Métodos Laboratoriais

com Reagentes

Marcados

Prof.a Dra. Joana Hygino

 • Métodos laboratoriais com reagentes não
Principais marcados

métodos Interação é visível a olho nu.

laboratoriais • Métodos laboratoriais com reagentes

marcados
empregados na
imunologia Testes marcados com algum corante
fluorescente ou quimioluminescente,
clínica: com radioisótopos ou com enzimas que
geram uma coloração ao final da reação.
Métodos Laboratoriais com Reagentes Marcados

Ensaio
Imunofluo- Radioimuno-
Imunoenzi-
rescência ensaio
mático

Imunocroma- Imuno-
tografia histoquímica
Imunofluorescência
• O desenvolvimento desse teste só foi
possível porque algumas substâncias
são capazes de armazenar energia
luminosa e liberá-la depois, fenômeno
esse conhecido como luminescência;
• Molécula consegue armazenar a luminescência
por longos períodos até sua emissão:
fosforescência;
• Período de emissão mais curto: fluorescência;
• Os corantes fluorescentes mais utilizados são:
rodamina e fluoresceína.
Imunofluorescência
• Após a coloração, as amostras podem ser analisadas ao microscópio óptico de
fluorescência ou no citômetro de fluxo;
• A imunofluorescência representa um grande avanço na imunologia clínica →
permitiu a detecção de substâncias de forma direta, mesmo que em pequenas
concentrações e utilizando pequenas quantidades de corantes fluorescentes;
• É utilizado para o diagnóstico e o acompanhamento de diferentes doenças (ex:
câncer, raiva, toxoplasmose, leishmaniose, leptospirose);
Imunofluorescência

Imunofluorescência Imunofluorescência
Direta Indireta
 • É utilizada para detectar Ags em biópsias de
tecidos, como a presença de células
Imunofluorescência
cancerosas;
Direta
• Consiste no reconhecimento do Ag por Ac
monoclonal conjugado com uma substância
fluorescente;
• A presença de fluorescência indica que a
amostra tem a substância pesquisada;
• A análise por esse método costuma ser
qualitativa.
Esfregaço de sangue com formas
de tripanossoma.
(A) e (B): Amostras de tecido cerebral de pacientes infectados pelo vírus
da raiva.
Imunofluorescência Indireta (IFI)
• Utiliza-se um Ac
secundário conjugado
com o radical
fluorescente;

• Utilizado para pesquisa de

Acs ou de Ags;
 Ensaio Imunoenzimático (ELISA)
• Detecta Ags ou Acs;
• É realizado em microplacas de 96 poços;
• É capaz de apresentar uma sensibilidade
muito similar à do radioimunoensaio, porém,
com a vantagem de não se utilizar elementos
radioativos;
• Consegue detectar quantidades muito
pequenas de Ags ou Acs.
Ensaio Imunoenzimático (ELISA)

• Leitura: Quanto mais intensa a cor

obtida, maior é a concentração da
enzima conjugada e, assim, maior a
concentração da substância na amostra
investigada.
 • Leitura qualitativa: apenas verificando a
Ensaio alteração de cor;
Imunoenzimático • Leitura quantitativa: realizada em
espectrofotômetro;
(ELISA) • Espectrofotômetro: converte as diferentes
intensidades de cor em valores numéricos
(valores de densidade óptica).
Tipos de ELISA

• ELISA Direto

• ELISA Indireto

• ELISA Sanduíche

• ELISA Competitivo
 Pesquisa a presença de Ags;

ELISA É amplamente empregado em testes

imuno-histoquímicos, que buscam
detectar, por exemplo, proteínas,
Direto enzimas, receptores e alterações
celulares em amostras de tecidos
obtidas por biópsia;
 ELISA Direto
• Etapas do método:
✓Tecido ou amostra (com os Ags
pesquisados) é fixado a uma superfície;
✓Em seguida, é adicionado um Ac (específico
para o Ag investigado) conjugado a uma
enzima (fosfatase alcalina ou peroxidase);
✓Ao adicionar o substrato da enzima, tem-se
uma coloração.
 • É utilizado para pesquisar a concentração de
Acs presentes em uma amostra de soro ou
ELISA plasma;

• É empregado no diagnóstico de doenças

Indireto infectocontagiosas como infecção pelo HIV e
doença de Chagas;
 ELISA Indireto
• Etapas do método:
✓Os Ags (reagentes) são imobilizados na fase
sólida (placa de ELISA);
✓Adição da amostra biológica (soro ou plasma);
✓Adição do Ac secundário (especificidade para
porção Fc da imunoglobulina humana)
conjugado à enzima (fosfatase alcalina ou
peroxidase);
✓Ao adicionar o substrato da enzima, tem-se uma
coloração.
ELISA Sanduíche

• É utilizado na pesquisa de Ags solúveis em uma amostra biológica;

• Esse método é empregado no teste de gravidez para detecção do

βhCG no soro (≠ método de detecção na urina → Inibição da
aglutinação – partículas de látex).
 ELISA
Sanduíche
• Etapas do método:
✓Placa é sensibilizada com o Ac de captura;
✓Adição da amostra biológica contendo o Ag;
✓Em seguida, é adicionado o Ac secundário conjugado à
enzima (fosfatase alcalina ou peroxidase);
✓A reação é revelada com a adição do substrato da
enzima.
 • É utilizado para a pesquisa de Ags nas amostras
pela competição com Ags conjugados à enzima;
• Etapas do método:
✓A placa é sensibilizada com o Ac de captura;

ELISA
✓Em seguida, são adicionados ao mesmo tempo a
Competitivo amostra em investigação e quantidades fixas de Ags
conjugados;

+
 ✓Ambos competirão pela ligação ao Ac, que se liga
àquela molécula que estiver em maior
concentração;

✓Após a adição do substrato da enzima, a interação

ELISA Ac de captura e Ag marcado gera uma cor;

Competitivo

• Leitura: Quanto maior a intensidade de coloração,

mais Ags conjugados estão ligados e menor é a
concentração de Ags na amostra.
 Radioimunoensaio (RIA)
• Em 1956, foi desenvolvida a técnica radioimunoensaio (RIA) para a detecção da
insulina, a primeira metodologia padronizada que utiliza reagentes marcados
para a detecção de moléculas na ordem de nano e picogramas;
• O RIA é semelhante ao ELISA competitivo, mas utiliza substâncias marcadas com
radioisótopo;
• Os radioisótopos mais empregados são:iodo-125 (dosagem de hormônios
proteicos), trítio (3H) (dosagem de esteroides), carbono 14;
• Esse teste é amplamente empregado para dosar catecolaminas (adrenalina,
noradrenalina e dopamina), hormônios, drogas, vitaminas, IgE, bem como
verificar a presença de vírus como o da hepatite B e a presença de alguns
marcadores tumorais.
 Radioimunoensaio (RIA)
• A detecção de Ags ou Acs ocorre por meio da competição pelo sítio de ligação
entre a substância marcada com radioisótopo e a substância que se deseja
analisar;
• Os Ags ou Acs são adicionados à fase sólida e acrescentados às moléculas
marcadas com radioisótopo junto com a amostra do paciente.
 Radioimunoensaio (RIA)
• Leitura e quantificação:
✓A quantificação é realizada em aparelho
específico para a detecção da
radioatividade (leitor radiométrico);
✓Quanto maior for a leitura da
radioatividade, maior a formação de
imunocomplexos com a substância
marcada e menor é a concentração do
Ag ou Ac investigado.
 • Realizam a detecção da interação Ag-Ac pela
difusão cromatográfica, em que o complexo
formado gera uma cor e, a partir dele, pode-se
detectar Ags ou Acs;

• Os testes rápidos são um exemplo clássico de

Imunocromatografia
imunocromatografia e são muito utilizados
para teste de gravidez e para a detecção de
várias doenças infectocontagiosas, como:
infecção pelo HIV, Hepatite B, Hepatite C,
COVID-19, Sífilis e Dengue.
 Imunocromatografia
• Vantagens:
✓Fácil execução e baixo custo;
✓Confere resultados rápidos (até 30 min);
✓Dispensa equipamentos;
✓Pode ser realizada em diferentes amostras, como soro, plasma, sangue total,
saliva, swab de nasofaringe e orofaringe, urina e fezes;
✓Assistência ao paciente numa única consulta;
✓Dispensa transporte e coleta de sangue venoso;
✓Prevenção da transmissão vertical ou horizontal (mãe-feto);
✓Promoção do acolhimento imediato do paciente.
 Testes Rápidos
Imunocromatografia de Fluxo Lateral
• O sistema:
✓ É realizado em um cassete;
✓ Contém uma matriz de membrana porosa de nitrocelulose ou de
náilon, coberta por uma membrana absorvente de fibra de vidro
(acetato) transparente para facilitar a visualização do teste;
✓ Envolvendo as membranas, há um dispositivo plástico que contém
os locais de aplicação das amostras e verificação dos resultados.
 Testes rápidos
Imunocromatografia de Fluxo Lateral

• Fase sólida (membrana porosa): onde ocorre a interação Ag-Ac e onde

estão presentes os elementos de captura (Ags ou Acs específicos) fixados na
membrana;
• Fase móvel: deslocamento das substâncias por capilaridade.
 Teste Rápido: Princípio
• Para a detecção de Ags, a amostra é colocada em uma região predeterminada da
membrana;
• Nessa área, estão presentes Acs conjugados com ouro coloidal (coloraçãorosa)
ou com prata coloidal (azul marinho), que será responsável pela revelação da
interação Ag-Ac;
• Após aplicação, a amostra migra em direção às regiões teste (T) e controle (C);
• Caso haja reconhecimento entre o Ag-Ac conjugado, esse complexo será retido
pela ligação com os Acs secundários presentes na região T, que reconhecem os
epítopos do Ag em investigação e geram uma linha colorida.
 Teste Rápido: Princípio

• Caso não haja interação, essa linha colorida não aparecerá;

• Após a região teste, há a região controle, com Acs anti-IgG que são capazes de se
ligar a todos os Acs livres presentes na amostra;

• O aparecimento da linha controle é essencial (indica que houve migração da

amostra e deve estar presente nos resultados positivos e negativos);

• O não aparecimento da linha controle invalida o teste.

Teste Rápido:
Princípio
Detecção do antígeno HBs-Ag do vírus da Hepatite B
Detecção do antígeno NS1 do vírus da Dengue
Teste de Gravidez (detecção de hCG na urina)
Testes Rápidos:
Leitura
 Imuno-histoquímica (IHQ)
• É uma técnica que combina imunologia, histologia e química;
• Tem como finalidade o reconhecimento de proteínas de alta afinidade
durante os exames histopatológicos;
• É empregado em cortes de tecidos obtidos após a biópsia para detecção:
✓De doenças degenerativas ou parasitárias;
✓Identificação de substâncias;
✓Análise de estruturas dos tecidos normais e alteradas durante a evolução
de determinada doença;
• Normalmente, em sistemas reveladores na IHQ, são utilizadas reações
enzimáticas, gerando uma coloração marrom-ferruginosa.
• Direta:
Imuno-
✓Ac primário marcado;
✓Os cortes histológicos, em lâmina, são histoquímica
colocados em contato com os Acs
primários e, após a incubação, é (HIQ):
realizada a leitura em microscópio;
• Indireta: Técnicas
✓Uso de Ac primário não marcado e de
um Ac secundário marcado.
Câncer Colorretal Melanoma
Mas e a imunidade celular?
Quais são as técnicas que avaliam in vitro ou
in vivo esse tipo de imunidade?

• In vitro:

✓Ensaio de Linfoproliferação e Citometria de Fluxo

• In vivo:

✓Teste de Hipersensibilidade Celular Cutânea Tardia

 Citometria de Fluxo

• Uso de Ac monoclonais específicos ligados a fluorocromos para as estruturas (de

membrana celular ou intracelulares) a serem analisadas;
• Equipamento utilizado para leitura: Citômetro de Fluxo;
• Há citômetros capazes de realizar a leitura de 30 fluorocromos
simultaneamente;
• Para realizar tal técnica, a amostra precisa estar em suspensão;
• Os reagentes são caros e os profissionais que analisam os dados precisam ter
bastante experiência.
Citometria de Fluxo: Princípio

Fluxo da
Complexidade
Célula
celular

Tamanho

Intensidade da
Fluorescência
 Citometria de Fluxo: Aplicabilidade
• Contagem celular;
• Identificação do tipo celular (fenotipagem celular);
• Estado de maturação celular;
• Ciclo celular, viabilidade e proliferação;
• Função (ex: produção de citocinas);
• Diagnóstico de doenças hematológicas (ex: leucemia, mieloma, linfoma,
imunodeficiências primárias);
• Monitorar a eficácia de tratamentos (ex: razão de células CD4/CD8 em
pacientes HIV+; análise de fenótipo de células imunes de pacientes com
doenças autoimunes ou com determinado câncer hematológico, ambos sob
tratamento).
 +/- +/+
Citometria de
Fluxo:
Análise dos Dados
-/- -/+
 Citometria de Fluxo: Análise dos Dados

CD8

CD4 Análise de Proliferação Celular