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Radioimunoensaio Conceito: Marcao da molcula biolgica com istopos radioativos.

s. Alta especificidade e afinidade (deteco na ordem de picogramas) Amostras diretamente do lquido biolgico com volume reduzido.

A importncia desse mtodo reside, de um lado, em permitir a dosagem de pequenas quantidades de determinada substncia, da ordem de at nano e picogramas, na presena de elevadas concentraes de muitas outras, como ocorre na corrente sangnea e nos extratos. Por outro lado, a determinao qualitativa das substncias altamente especifica, decorrente do carter imunolgico da reao. Portanto, as caractersticas principais do RIE, sua sensibilidade, especificidade e preciso elevadas, aliadas a sua praticabilidade para ensaiar convenientemente grande nmero de amostras biolgicas permitiram seu rpido desenvolvimento e seu amplo emprego nos ltimos 30 anos. O principio do RIE baseia-se na competio entre determinado antgeno marcado isotopicamente (traador) e o mesmo antgeno no marcado (padro ou desconhecido) pelos stios de ligao de seus anticorpos especficos, formando um complexo antgeno-anticorpo (Figura 1). Como no sistema de RIE as quantidades de traador e de anticorpo so mantidas constantes, constroem-se curvas de calibrao adicionando-se ao sistema quantidades variveis e conhecidas de antgeno padro. Conseqentemente, a proporo de complexo radioativo formado (antigeno marcadoanticorpo) inversamente proporcional quantidade de antgeno no marcado. Dessa forma, a concentrao de um determinado antgeno determinada em amostras de extratos ou fluidos biolgicos (soro, plasma, urina, etc.) pela leitura direta na curva de calibrao, obtida pela incubao simultnea das amostras e dos padres com o traador e o anticorpo especifico. Compara-se, portanto, o efeito inibitrio do antgeno presente na amostra ensaiada na ligao do traador ao anticorpo especifico, com o mesmo efeito inibitrio dos padres conhecidos. Segundo Catalani, essa tcnica tem perdido terreno gradativamente nos ltimos 20 anos para o uso dos enzimaimunoensaios. "Houve um avano grande durante muito tempo dos radioimunoensaios, inclusive com a facilitao do trabalho. Porm, essa tcnica muito cara, por vrios aspectos, como a produo e descarte do radioistopo, o uso de aparato especial de segurana para o laboratrio, normas trabalhistas a serem observadas, entre outros fatores." Utilizao do radioimunoensaio aplicado para determinar: Hormnio de crescimento Hormnio luteinizante (LH) Gonadotrofina corinica (GH) Testosterona Imunoglobulinas Hormnios tireoidianos (T3, T4) Marcadores tumorais Antgenos virais Drogas Alrgicos Doenas parasitrias

O radioimunoensaio pode ser utilizado para quantificar hormnios, drogas, marcadores tumorais, alrgenos e anticorpos e antgenos em doenas parasitrias. H muitas variaes, mas o princpio o mesmo: a quantidade de reagente marcado (antgeno ou anticorpo) quantifica o antgeno ou anticorpo no-marcado na amostra. Histrico

1934, Clarck e Collip- relataram a presena de anticorpos 1959, Yallow e Berson 1960 utilizaram para quantificar insulina Ekins na Inglaterra desenvolveu tcnica similar usando protenas carreadoras A partir dos 1960 grande disseminao Princpios bsicos A quantidade de reagente marcado (antgeno ou anticorpo) quantifica o antgeno ou anticorpo nomarcado na amostra. Reao de competio de uma substncia a ser determinada e da mesma substncia marcada, radioisotopicamente, por um receptor especfico comum a ambas.

Radioimunoensaio Direto No radioimunoensaio direto, uma quantidade fixa e limitada de anticorpo ligada a um suporte slido. Adiciona-se uma quantidade fixa e pequena de antgeno marcado, misturada com uma amostra em teste ou com as solues padro que contm concentraes conhecidas do antgeno no-marcado. Aps um perodo de incubao, remove-se o antgeno no ligado e faz-se a medida da radioatividade da fase slida. A partir da resposta obtida, a concentrao do antgeno em teste estimada por interpolao na curva. Radioimunoensaio de competio No radioimunoensaio de competio, uma quantidade fixa do antgeno imobilizada em um suporte slido. Adiciona-se uma quantidade fixa de anticorpo marcado especfico, misturada com a amostra em teste ou uma srie de solues padro com concentraes variadas do antgeno solvel. Aps um perodo de incubao, o anticorpo marcado que no se ligou fase slida e o antgeno solvel so removidos por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase slida. A partir da resposta obtida, a concentrao do antgeno em teste estimada por interpolao na curva. Radioimunoensaio de captura No radioimunoensaio de captura, uma quantidade fixa de anticorpo imobilizada em um suporte. A soluo teste, com quantidade desconhecida de antgeno, ou as solues padro, com concentraes conhecidas do antgeno so adicionadas. Aps a incubao, remove-se o antgeno no-ligado e adicionam-se anticorpos marcados especficos para o antgeno, com stio de ligao diferente do stio do anticorpo de fase slida. O anticorpo marcado no-ligado removido por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase slida. A partir da resposta obtida, a concentrao do antgeno em teste estimada por interpolao na curva. TCNICAS IMUNOENZIMTICAS As tcnicas imunoenzimticas so baseadas na utilizao de antgenos ou anticorpos marcados com enzimas e permitem a deteco, titulao e quantificao de substancias de interesse biolgico. Imunoperoxidase As tcnicas para localizao de constituintes celulares seguem o mesmo princpio da imunofluorescncia, com a diferena de que, em vez do fluorocromo, emprega-se a enzima, que tem maior capacidade de amplificao. A enzima converte o componente cromgeno (substrato+doador de hidrognios) em produto insolvel que precipita no stio da reao. Esses precipitados podem ser visveis ao microscpio eletrnico. Enzimaimunoensaio

O enzimaimunoensaio um mtodo quantitativo em que a reao antgeno-anticorpo monitorada por medida da atividade enzimtica. Desempenha um papel muito importante no laboratrio clnico, pois, alm da elevada sensibilidade comparvel do radioimunoensaio, apresenta vantagens de utilizar reagentes estveis, estar livre das exigncias de trabalhar com radioistopos e poder ser adaptado tanto a testes simples como automao sofisticada. Uma caracterstica comum entre radioimunoensaio e enzimaimunoensaio que ambos medem, diretamente, a interao entre o antgeno e o anticorpo, no dependendo de um segundo fenmeno como precipitao, aglutinao ou fixao de complemento. O enzimaimunoensaio foi classificado em dois tipos: homogneo e heterogneo. Nos ensaios homogneos no necessria a separao entre os complexos antgeno-anticorpo e o antgeno e/ou o anticorpo livres, pois a interao antgeno-anticorpo modula a atividade da enzima. Nos ensaios heterogneos, a separao necessria, pois a atividade da enzima no alterada pela reao antgenoanticorpo. Os ensaios homogneos so mais utilizados para a deteco de haptenos e os heterogneos para a deteco de molculas maiores. ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) Esse teste foi desenvolvido como uma alternativa ao radioimunoensaio para a deteco de antgenos e anticorpos. O seu princpio bsico a imobilizao de um dos reagentes em uma fase slida, enquanto outro reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservao tanto da atividade enzimtica como da imunolgica do anticorpo. O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antgenos ou anticorpos, podendo ter elevada preciso se os reagentes e os parmetros do ensaio forem bem padronizados. Especial ateno deve ser dada a fase slida, cujas propriedades podem variar de acordo com a composio. O grau de pureza do antgeno ou do anticorpo da fase slida muito importante, pois qualquer material heterlogo competir pelo espao na placa. O objetivo do ensaio a quantificao ou verificao da presena de um antgeno ou anticorpo SLFIA (Substrate-Labelled Fluorescent Immunoassay) Pode ser utilizado para detectar reagentes de alto e baixo peso molecular. Foi desenvolvido pela Ames Company of Miles Laboratories. No ensaio, um substrato fluorognico da -galactosidase ligado covalentemente a um antgeno protico ou hapteno. Se o anticorpo especfico reage com antgeno, a enzima -galactosidase no cliva o substrato, por impedimento estrico. Se a amostra tiver antgeno, este se ligar ao anticorpo e o substrato ligado ao antgeno ficar livre e reagir com a enzima para formar o produto fluorescente. O grau de fluorescncia proporcional quantidade de antgeno na amostra.

A relao B/F onde: B = complexo Ag*-Ac F = Ag* livre O ensaio utiliza quantidade padronizada de anticorpo e de antgeno marcado = AcAg ; a esse sistema adicionado o antgeno no marcado. Estabelecer curva padro OBTENA E ESCOLHA DO ANTICORPO Os anticorpos so produzidos em animais:

Coelhos Cobaias Repetidas injees do antgeno (Ag+adjuvante de Freund completo e depois Ag + Ag+adjuvante de Freund incompleto ) Adjuvante de Freund= tem a finalidade de retardar a liberao do antgeno no corpo do animal. Tempo= 6 semanas a 6 meses

Marcao do Hormnio com Istopo Radioativo


uma tarefa importante da Radioqumica. Quase todos os hormnios proticos e derivados so marcados com o I125, istopo radioativo de Iodo com meia vida de 60 dias, emissor de radiao gama de 35 K e V sendo muito conveniente tanto para as medidas como para a comercializao, sob forma de kits, para a dosagem de hormnios pelo RIE. Como j dissemos os hormnios com exceo dos da Tireide T3 e T4, no possuem Iodo em sua molcula, mas, podem passar a ter sem que haja alterao de suas propriedades qumicas e principalmente imunolgicas. A iodinao com o I125 que se faz na razo de 1 tomo por molcula, se realiza por diversos processos, procurando sempre obter hormnios com alta atividade especfica (ci/ng hormnios), dada a pequena quantidade de hormnios existentes nos fludos biolgicos, e, ao mesmo tempo procurando evitar a leso radioqumica, isto , danos causados s molculas hormonais pelos efeitos das radiaes ionizantes s ligaes moleculares. Outras tcnicas envolvidas: Produo do anticorpo Policlonal ou monoclonal Cultura de clula Obteno do radioistopos Fsica das radiaes cromatografias Radioimunoensaio Centrifugao Pipetagem com preciso imunoensaio