Ensaio Imunoenzimático

ELISA
Júlia, Lucas B, Natacha e Renan
TÓPICOS
1 INTRODUÇÃO

2 REVISÃO SOBRE ANTICORPOS

3 ELISA DIRETO

4 ELISA INDIRETO

5 ELISA SANDUÍCHE

6 ELISA COMPETITIVO
 1

INTRODUÇÃO
ASPECTOS HISTÓRICOS 1 INTRODUÇÃO

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

(ELISA)
Inventado por Eva Engvall e Peter
Perlmann
Modificação do radioimunoensaio (iodo
radioativo 125).
Determinação dos níveis de IgG em soro
de coelho e HCG em urina humana
Uso de anticorpos para detecção de Eva Engvall Peter Perlmann
antígenos ou anticorpos em amostras
Possui diversas variações
ALHAJI, M.; ZUBAIR, M.; FARHANA, A.; Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay (ELISA). PubMed. 23, abril 2023.
 2

REVISÃO SOBRE
ANTICORPOS
 REVISÃO SOBRE
2
DEFINIÇÃO ANTICORPOS

Proteínas plasmáticas pertencentes à fração

gamaglobulina e que são produzidas por células
B efetoras (plasmócitos) determinando a
imunidade humoral.

Funções
Neutralização de patógenos e toxinas;
Ativação do Sistema de Complemento;
Opsonização de patógenos
Citotoxicidade celular dependente de
anticorpo
ESTRUTURA
REVISÃO SOBRE
2 ANTICORPOS
 3

ELISA DIRETO
 LUCAS
ELISA DIRETO
A técnica ELISA direto consiste na impregnação do
antígeno na placa e, em seguida, a adição de um
anticorpo primário ligado a uma enzima que se ligará
ao antígeno diretamente, marcando ele, e um
substrato cromógeno que sofrerá catálise pela
enzima associada, alterando a coloração da solução
resultante devido aos produtos formados.

Um leitor de coloração (espectrofotômetro) é

utilizado para estimar, por meio da intensidade
da cor, a quantidade do antígeno/anticorpo
analisado na amostra
ABCAM. ELISA guide: everything you need to perform your ELISA experiments.
RAMIREZ, A. Teste ELISA como ferramenta de diagnóstico (1/2): Princípios básicos.
 LUCAS
PROCEDIMENTO

PASSO 01

Adição da amostra aos poços da placa

PROCEDIMENTO LUCAS
 LUCAS
PROCEDIMENTO
PASSO 02
Revestimento de antígenos nas placas de ELISA

Incubar a 37 °C por uma hora

Lavar as placas usando agentes como BSA,

ovalbumina, aprotinina ou outras proteínas animais
PROCEDIMENTO LUCAS
 LUCAS
PROCEDIMENTO
PASSO 03
anticorpo de detecção primária liga-se diretamente à proteína de
interesse

placa é lavada novamente para remover quaisquer anticorpos não

ligados
PROCEDIMENTO LUCAS
 LUCAS
PROCEDIMENTO
PASSO 04
Um substrato cromóforo para a fosfatase alcalina (AP) ou peroxidase
de rábano (HRP), é adicionado à placa

resulta em uma mudança de cor

ocorre pela hidrólise dos grupos fosfato do substrato pelo AP ou pela

oxidação dos substratos pelo HRP
PROCEDIMENTO LUCAS
 LUCAS
PROCEDIMENTO

PASSO 05
Um leitor de coloração (espectrofotômetro) é utilizado para estimar, por meio da
intensidade da cor, a quantidade do antígeno/anticorpo analisado na amostra
 LUCAS
PROCEDIMENTO
 LUCAS
EMPREGO
Detectar a presença de um patógeno alvo através da detecção de

proteína/antígeno do patógeno alvo.

Detectar a presença de anticorpos contra patógenos específicos.

Determinar o tempo de infecção (mudança no nível de anticorpos) ao

longo do tempo.

Determinar o estado de vacinação de um indivíduo.

RAMIREZ, A. Teste ELISA como ferramenta de diagnóstico (1/2): Princípios básicos.


VANTAGENS
Elevada sensibilidade
Elevada especificidade
Rapidez e baixo custo
Objetividade de leitura
Possibilidade de adaptação a
diferentes graus de automação
LUCAS
x DESVANTAGENS
Necessidade de mão de obra
especializada
Necessidade de conhecimento acerca
dos produtos utilizados
Viéses de aferição associados a erros
de pipetagem, variações no tempo de
incubação e lavagens, dentre outros.
RAMIREZ, A. Teste ELISA como ferramenta de diagnóstico (1/2): Princípios básicos.
ANIMAÇÃO DEMONSTRATIVA
 4

ELISA
INDIRETO
Elisa Indireto JÚLIA
Ag é aderido a um suporte sólido para
a detecção de Ac presentes em soros teste

Utiliza de dois anticorpos: Primário e secundário

Elisa Indireto - Método JÚLIA
A doença de Chagas (ou Tripanossomíase americana)
é a infecção causada pelo protozoário Trypanosoma
cruzi

BRASIL. Ministério da Saúde.

Elisa Indireto - Método JÚLIA
Método - Etapa 1 JÚLIA

Fase sólida

Ag purificados aderidos aos poços da placa de

poliestireno
Método - Etapa 2 JÚLIA

Adição da amostra sorológica - Ac primário

Ligação dos anticorpos específicos aos antígenos

aderidos
Método - Etapa 3 JÚLIA
Adição do conjugado - Ac secundário

Anti-anticorpo + Enzima
Interação entre conjugado e anticorpo da amostra
Método - Etapa 4 JÚLIA

Adição do substrato e do cromógeno

substância que tem a capacidade de produzir cor
quando submetida a uma reação
Método - Etapa 5 JÚLIA
A ação da enzima no substrato é revelada pelo
cromógeno, que sofre um processo de oxidação
dando origem a um produto com cor na amostra
reagente. A cor varia de acordo com o tipo de
cromógeno utilizado
Método - Etapa 5 JÚLIA
A cor resultante da ação da enzima deve ser lida
em espectrofotômetro
Elisa Indireto - Resultado JÚLIA

O resultado de uma reação é definido pela leitura da

absorbância ou densidade ótica (DO) em
espectrofotômetro, utilizando um filtro com
comprimento de onda indicado pelo fabricante do
conjunto diagnóstico

Kit teste Erbalisa

Elisa Indireto - Resultado JÚLIA
Usualmente, cada conjunto tem sua forma de
calcular o ponto de corte (cut-offCO), acima (+) ou
abaixo (-) do qual as amostras são consideradas
reagentes, não reagentes ou indeterminadas
As amostras indeterminadas são aquelas cujos
valores de DO estão incluídos na zona cinza
(borderline). A zona cinza compreende a faixa de
valores em torno do cut-off, dentro da qual não se
pode ter certeza do resultado
Elisa Indireto - Emprego JÚLIA

No cotidiano esse teste é muito usado para as

doenças infecto contagiosas como a doença de
chagas, doença na qual é fundamental o diagnóstico
precoce com a finalidade de evitar complicações.
 5

ELISA
COMPETITIVO
 RENAN

ELISA
COMPETITIVO
A técnica ELISA por competição consiste
em um teste em que a presença de
antígenos em determinado soro é revelada
pela competição com um antígeno
marcado por um anticorpo específico.
 RENAN
Vantagens e Desvantagens
Vantagens:

Alta sensibilidade para pequenos antígenos;

Útil para amostras complexas;
Pode detectar antígenos em concentrações muito baixas;
Ideal para antígenos com apenas um epítopo disponível.

Desvantagens:

Menor especificidade em comparação com outras formas de ELISA;

Sensibilidade pode ser afetada em amostras muito diluídas;
Quantificação pode ser desafiadora devido à natureza inversa do sinal.
 RENAN
EXPLICAÇÃO DO TESTE

Placa sensibilizada com anticorpos

específicos para doença que
queremos testar.
EXPLICAÇÃO DO TESTE RENAN

A amostra do paciente é inserida e, caso a

amostra tenha antígenos para esse
anticorpo, veremos a ligação antígeno-
anticorpo nos sítios de ligação.
EXPLICAÇÃO DO TESTE RENAN

Após a etapa anterior, será adicionado um antígeno teste

com uma enzima conjugada. O antígeno teste se ligará nos
sítios de ligação onde não houve ligação.

Ele vai competir de maneira específica pelos sítios de

ligação.
 EXPLICAÇÃO DO TESTE RENAN

Como resultado haverá cor

Substrato é adicionado que na
mais forte quando o
presença da enzima gera
antígeno conjugado ocupou
alteração de cor
mais sítios de ligação
 6

ELISA
SANDUÍCHE
 NATACHA
ELISA SANDUÍCHE
Características
do teste
Objetivo
Detecção simultânea de
Utilização de antígenos recombinantes ou imunoglobulinas de diferentes
peptídeos sintéticos na fase sólida ou sub classes
conjugada.

O ensaio mais sensível e específico, pois os anticorpos

anti-HIV (IgG, IgM e IgA) passaram a ser detectadas.
Redução do período de janela imunológica.
 NATACHA
PROCEDIMENTO

Passo 1 Passo 2 Passo 3

Adição de anticorpo de Lavagem para a retirada dos Adição da amostra com os
captura à placa anticorpos livres antígenos alvo que irão se
ligar aos anticorpos de
captura

PROCEDIMENTO
Passo 4
IV. Lavagem para retirar os
antígenos não capturados.
NATACHA
Passo 5 Passo 6
V. Adição do conjugado VI. Outra lavagem é feita
específico para o antígeno, para retirar os conjugados
nesse caso, a solução de que ficaram livres.
proteínas recombinantes e
peptídeos sintéticos do
HIV-1 e grupo O e HIV-2,
conjugadas com 1 enzima.
 NATACHA
PROCEDIMENTO

Passo 4 Passo 5 Passo 6

Lavagem para retirar os Adição do conjugado Outra lavagem é feita para
antígenos não capturados. específico para o antígeno, retirar os conjugados que
nesse caso, a solução de ficaram livres.
proteínas recombinantes e
peptídeos sintéticos do
HIV-1 e grupo O e HIV-2,
conjugadas com 1 enzima.
 NATACHA
PROCEDIMENTO

Passo 7 Passo 8
O cromógeno e o substrato Espectrofotômetro: medir a
(peróxido de hidrogênio + absorvância da luz e a
peroxidase) são intensidade é de acordo com a
adicionados, quando há a quantidade de antígeno-
oxidação do cromógeno anticorpo na amostra, o que
pela enzima, resultando em fornece quantidadade de
uma mudança de cor antígeno/anticorpo.
 NATACHA

VANTAGENS x DESVANTAGENS
Alta sensibilidade Custo e tempo
Alta especificidade Possibilidade de erros durante os

Baixa interferência procedimentos e análise dos dados

Não há como ter certeza de que o
Objetividade de leitura
anticorpo coordenado por enzimas
Possibilita a quantificação e é
secundárias se liga apenas ao anticorpo
adaptável
de detecção e não ao anticorpo de
captura ligado à placa.
RAMIREZ, A. Teste ELISA como ferramenta de diagnóstico (1/2): Princípios básicos.
 NATACHA
EMPREGO

Infecções virais: HIV, hepatite B

e C, herpes;
Doenças autoimunes: agentes
infecciosos bacterianos,
parasitários ou fúngicos
Doenças endócrinas: hormônios
Alergias
Agradecemos
pela atenção!
 REFERÊNCIAS
RAMIREZ, A. Teste ELISA como ferramenta de diagnóstico (1/2): Princípios básicos. 3tr3:
comunidade profissional de suinocultura, 2022. Disponível em:
<https://www.3tres3.com.br/artigos/elisa-como-ferramenta-de-diagnostico-1-2-principios-
basicos_2575/>. Acesso em: 02, nov. de 2023.
ABCAM. ELISA guide: everything you need to perform your ELISA experiments. Disponível em:
<https://www.abcam.com/protocols/the-complete-elisa-guide?
gclsrc=aw.ds&gad_source=1&gclid=Cj0KCQiAr8eqBhD3ARIsAIe-buP-
Zi636mcjTZ89cw5CZfQQ1y0LvsmmzxMDVHgRY7It9duX4RnHfncaAgSEEALw_wcB&gclsrc=aw.ds
>. Acesso em 13, nov. 2023.
ALHAJI, M.; ZUBAIR, M.; FARHANA, A.; Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). PubMed. 23,
abril 2023. Disponível em: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK555922/>. Acesso em: 13, nov.
2023.
Doença de Chagas – Triagem e diagnóstico sorológico em unidades hemoterápicas e laboratórios
de saúde público. – Brasília: Ministério da Saúde, Coordenação Nacional de Doenças Sexualmente
Transmissíveis e Aids. 1998. 76. p. : il (Série TELELAB)
FRANCO, Victor Luiz de Matos et al. A técnica de elisa e a sua importância para o diagnóstico clinico.
Brazilian Journal of Development, [S. l.], p. 89877-89885, 1 set. 2021. DOI 10.34117/bjdv7n9-243.
Disponível em: https://ojs.brazilianjournals.com.br/ojs/index.php/BRJD/article/view/35988/pdf.
Acesso em: 14 nov. 2023.
SCIENCO. Você sabe a diferença entre teste de ELISA direto e indireto?. [S. l.]. Disponível em:
https://www.scienco.bio.br/voce-sabe-a-diferenca-entre-teste-de-elisa-direto-e-indireto/. Acesso
em: 14 nov. 2023.
 REFERÊNCIAS
JoVE. Elisa assays: indirect, sandwich, and competitive. [S.l.], [s.d.]. Disponível em:
https://www.jove.com/v/10496/elisa-assays-indirect-sandwich-and-competitive?
language=Portuguese. Acesso em: 5 Nov. 2023

IBAP Cursos. Teste de ELISA Imunoenzimático: como é feito, quais doenças detecta e quais os
tipos. IBAPCursos, [s.d.]. Disponível em: https://ibapcursos.com.br/teste-de-elisa-
imunoenzimatico-como-e-feito-quais-doencas-detecta-e-quais-os-tipos/#google_vignette.
Acesso em: 5 Nov. 2023