Introdução a Histologia I

Métodos de Estudo

Elsa Mugabe
 Conteúdos
• Introdução à Histologia
Conceito
Breve historial
Relação com outras disciplinas
Métodos de estudo de tecidos biológicos
• Microscópio
Tipos
Constituição
Manuseamento
Cuidados.
 No final da aula o estudante deve saber:
• Conceituar a cadeira;

• Mencionar a importância da histologia e a sua relação com as outras disciplinas;

• Mencionar os diferentes métodos de estudos dos tecidos biológicos;

• Identificar o Microscópio, os seus componentes.

Introdução a Histologia
 Conceito
• Histologia é um Módulo das ciências médicas que se dedica ao estudo das
células e dos tecidos do corpo e de como essas estruturas se organizam para
constituir os órgãos.

Breve Historial
• Surge inicialmente por Mayer em 1819, para descrever texturas diferentes
encontradas no corpo animal, derivou o termo “tecido” criado pelo
anatomista francês Bichat, por volta de 1800. Mayer fez a conjugação do
termo histos (tecido) e logos(estudo).

• Os primeiros histologistas descobriram muito sobre a estrutura do material

biológico estabelecendo a teoria celular – “a célula é a unidade básica da
arquitectura da maioria dos organismos vivos”
 Histologia

CÉLULAS TECIDOS ÓRGÃOS

SISTEMAS ORGANISMO
CÉLULA
• É a unidade fundamental do corpo

TECIDOS
• São a associação de várias células semelhantes

ORGÃOS
• São a junção de vários tecidos que realizam uma
determinada função
 Relação com outros Módulos
• Química
• Fisiologia
• Imunologia
• Patologia
• Conhecimento adequado da biologia das células, dos
tecidos e dos órgãos e de como seus vários
componentes interagem na saúde e na doença.
Métodos de Estudo
UNIDADES DE MEDIDA

• A unidade de medida Angstrom (Å) não é mais utilizada. No seu

lugar é utilizado a unidade de medida nanômetro (nm) (1nm = 10
Å). Outra unidade de medida utilizada é o micrómetro (µm)

Unidade Representação e valor

Micrómetro 1 µm = 0,001 milímetro
Nanometro 1 nm = 0,001 micrómetro
 Técnica Histológica
• Conjunto de processos a que se submetem os tecidos a fim de que possam ser
observados significativa e adequadamente permitindo o diagnóstico histológico ou
patológico
Preparação do tecido para Exame
Microscópico
 PREPARAÇÃO DE LÂMINAS
HISTOLÓGICAS
• O microscópio óptico é o mais utilizado em histologia. Neste
instrumento os objectos são observados por transparência.

• Na sua maioria os órgãos são muito espessos e necessitam ser

reduzidos a cortes muito finos( micrótomo), suficientemente finos para
permitir a passagem da luz.

• Mas, antes de serem observados, os tecidos tem de passar por uma

série de tratamentos.
 Colecta da Amostra
• Biopsia: retirada de um fragmento num animal vivo.

• Necropsia: retirada do fragmento num animal morto.

Obs: fragmento de espessura ideal de 4-6mm para boa fixação

Fixação

Tratamento da peça histologica a fim de que se possa observar ao microscópio,

os componentes teciduais, com a morfologia e composição química
semelhantes as existentes no ser vivo.

• Objectivo: desta 1ª etapa é estabilizar os tecidos, a fim de evitar a destruição

da célula por suas próprias enzimas (autólise), ou por bactérias.

• Esta etapa serve também para endurecer os tecidos para que estes se tornem
mais resistentes para se submeterem às etapas subsequentes da técnica
histológica.
 Cont...
• A fixação pode ser realizada por processos físicos, como o calor e por processos
químicos, através de substâncias chamadas fixadoras, que insolubilizam as proteínas
dos tecidos.

• Alguns fixadores precipitam as proteínas (cloreto de mercúrio, ácido pícrico) enquanto

outros causam a sua coagulação (aldeido fórmico, tetróxido de ósmio, aldeído glutárico).

• Todos eles têm os seus defeitos por isso os histologistas utilizam misturas fixadoras com
o objectivo de eliminar as desvantagens.
– liquido de Bouin (solução aquosa saturada de ácido pícrico – 75ml, formol – 25ml,
ácido acético glacial – 5ml) e o
– liquido de Helly (bicromato de potássio – 2,5gr, cloreto de mercúrio – 5gr, água –
100ml, formol – 5ml)

• Entre os fixadores simples mais utilizados temos o formaldeído a 10% em microscopia

óptica e o aldeído glutárico a 2-6% em microscopia electrónica .
– Desidratação
A água presente nos tecidos é extraída pela passagem dos mesmos em banhos de
concentrações crescentes de etanol (70 a 100%);

– Clareamento / Diafanização
O etanol presente nos tecidos é substituído por um liquido miscível tanto em etanol
como em parafina, passando os tecidos em xilol ou benzol;

– Impregnação
O objectivo desta etapa é tornar as peças suficientemente resistentes para que
possam ser cortadas em camadas extremamente finas.
As substâncias mais utilizadas são: gelatina, celoidina, parafina (MO) e resinas
epóxi (ME).
Mergulham-se tecidos em parafina fundida a 60ºC numa estufa. Devido ao calor o
xilol ou o benzol evaporam e os espaços são ocupados pela parafina. Em seguida
coloca-se a peça num pouco de parafina fundida num recipiente de forma
rectangular e deixa-se solidificar a temperatura ambiente
CORTE OU MICROTOMIA

• Os blocos de parafina, contendo os tecidos incluídos são seccionados pela

navalha de aço do micrótomo obtendo-se geralmente cortes de 3 a 8 µm de
espessura.

• Estes cortes são estirados em água quente e, depois, colocados nas lâminas.

• Para a microscopio electrónico são necessários cortes mais finos (cerca de

0,02 a 0,1 µm).

• O material é embebido em resina epóxi dura, e para cortá-los usam-se

navalhas de vidro ou diamante.
COLORAÇÃO
• A maioria dos tecidos é incolor, o que torna difícil sua observação ao
microscópio óptico. Devido a isso, foram introduzidos métodos para a
coloração dos tecidos, de modo a tornar seus componentes visíveis e
destacados uns dos outros.

• A coloração é feita usando-se geralmente misturas de substâncias

químicas denominadas corantes.

• A maioria dos corantes usados em histologia comportam-se como ácidos

ou bases e tendem a formar ligações salinas com radicais ionizáveis
presentes nos tecidos.

• Os componentes dos tecidos que se coram facilmente com corantes

básicos são chamados basófilos, sendo chamados de acidófilos os que se
ligam a corantes ácidos.
COLORAÇÃO

• Os corantes podem ser classificados:

• Quanto à natureza química:

– ÁCIDOS - Coram elementos acidófilos. Eosina, ácido ósmico e
P-A-S- (Periodic Acid Schifft)
– BÁSICOS – Coram as estruturas basófilas. Hematoxilina, orceína,
azul de metileno, lugol, Verde-janus B, violeta de genciana.
– NEUTROS - Efeito tintorial sobre as estruturas que não revelam
acidofilia nem basófilia. Vermelho neutro.
COLORAÇÃO

• Os corantes podem ser classificados:

Quanto ao papel fisiológico:

– VITAIS - Coram a célula sem determinar sua morte. Verde-janus B,
azul de metileno, azul brilhante de cresil, vermelho neutro, Sudan III.
– NÃO-VITAIS - Determinam a morte celular. Hematoxillna, eosina,
ácido ósmico, lugol, vermelho escarlate, violeta de genciana.
COLORAÇÃO

• Os corantes podem ser classificados:

• Quanto às propriedades tintoriais:

– ORTOCROMÁTICOS - Conferem á célula a mesma cor que
apresentam in vítro. Azul de metileno, verde-janus B, vermelho
neutro.

– METACROMÁTICOS - Dão á célula coloração diferente da

que apresentam in vítro. Laranja de acridina, tionina, azul de
toluidina.
 PLACENTA DE BÚFALO,
HISTORESINA, AZUL DE TOLUIDINA

COLORAÇÃO
• O azul-de-toluidina e o azul-de-metileno são exemplos de corantes
básicos.

• A hematoxilina comporta-se principalmente como um corante básico,

ligando-se às estruturas basófilas dos tecidos - as nucleoproteinas e as
glicoproteínas ácidas.

• Corantes ácidos tais como o orange G, a eosina e a fucsina ácida,

coram principalmente os componentes básicos das proteínas
citoplasmáticas.

• A coloração dupla pela hematoxilina e pela eosina (HE) é a mais

utilizada na rotina em histologia, porém muitos outros corantes são
usados. Além dos corantes, usa-se também a impregnação metálica
com sais de prata e ouro, principalmente no estudo do tecido nervoso
Tipos de coloração
• Coloração Simples: usa-se apenas 1 tipo de corante.
Ex. Células da bochecha – azul de metileno

• Coloração Combinada: usamos 2 ou mais tipos de corantes.

Ex. H.E. (Hematoxilina e Eosina)

• Coloração Difusa: todo o material é corado.

Ex. Medula espinal (H.E.) cora-se tanto a substância Branca como a substância
Cinzenta.

• Coloração Electiva: escolhemos a estrutura a ser corada e usamos um corante

específico.
Ex. DNA – Reacção de Feulgen

• Coloração Directa: a estrutura tem afinidade pelo corante.

Coloração
• Coloração Indirecta - a estrutura não tem afinidade pelo corante e usamos
uma solução para torná-la afim dele. A essa substância dá-se o nome de
MORDENTE.
Ex. Coloração de Gram à corar bactérias. Usa-se Lugol como mordente
Hematoxilina Férrica de Regaud à corar mitocôndria. Usa-se Alúmem de
Ferro como mordente.

• Coloração Ortocromática - a estrutura adquire a cor do corante.

• Coloração Metacromática - a estrutura muda de cor, não fica com a cor do

corante.
Ex. Mastócito - Azul de metileno. Ao microscópio óptico, aparece roxo.
• Coloração Progressiva - cora-se lentamente até atingir a cor
desejada.

• Coloração Regressiva - faz-se uma hipercoloração e depois

descora-se lentamente até atingir a cor desejada.

• Coloração Negativa - destruímos a estrutura a ser observada e

depois coramos o restante do material.
Ex. RNA destruí-lo com RNAse. Depois cora-se com
Galocianina.
Microscópio
Instrumento projectado
especialmente para poder
apreciar elementos muito
pequenos e que, obviamente,
são praticamente
imperceptiveis para visão
humana.
• Microscópio óptico: consiste em uma
ou mais lentes e permitem obter uma
imagem ampliada do objecto e que
funciona graças a refracção.

• Neste instrumento geralmente usam-se

preparados corados que são observados
por transiluminação.

• Consideram-se no microscópio a parte

óptica e a parte mecânica
MICROSCÓPIO ÓPTICO
Parte mecânica:
• Pé
• Braço
• Tubo ou canhão
• Revólver
• Platina
• “Charriot”
• Parafusos para ajuste do
foco, macrométrico
e/ou micrométrico
MICROSCÓPIO ÓPTICO
Parte óptica:
• Sistema de aumento:
 oculares
 objectivas
• Sistema de iluminação:
 espelho
 condensador
 diafragma
 filtro
 MICROSCÓPIO ÓPTICO
• O factor mais importante para obtenção de uma boa imagem é a
resolução que é a menor distância para que 2 partículas apareçam como
objectos separados.

• Por exemplo: 2 partículas separadas por 0,2 µm aparecerão

individualizadas quando examinadas num sistema óptico com limite
resolutivo de 0,2 µm. Mas se forem examinadas num sistema com limite
resolutivo de 0,5 µm, aparecerão fundidas, como se fossem uma só
partícula, de maior tamanho.

• O limite de resolução dos microscópios ópticos é de cerca de 0,2 m (ou

200 nm ou 2000 Å ), é melhor que o olho humano cerca de 500 vezes.
Não se consegue construir microscópios ópticos com desempenho
melhor que este, pois o factor limitante é o comprimento de onda da luz.

• O microscópio de luz não permite o estudo de detalhes com menos de

0,2 µm
• O que determina a riqueza de detalhes da imagem fornecida por um
sistema óptico é o seu limite resolutivo e não o seu poder de aumentar
os objectos

• A propriedade de aumentar só tem valor prático se for acompanhada por

um aumento paralelo do poder resolutivo. O limite resolutivo depende
essencialmente da objectiva. A ocular apenas aumenta de tamanho a
imagem projectada pela objectiva.

• Uma das características mais importantes de uma objectiva é a sua

abertura numérica (AN), pois o limite resolutivo depende principalmente
dela e do comprimento de onda da luz utilizada.
Observações:

Campo microscópico é a área da preparação que se está observando ao

M.O.. Quanto maior o aumento da imagem, menor é a abrangência do
campo.

Em virtude do último item, sempre ao iniciar a observação ao M.O. usa-

se uma combinação de lentes que proporcione um menor aumento, a fim
de se obter uma visão panorâmica da preparação; depois usa-se uma
combinação de lentes que proporcione um maior aumento, permitindo a
visualização de detalhes do campo microscópico.
 Manuseio
1. Acender a lâmpada do sistema de iluminação.

2. Abrir totalmente o diafragma e colocar o sistema condensador/diafragma na posição

mais elevada, pois é aquela que permite melhor iluminação.

3. Movimentar o revólver, colocando em posição a objectiva de menor aumento.

4. Tomar a lâmina com a lamínula para cima, colocá-la na platina, prendendo-a com os
grampos.

5. Movimentar o “charriot” , fazendo com que o preparado fique em baixo da objectiva.

6. Com o parafuso macrométrico, elevar a platina ao máximo, observando que a objectiva

não toque na lamínula, pois poderá quebrá-la.

7. Focalizar a preparação, quer dizer, obter uma imagem nítida, movimentando o parafuso
macrométrico e abaixando a platina até que se possa visualizar a imagem.
• 8.Aperfeiçoar o foco com o parafuso micrométrico.

• 9.Colocar a região do preparado que se quer ver com maior aumento bem no centro do campo visual da
lente.

• 10.Movimentar o revólver, colocando em posição a objectiva de 10X.

• 11.Repetir o procedimento do item 6.

• 12.Para focalizar a nova imagem, repetir o procedimento do item 7.

• 13.Repetir o item 8.

• 14.Repetir o item 9.

• 15.Colocar a objectiva de 40X em posição e repetir os itens 6, 7 e 8.

OBSERVAÇÕES:

• A maior parte de nossos microscópios possuem lentes parafocais. Isto significa que, uma
vez obtido o foco com a objectiva de menor aumento, basta girar o revólver, colocar a
objectiva 10X em posição e acertar o foco apenas com o parafuso micrométrico.

• Age-se da mesma forma, ao focalizar a objectiva 40X, desde que a imagem esteja em foco
com a objectiva 10X. A objectiva de 100X é chamada de “imersão”

• O aluno deverá repetir várias vezes as operações descritas a partir do item 3, a fim de
atingir maior desenvoltura no manuseio do microscópio óptico.
 MICROSCÓPIO DE FLUORESCÊNCIA
COMUM
• Certas substâncias têm a propriedade
de emitir luz quando excitadas por
radiações de certos comprimentos de
ondas (normalmente
ultravioleta),podendo combinar-se a
substâncias presentes nas células
permitindo a localização de
determinadas estruturas.
• A técnica usa agentes químicos que
emitem luz visível que pode ser verde,
laranja ou vermelho.

• Uma vantagem da microscopia de

fluorescência é que pode ser aplicada a
células vivas para se determinar a
concentração intracelular de íons de
Ca+ e H+ podendo ser utilizado como
forma de monitorar o pH de células
vivas.
 MICROSCÓPIO DE FLUORESCÊNCIA CONFOCAL
• A microscopia de imunofluorescência
tem suas limitações, uma delas é a
superposição de imagens fluorescentes
de moléculas, tornando difícil
determinar o real arranjo molecular
tridimensional.

• O microscópio de fluorescência
confocal evita esse problema
permitindo a visualização da imagem
muito mais precisa.
 MICROSCÓPIO DE FLUORESCÊNCIA CONFOCAL

• Aqui as células são submetidas a

compostos fluorescentes e as
imagens são derivadas da luz
excitatória de um feixe de laser que
serão registradas por uma câmara de
vídeo e armazenadas em um
computador.
 MICROSCÓPIO DE CONTRASTE DE FASE E
INTERFERÊNCIA DE NOMARSKI
• A microscopia de contraste de fase é
especialmente útil no exame da
estrutura e de movimento de organelas
maiores como o núcleo e mitocôndrias
de tecidos vivos, transparentes e não-
corados.

• Ela gera uma imagem com diferentes

graus de obscuridade ou luminosidade.
 MICROSCÓPIO DE CONTRASTE DE FASE E
INTERFERÊNCIA DE NOMARSKI
• A microscopia de interferência de Nomarski, ou diferencial evidencia apenas
os contornos de grandes organelas como o núcleo e o vacúolo.
• As duas técnicas utilizam índices de refracção e difracção para formar uma
imagem.
• Observe que a microscopia de interferência de Nomarski ou diferencial gera
uma imagem parecendo que o espécime está projectando uma sombra para um
dos lados: a sombra basicamente representa uma diferença no índice de
refracção.

• Tanto a microscopia de contraste de fase como a microscopia de interferência

de Nomarski podem ser utilizadas na microscopia de lapso de tempo em que a
mesma célula é fotografada a intervalos regulares ao longo de períodos que
duram várias horas.
• Esse procedimento permite ao observador estudar o movimento celular, desde
que a platina do microscópio possa controlar a temperatura do espécime e o
ambiente.
 MICROSCÓPIO DE POLARIZAÇÃO
• O microscópio de polarização é semelhante a microscópio de luz, acrescido
de dois prismas ou dois discos polaróides, que permitem estudar certos
aspectos da organização molecular dos constituintes celulares.

• Ao atravessar a célula o feixe de luz pode passar por estruturas cristalinas

ou moléculas alongadas e paralelas que dividem o feixe polarizado
denominando as estruturas de birrefringentes ou anisotrópicas.

• As estruturas celulares que não apresentam tal organização não modificam

o plano de polarização da luz e são ditas isotrópicas.

• O microscópio de polarização serve para individualizar a estrutura que se

quer analisar.
MICROSCÓPIO DE POLARIZAÇÃO
 MICROSCÓPIO ELETRÔNICO
O ME consiste basicamente em:
– Canhão electrónico com R fonte de eléctrons (fio
aquecido), que podem ser acelerados em potenciais em
geral de 20 até 100 KV.

– Sistema eléctrico para suprir as tensões e correntes do

aparelho.

– Lentes magnéticas, que são bobinas (fios enrolados)

para produzir um campo magnético actuante sobre os
eléctrons, tendo um efeito semelhante ao de uma lente
comum para a luz.
 MICROSCÓPIO ELETRÔNICO
– Sistema de bombas para produzir
alto vácuo (pressão de cerca de 10-6
atm) e permitir que os eléctrons
migrem pelo tubo do aparelho, além
de evitar a combustão do filamento
pelo oxigénio do ar.

– Tela fluorescente para produzir uma

imagem final visível, quando
atingida pelos eléctrons.
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE TRANSMISSÃO
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE
VARREDURA OU REFLEXÃO
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA
 DIFERENÇAS ENTRE MO E ME
• Ao contrário do MO o ME tem o aumento da lente objectiva fixo, variando
os aumentos graças a modificações da força do campo magnético das lentes
projectoras, que são equivalentes às oculares do MO

• Devido ao facto de serem os electrons facilmente desviados pelo objecto,

torna-se necessário utilizar cortes muito finos de tecido.

• Enquanto no MO a luz é absorvida pelas estruturas coradas no ME os

electrons são desviados por porções do objecto que contenham átomos de
elevado peso atómico. Estas estruturas aparecem escuras na tela
fluorescente e são chamadas de electro-densas
 LIMITAÇÕES DO ME
• O pequeno poder de penetração dos feixes electrónico permite seu uso
apenas em alto vácuo e com cortes muito finos, o que impede a
observação de material vivo.

• Além disso a alta aceleração dos electrons pode danificar o objecto,

promovendo alterações em sua estrutura.
OBSERVAÇÃO DOS CORTES
• Ao estudar um corte histológico ao microscópio, é preciso ter em mente
que a estrutura das células e tecidos está alterada pela técnica
histológica.

• Alguns fixadores, precipitando as proteínas, transformam o

protoplasma, que, in vivo, era um colóide hidrófilo, num precipitado
irregular.

• As etapas da técnica histológica, subsequentes à fixação, também

introduzem algumas modificações nos tecidos.

• Além disso, a delgada espessura dos cortes cria um obstáculo ao estudo

tridimensional dos tecidos e órgãos. Essas estruturas têm três dimensões,
enquanto os cortes, praticamente, têm apenas duas. Para se chegar a
compreender a arquitectura de um órgão ou tecido, torna-se necessário o
estudo de cortes realizados em diferentes direcções.
• Totalidade do tecido
• impossibilidade de se corar diferencialmente todos os
componentes das células e tecidos em um só preparado
• é necessário examinar várias preparações diferentes, cada qual
corada por outro método, e assim obter uma visão completa da
composição e estrutura de um tecido
OBSERVAÇÃO DOS CORTES

• Órgãos pequenos ou partes de órgãos maiores podem ser estudados pelos cortes
seriados, técnica que consiste na obtenção de cortes sucessivo do material em
questão.

• Pelo exame desses cortes, na mesma sequência em que foram feitos, pode-se
seguir uma estrutura e obter informações sobre sua arquitectura em três
dimensões.

• Outra dificuldade encontrada no estudo da histologia decorre do facto de que,

quando se cora um preparado histológico, dependendo da técnica empregada,
apenas alguns aspectos das estruturas teciduais são evidenciados.

• É impossível o preparo de uma lâmina que mostre todos os componentes

celulares e todos os detalhes dos tecidos. É necessário, pois, estudar várias
lâminas, coradas por diferentes métodos, para se ter uma ideia mais complexa
da composição e estrutura do tecido ou órgão em exame.
 Problemas na Interpretação de Cortes
• Artefactos de Técnica:

• Retração produzida pelo fixador, pelo etanol e pelo calor da

parafina usada para inclusão.

• Leva ao aparecimento de espaços artificiais nas células e entre

as células e outros componentes de tecido.
 Artefactos de Técnica
• Os espaços artificiais originam a perda de moléculas não
mantidas correctamente nos tecidos pelo fixador ou retiradas
pelas soluções de desidratação e clareamento.
• Glicogênio e lipídios.
 Artefactos de Técnica
• Pregas do corte:
• Confundidas com capilares sanguíneos

• Precipitados de corantes ou de sujeira:

• Confundidos com grânulos citoplasmáticos
• Duas dimensões e três dimensões
• Quando uma estrutura tridimensional é cortada em secções
muito delgadas, as secções parecem ter somente duas
dimensões: comprimento e largura.
• Conduz o observador a erros se ele não se conscientizar de que
uma esfera seccionada é vista como um círculo e que um tubo
seccionado é visto como um anel
Muito Obrigada!
 Bibliografia
• Junqueira e Carneiro; Histologia Basica; 12a edição.
• Junqueira e Carneiro; Histologia Básica; 13a edição.
• Aulas da Dra. Maria Helena
• Aulas da Dra. Cesaltina