AGRUPAMENTO DE ESCOLAS CANEÇAS

Ficha Informativa de Biologia Geologia – 10º ANO

Aluno: _____________________________________ Nº: ___ Turma: ___ Data: ___ / ___ / _____

O MICROSCÓPIO ÓTICO COMPOSTO (MOC)

A utilização do microscópio ótico implica vários conhecimentos e procedimentos com que os
alunos devem estar familiarizados.

Constituição de um microscópio ótico composto (MOC)

O MOC é constituído por duas partes: uma parte mecânica e uma parte ótica. Cada parte
engloba uma série de componentes com diferentes funções (Fig. 1). No seu conjunto, a parte
ótica permite a obtenção da imagem e a mecânica serve para dar estabilidade e suporte à parte
ótica.

Fig. 1 Constituição de um microscópio ótico composto (MOC). Os elementos da parte mecânica estão
representados a laranja e os da parte ótica estão a verde.

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Funcionamento do MOC e características da imagem obtida
O MOC permite observar material biológico ampliado e em pormenor, usando um feixe de luz que
atravessa o objeto. A imagem é então ampliada pela objetiva, seguidamente é transmitida a um
espelho (no canhão) e, finalmente, sofre nova ampliação pela ocular. Esse percurso dos raios
luminosos justifica as características da imagem que o observador vê. Relativamente ao objeto real,
a imagem obtida ao MOC é ampliada, invertida e simétrica.
O poder de ampliação e a resolução permitem tornar visível ao olho do ser humano objetos que
sem o MOC são invisíveis. A ampliação a que se observa o objeto é calculada multiplicando a
ampliação da ocular pela ampliação da objetiva. A resolução é a menor distância a que devem estar
dois pontos para que possam ser observados como distintos. O MOC tem um limite de resolução
de 0,3-0,2 μm. O poder de resolução depende da abertura numérica da objetiva, do comprimento
de onda da luz utilizada e da refração que o meio oferece.
O que se observa focado ao MOC é função da profundidade de campo, que se define como a
variação da posição de foco da objetiva que não provoca alterações na acuidade visual e nitidez da
imagem de um ponto no centro do campo. A profundidade de campo, bem como o campo de visão,
são inversamente proporcionais à ampliação. Em termos práticos, aumentar a ampliação implica
reduzir o campo de visão e ter maior dificuldade em focar o objeto.

PREPARAÇÃO DO MATERIAL PARA OBSERVAÇÃO AO MOC

Preparações temporárias ou definitivas

Para observação ao microscópio, o material biológico deverá ser preparado numa camada muito
fina entre lâmina e lamela, para poder ser examinado, pois a luz tem de atravessar o conjunto – a
preparação biológica. As preparações são normalmente constituídas por quatro elementos, a saber:
a lâmina, o meio de montagem, o objeto biológico em estudo e a lamela.
As preparações biológicas podem ser temporárias ou definitivas, se apresentam, respetivamente,
curta ou longa duração. As preparações temporárias permitem observar o material vivo, inclusive
no seu meio normal de vida: água salgada, água doce ou fluidos corporais. Esses meios, nos quais
se encontram as células a observar, constituem o meio de montagem. O soro fisiológico e a solução
de Ringer são soluções isotónicas que permitem manter, em equilíbrio hídrico, respetivamente,
células animais e células vegetais vivas.
As preparações temporárias têm uma duração limitada, uma vez que o meio de montagem evapora
e as células também se degradam e autodestroem por autólise.
Nas preparações definitivas, como as que se podem adquirir a empresas especializadas, o material
é submetido a técnicas morosas que requerem equipamento especializado. Apesar de não
permitirem observar material biológico vivo, têm a vantagem de a preparação ter uma grande
durabilidade. Nas aulas de microscopia só se irão efetuar preparações temporárias, mas o estudo
destas pode e deve ser complementado com a utilização de preparações definitivas, porque a
qualidade das mesmas, nomeadamente os cortes histológicos, permite visualizar estruturas que de
outra forma não seriam observáveis. Estas preparações apresentam ainda uma mais-valia em
termos didáticos, pois, devido a técnicas de coloração diversas, põem em evidência determinadas
estruturas celulares, extracelulares e ultracelulares.

Técnicas de coloração
As células apresentam estruturas muito transparentes que não contrastam suficientemente de modo
a tornarem-se distintas umas das outras. As exceções são os cloroplastos e os vacúolos, que têm
pigmentos hidrossolúveis das células vegetais, e os cromatóforos, que são células animais
especializadas. A função dos corantes é dar maior contraste/evidência a estruturas celulares que,
pela sua transparência e fraco contraste ótico, se tornariam difíceis de observar.

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Existem corantes vitais e corantes não vitais; os primeiros mantêm o material biológico vivo e os
segundos não. No entanto, o mesmo corante pode ser vital ou não, dependendo da concentração
em que se usa. Os corantes vitais são geralmente usados em concentrações muito baixas.
Não existe uma técnica de coloração que ponha em evidência todas as estruturas celulares. A
coloração das células deve-se sobretudo à combinação dos corantes com as proteínas,
dependendo da sua carga elétrica. Por esta razão, o facto de os corantes poderem corar
especificamente um organelo e não outro – corantes seletivos – está relacionado com a diferença
de cargas elétricas existente entre as proteínas dos diferentes organelos celulares e os corantes
que a elas se podem ligar quimicamente. Assim, quando colocamos corante azul (ex. azul de
metileno) numa preparação, podemos verificar de início que toda a preparação fica azul, mas, se
lavarmos a preparação, o corante que não se encontra ligado a nenhuma estrutura é arrastado.
Nas preparações definitivas é frequentemente utilizado mais do que um corante. Em preparações
de cortes histológicos de tecidos animais, a técnica de coloração mais utilizada é da
hematoxilinaeosina. A hematoxilina (hemateína) cora substâncias ácidas presentes no núcleo
(ácidos nucleicos) e a eosina cora os compostos básicos do tecido, como o citoplasma. Em cortes
histológicos de órgãos vegetais apenas as paredes são visíveis e geralmente apresentam-se
coradas de forma diferenciada, de acordo com a presença ou não de lenhina.
A tabela 1 indica alguns corantes de uso comum e a sua aplicabilidade.
Tabela 1
Corante Aplicabilidade

Em espécimes animais e vegetais. Cora o núcleo e alguns

organelos como os lisossomas e os vacúolos.
Vermelho neutro Pode ser utilizado para evidenciar tecidos e seres
planctónicos. É um corante vital.

Em espécimes animais e vegetais.

Azul de metileno Cora rapidamente o núcleo.
É um corante vital.

Em espécimes animais.
Carmim acético Cora o núcleo.

Em espécimes animais e vegetais.

Safranina Cora o núcleo.
Em tecidos vegetais cora as paredes lenhificadas

Deteta a presença de açúcares redutores (monossacarídeos,

Solução de Fehling A + B como a glucose, e dissacarídeos, como a maltose e a
lactose) e aldeídos.
Em espécimes vegetais.
Soluto de lugol Cora estruturas com amilose.

A aplicação do corante pode ser feita de diferentes formas.

Coloração por imersão

Nesta técnica de coloração, o material biológico fica imerso
durante algum tempo no corante selecionado
(Fig. 2).

Fig. 2 Técnica de coloração por imersão.

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Coloração por irrigação
Na técnica de coloração por irrigação substitui-se o meio de montagem de uma preparação pelo
corante. Para tal, coloca-se o corante num dos lados da preparação e, no outro lado, absorve-se o
meio original com papel absorvente (Fig. 3).

Fig. 3 Técnica de coloração por irrigação.

Montagem de uma preparação

Etapas a seguir para a montagem de uma preparação:
1. Na parte central da lâmina bem limpa, coloca-se uma gota do meio de montagem que se vai
utilizar.
2. Sobre o meio de montagem, coloca-se o material a observar e cobre-se com a lamela.
Nota: Para evitar a formação de bolhas de ar na preparação, deve-se colocar a lamela fazendo um
ângulo de 45° com a lâmina e, com a ajuda de uma agulha de disseção, deixá-la cair lentamente
sobre a lâmina (Fig. 4).

Fig. 4 Montagem de uma preparação.

Por vezes, no estudo de microrganismos e de tecidos animais ou vegetais, temos necessidade de
observar o material in vivo (ao vivo), no seu estado natural, sem uso de fixadores nem corantes,
que de algum modo sempre criam artificialidades no material da observação.
Existem técnicas especiais que são vantajosas em determinadas situações.

Técnica de esfregaço
Esta técnica utiliza-se quando as células a observar estão em meio líquido, como é o caso das
células sanguíneas ou das bactérias do iogurte. A técnica do esfregaço consiste em espalhar o
material biológico ao longo de uma lâmina de vidro, com o auxílio de outra lâmina de vidro, sob a
forma de uma camada delgada e homogénea (Fig. 5-A). Também poderá ser efetuada com o auxílio
de uma ansa de inoculação (Fig. 5-B).

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 A

Fig. 5 A – Técnica do esfregaço com lâmina de vidro.

B – Técnica do esfregaço com uma ansa.

Técnica de esmagamento
Este método é usado nos casos em que existe uma aderência fraca entre as células do tecido a
observar. Para visualizar as células, basta colocar um pequeno fragmento do tecido entre a lâmina
e a lamela e fazer uma pequena pressão com o polegar. Provoca-se assim um esmagamento do
tecido, o que faz que as células se espalhem, formando uma fina camada, que é facilmente
atravessada pela luz.

Fig. 6 Técnica do esmagamento.

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UTILIZAÇÃO DO MOC
Nas aulas de microscopia deve estar disponível um microscópio ótico por aluno ou no máximo para
ser partilhado por dois alunos. Deve-se frisar, aos alunos, que partilhar um microscópio não é utilizá-
lo simultaneamente por dois alunos, apesar de possuir dois parafusos macrométricos e dois
parafusos micrométricos.
Na utilização do MOC devem ser seguidas algumas regras básicas:
1. Se o MOC possuir uma ocular, deve-se olhar por ela com o olho esquerdo (se se for destro),
mantendo os dois olhos abertos. Se o MOC tiver duas oculares, deve-se olhar por ambas.
2. A mão dominante deve ficar livre para desenhar as observações; assim, os parafusos de
comando devem ser manuseados com a outra mão.
3. Os mecanismos de deslocação não devem ser forçados. Os parafusos macrométricos e
micrométricos são muito sensíveis e a sua substituição tem um custo elevado.
4. No final da sua utilização deve-se: desligar a fonte de luz; rodar o revólver de modo a colocar
no eixo ótico a objetiva de menor ampliação; baixar a platina com o parafuso macrométrico e
retirar a preparação; deixar a platina e as lentes (ocular e objetivas) limpas.

Iluminação da preparação
As imagens do MOC são obtidas por transparência e, muitas vezes, não é com mais luz que se
conseguem as melhores imagens. Como numa fotografia, a luz é o mais importante, mas na «dose»
e na incidência certas. A iluminação é regulada de acordo com o material a observar, pois algumas
preparações exigem mais luz do que outras.
Na iluminação de uma preparação devem ser observadas as seguintes etapas:
1. Ligar a fonte de luz. Alguns microscópios têm um reóstato que permite regular a intensidade
da fonte de luz.
2. Regular o condensador, rodando-o, até que o campo do microscópio se apresente claro e
uniforme. As mudanças de objetiva devem ser acompanhadas de um ajuste do condensador.
3. Regular a abertura do diafragma, de forma a obter a iluminação ideal. Para objetos com
grande transparência, o fecho do diafragma pode fornecer uma luz oblíqua que evidencia o
que se pretende observar.

Técnica de focagem da imagem

Focagem com a objetiva de menor ampliação

1. Descer completamente a platina e verificar se a objetiva de menor ampliação está
devidamente colocada no eixo ótico. Se não estiver, roda-se o revólver até se sentir um
pequeno estalido, que é indicador da posição de encaixe.
2. Fixar a lâmina preparada para observação na platina, usando as pinças.
3. Deslocar a platina horizontalmente de modo que o material a observar fique alinhado com a
objetiva.
4. Sem olhar pela ocular, mas sim lateralmente e para a preparação, subir completamente a
platina, movendo o parafuso macrométrico.
5. Observar pela ocular e mover lentamente o parafuso macrométrico até que o material fique
visível.
6. Aperfeiçoar a focagem com o parafuso micrométrico. Corrigir a iluminação, se necessário.

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Focagem com as objetivas de maior ampliação
1. Para aumento de ampliação, trocar a objetiva. Para o efeito, depois de focar com a objetiva
de menor ampliação, iluminar o melhor possível o material e situar no centro do campo do
microscópio o pormenor que se quer observar mais ampliado.
2. Rodar o revólver, de modo a colocar a objetiva que tem a ampliação imediatamente superior.
3. Focar, utilizando exclusivamente o parafuso micrométrico, movendo-o muito lentamente, pois
qualquer movimento brusco pode partir a preparação ou danificar a objetiva (alguns
microscópios têm mecanismos de travão que evitam danos).
4. Ajustar de novo a iluminação.
5. Se não se conseguir focar, repetir todas as operações pela ordem indicada.

REGISTO DAS OBSERVAÇÕES

Fotografias de imagens ao MOC

«Uma imagem vale mais de que mil palavras.» Na microscopia isso também é verdade, mas existem
algumas limitações. A imagem ao MOC foca apenas um plano, pelo que uma fotografia capta
apenas esse plano. No entanto, quando se faz uma observação ao microscópio pode ficar-se com
uma ideia da estrutura 3D movimentando o parafuso micrométrico, o que permite focar vários
planos.
As fotografias de preparações microscópicas podem ser realizadas com câmaras digitais acopladas
à ocular ou simplesmente com um telemóvel (já existem no mercado objetos para acoplar os
telemóveis à ocular).

Execução de desenhos de observação microscópica

Para quê fazer desenhos, se é mais moroso e difícil do que tirar fotografias?
A prática do desenho tem uma importância fundamental na interpretação e na descoberta dos
pormenores, pois desenvolve as faculdades de observação e ajuda a memória a reter os aspetos
morfológicos. Pode também ser «uma dor de cabeça» para alguns alunos, porque consideram que
não tem jeito para o desenho, ou mesmo para o professor, porque alguns alunos podem ser
tentados a fazer desenhos artísticos que não representem o real observável. É necessário explicar
muito bem quais são as regras que os alunos devem seguir neste trabalho.
Antes de desenhar, o aluno deve ter bem presente o objetivo em vista. O desenho, antes de mais
nada, é uma escolha e um resumo. Com uma objetiva de baixa ampliação, o aluno deve explorar a
preparação em toda a sua extensão e selecionar o seu objetivo. Deve colocar a parte selecionada
no centro do campo de visão, recorrer à ampliação adequada e fazer então o seu registo.
Para realizar cada desenho deve-se usar lápis preto macio, papel branco e borracha. O desenho
deve ocupar sensivelmente meia folha A4.
É desnecessário fazer um círculo em volta do desenho para mostrar que foi visto ao microscópio.
O desenho esquemático tem de estar centrado no que se pretende ver, pelo que não faz nenhum
sentido representar, por exemplo, uma bolha de ar ou um resíduo de corante, simplesmente porque
está lá. O aluno deve representar apenas o que vê, confiar na sua capacidade de observação e não
copiar representações esquemáticas realizadas por colegas ou existentes em livros, pois o que está
a ver pode até ter muito mais interesse.

O aluno deve começar com traços muito suaves e apagar o mínimo de vezes possível (não faz mal
que fiquem alguns traços ténues no fundo). É indispensável que compare muitas vezes o seu
desenho com o que vê. Deve mexer o parafuso micrométrico para focar diferentes planos e integrar
no esquema a informação que recolheu. Por fim, é importante que realce os pormenores
pretendidos.

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Como legendar fotografias ou esquemas
Na legendagem devem ser seguidas as seguintes regras:
x dar um título à representação e indicar a ampliação total com que foi obtida; x
fazer a legenda fora do esquema e em letra legível; x usar um lápis e uma régua
para desenhar as linhas da legenda; x colocar, preferencialmente, as linhas da
legenda na horizontal.
Fontes:
https://wikiciencias.casadasciencias.org/wiki/index.php/Microsc%C3%B3pio_%C3%93ptico;
https://www.fciencias.com/2014/06/26/tecnicas-de-coloracao/
https://blogs.zeiss.com/microscopy/en/education-in-biology/
https://mmegias.webs.uvigo.es/02-english/6-tecnicas/5-general.php (consultados em
09/04/2021)