da batata não seria possível visualizar
a sua atividade.

7ª PRÁTICA: Relação energética da embebição

Colocamos uma porção de amido em estufa, a 105 °C durante 2 horas. Após sua
retirada adicionamos a um tubo de ensaio uma porção de amido em temperatura ambiente
e aferimos sua temperatura, onde a mesma se encontrava em 27 °C. Adicionamos então,
a esse tubo de ensaio água destilada na mesma temperatura. A mistura então apresentou
a temperatura de 30 °C. Em outro tubo de ensaio adicionamos o amido retirado da estufa
e aferimos sua temperatura, registrando então 29 °C e adicionamos água na mesma
temperatura. Ao aferir a temperatura dessa mistura a mesma estava em 35 °C.

QUESTÃO:

 Por que, quando se coloca água em amido desidratado, a temperatura do

sistema aumenta muito mais do que quando se adiciona água em amido
hidratado?

Realizando o cálculo para sabermos o potencial matricial, que mede a redução da

energia livre d´água, em razão de fenômenos de superfície, como a embebição, por
exemplo, vimos que o mesmo se apresentou mais elevado na solução com amido
desidratado, pois a energia que foi liberada durante a secagem do amido foi maior, já que
se perdeu muitas moléculas de água (Tabela 1).

Tabela 1: Potencial matricial de amido hidratado e desidratado em estufa a 105 °C

Amido T°C inicial T°C final ΔT°C Pressão ψM

Hidratado 27 30 3 339,99 -339,99
Seco em estufa 29 35 6 679,98 -679,98

8ª PRÁTICA: Recuperação de turgescência em ramos cortados

Coletamos alguns ramos de mamona (Ricinus communis) com folhas e colocamos

alguns diretamente em um béquer com água, em outros cortamos cerca de 50 mm da base
e os depositamos em outro béquer com água. Ainda, em mais alguns ramos cortamos
novamente cerca de 50 mm da base, no entanto, desta vez dentro do béquer contendo
água. Coletamos também alguns ramos de uma planta aleatória e os colocamos em um
quitasato contendo água, tampamos a boca do recipiente com massa modelar para não
deixar sair o ar e, com o auxílio de uma bomba a vácuo aplicamos vácuo por cinco
minutos no quitasato (Imagem 6). Observamos o que ocorreu nos quatro tratamentos.
Imagem 6: Ramo vegetal em kitasato sendo submetido a retirada de vácuo do
recipiente

QUESTÕES:

 Dentre os tratamentos aplicados (corte do ramo fora da água e cortar o ramo

dentro da água), quais ramos recuperam a turgescência mais rapidamente e
como você explica as diferenças na velocidade?

Os ramos cortados dentro da água recuperam a turgescência mais rapidamente.

Isso se dá porquê ao ser desprendido da planta ocorre a entrada de ar pela abertura exposta
do ramo, causando cavitação e assim, por meio da embolia provocada a água tem a sua
passagem impedida através dos vasos do xilema. Nos ramos que são cortados fora da
água não há recuperação da turgescência, pois mesmo que se tenha retirado a porção que
provavelmente estava com ebolia, os ramos, fora da água tende a puchar o ar na tentativa
de uma recuperação mas acaba ocasionando cavitação novamente. Já para os ramos que
são cortados dentro da água, assim que a porção com uma possível ebolia é retirada o
ramo já passa a absorver água pelo xilema levando – a até a célula.

 Qual a explicação para recuperação da turgescência do ramo que estava no

frasco a vácuo?

O vácuo removeu as possíveis bolhas de ar dos vasos condutores da planta,

permitindo que a mesma absorvesse a água e recuperasse sua turgescência.
9ª PRÁTICA: Exsudação da seiva do floema

Coletamos um ramo de melão caetano (Mormodica charantia) e com o auxílio de

uma lâmina de barbear retiramos uma porção do caule e o mergulhamos em álcool etílico.
Foi possível visualizar o exsudato saindo do ramo por um tempo e depois sessando.

QUESTÕES:

 Por que a exsudação paralisa após alguns minutos?

Como mecanismo de proteção, as proteínas P das paredes do floema se
desprendem e se depositam nas placas crivadas das células desse tecido, formando uma
barreira que impede a saída da sacarose, por esse motivo a visualização do exsudato é
interrompida depois de um tempo.

 Como você poderia correlacionar a saída do exsudato com o modelo da teoria

do fluxo em massa, por pressão (força positiva), de Munch? (lembre do
desenho que fiz em sala da fonte e dreno)

O exsudato observado na prática, é a sacarose produzida pela planta durante a

fotossíntese saindo da fonte e indo em direção ao dreno. A teoria de Munch diz que, esse
acúmulo de solutos nas folhas derivado da fotossíntese exerce uma pressão negativa, que
faz com que as folhas retirem, por osmose, água do xilema. As células das folhas, ficariam
então preenchidas por água, o que causaria uma diferença de potencial de pressão
positiva, fazendo com que a sacacores fosse levada, de célula em célula, através do floema
para o fruto (dreno).

10ª PRÁTICA: Efeito da temperatura sobre a permeabilidade das membranas celulares

Cortamos cerca de 20 mm de fragmentos da beterraba (Beta vulgaris). Lavamos

esses fragmentos em água corrente até o seu pigmento característico parar de escorrer.
Logo após colocamos esses fragmentos em tubos de ensaio com água nas temperaturas
de -15, 0, 10, 20, 40 e 60 °C durante 1 hora. Após o tempo transcorrido realizamos a
leitura em espectrofotômetro a 525 nm.
QUESTÃO:

• Por que a absorbância é alta quando se congela o cilindro de beterraba? E

por que a absorbância é baixa entre 10 e 30º e aumenta em temperaturas mais
elevadas?

A partir do gráfico (Figura 3) feito após as leituras podemos ver que, tanto as
baixas temperaturas devido sua formação de cristais de gelo, quanto as altas temperaturas
por desnaturação de proteínas, possibilitaram uma maior desestabilização da membrana,
ocasionando uma maior perda de solutos. Já as temperaturas de 10 e 20 °C ainda
mantinham a membrana estável com poucas perdas. Temperaturas extremas, como o
congelamento e a partir de 60 °C possibilitam a desestabilização da membrana celular,
permitindo que os seus solutos sejam extravassados. No caso das betalaínas, principais
pigmentos presentes na beterraba, e acumuladas no vacúolo, houve a desestabilização das
membranas dessa organela, afetando a sua permeabilidade, e permitindo o
extravasamento do pigmento, o qual foi lido pelo método de espectrofotometria.

600

500

400
Absorbâncias

300

200

100

0
-20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70
Temperaturas °C

Figura 3: Conteúdo de betalaínas em células da beterraba sob diferentes temperaturas

11ª PRÁTICA: Plasmólise e efeito de substâncias tóxicas sobre a permeabilidade das
membranas celulares

Com o auxílio de uma lâmina de barbear retiramos um fragmento de uma folha de

planta de Zebrina e inicialmente produzimos uma lâmina para visualização em
microscópio óptico com apenas água. Conseguimos visualizar a célula vegetal em
perfeito estado hídrico. Quando a célula estar túrgida o potencial de pressão é positivo e
o potencial hídrico é zero. Após secamos a lâmina e adicionamos uma solução de sacarose
0,25 M para visualização em microscópio óptico. Por último, adicionamos á lâmina álcool
etílico.

QUESTÕES:

 Defina plasmólise e desplasmólise

A plasmólise é o processo pelo qual, a célula perde água e vai se contraindo,
fazendo com que a membrana plasmática se desprenda da parede celular. Como este é um
processo que pode ser reversível, a membrana pode voltar a absorver água e se prende
novamente a parede celular, através do que chamamos de desplasmólise.

 Por que o pigmento não saiu das células quando houve plasmólise (induzido
por sacarose)? E por que saiu quando as células plasmolisadas foram
tratadas com alcool?

Esse fenômeno se dá porque reduzimos o potencial osmótico no exterior da célula,

fazendo com que a água saisse do vacúolo e este se contraisse e reduzisse o potencial de
pressão até zero, além do potencial osmótico, em estado de plasmólise. Como não há o
extravasamento do conteúdo celular, apenas o desprendimento da membrana plasmática
da parede celular, a cor vermelha é resultado da presença de antocianinas no vacúolo que
apesar da plasmólise, não são perdidas. O alcoól etílico, por sua vez, provocou após algum
tempo a completa lise celular, ou seja, todo o conteúdo da célula foi perdido por
extravasamento, sendo possível visualizar células totalmente vazias (Imagem 7).
 A B

Imagem 7: Visualização de células vegetais em microscópio óptico. A. células em

plasmólise; B. células em lise celular

12ª PRÁTICA: Efeito do etileno em plantas

Durante quatro dias expomos algumas plantas de feijão (Phaseolus vulgaris) e de

milho em duas campânulas de vidro, onde em uma colocamos além das plantas
mencionadas, duas bananas e na outra campânula duas laranjas (Citrus) (Imagem 8). Ao
final do quarto dia observamos que na campânula com a banana as folhas de feijão e de
milho estavam mais amareladas, curvadas e tiveram um crescimento do caule maior.

A B
Imagem 8: Câmpanulas de vidro para análise da ação do etileno. A. Plantas de milho e
de feijão juntamente com laranjas; B. Plantas de milho e de feijão juntamente com
bananas

QUESTÃO:

 O que é epinastia? Por que, em campanulas com laranja, as plantas não

apresentaram folhas com epinastia diferentemente de campanulas com
Banana?

O que ocorreu nas campânulas foi a liberação do hormônio gasoso etileno pelas
frutas expostas. A banana é um fruto conhecido como climatérico, pois apresenta seu pico
de etileno juntamente com o da respiração durante o amadurecimento, diferentemente da
laranja que é um fruto não-climatérico e por isso não apresenta picos de respiração e de
produção de etileno. As características observadas nas plantas são sintomas provocados
pelo etileno como senescência, no caso da queima das folhas e epinastia, fenômeno que
causa a curvatura e crescimento anormal do pecíolo da folha, pela conversão do ACC em
etileno.

PRÁTICA EXTRA: Pressão positiva do xilema

Observamos o que ocorreu com as plantas de feijão e de milho expostas nas

campânulas de vidro.

QUESTÃO:

 Por que houve sudação ou gutação em plantas que estavam em campânulas

de vidro? Qual fenômeno físico induz esse processo?

As plantas expostas nas campânulas apresentaram o fênomeno de gutação por

estarem submetidas a baixa radiação, alta umidade e redução da transpiração, fatores que
desencadeiam esse fenômeno, o qual se dá através da pressão da raiz. Quando a
transpiração ocorre lentamente, as células da raiz continuam enviando solutos para dentro
do xilema, fazendo com que seu potencial hídrico se torne mais negativo, isso faz com
que a água penetre nesse tecido por osmose, desenvolvendo a pressão positiva da raiz.
Como a quantidade de água que entra pelo xilema para a folha é maior do que a que sai
pela transpiração, que estar ocorrendo lentamente, esse excedente acaba sendo eliminado
pela folha na forma líquida, através da gutação.