Universidade Estadual de Goiás

UnUCET

Imunoensaios utilizando
conjugados

Imunologia Clínica
Profa Elisa Flávia Bailão
 IMUNOENSAIOS UTILIZANDO CONJUGADOS
¢  Ainteração Ag-Ac nem sempre é evidenciada por um
fenômeno visível;
¢  Conjugados: moléculas ligadas covalentemente aos
compostos ligantes;
¢  Asmoléculas conjugadas mantêm as propriedades
funcionais de ambas;
¢  As técnicas podem diferir quanto:
¢  Ligante ou marcador;
¢  Sistema de revelação do ligante;
¢  Molécula conjugada ao ligante;
¢  Meio onde ocorre o ensaio imunológico.
 IMUNOENSAIOS UTILIZANDO CONJUGADOS
¢  A molécula conjugada pode ser uma proteína,
antígenos, imunoglobulinas ou haptenos;
¢  Os testes podem ser realizados em fase sólida
(sistema heterogêneo) ou em meio líquido
(sistema homogêneo).
IMUNOENSAIOS UTILIZANDO CONJUGADOS
¢  Ligantes e sistemas de revelação ou medida:

¢  Radioisótopos;

¢  Fluorocromos;

¢  Substâncias luminescentes biológicas ou químicas;

¢  Enzimas com substratos cromogênicos;
¢  Enzimas com substratos fluorigênicos;
¢  Enzimas com substratos luminescentes.
 IMUNOFLUORESCÊNCIA
¢  Sãoempregados conjugados constituídos de
anticorpos ou antígenos ligados covalentemente a
moléculas reveladoras denominadas fluorocromos;
¢  Equipamentoscom detector de fluorescência podem
medir a emissão de luz em variados comprimentos
de onda.
 IMUNOFLUORESCÊNCIA
¢  F l u o r o i m u n o e n s a i o :
antígeno ou anti-
imunoglobulina marcados para a pesquisa de
anticorpos na amostra;
¢  Imunofluorimetria: anticorpo marcado para a
pesquisa e dosagem de moléculas antigênicas na
amostra;
¢  Testes de imunofluorescência: antígenos
particulados que devem ser visualizados por
microscopia.
 IMUNOFLUORESCÊNCIA
¢  Direta: detecção do antígeno diretamente em
células ou tecidos, utilizando um anticorpo específico
marcado com fluorocromo;
¢  Limitação: necessidade de um conjugado para cada
antígeno;
 IMUNOFLUORESCÊNCIA
¢  Indireta: utiliza um
anti-anticorpo marcado
para a detecção de um
anticorpo que se fixou a
antígenos;
¢  Vantagem?
 RADIOIMUNOENSAIO (RIA)
¢  É capaz de detectar e quantificar substâncias
presentes em amostras com limite de detecção da
ordem de picogramas;
¢  Ensaio com antígeno marcado do tipo competitivo;
¢  O 125Ié comumente empregado à liga-se facilmente
a resíduos de tirosina das proteínas;
¢  A quantificação do componente pesquisado é
determinada pela contagem do material radioativo
presente na reação.
RADIOIMUNOENSAIO (RIA)
 ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS
¢  Permitem medidas quantitativas diretas da
interação antígeno-anticorpo por medida de
atividade enzimática sobre um substrato;
¢  Comparável sensibilidade ao RIA;
¢  A enzima utilizada neste ensaio deve apresentar:
¢  Elevada atividade específica;
¢  Facilidade de obtenção na forma purificada;
¢  Conjugação fácil a Ag, Ac ou haptenos;
¢  Produto da reação de fácil quantificação;
¢  Estabilidade e custo acessível.
 ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS
¢  Ossubstratos cromogênicos devem ser estáveis,
atóxicos, de baixo custo e produzir uma substância
solúvel de cor mensurável;
¢  Ensaios homogêneos: não apresenta etapas de
lavagem;
¢  Ensaios
heterogêneos: são necessárias etapas de
lavagem que retiram os componentes não-ligados e
uma fase sólida na qual vão sendo fixados os
componentes que participam da interação.
 ELISA
¢  Imobilizaçãode um dos componentes, antígeno ou
anticorpo, em fase sólida, e na utilização de um
conjugado, que também pode ser antígeno ou
imunoglobulina, ligado a uma enzima;
¢  Osubstrato da enzima forma um produto colorido à
a alteração de cor é monitorada por
espectrofotometria;
¢  Apresenta elevada sensibilidade e especificidade;
¢  Rapidez e baixo custo;
¢  Objetividade de leitura;
¢  Pode ser automatizada.
 ELISA
¢  Fase sólida ou suporte: poliestireno.
 ELISA
¢  Leitora de microplacas do tipo ELISA:
 ELISA
¢  Amostra: soro ou plasma;
¢  Deve ser límpida, sem hemólise e não-lipêmica;
¢  Pode ser conservada até sete dias entre 2 e 8 oC;
¢  Bloqueio: utilização de proteína para bloquear os
sítios reativos remanescentes na fase sólida após a
adsorção da molécula (Ag ou Ac);
¢  Diluenteda amostra: deve conter componentes
que reduzam a adsorção inespecífica de componentes
da amostra ao suporte sólido;
¢  Soluçãode lavagem: isotônica, pH ~ 7,0, contendo
pequena concentração de detergente não iônico.
 ELISA
¢  Conjugado:duas moléculas covalentemente ligadas
que preservam suas funções originais;
¢  ProteínaA conjugada com peroxidase: liga-se à
região Fc da IgG humana à produto colorido;
¢  Streptavidina-peroxidase: liga-se à biotina;
¢  Anti-IgG
conjugada a corante coloidal: formação de
manchas coloridas na fase sólida.
 ELISA
¢  Substrato cromogênico: são moléculas que sob
ação enzimática originam produtos coloridos,
solúveis ou não à quantificação por
espectrofotometria ou pela intensidade de cor visual;
 ELISA - RESULTADO
¢  Cutoff: limite de reatividade da amostra que
permite diferenciar amostras positivas daquelas
negativas;
¢  Método proporcional: Razão entre os valores da
amostra e um valor médio de um grupo de amostras
de indivíduos não-doentes (grupo controle);
¢  Curva de unidade padrão: os valores obtidos são
transformados em unidades que fornecem uma
escala contínua proporcional à quantidade de
anticorpo presente na amostra.
 ELISA

Amostra
 ELISA
¢  Sistema avidina-biotina: amplificação do sinal;
 IMMUNOBLOT OU WESTERN BLOTTING
¢  Eletroforese: aplicação de um campo elétrico;
 IMMUNOBLOT OU WESTERN BLOTTING
¢  Eletrotransferência: proteínas migram para uma
membrana;
 IMMUNOBLOT OU WESTERN BLOTTING
¢  Immunoblot: ensaio imunoenzimático realizado na
superfície da membrana;
 IMMUNOBLOT OU WESTERN BLOTTING
¢  Immunoblot: ensaio imunoenzimático realizado na
superfície da membrana;
TESTES RÁPIDOS (REMOTOS)

Ac anti-Ag pesquisado conjugado à

corante
Ac anti-Ag pesquisado imobilizado

Ac anti-Ig humana
TESTES RÁPIDOS (REMOTOS)
 TESTES RÁPIDOS (REMOTOS)
Reagente Não Reagente

Inválido
TESTES RÁPIDOS (REMOTOS)
DÚVIDAS???