UNIVERSIDADE ESTADUAL DE LONDRINA-UEL

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA e BIOTECNOLOGIA-BBTec

Centro de Ciências Exatas-CCE Curso de Química Integral

PRÁTICAS DE BIOQUÍMICA
Prof. Doumit Camilios Neto

Londrina
2022
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AULA 1: INSTRUÇÕES GERAIS PARA O LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA

O trabalho que se realiza em um curso prático requer muita atenção e cuidado, além de
interesse e dedicação. Para o bom desempenho das aulas práticas, algumas instruções são
dadas e devem ser rigorosamente seguidas.
• Compareça pontualmente às aulas nos dias designados para sua turma.
• Vista sempre o jaleco (avental) antes de entrar no laboratório.
• Não é permitido o uso de telefones celulares no laboratório.
• Não é permitido fumar, beber ou comer no laboratório.
• Leia com atenção os roteiros de aula antes do início das práticas. Deve-se registrar em
caderno apropriado tudo o que se observou durante as mesmas.
• Evite o desperdício de reagentes, material, gás, luz e outros. Trabalhe apenas com as
quantidades indicadas no roteiro. Realize somente os experimentos indicados na aula.
• Evite contaminar reagentes: leia o rótulo do frasco antes de utilizá-lo, não troque as
tampas dos reagentes, use uma pipeta limpa para cada reagente, nunca devolva a
solução para o frasco estoque. Não troque os reagentes de uma mesa para outra.
• Para preparo de uma solução ou para fazer diluições utilize sempre água destilada.
• Ao aquecer um tubo de ensaio sempre com o auxílio de uma pinça e proceda de modo
adequado para que o conteúdo não seja lançado fora causando acidentes. Terminado o
uso do bico de Bunsen, verifique se as torneiras de gás estão bem fechadas, evitando
assim explosões e intoxicações. Nunca abra ou deixe frascos de líquidos inflamáveis
(éter, álcool, acetona, benzeno etc) nas proximidades da chama.
• Tome o máximo de cuidado com ácidos e bases concentradas. Nunca adicionar água
ao ácido e sim, o contrário, ácido sobre água, cuidadosamente.
• Reações com liberação de gases tóxicos, evaporação de soluções ácidas, amoníacos
etc, devem ser realizadas na capela. Para verificar o odor das substâncias, nunca leve o
rosto diretamente sobre o frasco.
• Ácidos e bases concentrados atacam a pele e os tecidos. Use-os com muito cuidado,
principalmente em reações de neutralização, evitando reações violentas. Quando
houver acidentes, quebra ou dano de materiais, avise ao professor e ao técnico
responsável.
• A bancada deve permanecer organizada durante toda a aula, reduzindo as chances de
erros e acidentes.
• Ao final da aula, a equipe deve lavar as vidrarias e deixar a bancada devidamente
organizada.
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Introdução ao Estudo da Bi oquímica

Os grandes avanços da ciência, especialmente na área biológica, sempre

ocorreram após descoberta de novas tecnologias e do desenvolvimento de novos instrumentos
e metodologias de investigação. Assim, à medida que os avanços tecnológicos ocorrem, o
conhecimento científico vai sendo acumulado. Uma notável revolução nas técnicas de Biologia
Molecular, em que se incluem a Biologia Celular e a Genética, possibilitaram um extraordinário
progresso na compreensão das funções de moléculas e macromoléculas em processos vitais
até então pouco explicados. Os saltos recentes de conhecimento na área de Biologia
Molecular, ocorridos nas últimas décadas, transformaram-na em uma das mais fascinantes
áreas de pesquisa, impulsionando a expansão da biotecnologia e proporcionando contribuições
significativas ao estudo do material genético microbiano, vegetal e animal e em especial,
humano, e conseqüentemente à solução de problemas na medicina, agronomia e veterinária
(JORDÃO et al. 1998).
A bioquímica é uma ciência dinâmica em rápido crescimento, e durante muito
tempo influenciada pela química e essencialmente concentrada na investigação da
transformação da matéria e reutilização de energia. Em primeiro plano ficava a compreensão
da estrutura e da relação de moléculas biologicamente relevantes e seus processos
metabólicos. Novas bases foram progressivamente acrescentadas, herdadas de suas
segundas mães, as biociências: a relação entre estrutura química e função biológica, a
atividade de rotas metabólicas na transferência de informação, a atenção da distribuição
especial e temporal diferente das biomoléculas nas células e nos organismos e o fato de os
processos bioquímicos estarem também sujeitos a uma evolução. O limite exato entre a
bioquímica e as disciplinas afins (como biologia celular, anatomia, fisiologia genética ou
farmacologia) é de difícil precisão e, em muitos casos, arbitrário. Essa sobreposição de
disciplinas não é naturalmente um acaso. O objeto de observação é freqüentemente o mesmo,
uma célula uma mitocôndria ou um produto do metabolismo celular; o que muda é o ponto de
vista do especialista (KOOLMAN; RÖHM, 2005).
Organismos vivos freqüentemente são designados como “máquinas químicas”,
porque são constituídos de compostos químicos e sobrevivem por meio de reações químicas.
Assim o conhecimento da química é essencial para a compreensão da vida. Esta ciência
estuda a composição, a estrutura e as propriedades das substâncias e suas transformações. A
bioquímica trata especificamente da química relacionada à estrutura e função dos seres vivos.
Sendo assim a introdução ao estudo desta ciência está baseado na descrição da estrutura e
função celular (PELCZAR Jr. et al. 1997)
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AULA 2: Visão Geral de Células: Animal, Vegetal e Bacteri ana

Ao estudar os seres vivos, ao nível celular, deve-se empregar várias técnicas visando
superar três principais limitações destes estudos: as pequenas dimensões celulares, a grande
espessura da maioria dos tecidos e a transparência (falta de contraste) das células e suas
estruturas. Em conseqüência o estudo da organização celular depende do uso de
microscópios, aparelhos destinados à observação de detalhes difíceis de serem observados a
olho nu e do emprego de técnicas básicas de preparação do material a ser analisado. O nome
microscopia fotônica é dado ao tipo de microscopia em que a luz comum atravessa o objeto e
um sistema óptico (conjunto de lentes) compatível, formando a imagem que atinge olho. A
microscopia eletrônica utiliza no lugar da luz visível, um feixe de elétrons que passa através do
objeto a ser estudado. Também existe a microscopia que usa um feixe de raios laser, chamada
de microscopia confocal (JORDÃO et al. 1998).
De acordo com as mesmas autoras, os microscópios de luz podem ser de
vários tipos: de luz comum, também chamado de campo claro, de polarização, de contraste de
fase, de fluorescência, invertido ou de campo escuro. Os microscópios eletrônicos podem ser:
de transmissão, de varredura ou de alta voltagem.

1- Ocular
2- Objetivas e revólver
3- Platina
4- Chariiot
5- Macrométrico
6- Micrométrico
7- Diafragma no condensador
8- Condensador
9- Botão do condensador
10- Parafusos centralizadores de condensador
11- Fonte de luz
12- Controle da iluminação
13- Diafragma de campo
14- Parafusos de ajuste da lâmpada
15- Focalizadora da lâmpada

Embora as células procariontes se diferenciem das eucariontes por várias

características estruturais e funcionais, apenas a principal diferença entre elas pode ser
detectada através da microscopia fotônica. Já entre as células eucariontes, encontram-se
muitas características morfológicas diferenciais detectáveis, principalmente entra as células
animais e vegetais. No entanto, para que sejam identificadas ao identificadas ao microscópio
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fotônico, as estruturas de qualquer tipo celular devem ter cor própria ou devem ser coradas
com substâncias corantes que lhes conferem diferentes graus de absorção de luz acentuando
os contrastes.

1 Objetivo:
-Detectar, ao microscópio fotônico, características diferenciais entre tipos celulares.

2 Materiais:
2.1 Célula animal: células descamadas da mucosa oral
- preparação a fresco, sem coloração
- preparação a fresco, corada com azul de metileno
2.2 Célula vegetal:
- preparação a fresco de folhas de Elodea sp.
- preparação a fresco de epiderme inferior de folha de Tradescantia sp.
2.3 Célula bacteriana:
- preparação semi-permanente de bactérias, corada pelo método de Gram.
2.4 Célula Fúngica: células leveduriformes
- preparação a fresco de suspensão de Saccharomyces cerevisiae.
2.5 Célula Fúngica: hifas-fungos filamentosos
- preparação a fresco de hifas de fungo filamentoso gênero Aspergillus.
OBS: Desenhar de forma esquemática as estruturas observadas.

Referências Bibliográficas
JORDÃO, B.Q.; ANDRADADE, C.G.T.J., RUAS, C.F., CÓLUS, I.M.S., BUIM, M.E.; Práticas de
Biologia Celular. Londrina, EDUEL, 1998, 163p.
KOOLMAN, J.; RÖHM, K.H.; Bioquímica Texto e Atlas. 3.ed., Porto Alegre, Editora Artmed,
2005, 478p.
PELCZAR Jr. M.J.; CHAN, E.C.S.; KERIEG, N.R., Microbiologia Conceitos e Aplicações. 2.
ed, São Paulo, Editora Makron Books do Brasil LTDA, v.1, 1996, 524p.
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AULA 3: DETERMINAÇÃO DE pH PELO MÉTODO COLORIMÉTRICO E EFEITO TAMPÃO

1. FUNDAMENTO TEÓRICO
O método colorimétrico de determinação de pH baseia-se nos conhecimentos dos pKs
dos indicadores, os quais podem ser considerados como ácidos ou bases fracas. A dissociação
de um indicador ácido, de forma simplificada, é a seguinte:
HIn  In− + H+
Ácido Base
(cor A) (cor B)

A adição de ácido à solução de indicador aumenta a concentração de H+ e há predomínio

da cor ácida (A). A adição de base diminui a concentração de H+ e ocorre o predomínio da cor
básica (B). A cor do indicador é, portanto, uma função do pH da solução. Este pH é dado pela
equação:
pH = pKIn + log [In−]
[HIn]

O indicador exibe a sua cor quando a razão [In−]/[HIn] = 1. Portanto, pH = pKIn.

Para determinar o pH de uma solução pelo método colorimétrico, adiciona-se algumas
gotas do indicador universal na solução e compara-se a cor desenvolvida com a cor de uma
série de tampões de pH conhecidos contendo indicador universal.

2. TÉCNICA

2.1. Preparo de escala de padrão de pH

 Preparar uma bateria de 8 tubos de ensaio,
 Adicionar a cada tubo 1,0 mL da solução tampão de pH 3,0 até 10,0,
 Adicionar a todos os tubos 9,0 mL de água destilada e 5 gotas do indicador universal e
misturar bem. Anotar as cores.
Esta escala padrão de pH será utilizada no experimento seguinte.

pH Cor pH Cor
3 ou - 8
4 9
5 10
6 11 ou +
7
 7

2.2. Observação do efeito tempão

Experimento 1
REGENTES TUBO 1 TUBO 2
Água destilada 10 mL 5 mL
Indicador 5 gotas 5 gotas
Tampão pH 7,0 - 5 mL
Anotar o pH
+ NaOH 1 gota 1 gota
Anotar o pH
+ sopro
Anotar o pH

Após a adição dos 3 primeiros reagentes, misturar e anotar o pH utilizando a escala

padrão de pH.
 Após a adição de uma gota de NaOH nos tubos 1 e 2, misturar bem e anotar o pH.
 Com auxílio de uma pipeta soprar o ar expirado através da solução de tubo 1 por cerca
de 45 segundos, repetir o mesmo procedimento para o tubo 2 e anotar o pH.

Experimento 2
REGENTES TUBO 1 TUBO 2
Indicador 5 gotas 5 gotas
Água destilada 10 mL 5 mL
Tampão pH 7,0 - 5 mL
Anotar o pH
+ HCl 2 gotas 2 gotas
Anotar o pH
Nº gotas de HCl

 Adicionar 2 gotas de HCl em ambos os tubos, misturar bem e anotar o pH.

 Ao tubo 2 adicionar HCl gota a gota e anotar o número de gotas necessárias para que
a solução atinja o mesmo pH (coloração) do tubo 1.
Interpretar os resultados.
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AULA 4- TITULAÇÃO POTENCIOMÉTRICA DE AMINOÁCIDOS

1. FUNDAMENTO TEÓRICO
Os aminoácidos têm pelo menos dois grupos ionizáveis que podem existir na forma
protonada (-COOH, NH3+) ou desprotonada (-COO-, - NH2), dependendo do pH do meio em
que ele se encontra.
A curva de titulação do aminoácido é feita com NaOH e inicia-se em pH abaixo do pK do
grupo carboxila e o aminoácido está com carga líquida positiva (forma a). À medida que se
adiciona base, o valor do pH sobe gradativamente, aumentando a dissociação do grupo
carboxila, resultando na forma neutra (b). Continuando a adição de base, o valor de pH
aumenta até que se inicia a dissociação do grupo amino e o aminoácido fica com a carga
líquida negativa (forma c).
O pH onde predomina a forma eletricamente neutra do aminoácido é chamado de ponto
isoelétrico (pI) do aminoácido e pode ser determinado através da média aritmética dos dois
pKs.

2. TÉCNICA

2.1. Titulação de um aminoácido neutro (Glicina em HCl)

• Pipetar 10,0 mL da solução de glicina 0,1N em um becker e adicionar, com cuidado,
uma barra magnética.
• Calibrar o potenciômetro com solução tampão pH 4,0 e 7,0.
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• Colocar o becker com a solução de glicina sobre o suporte com agitador magnético e
mergulhar com cuidado os eletrodos, de forma a não encostá-los na barra magnética
e adicionar água destilada até cobrir totalmente o eletrodo.
• Titular com NaOH 0,1N e anotar os valores de pH para cada mL de NaOH
adicionado.

Tabela:
NaOH 0,1N pH NaOH 0,1N pH
(mL) (mL)
0 11
1 12
2 13
3 14
4 15
5 16
6 17
7 18
8 19
9 20
10

2.2. Titulação de um aminoácido ácido (Ác. aspártico ou Glutâmico em HCl)

• Pipetar 10,0 mL da solução de ácido aspártico ou glutâmico 0,1N em um becker e
adicionar, com cuidado, uma barra magnética.
• Calibrar o potenciômetro com solução tampão pH 4,0 e 7,0.
• Colocar o becker com a solução de do aminoácido sobre o suporte com agitador
magnético e mergulhar com cuidado os eletrodos, de forma a não encostá-los na
barra magnética e adicionar água destilada até cobrir totalmente o eletrodo.
• Titular com NaOH 0,1N e anotar os valores de pH para cada mL de NaOH
adicionado.
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Tabela:
NaOH 0,1N pH NaOH 0,1N pH NaOH 0,1N pH
(mL) (mL) (mL)
0 11 21
1 12 22
2 13 23
3 14 24
4 15 25
5 16 26
6 17 27
7 18 28
8 19 29
9 20 30
10

2.3. Titulação de um aminoácido básico (Lisina ou Arginina em HCl)

• Pipetar 10,0 mL da solução de lisina ou arginina 0,1N em um becker e adicionar, com
cuidado, uma barra magnética.
• Calibrar o potenciômetro com solução tampão pH 4,0 e 7,0.
• Colocar o becker com a solução de do aminoácido sobre o suporte com agitador
magnético e mergulhar com cuidado os eletrodos, de forma a não encostá-los na
barra magnética e adicionar água destilada até cobrir totalmente o eletrodo.
• Titular com NaOH 0,1N e anotar os valores de pH para cada mL de NaOH
adicionado.
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Tabela:
NaOH 0,1N pH NaOH 0,1N pH NaOH 0,1N pH
(mL) (mL) (mL)
0 11 21
1 12 22
2 13 23
3 14 24
4 15 25
5 16 26
6 17 27
7 18 28
8 19 29
9 20 30
10

3. RESULTADOS

A partir dos resultados obtidos, pede-se:

• A curva de titulação, colocando na abscissa o volume de NaOH e na ordenada os
valores de pH obtidos.
• Determinar graficamente os valores de pK e comparar com os valores de literatura
• Calcular o valor do ponto isoelétrico
• Escrever as possíveis formas de ionização de cada aminoácido.
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AULA-5: REAÇÕES QUALITATIVAS PARA IDENTIFICAÇÃO DE AMINOÁCIDOS E

PROTEÍNAS

1. REAÇÃO DE BIURETO

As substâncias que contém 2 ou mais ligações peptídicas dão reação de biureto positiva
(tripeptídeos, oligopeptídeos e proteínas). O íon cobre fornecido por uma solução diluída e
alcalina de CuSO4 se complexa com os grupos aminos das ligações peptídicas desenvolvendo
uma coloração violeta, que pode ser representado como segue:

1.1 Técnica
Preparar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo:
REAGENTES TUBO 1 TUBO 2 BRANCO
Solução de proteína 10 gotas - -
Solução de glicina - 10 gotas -
Água destilada - - 10 gotas
NaOH 2,5N 5 gotas 5 gotas 5 gotas
CuSO4 1% 5 gotas 5 gotas 5 gotas
Resultado
Anotar os resultados e concluir.

2 REAÇÃO DE NINHIDRINA

A ninhidrina oxida os grupamentos aminos livres de aminoácidos, peptídeos e proteínas

dando origem a um composto de coloração chamado púrpura de Ruhermann (violeta).
2.1 Técnica
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Preparar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo:

REAGENTES TUBO 1 BRANCO
Proteína 5 gotas -
H2O 5 gotas
Ninhidrina 10 gotas 10 gotas
Ferver todos os tubos
Resultado
Anotar os resultados e concluir.

3. REAÇÃO XANTOPROTÉICA

A presença de radicais aromáticos nas proteínas, peptídeos e aminoácidos reagem com

HNO3 formando nitro-derivados fortemente coloridos (alaranjados) em meio alcalino. Os
aminoácidos responsáveis pelo teste positivo são tirosina e triptofano. O anel simples da
fenilalanina não tem capacidade de positivar o teste.

3.1 Técnica
Preparar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo:
REAGENTES TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 BRANCO
-
Proteína 10 gotas - - -
-
Tyr - 10 gotas - -
Trp - - 10 gotas - -
-
Phe - - 10 gotas -
H2O - - - - 10 gotas
HNO3 conc. 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL
Ferver os tubos por 1 minuto.
NaOH 20% 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL
Resultado
Anotar os resultados e concluir.

4. REAÇÃO DE MILLON

O grupo hidroxifenil da tirosina, presente nas proteínas e peptídeos, é o responsável pela

reação de Millon positiva. As proteínas são precipitadas por ação do HNO3 e mercúrio. Com
aquecimento, desenvolverão uma coloração avermelhada no precipitado. Com a solução de
tirosina, sob as mesmas condições, ocorre apenas a formação da coloração avermelhada.
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4.1 Técnica
Preparar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo:
REAGENTES TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 BRANCO
Solução de proteína 10 gotas - - -
Solução de tirosina - 10 gotas - -
Solução de triptofano - - 10 gotas
Água destilada - - - 10 gotas
Reagente de Millon (HNO3 e Hg) 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas
Ferver os tubos durante 1 a 2 minutos.
Resultado
Anotar os resultados e concluir.

5. REAÇÃO DE HOPKINS-COLE

O anel indólico do triptofano, presente nas proteínas e peptídeos, reage com o ácido
glioxílico formando um anel violeta na interfase da solução.

5.1 Técnica
Preparar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo:
REAGENTES TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 BRANCO
Solução de proteína 10 gotas - - -
Solução de triptofano - 10 gotas - -
Solução de tirosina - - 10 gotas
Água destilada - - - 10 gotas
Hopkins-Cole 10 gotas 10 gotas 10 gotas 10 gotas
Misturar. Inclinar o tubo e deixar escorrer lentamente pela parede 1 mL
de H2SO4 concentrado. Agitar levemente.
Resultado
Anotar o resultado e concluir.

6. REAÇÃO PARA AMINOÁCIDOS SULFURADOS

O enxofre presente nas proteínas, na forma de grupos sulfidrilas (cisteína) e dissulfetos

(cistina), pode ser identificado pela reação com acetato de chumbo em meio alcalino, formando
o sulfeto de chumbo (PbS), com coloração castanho a preto, com ou sem precipitado.
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6.1 Técnica
Preparar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo:
REAGENTES TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 BRANCO
Solução de proteína 10 gotas - - -
Solução de cisteína - 10 gotas - -
Fio de cabelo - - 1 -
Água destilada - - 10 gotas 10 gotas
NaOH 2,5N 20 gotas 20 gotas 20 gotas 20 gotas
Aquecer os tubos até fervura.
Acetato de Chumbo 5 gotas 5 gotas 5 gotas 5 gotas
Ferver novamente os tubos.
Resultado
Anotar os resultados e concluir.
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AULA-6: REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS

A exposição das moléculas de proteínas a agentes como calor, extremos de pH, metais
pesados, alcalóides, detergentes, solução concentrada de uréia, solventes orgânicos, radiação
ultravioleta etc, faz com que a maioria delas apresente modificações físicas conhecidas como
desnaturação.
A desnaturação envolve alterações nas estruturas quaternária, terciária e secundaria da
proteína. Durante o processo de desnaturação, a proteína é desorganizada e expõe grupos
hidrofóbicos que repelem a água. Portanto, a proteína desnaturada torna-se menos solúvel e
precipita.

1. Precipitação Irreversível (Precipitação das proteínas com desnaturação)

Desnaturação pelo calor

Técnica
Em um tubo de ensaio colocar 2,0 mL da solução de proteína e aquecer diretamente na
chama.
Observar a formação de um coágulo branco de proteína desnaturada.

Desnaturação por ácidos

O ânion tricloroacetato (CCl3 – COO-) do ácido tricloroacético (TCA) e o NO3- do ácido
nítrico podem precipitar as proteínas com cargas positivas formando sais insolúveis.
Técnica
Preparar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo:
REAGENTES TUBO 1
Solução de proteína 1 mL
TCA Gotas até precipitação, pela
parede do tubo, sem agitação.
Resultado
Anotar os resultados e concluir.

Desnaturação por sais de metais pesados

Os cátions de sais de metais pesados, como Hg2+, Ag2+ e Pb2+, associam-se fortemente
com os grupos carregados negativamente da molécula de proteína, formando complexos
insolúveis.
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Técnica
Preparar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo:
REAGENTES TUBO 1
Solução de proteína 1 mL
AgNO3 2% Gotas até precipitação
Resultado
Anotar os resultados e concluir.

Desnaturação por solventes orgânicos

Os solventes orgânicos como etanol e acetona provocam a perda da solubilidade das
proteínas por ação desidratante.
Técnica
Preparar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo:
REAGENTES TUBO 1
Solução de proteína 1 mL
Etanol Gotas até precipitação
Resultado
Anotar os resultados e concluir.

2. Precipitação Reversível
2.1. Solubilização por salificação (Salting - in)
Os sais neutros em concentrações reduzidas aumentam a solubilidade de muitas
proteínas, fenômeno denominado de Salting-in. A capacidade dos sais neutros de influenciar
na solubilidade das proteínas é uma função de sua força iônica, que depende da sua
concentração e do número de cargas elétricas dos cátions e dos ânions que formam o sal.
Técnica
Em um becker adicionar 1,5 mL de clara de ovo e 5 mL de água destilada.
Agitar com bastão de vidro até o aparecimento de precipitado de proteína.
Adicionar NaCl 1,0N, gota a gota, até a redissolução do precipitado de proteína.
Este material será utilizado na experiência seguinte.

2.2 Precipitação por salificação (Salting – out)

A precipitação por salificação é a precipitação reversível das proteínas por adição de
concentração elevada de sal neutro. A concentração elevada de sais pode remover a água de
hidratação das moléculas protéicas reduzindo sua solubilidade. As proteínas precipitadas
mantêm a sua conformação nativa e podem ser dissolvidas novamente, em geral sem haver
desnaturação.
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Técnica
Da solução obtida na experiência anterior, pipetar 1,5 mL em um tubo de ensaio.
Adicionar 1,5 mL de solução saturada de sulfato de amônio e observar a formação do
precipitado de proteína.
Adicionar de 3,0 a 5,0 mL de água destilada, misturar por inversão lenta e observar a
redissolução do precipitado de proteína.
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AULA-7: CARACTERIZAÇÃO DA ENZIMA UREASE

A urease é encontrada em algumas bactérias e plantas e pode ser extraída facilmente da

soja (Glycine max). É uma enzima que catalisa a hidrólise da uréia em amônia e dióxido de
carbono como demonstrado abaixo.

H2N
\
C = O+ H2O  CO2 + 2NH3

H2N

Em meio aquoso

2NH3 + 2H2O  2NH4OH

Hidróxido de amônio

CO2 + H2O  H2CO3

ácido carbônico

H2CO3 + 2NH4OH  (NH4)2CO3 + 2H2O

carbonato de amônio

1. Reação de Biureto
Reação específica para peptídeos e proteínas, com duas ou mais ligações peptídicas. O
íon cúprico fornecido pela solução de CuSO4 se complexa com os grupos –NH, forma um
complexo de coloração violeta em meio alcalino.

Técnica
Preparar os tubos conforme a tabela abaixo:
REAGENTES TUBO 1 BRANCO
Urease 10 gotas -
Água destilada - 10 gotas
NaOH 2,5N 5 gotas 5 gotas
CuSO4 1% 5 gotas 5 gotas
Resultado
Agitar os tubos e anotar os resultados. Concluir.

2. Reação de Heller
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Esta reação baseia-se na precipitação de proteínas por ácido forte.

Técnica
Em um tubo de ensaio adicionar:
3 gotas de solução de urease e 1 mL de água destilada e misturar
Inclinar o tubo e deixar escorrer lentamente pela parede 1 mL de HNO 3 concentrado, de
modo que formem duas fases.
Observar o resultado e concluir.

3. Atividade da enzima urease

A atividade da urease pode ser verificada pela formação do carbonato de amônio, que é
um sal básico e cuja presença é detectada por meio de um indicador ácido-básico como o
vermelho de fenol. O vermelho de fenol em meio básico é rosa e em meio ácido ou neutro é
amarelo.

Técnica
Preparar os tubos conforme a tabela abaixo:
REAGENTES TUBO 1 CONTROLE
Uréia 1% 1 mL -
Água destilada - 1 mL
Uréase 3 gotas 3 gotas
Vermelho de fenol 1 gota 1 gota
Resultado
Agitar os tubos, observar a coloração e anotar o resultado.

3. Desnaturação pelo calor

Técnica
Em um tubo de ensaio:
Adicionar 1 mL de água destilada + 5 gotas da solução de urease.
Agitar e ferver por 2 minutos.
Adicionar 1 mL de uréia + 1 gota de vermelho de fenol.
Agitar. Observar o resultado e comparar com o teste da atividade.
Concluir.

5. Inibição por metais pesados

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Técnica
Em um tubo de ensaio:
Adicionar 1 mL de água destilada + 5 gotas da solução de uréase.
Agitar.
Adicionar 3 gotas de HgCl2.
Agitar.
Adicionar 1 mL de solução de uréia 1% + 1 gota de vermelho de fenol.
Agitar. Observar o resultado e comparar com o teste da atividade.
Concluir.

6. Especificidade da urease
Técnica
Preparar os tubos conforme a tabela abaixo:
REAGENTES TUBO 1 TUBO 2
Uréia 1% 1 mL -
Tiouréia 1% - 1 mL
Urease 5 gotas 5 gotas
Vermelho de fenol 1 gota 1 gota
Resultado
Agitar os tubos. Anotar os resultados. Concluir.
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AULA-8: CINÉTICA DA INVERTASE: EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO

1. Fundamento teórico
A invertase é uma enzima que catalisa a hidrólise da sacarose. A sacarose é um
dissacarídeo formado por glicose e frutose ligados por ligação glicosídica do tipo (1→2). A
sacarose é um dissacarídeo não redutor. A ação da invertase sobre a sacarose libera como
produtos de reação a glicose e a frutose que são redutores. Estes açúcares redutores em meio
alcalino e a quente formam enedióis que doam seus elétrons para reduzir o reagente 2,5,
dinitro-salicilato até 3-amino-5-nitrosalicilato, produzindo uma coloração alaranjada, cuja
intensidade é proporcional à concentração de açúcar redutor presente no meio da reação. A
cor produzida é lida em espectrofotômetro a 540nm.

Invertase

D-glucose D-frutose

2e-
OH-
Açúcar redutor Enediol + 3,5-DNS 3-NH-2,5-NS
(amarelo) (laranja)
 23

2. Técnica

REAGENTES BRANCO TUBO 1 TUBO2 TUBO3 TUBO 4 TUBO 5

Tampão pH 4,7 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
Agua 1,4 mL 0,9 mL 0,9 mL 0,9 mL 0,9 mL 0,9 mL
Sacarose 0,02M - 0,5 mL - - - -
Sacarose 0,04M - - 0,5 mL - - -
Sacarose 0,08M - - - 0,5 mL - -
Sacarose 0,10M - - - - 0,5 mL -
Sacarose 0,20M - - - - - 0,5 mL
Invertase 0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL
INCUBAÇÃO 25oC por 5 minutos
3,5-DNS 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
INCUBAÇÃO 100oC por 5 minutos
Água 6,5 mL 6,5 mL 6,5 mL 6,5 mL 6,5 mL 6,5 mL
Absorvâncias
Ler no espectrofotômetro a 540nm.
Com os resultados obtidos: traçar o gráfico de Michaelis-Mentem, indicando o valor de Km
e Vmáx
 24

AULA-9: EXTRAÇÃO E DOSAGEM DE ÁCIDO ASCÓRBICO

1. Fundamento teórico
O ácido ascórbico ou vitamina C é encontrado nas frutas cítricas, no tomate e em
vegetais verdes. O ácido ascórbico é um agente fortemente redutor, que perde com facilidade
seus átomos de hidrogênio para se tornar o ácido desidroascórbico, o qual também apresenta
atividade de vitamina C. O ácido metafosfórico é utilizado na extração do ácido ascórbico, a fim
de reduzir o pH do meio para precipitar as proteínas e também para estabilizar a vitamina C,
evitando sua oxidação.
O corante 2,6 diclorofenol-indofenol é utilizado na dosagem do ácido ascórbico. Na
reação com este corante o ácido ascórbico se oxida para ácido desidroascórbico e o
diclorofenol-indofenol reduz-se.
 25

2. Extração do ácido ascórbico de suco de frutas

Técnica
Espremer um limão ou uma laranja.
Em um Becker, pipetar 1,0 mL do suco.
Adicionar 9 mL de ácido metafosfórico 5%.
Agitar e filtrar em papel de filtro. O filtrado contendo a vitamina extraída será utilizado
para dosagem.

3. Dosagem do ácido ascórbico

Técnica
Preparar os erlenmeyers conforme a tabela abaixo:

REAGENTES ERLENMEYER 1 ERLENMEYER 2

Padrão de acido ascórbico 10 mg% 5 mL -
Filtrado do suco - 5 mL
H2SO4 (1N) 0,5 mL 0,5 mL
Titular com 2,6 diclorofenol-indofenol (2,6-DFIF) até o aparecimento de
coloração avermelhada.
Resultado (mL de 2,6-DFIF)
Anotar o volume gasto em cada titulação.
Calcular a concentração de ácido ascórbico do suco.
 26

AULA- 10: EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Fundamentação teórica: O DNA ou ácido desoxiribonucléico é formado por nucleotídeos

unidos entre si por ligações fosfodiéster. Os nucleotídeos são formados por uma ribose (a
desoxirribose) a qual estão ligadas uma base nitrogenada (carbono 1), adenina, guanina,
timina ou citosina e um grupo fosfato (carbono 5). As bases adenina e guanina são as bases
purínicas e timina e citosina são as bases pirimidínicas. Cada molécula de DNA é composta por
duas cadeias poliméricas de nucleotídeos unidas entre si por ligações de hidrogênio, formando
uma estrutura em hélice.

estrutura geral de um nucleotídeo

DNA

Para a análise do DNA de células eucarióticas, a primeira etapa importante é o seu isolamento.
O procedimento a seguir é utilizado para extrair grandes quantidades de DNA a partir de cebola
e outros tecidos vegetais. Protocolos similares são usados nas extrações de DNA de outras
fontes, como amostras de sangue, tecidos, etc.
A extração de DNA de células eucariontes consta fundamentalmente de três etapas:
• ruptura (física e química) das membranas celulares para liberação do material genético;
• desmembramento dos cromossomos em seus componentes básicos: DNA e proteínas;
• separação do DNA dos demais componentes celulares.

Inicialmente a cebola é ralada para que haja a ruptura da parede celular, expondo o
material genético das células. Em seguida as moléculas do detergente desestruturam as
moléculas de lipídios presentes nas membranas celulares. O aquecimento favorece a reação e
 27

desnatura as moléculas de DNA e a adição do sal (NaCl) no início da experiência proporciona

ao DNA um ambiente favorável. O sal contribui com a presença de íons positivos que
neutralizam a carga negativa do DNA. Numerosas moléculas de DNA podem coexistir nessa
solução. Como o DNA é insolúvel em álcool, emprega-se o etanol para separá-lo da solução. O
álcool desidrata as moléculas de DNA fazendo com que elas se aglutinem. O DNA tem também
menor densidade que os outros constituintes celulares, por isso surge na superfície da solução.
A estrutura de dupla-hélice só pode ser visualizada de modo indireto e através de aparelhos
sofisticados. O que está sendo observado a olho nu são milhares de fitas de DNA juntas.

I. Extração de ácidos nucléicos

Procedimento:
1. Rale uma cebola de aproximadamente 100 g.
2. Adicione 100 mL de uma solução feita com 90 mL de água destilada, 10 mL de detergente
e uma colher de sopa de sal de cozinha (NaCl). Misture bem a solução com a cebola e leve
ao banho-maria, a 60 °C, por 15 min.
3. Coloque o frasco com a cebola em banho de gelo por 5 min, sempre agitando. À medida
que a solução esfria é possível observar que o líquido parece estar “talhando”.
4. Filtre o material em gaze dobrada.
5. Cada equipe deve pipetar aproximadamente 10 mL do filtrado em um béquer
6. Adicionar 2 volumes de etanol a 95%, gelado. Forma-se um precipitado de ácidos
nucléicos.
7. Com a ajuda de bastão de vidro remova o precipitado e coloque em um tubo de ensaio
(tubo 1). Adicione 2 mL de água destilada para dissolver o precipitado. Este DNA será
utilizado para a caracterização.

II. Reações de caracterização do DNA: O DNA possui algumas propriedades físico-quimicas

que auxiliam na caracterização desta molécula, entre elas:
• Possui peso molecular elevado;
• Viscosidade (índice de enrolamento);
• A dupla hélice pode ser desnaturada por efeito de: temperatura, pH's extremos, uréia e
formamida, enzimas (helicases); a renaturação é espontânea, sob condições normais;
• Absorve luz na região do ultravioleta (máximo de absorção em 260 nm) e tem um efeito
hipercrômico (aumenta absorção quando as cadeias são desnaturadas);
• Reagem com a DIFENILAMINA formando um complexo corado azul por ligação à
desoxiribose e aquecimento.
 28

II.1. Efeito hipercrômico do DNA: A partir do DNA solubilizado (tubo 1), faça uma diluição de
1:100. Divida o volume do DNA diluído em dois tubos de ensaio: tubo 2 e tubo 3. Reserve o
tubo 2 a temperatura ambiente e incube o tubo 3 em banho-maria fervente por 5 minutos. Após
este tempo, coloque o tubo 3 imediatamente no gelo (fazer a leitura após 5 minutos de banho
de gelo; manter em gelo até a leitura). Observe e compare a viscosidade nos tubos 2 e 3. Faça
a leitura de absorbância a 260nm, em cubeta de quartzo, das amostras diluídas não-fervida e
fervida. Anote os resultados e interprete.

Amostras Viscosidade A260nm

Branco (1ml de água destilada) -----
Tubo 3 (DNA não-desnaturado)
Tubo 4 (DNA desnaturado)
 29

AULA- 11: REAÇÕES QUALITATIVAS PARA IDENTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATOS

1. Reação de Molish
A ação desidratante do H2SO4 concentrado sobre as moléculas de mono, oligo e
polissacarídeos provoca a formação de furfural (pentoses) e hidroximetilfurfural (hexoses).
Estes podem condensar com um composto fenólico (-naftol) formando um produto violeta.

Técnica
Preparar os tubos conforme a tabela abaixo:
REAGENTES TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4
Glicose 1% 10 gotas - - -
Sacarose 1% - 10 gotas - -
Amido 1% - - 10 gotas -
Celulose - - - 10 gotas H2O +
algodão
Molisch 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas
Misturar e adicionar cuidadosamente deixando escorrer lentamente pela parede do tubo
2mL de H2SO4 concentrado. NÃO AGITAR O TUBO ! Deixar em repouso e observar a
formação do anel violeta.
Resultado
Anotar os resultados. Concluir.

2. Reação de Selliwanoff
Esta reação é utilizada para diferenciar aldoses de cetoses. Os carboidratos sob ação
desidratante do HCl são convertidos em aldeídos cíclicos, os quais condensam com o
resorcinol formando um complexo de cor vermelha. A reação com cetoses é rápida e intensa.
Com aquecimento prolongado, as aldoses dão reação positiva.
 30

Técnica
Preparar os tubos conforme a tabela abaixo:
REAGENTES TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3
Glicose 1% 10 gotas - -
Frutose 1% - 10 gotas -
Sacarose1% - - 10 gotas
HCl conc. 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL
Selliwanoff 5 gotas 5 gotas 5 gotas
Agitar e aquecer até o aparecimento de cor vermelha.
Resultado
Anotar os resultados. Concluir.

3. Reação de Bial
Reação específica para pentoses. As pentoses produzem furfural por ação do HCl a
quente. O furfural combina-se com o orcinol e na presença de sais férricos forma um produto
de cor azul ou verde-azulado.
Técnica
Preparar os tubos conforme a tabela abaixo:
REAGENTES TUBO 1 TUBO 2
Glicose 1% 10 gotas -
Xilose 1% - 10 gotas
Reativo de Bial 0,5 mL 0,5 mL
Misturar e aquecer em banho-maria fervente durante 10 minutos ou até
o aparecimento da cor azul ou verde azulada.
Resultado
Anotar os resultados. Concluir.

4. Reações de Identificação de Açúcares Redutores

As reações para detecção de carboidratos redutores ocorrem em meio alcalino. O açúcar
redutor, em meio alcalino diluído, forma enediol, altamente reativo e instável que pode ceder
facilmente os elétrons e prótons respectivos.

4.1. Reações de Benedict

O reativo de Benedict é constituído de solução alcalina de CuSO4. O íon cúprico (Cu2+) do
CuSO4 , aceita os elétrons do enediol reduzindo-se a íons cuproso (Cu+), o qual em meio
alcalino forma hidróxido cuproso (amarelo) que é convertido a um precipitado vermelho de
óxido cuproso (Cu2O), por aquecimento. As cores verde, amarelo e vermelho tijolo refletem
quantidades crescentes de açúcares redutores.
 31

Técnica:
Preparar os tubos conforme tabela abaixo:
REAGENTES TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 BRANCO
Glicose 10 gotas - - - -
Frutose - 10 gotas - - -
Amido - - 10 gotas - -
Sacarose - - - 10 gotas -
H2O - - - - 10 gotas
Benedict 10 gotas 10 gotas 10 gotas 10 gotas 10 gotas
Ferver por 5 minutos
Resultados
Anotar os resultados. Concluir.
 32

AULA- 12: CARACTERIZAÇÃO E HIDRÓLISE DO AMIDO

1. Fundamento teórico
O amido é o carboidrato que as plantas sintetizam como principal reserva alimentar. È
constituído de -amilose e amilopectina. A -amilose é um polímero linear formado por
diversos milhares de resíduos de glicose unidos por ligação (1→4). A amilopectina é um
polímero ramificado de glicose com ligações do tipo (1→4) na parte linear e ligações do tipo
(1→6) nos pontos de ramificação. A amilopectina contém 106 resíduos de glicose.
O amido é insolúvel em água fria, porém, quando aquecido ou colocado em contato com
água fervente, os grânulos são desintegrados e formam uma solução coloidal.

2. Caracterização do amido
2.1. Reação de Molish
Reação utilizada para pesquisa de carboidratos, baseada na formação de compostos de
furfural pela ação desidratante do ácido forte. Os compostos de furfural reagem com o -naftol
formando um produto colorido
REGENTES TUBO 1 BRANCO
Amido 1,0 mL -
Água - 1,0 mL
Molish 3 gotas 3 gotas
Misturar e adicionar cuidadosamente deixando escorrer lentamente pela parede do tubo
2,0 mL de H2SO4 concentrado. NÃO AGITAR O TUBO !
Deixar em repouso e observar a formação do anel violeta

2.2. Reação com o Iodo (Lugol : KI + I2)

O amido forma complexo de coloração azul com o iodo. O complexo se dissocia por
aquecimento e forma-se novamente quando a solução é resfriada. A explicação para este
fenômeno é devido às moléculas de amido que tendem a formar agregados ou micelas. O iodo
reage com as micelas formando o complexo colorido, sob aquecimento as micelas
desagregam-se e a cor desaparece.
REGENTES TUBO 1 BRANCO
Amido 1,0 mL -
Água destilada - 1,0 mL
Lugol 1 gota 1 gota
Aquecer levemente o tubo 1 e anotar o resultado
Resfriar o tubo 1 em água corrente na torneira e anotar o resultado
2.3. Precipitação do Amido
 33

Os vários resíduos de glicose que constituem o amido apresentam grupos hidroxilas

polares tornando o polissacarídeo altamente hidratado. O sulfato de amônio e o etanol
desidratam o amido provocando precipitação.
TUBO 1: Adicionar 1,0 mL de amido e adicionar etanol até o aparecimento do precipitado.

3. Hidrólise do Amido
As ligações glicosídicas das amiloses e amilopectinas do amido podem ser hidrolisadas
por HCl concentrado e a quente. O processo de hidrólise do amido pode ser acompanhado
pela liberação de açúcares redutores que no decorrer da hidrólise é aumentado e detectado
pela reação de Benedict.

3.1 Técnica Benedict

Preparar uma série de 6 tubos de ensaio e identificá-los conforme o tempo de hidrólise: 0,
5, 10, 15, 20 e 25 minutos. Adicionar a cada tubo 10 gotas do reagente de Benedict e 2 gotas
de NaOH 2,5N e reservar.
Em um tubo de ensaio grande pipetar 10 mL da solução de amido e deixar em banho-
maria fervente para atingir a temperatura. Marcar o tempo e então adicionar 0,3mL de HCl
concentrado e misturar. Imediatamente, retirar 0,5 mL e passar para o tubo do tempo 0. Manter
o tubo grande no banho-maria e a cada 5 minutos passar 0,5mL para os respectivos tubos.
Levar os 6 tubos de ensaio contendo a amostra hidrolisada mais o reagente de Benedict
para o banho-maria fervente por 5 minutos e analisar os resultados.

3.2 Técnica do Iodo (Lugol)

Em uma placa escavada, coletar 1 gota da amostra (tempo zero) na primeira cavidade e
colocar 1 gota de lugol. Na segunda cavidade, coletar após 5 minutos 1 gota da amostra e 1
gota de lugol. E assim, a cada 5 minutos coletar amostras e adicionar lugol até completar 25
minutos de hidrólise.
 34

AULA-13: REAÇÕES QUALITATIVAS PARA IDENTIFICAÇÃO DE LIPÍDIOS

1 VERIFICAÇÃO DA ACIDEZ EM ÓLEO OU GORDURA RANÇOSA

Os óleos e gorduras não muito purificados contêm pequenas quantidades de ácidos
graxos livres. Quanto maior for o grau de impureza destes lipídios ou quanto mais tempo forem
deixados em contato com o ar, à temperatura ambiente, maior será a quantidade de ácidos
graxos livres.

Técnica
Preparar os tubos conforme tabela abaixo:
REAGENTES TUBO 1 TUBO 2
Etanol 2 mL 2 mL
NaOH 0,1 N 1 gota 1 gota
Fenolftaleína 1 gota 1 gota
Óleo rançoso Gota a gota, até descorar -
Óleo fresco - Adicionar o dobro do nº de
gotas gastos para o óleo
rançoso
N° de gotas
Anotar os resultados. Concluir.

2 SAPONIFICAÇÃO
Os óleos e gorduras, quando tratadas com solução alcalina e a quente, se hidrolisam
produzindo glicerol e os sais de ácidos graxos (sabões).

O
H2C O C R1 CH2OH
O
HC O C + 3 KOH + 3R-COO-K+
R2 CHOH
O
H2C O C R3 CH2OH
Triacilglicerol Glicerol Sabões (sais dos A.G.)
Técnica:
Em um tubo de ensaio grande adicionar:
15 gotas de óleo vegetal fresco.
5 mL de potassa alcoólica (2,5 mL de KOH 40% e 2,5 mL de etanol).
Aquecer o tubo em banho-maria fervente até 30 minutos.
Anotar o resultado e concluir.
 35

3. PROPRIEDADES DOS SABÕES

Técnica:
Repartir a solução de sabão obtida anteriormente em três tubos de ensaio e realizar
os seguintes testes:
3.1. Abaixamento da tensão superficial
Adicionar ao tubo 1, 10 mL de água destilada, agitar e verificar a formação de
espuma.
3.2. Precipitação de ácidos graxos
O aparecimento da turbidez com a adição de ácido acético, indica a liberação dos
ácidos graxos, os quais sendo insolúveis em água e menos densos ficam nos sobrenadante.
Adicionar gota a gota ácido acético até o aparecimento da turbidez.

R-COO-K+ + CH3COOH R-COOH + CH3COO-K+

Sabões Ácido acético Ácido graxo Acetato de K
Adicionar ao tubo 2, gota a gota, ácido acético concentrado até o aparecimento de
turbidez, resultante da liberação de ácidos graxos.

3.3. Precipitação de sabões de cálcio insolúveis

Os sais de ácidos graxos em presença de cálcio formam um precipitado de sabão
de cálcio insolúvel. Adicionar gota a gota s solução de CaCl2 10% até o aparecimento de um
precipitado branco de sabão de cálcio.
Adicionar, gota a gota, solução de CaCl2 10%, até aparecimento de um precipitado
de sabões de cálcio. Colocar água e agitar para verificar a formação de espuma.

3.4. Precipitação por excesso de eletrólitos

Os sais de ácidos graxos precipitam em presença de excesso de eletrólitos, devido
ao efeito de íon comum da dissociação do sal. Adicionar um volume igual de solução saturada
de NaCl. Observar a formação de um precipitado de sabão por excesso de eletrólitos. Colocar
água e agitar para verificar a formação de espuma.

4. Caracterização do Glicerol
O glicerol sob ação de um desidratante como o bissulfato de potássio (KHSO4), dá
origem a acroleína, reconhecida pelo odor desagradável.
Em um tubo de ensaio colocar 2 gotas de óleo vegetal e adicionar uma pitada de
bissulfato de potássio e aquecer.
 36

AULA- 14: EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA LECITINA

A lecitina é um fosfolipídio que pode ser hidrolisada totalmente pela adição de bases e
ácidos. Com hidrólise alcalina em NaOH ocorre a liberação dos ácidos graxos (sais de ácidos
graxos) e da colina. Com a adição de ácido acético glacial libera-se o ácido fosfórico e o
glicerol.

1 EXTRAÇÃO E HIDRÓLISE DA LECITINA

1.1 Extração

1g de gema de ovo (previamente extraída com acetona)

adicionar 10 mL CHCl3 (1a filtragem) + 10 mL CHCl3 (2a filtragem)

Recolher o filtrado em erlenmeyer

Evaporar em bico de bunsen, até reduzir a 1/5 do volume

1.2 Hidrólise
Adicionar 5 mL de etanol + 2 mL NaOH (10N) + 8 mL água destilada

Ferver por 10 minutos e resfriar

Adicionar CH3COOH até fraca reação do papel tornassol

Aquecer por 1 minuto e filtrar em papel pré-umedecido

O filtrado será utilizado para os testes de caracterização.

2 CARACTERIZAÇÃO DA LECITINA

2.1 Detecção da Colina

A colina liberada da lecitina através da hidrólise pode ser detectada pela adição de iodo
a baixas temperaturas. A colina reage com o iodo e forma iodidrato de colina (cristais de
florence).
 37

Técnica
Em uma lâmina adicionar uma gota do filtrado e um gota de lugol concentrado, cobrir
com lamínula e levar ao freezer por 5 minutos. Observar imediatamente ao microscópio
formação de cristais que indica presença de colina.

2.2 Detecção do fosfato

O fosfato liberado da hidrólise da lecitina pode reagir com molibdato de amônio,
formando o fosfomolibdato de amônio, que pode ser reduzido pelo agente redutor a amino
naftol sulfônico e formar óxidos de molibdênio (cor azul clara positiva o teste).
Técnica
Colocar 1 mL do filtrado em um tubo de ensaio. Adicionar 1 mL de molibdato de amônio
2,5% em H2SO4. Aquecer por 2 a 3 minutos. O produto formado será o fosfomolibdato de
amônio. Adicionar o agente redutor. Observar a formação da coloração azul.
 38

AULA- 15: FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA POR Saccharomyces cerevisae

1. Técnica
1.1. Microrganismo: Levedura Saccharomyces cerevisae de fermento de pão desidratado.
1.2. Meio de cultivo:
500mL de caldo de cana
0,01g de MgSO4.7H2O
0,001g de Co(NO3)2.2H2O
0,001g de MnSO4.H2O
Ferver o cultivo por 5 minutos e resfriar. Medir o pH do meio e corrigir para 4,5.
1.3. Desinfecção: lavar todas as vidrarias e materiais com água destilada e depois com álcool
70%.
1.4. Preparo do inócuo: transferir o meio de cultivo para um balão de fundo redondo de 1L,
adicionar 2g de fermento de pão. Homogeneizar, fechar com rolha, conectar uma mangueira
ligando o balão de fermentação a um segundo balão contendo água de cal. Manter o sistema
por 7 dias.
 39

AULA- 16: DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE AÇÚCAR TOTAL PELO MÉTODO DO

FENOL-SULFÚRICO (Dubois e colaboradores, 1956)

Princípio de método:

O ácido sulfúrico concentrado desidrata pentoses e hexoses convertendo-os em

furfural e hidroximetilfurfural respectivamente, os quais reagem com o fenol formando um
complexo colorido de coloração alaranjada. O complexo formado com pentoses absorve com
maior intensidade na região de 480nm, enquanto com hexoses em 490nm.

Reagentes:

• Fenol 5% (50mL de fenol liqüefeito diluir em uma porção de água destilada e completar o
volume para um litro).
• H2SO4 concentrado D = 1,844 P.A.
• Solução padrão de glucose 0,1g% (m/v). Diluir 1:10 para obter uma solução 100g/mL para
preparar a curva de calibração.

Sensibilidade: 1 - 60g

Materiais:

• Pipetas de vidro
• Tubos de ensaio
• Espectrofotômetro

Técnica:

Curva de calibração:
• Preparar quatorze tubos de ensaio de boca larga e bem limpos. Identificá-los previamente
antes de distribuir os diferentes volumes correspondentes às respectivas concentrações
citadas abaixo. Completar o volume de cada amostra para 0,5mL com água destilada.
• Adicionar 0,5mL de solução de fenol 5%.
• Acrescentar 2,5mL de H2SO4 concentrado (com pipeta de ponta cortada, em um único jato),
agitar vigorosamente.
• Deixar em repouso à temperatura ambiente durante 20 minutos.
• Ler no espectrofotômetro a 490nm, utilizando a solução do tubo “branco” (água destilada e
demais reativos) para zerar o aparelho.
• Diluir a amostra caso necessário.
 40

Curva de calibração

Tubo Padrão H2O dest. Amostra Fenol 5% H2SO4 Concentração

100g/mL Conc. g/mL
B - 0,5 - 0,5 2,5 -
1 0,1 0,4 - 0,5 2,5 20
2 0,2 0,3 - 0,5 2,5 40
3 0,3 0,2 - 0,5 2,5 60
4 0,4 0,1 - 0,5 2,5 80
5 0,5 - - 0,5 2,5 100
A - - 0,5 0,5 2,5 -

Ler no espectrofotômetro a 490nm.

• Traçar o gráfico em papel milimetrado, lançando as concentrações de glicose na abscissa

contra os valores de absorbância na ordenada.
• Calcule o fator de calibração.
• Calcule a concentração de carboidratos na amostra, levando em consideração a diluição.
• Interferentes: Ácidos orgânicos e alguns íons metálicos pesados, proteínas, azida, etc.

Referência Bibliográfica:

DUBOIS, N.; GILLES, K.A. HAMILTON, J.K.; REBERS, B.A. and SMITH, F. – Colorimetric
Method Determination of Sugars and Substances. Anal. Chem.. v.23, p. 350-356, 1956.
 41

AULA- 17: DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE AÇÚCAR REDUTOR PELO MÉTODO DE

SOMOGYI-NELSON

1. Fundamento teórico
O açúcar redutor reduz o reativo cuproalcalino Somogyi formando óxido cuproso, o qual
na presença do reativo arseno-molibdico de Nelson forma o óxido de molibdênio, de cor azul
estável. A cor desenvolvida é proporcional à concentração de açúcar redutor presente na
amostra e é estável por várias horas.

2. Técnica
Solução Padrão de Glicose: 0,1% (p/v). Diluir 1:10 para obter uma solução de 100
g/mL para preparar a curva padrão.
TUBOS GLICOSE ÁGUA SOMOGYI NELSON ÁGUA [GLICOSE] A
(100g/mL) (mL) (mL) (mL) (mL) (g) 540 nm
Branco - 1,0 0,5 Ferver 0,5 3,5
1 0,2 0,8 0,5 por 10 0,5 3,5
2 0,4 0,6 0,5 minutos 0,5 3,5
3 0,6 0,4 0,5 e 0,5 3,5
4 0,8 0,2 0,5 Resfriar 0,5 3,5
5 1,0 - 0,5 0,5 3,5
Amostra 1,0 - 0,5 0,5 3,5
Traçar a curva padrão e calcular a concentração de açúcar redutor da amostra
*Colocar bolinhas de gude sobre a boca do tubo
 42

AULA- 18: INIBIÇÃO DA GLICÓLISE PELO FLUORETO:

A glicólise é o processo anaeróbico pelo qual a glicose é degradada até piruvato. Como
os primeiros organismos vivos apareceram em uma atmosfera sem oxigênio, a glicólise é o
mecanismo mais antigo que os organismos começaram a utilizar para extrair energia das
moléculas combustíveis. A glicólise ocorre no citoplasma. Em animas, a glicólise ocorre
intensamente para fornecer energia para a contração muscular particularmente nos músculos
brancos. Estes são responsáveis pelo vôo em galinhas e perus, assim estas aves são capazes
de realizar vôos curtos. Os músculos brancos contêm pouca mitocôndria e a contração é muito
rápida, assim só pode funcionar em velocidade máxima por períodos curtos. O fluoreto inibe a
glicólise, pois age sobre a enolase, enzima que catalisa uma das reações da via glicolitica,
como esquematizado abaixo:

Glicose

2- Fosfoglicerato
Enolase
Fosfoenolpiruvato

Piruvato
Essa inibição provoca um acúmulo de glicose. Essa aula utiliza a levedura de
panificação Saccharomyces cerevisiae, que inicia o catabolismo da glicose pela glicólise.

Suspensão celular: Dissolver 1g de fermento em 10mL de água em tubo grande.

Agitar por 2 minutos para homogeneização.
Preparar os tubos A e B como descrito na tabela abaixo:
Tubo A Tubo B
Meio cultura 4,5 mL 4,5 mL
Fluoreto 1,5 mL -
H2O - 1,5 mL
Suspensão Celular 0,5 mL 0,5 mL
Decorrido 20 min de fermentação a 37º C, centrifugar por 4 minutos a 4.000 rpm.
Separar o sobrenadante e realizar a quantificação da glicose.

Quantificação da Glicose: O consumo de glicose será realizado pelo método de DNS.

A cor desenvolvida é proporcional à concentração de açúcar presente no meio e é estável por
várias horas.
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As amostras devem ser diluídas em 1:50 (0,1mL + 4,9 mL de água) e depois retirar
1,0mL para as determinações. O padrão de glicose está na concentração de 1mg/mL.

Tubos Amostra H2O DNS H2O Abs

(540nm)
Branco - 1,0mL 1mL Ferver 7 mL
Padrão 0,5mL 0,5mL 1mL todos 7 mL
Meio 1,0mL - 1mL os 7 mL
Tubo A 1,0mL - 1mL tubos por 7 mL
Tubo B 1,0mL - 1mL 5’ 7 mL

Zerar o aparelho com o tubo branco.

Calcular a concentração de glicose presente nas amostras TA (com fluoreto) e no TB (sem

fluoreto).

Calcular a percentagem de consumo de glicose do TA e TB.