INTERAÇÕES

ANTÍGENO-ANTICORPO
 Antígeno

-Toda molécula reconhecida como estranha pelo

organismo – interage com Ac e TCR

-Epitopo – menor fração de um antígeno capaz de ser

reconhecida por anticorpos ou se ligar a TCRs.

-Antigenicidade: capacidade de um antígeno de ser

reconhecido pelo sistema imunológico

-Imunogenicidade: capacidade do antígeno de ativar

uma resposta imunológica
 Determinantes Antigênicos

A estrutura íntegra do antígeno é primordial

para seu reconhecimento ideal
 Ligação do Antígeno ao Anticorpo

A ligação entre Ag e Ac é resultado da conformação do Ag e

do Fab do Ac e das interações químicas entre eles
 INTERAÇÃO AG-AC

Ag + Ac Ag-Ac

A interação Antígeno-Anticorpo
segue a lei das massas
 Complexo Ag-AC

A quantidade de um antígeno e de um anticorpo em uma

Solução é fundamental para a formação de complexos Ag-Ac
 INTERAÇÕES
 Reações reversíveis.
reversíveis

 Ligações não covalentes:

-Pontes de hidrogênio
-Interações hidrofóbicas
-Interações de Van der Waals
-Ligações iônicas
 Detecção, quantificação e
caracterização dos anticorpos e
seu uso como ferramenta para
pesquisa e diagnóstico
 MÉTODOS
• PRECIPITAÇÃO APLICAÇÕES
- Imunodifusão
• AGLUTINAÇÃO - Pesquisa
- Aglutinação direta e indireta
- Diagnóstico
- Inibição da aglutinação
- Teste de Coombs - Soroepidemiologia
• IMUNOENSAIOS
- RIA
- ELISA
- Imunofluorescência e Citometria de Fluxo
- Western Blotting
 MÉTODOS

1) Reagentes não marcados

• Reação de precipitação
• Reação de aglutinação

2) Reagentes marcados
• Radioimunoensaios (RIA)
• Ensaios imunoenzimáticos (ELISA)
• Imunofluorescência
• Western Blotting
 PRECIPITAÇÃO X
AGLUTINAÇÃO
• Precipitação:
Formação de complexos Ag/Ac.

• Aglutinação:
É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas de
Ac que se ligam a Ag na superfície de partículas adjacentes.

• As reações de precipitação e de aglutinação decorrem,

respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúvel e
particulado.
Classificação das reações de precipitação
1.Precipitação em meio líquido
2.Imunodifusão radial dupla
3.Imunodifusão radial simples
 Precipitação em meio líquido
(Oudin, 1946)
• Zona de excesso de anticorpo = Formam-se
imunocomplexos menores e solúveis e o sinal
de leitura é baixo.

• Zona de equivalência = Formam-se grandes

complexos gerando um sinal máximo.

• Zona de excesso de antígeno = Formam-se

imunocomplexos menores e solúveis e o sinal
de leitura decresce novamente.
O sistema para detecção dos precipitados:
• Fonte de energia radiante (halogênio,
tungstênio e laser)
• Condensador (flash de luz paralelo e não
divergente)
• Seletor de comprimentos de onda (filtro ou
monocromadores)
• Cubeta
• Sistema de detecção (define a técnica
empregada)
•  0º = Turbidimetria
•  90º = Nefelometria
• Turbidimetria:

Cubeta

 0º

Fonte
de luz
• Nefelometria:

Cubeta

 0º

Fonte  30º

de luz  90º
Tungstênio
Mercúrio
Xenônio

17
  Imunodifusão radial dupla
(Ouchterlony, 1947)
Antígeno e anticorpo colocados em posição
horizontal, em pontos diferentes, difundem-se um
contra o outro formando um precipitado.

Ag Ag

Ac
1. Os reagentes são colocados em
concentrações molares idênticas
a velocidade de difusão vai
depender do PM.
2. A curvatura estará dirigida
sempre para o orifício em que se
encontra a substância de maior
PM, nas condições ideais para a
reação.
 Imunodifusão radial simples
(Mancini e Fahey, 1965)
 REAÇÕES DE
AGLUTINAÇÃO
• Ac + Ag multivalente particulado
• Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-
quantitativo)
• Agregação visível de
partículas = Eritrócitos,
bactérias, fungos e látex
 ANTÍGENOS PARTICULADOS
Exemplos:
Aglutinação Ativa:
Bactérias (Brucelose)
Hemácias (Sistema ABO)

Aglutinação Passiva:
Hemácias tratadas antígenos
Partículas tratadas antígenos
anticorpos
 Partículas Naturais Partículas
Sintéticas

HEMAGLUTINAÇÃO BACTÉRIAS LÁTEX, ETC

Antígenos ou
Receptores Passiva Antígenos Passiva
superfície Conjugação superfície Conjugação
membrana Prévia Ag membrana Prévia Ag ou Ac
 AGLUTINAÇÃO DIRETA
Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação

Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)

1) Amostra de sangue na placa teste:

2) Reagente (anticorpo anti A, B):

AGLUTINAÇÃO DIRETA
Leitura do resultado:

negativo positivo

Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação

visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como
ilustrado acima.
 N ac
licos etil
amin
a
 INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO
Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)

+
Urina
Soro anti - hCG
Resultado negativo:
Adicionam-se Partículas (ausência de hCG
revestidas com hCG na urina).
São incubados e
colocados numa Ocorre aglutinação,
placa pois os anticorpos
anti-hCG não são
bloqueados na
incubação inicial,
Resultado positivo: porque não havia o
(presença de hCG hormônio na urina.
na urina): não ocorre
aglutinação.
Livres, podem
aglutinar as
Ac se ligaram no hCG da urina, partículas
(ficando bloqueados), na incubação inicial revestidas de hCG.
 TESTE DE
COOMBS
• Ac antiimunoglobulinas
(Robert Coombs);
• DHRN – mãe produz IgG anti-
Rh;
• Não aglutinam os eritrócitos;
• Direto: Ac ligados aos
eritrócitos fetais;
• Indireto: Ac anti-Rh não
aglutinantes no soro materno.
• Permite detectar
incompatibilidades Rh,
prevenindo contra DHRN.
 IMUNOENSAIOS
• Reagentes marcados (enzimas, fluorocromos,
isótopos)
• Tipos:
- Radioimunoensaios
- Ensaios imunoenzimáticos (ELISA)
- Imunofluorecência / Citometria de Fluxo
- Western blotting
 Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)

Marcação de Anticorpos

1966 Nakane Conjugação

Avrameas de anticorpos com a
Peroxidase

Inicialmente aplicada a
antígenos particulados
 Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)

HOMOGÊNEOS Todo em fase líquida

EIE
Separação em
HETEROGÊNEOS fase sólida

CROMÓGENOS SOLÚVEIS CROMÓGENOS INSOLÚVEIS

(ELISA) ( W. BLOTTING)
 Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)

1971 Engval & Perlmann

IMOBILIZAÇÃO DE ANTÍGENOS SOLÚVEIS

EM FASES SÓLIDAS (PLÁSTICOS)

ELISA
Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)

UTILIZAM UMA ENZIMA PARA GERAR O SINAL

DA REAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO
ELISA
FASE SÓLIDA POLIESTIRENO
POLIVINILCLORETO
NYLON
IMUNOPEROXIDASE
SOBRE TECIDOS OU CULTURAS CELULARES
WESTERN BLOTTING
SOBRE PAPEL DE NITROCELULOSE OU
NYLON APÓS TRANSFERÊNCIA DO GEL DE
ELETROFORESE
 ENZIMAS
O QUE LEVAR EM CONSIDERAÇÃO ???

•Pureza
•Atividade específica
•Limiar de detecção
•Facilidade de conjugação
•Eficácia após conjugação
•Estabilidade do conjugado
 PEROXIDASE
FÁCIL OBTENÇÃO E BAIXO CUSTO

 FÁCIL CONJUGAÇÃO A PROTEÍNAS

 ESTÁVEL APÓS CONJUGAÇÃO

 VÁRIOS CROMÓGENOS DISPONÍVEIS

 PEROXIDASE
Como se processa a reação ????
H2O

H2O2 PEROXIDASE

Cromógeno
½ O2
COR
 CROMÓGENOS PARA
PEROXIDASE

 Orthophenylene diamine (OPD)

 5-aminosalicylic acid (5AS)

 Tetramethylbenzidine (TMB)

 2,2 azino-di(3- ethylbenzothiazoline) (ABTS)

 4-Cloronaphthol

 Diaminobenzidine (DAB)
ELISA INDIRETO
ELISA / CAPTURA
OPD

TMB
 APLICAÇÕES DOS ENSAIOS IMUNO-ENZIMÁTICOS
- Borrelia burgdorferi (IgG e IgM)
- Citomegalovírus (IgG e IgM)
- Citomegalovírus (Ag)
- Hepatite A (Ac totais)
- Hepatite B:
anti-HBs
anti-HBc (IgG e IgM)
anti-HBe
HBsAg
HBeAg
- Hepatite D (Ac totais)
- Hepatite C
- HIV - Ac
- HIV - Ag
- HTLV-1 e HTLV-2 - Ac
- Rubéola (IgG e IgM) Curso CBAB/CNPq/MCT - 2006
ELISPOT
Imuno-histoquímica
Western-blot
 Negative
gp160 -No bands present
gp120
Positive
gp55
-Bands at either p31 OR p24
gp41 AND bands present at either
gp160 OR gp120
gp31

gp24 Indeterminate
- Bands present, but pattern
does not meet criteria for
positivity
Radioimunoensaios
 Quimioluminescência

luciferina
luminol
lucigenina
Reações de Imunofluorescência
(Coons et al., 1941,1942)
Luz ultra-
violeta
(145-290 nm) Luz visível
(>450nm)
Isotiocianato de Isotiocianato de
Fluoresceína Rodamina B
(ITCF)
Treponema pallidum

Tripanosoma cruzi

Pneumocystis carinii
Giardia lamblia