RESUMO DE IMUNOLOGIA CLÍNICA - PROVA I

MATERIAL BIOLÓGICO

A coleta de materiais biológicos pode sofrer diversas interferências, devendo-se anotar

as condições/alterações que o material recebido apresenta caso ele esteja ictérico (bilirrubina),
lipêmico, hemolisado.

INTERFERENTES

 Medicamentos: anticoncepcional, suplementos alimentares, laxantes e analgésicos.

 Fumo: nicotina influencia os valores de cortisol e de GH, evitar por pelo menos 4 horas.
 Jejum: evitar coleta até 2h após refeição, lipídios interferem no desempenho do teste e
geralmente, o tempo ideal é 8h. Para pesquisa de Ac em teste imunoenzimático,
imunofluorescência e quimioluminescência, recomenda-se jejum de 4 horas.
 Gravidez: podem afetar os parâmetros hormonais e proteicos e deve-se anotas a data da
última menstruação para averiguar possibilidade de estar grávida.
 Exercícios: é interessante proceder com o repouso antes da coleta quando se tem
exercícios extenuantes, visto que isso pode causar alterações nos parâmetros
bioquímicos e hormonais, além do desequilíbrio hídrico (perda de H2O pelo suor).
 Idade: variação dos resultados conforme a idade (Imunoglobulinas, concentração
hormonal e proteínas).

AMOSTRAS:
Podem ser de soro, plasma ou sangue total
⇨ Soro: obtido a partir do sangue sem anticoagulantes. (Parte líquida - fibrinogênio).
⇨ Plasma: contém água, proteínas, sódio, globulinas, albumina e fibrinogênio.
⇨ Sangue total: deve ser processado em 24h. (Células sanguíneas e plasma).

Victória Tomaz – Biomedicina 2017 - UFCSPA

Cuidados: Se o soro é colhido em tubo com gel, durante a centrifugação (10-15’) esse diminui a
sua viscosidade e se deposita acima das células. Espera-se de 30-60’ antes de centrifugar a
amostra. O plasma e o soro dos tubos sem gel devem ser removidos da camada celular em até
2 horas após a coleta da amostra. O sangue total deve ser processado em até 24hs, não devendo
ser refrigerado. As amostras são estáveis por até 3 dias (tubos com gel separador), podendo ser
armazenadas em geladeira (2-8ºC) por no máximo 1 semana, se for necessário armazenar por
mais tempo congelar em alíquotas. Não recentrifugar a amostra pois o liquido que fica contido
abaixo do gel causa lise celular.

Ordem de coleta: Hemocultura, seco ou com gel separador (vermelho/amarelo), citrato (azul),
heparina (verde), EDTA (roxo) ou inibidor de glicólise (cinza).

OUTRAS AMOSTRAS

 Urina: Determinações hormonais e de drogas, depende da função renal e da ingestão

de líquido precede à coleta e é ideal a primeira urina da manhã.
 LCR: Pesquisa de Ag bacteriano, virais ou parasitários que afetam o SNC.
 Líquido amniótico: Alfafetoproteina.
 Líquido sinovial: Obtido de articulações, ↑ volume pelo processo inflamatório e
frequente em artrites de etiologia auto-imunes.
 Fezes: Pesquisa Ag de rotavirus, E. histolytica e Giardia lamblia, ensaios tipo
imunocromatografia em tiras ou em dispositivos (sabonetinhos), micropartículas de
poliestireno (látex) e previamente ao ensaio/suspensão de fezes.

COLETA DE SANGUE: A VÁCUO OU COM SERINGA E AGULHA

1. Higienizar bem as mãos e colocar luvas

2. Posicionar o braço do paciente, inclinando para baixo na altura do ombro
3. Antissepsia do centro para fora (onde for a coleta)
4. Escolha da veia (cubital; cefálica)
5. Rosquear a agulha no adaptador (se for a vácuo) ou abrir a seringa na frente do paciente
6. Testar a seringa 3x (para ver se o empolo está funcionando)

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 7. Fazer o garrote (um palmo acima do local da coleta) e pedir para o paciente fechar a
mão
8. Quando picar o paciente ver o sangue entrando no início da seringa (sinal que acertou
a veia) e pedir para que abra a mão
9. Quando terminar desgarrotear o paciente e por algodão no local sem apertar
10. Após a retirada da seringa, pressionar o algodão no local e colocar um oclusivo

ERROS DE PUNÇÃO

 INTERRUPÇÃO DO FLUXO SANGUÍNEO: Bisel encostado na parede superior da veia.

Ideal é inclinar um pouco para cima e avançar um pouco a agulha, assim tenha passagem
do fluxo.
 INTERRUPÇÃO DO FLUXO SANGUÍNEO: Parte posterior da agulha está encostado na
parede da veia. Retroceder um pouco com a agulha e girar sutilmente o
adaptador/seringa permitindo o fluxo.
 AGULHA TRANSFIXOU A VEIA: Retroceder um pouco a agulha e observar o fluxo.
 BISEL DA AGULHA PENETROU PARCIALMENTE A VEIA: Extravasamento de sangue
abaixo da pele. Introduzir um pouco mais da agulha e ao termino fazer uma compressa
de gele.
 PROCESSO DE ESTENOSE VENOSA: Retirar ou afrouxar o garrote para restabelecer a
circulação, retroceder um pouco a agulha para permitir o fluxo.

PARÂMETROS SOROLÓGICOS

Sensibilidade: Porcentagem de pacientes doentes com teste positivo detectados em população

sabidamente infectada (A: positivos verdadeiros e C: falsos negativos).

Sensibilidade= A / A + C

Especificidade: Porcentagem de indivíduos normais com teste negativo em população

sabidamente não infectada (D: negativos verdadeiros e B: falso positivo).

Especificidade= D/B + D

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Eficiência: Relação entre o somatório dos resultados positivos e resultados negativos da
população estudada. Quanto mais próximo de 1 for essa relação, melhor será o teste (A:
positivos verdadeiros, B: falso positivos, C: falso negativos e D: verdadeiros negativos).

Eficiência= A + D / A + B + C + D

Prevalência: Porcentagem de indivíduos infectados em uma população. Considera-se como

indivíduos infectados os verdadeiros positivos somados aos falsos negativos.

Prevalência= Infectados / População

Prevalência sorológica: Porcentagem de casos positivos pelo teste em uma população.

Considera-se como indivíduos positivos a soma dos verdadeiros positivos e falsos positivos
detectados pelo teste.

Prevalência sorológica= Positivos / População

Limiar de reatividade ou cut off: Região de corte do teste sorológico. LR é determinado pela
média aritmética das densidades ópticas (DO) das amostras acrescidas de 2 desvios padrão.

Reprodutibilidade: Obtenção resultados iguais em testes realizados com a mesma amostra

biológica, quando feitos por diferentes pessoas em diferentes locais.

 Variação da reprodutibilidade: erros de pipetagem, trocas de amostra, calibração boa,

reagente de qualidade e armazenamento adequado.
 Itrateste: Repetição do teste ao mesmo tempo por ensaios em duplicata ou triplicata.
 Interteste: Repetição da mesma amostra em testes realizados em dias diferentes e em
diferentes laboratórios.

Padrão ouro: Método, procedimento ou critério considerado o melhor que se dispõe para
afirmar presença/ausência da doença. Procedimento para ser considerado padrão ouro deve
ser altamente confiável, capaz de indicar com segurança a presença/ausência da doença.

MÉTODOS IMUNOLÓGICOS DE DIAGNÓSTICO

Os métodos imunológicos têm sido os principais responsáveis pelo conhecimento sobre

o sistema imune. Eles se baseiam na interação Ag-Ac para detectar ou mensurar substâncias
presentes na circulação, nos fluidos corporais e nos tecidos. Esses testes são importantes na
clínica para a detecção de infecções, doenças auto-imunes e estados de imunodeficiência. São
utilizados para:

 Detectar a produção e quantificação de Ag e Ac e diferenciar estágio de uma doença de

acordo com a classe de imunoglobulina produzida
 Selecionar doadores e receptores de órgãos para transplantes
 Avaliar o prognóstico de uma doença
 Avaliar a eficácia de um tipo de terapia

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Características: Antígeno é toda substância capaz de interagir com anticorpo produzido
especificamente contra ele. Interação Ag-Ac é uma reação química com 3 características
especiais:
 ESPECIFICIDADE: sintetizam o Ac sob a influência das características estruturais do Ag.
o Ac de pequena especificidade permitem reação cruzada com diversos Ag.
 AFINIDADE: capacidade de ligação do Ac com o Ag que estimulou a sua síntese.
o Alta afinidade: reconhecem grande parte da estrutura; forte ligação.
o Baixa afinidade: reconhecem pequena parte da estrutura, podendo reagir por
reação cruzada.
 DIVERSIDADE: Ac específicos sintetizados em resposta a um único determinante
antigênico são diferentes entre si e tem propriedade diferentes, especialmente em
relação a afinidade.

Métodos imunológicos podem ser realizados por meio de:

 Técnicas cujo resultado é avaliado pela visualização das reações → precipitação e
aglutinação
 Técnicas com a utilização de marcadores de superfície enzimáticos ou fluorescentes →
técnicas imunofluorescentes e imunohistoquímicas como: ELISA, imunoperoxidase,
imunofluorescência, citometria de fluxo

1. FORMAÇÃO DE IMUNOCOMPLEXOS

Precipitação: Empregada para detectar anticorpos produzidos contra antígenos solúveis em

concentrações de 2 e 20mg/mL. Para a realização desta técnica deve haver uma relação de
equivalência entre as concentrações de antígeno e anticorpo para que a reação seja visível. Em
caso de excesso de antígeno ou de anticorpo ocorre uma redução na formação do precipitado.

 Zonas de equivalência: Efeito pró-zona (excesso de anticorpo) e Efeito pós-zona (excesso

de antígeno)

Imunodifusão: Baseia-se na difusão de uma substância solúvel em meio semi-sólido (ágar ou gel
de agarose).
 Simples: Um dos componentes está fixado ao gel enquanto o outro migra até a
formação do imunocomplexo

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  Dupla: Dois elementos migram simultaneamente, um em direção ao outro. Formação
de arcos de precipitação no meio do caminho (Ac no meio contra diversos Ag).
 Linear ou unidimensional: Utiliza movimento direcionado por corrente elétrica ou
gravidade. Feita em tubos onde o Ac está no gel e o Ag é adicionado depois.
 Radial: Movimento ao acaso em todas as direções, a partir do orifício no qual se coloca
a amostra (Método: Ac no gel e Ag no poço; Interpretação: Diâmetro do anel é
proporcional a concentração). Diâmetro do halo formado é proporcional a concentração
de Ag (colocado nos poçinhos)

Nefelometria: Técnica já automatizada para medição da precipitação em soluções líquidas,

servindo para determinar proteínas de significado clínico em qualquer fluido corporal. Reações
de precipitação entre Ag e Ac que produzem ↑ reflexão da luz, pode ser diretamente medida
pela dispersão da luz incidente. A quantidade e natureza da dispersão dependem: o da forma e
do tamanho das partículas; o da concentração e; o do comprimento de onda da luz; o e do índice
de refração do meio.

Turbidimetria: baseia-se nas mesmas condições do anterior, mas mede-se a reação de

precipitação a partir da absorbância (espectrofotômetro). Assim como a anterior, é muito
utilizada na determinação de proteínas com significado clínico em fluídos corpo.

2. MÉTODOS QUE O ANTÍGENO OU ANTICORPO SE FIXAM A UMA SUPERFÍCIE SÓLIDA:

Aglutinação: Ocorre quando um Ag se associa com um Ac específico formando agregados. São

necessários menos Ac para aglutinar o Ag. Possui maior sensibilidade que a precipitação e
necessita de suporte ou superfície sólida. Pode ser realizado com partículas que apresentam
determinantes antigênicos naturais (hemácias, bactérias) → direta. Pode ser realizado com
partículas inertes (látex, poliestireno) → passiva ou indireta. Pró-zona: aumenta a concentração
de anticorpo, causando falso negativo, logo, deve-se diluir o soro.

 Aglutinação Direta: partículas antigênicas insolúveis (bactérias, hemácias, fungos,

protozoários) íntegras ou fragmentadas aglutinam com anticorpos específicos. É
utilizado no diagnóstico de infecções bacterianas e por protozoários.

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  Aglutinação passiva: baseia-se na adsorção passiva de partículas inertes (látex,
poliestireno) com partículas solúveis (proteínas, polissacarídeos). Pode ser observada a
olho nu ou ser quantificada por nefelometria e turbidimetria. É utilizada na detecção de
fator reumatoide, detecção de anticorpos contra CMV, HIV, HBV e HCV.

 Inibição da aglutinação passiva: é um ensaio competitivo sensível para a detecção de

antígenos solúveis ou anticorpos em concentrações entre 0,1-10µg/mL. Baseia-se na
adição de antígeno solúvel à amostra contendo anticorpo (ou adição de anticorpo em
amostra contendo antígeno), para bloquear os sítios de ligação do anticorpo. Quando
esta mistura é colocada em contato com o látex sensibilizado pelo mesmo antígeno, não
se observa aglutinação.

 Aglutinação reversa: baseia-se na adsorção passiva de anticorpos específicos em

partículas inertes. É utilizado na pesquisa de polissacarídeos bacterianos no soro, urina
ou plasma; pesquisa da PCR.

Hemaglutinação: é a técnica para a detecção de anticorpo específicos que reconhecerão

antígenos na superfície de eritrócitos, causando aglutinação.

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 Hemaglutinação direta: baseia-se na aglutinação de determinantes antigênicos da
própria hemácia por anticorpos específicos. É utilizado na pesquisa de antígenos
específicos como o sistema eritrocitários; em pesquisa de anticorpos contra antígenos
heterófilos (EBV).

 Inibição da hemaglutinação direta: baseia-se na capacidade de antígenos virais

aglutinar espontaneamente certos tipos de hemácias. Este método, em geral, não
distingue anticorpos da classe IgG e IgM. Utilizado para detectar anticorpos contra os
vírus da rubéola, sarampo, influenza e alguns enterovírus.

 Hemaglutinação indireta: baseia-se na capacidade do anticorpo de sensibilizar as

hemácias e na incapacidade de aglutiná-las. Há necessidade de 2º anticorpo
(antiglobulina – contém anti-IgG humana em combinação contra componentes do
complemento – ou soro de Coombs) para que ocorra a aglutinação. É utilizado na
identificação de anticorpo contra antígeno eritrocitário em incompatibilidade sanguínea
materno-fetal, anemias hemolíticas auto-imunes e provas de compatibilidade pré-
transfusionais.

o COOMBS DIRETO: Detecta Ac fixado as hemácias.

o COOMBS INDIRETO: Detecta os Ac séricos

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  Hemaglutinação passiva: baseia-se na utilização de hemácias (carneiro ou humano do
grupo O) como suporte de antígenos, por apresentarem uma superfície rica em
moléculas, proporcionando a adsorção de vários tipos de antígenos. Pode detectar
anticorpos em concentrações de até 0,01mg/mL. Não diferencia anticorpo da classe IgM
e IgG. É utilizado na detecção de anticorpos contra uma grande variedade de
microorganismos como Trypanossoma cruzi, Treponema pallidum, Toxoplasma gondii.

 Hemaglutinação reversa: baseia-se na adsorção passiva de anticorpos específicos à

hemácias. Utilizada para detectar antígenos, como por exemplo o de superfície do HBV
(HBsAg).

3. ELETROFORESE

Conceito: Através da técnica de SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil

sulfato de sódio – detergente aniônico que confere carga negativa as proteínas, facilitando a
separação por peso molecular). Coloração para identificar a composição de proteínas: Comassie
blue (na ordem de 10ng) e Nitrato de prata (até 0,1ng).

Western blotting/Immunoblot: eletroforese em gel e eletrotransferência para uma membrana

de nitrocelulose. Utilizado para analisar qualquer interação específica de uma molécula e seu
ligante. Verifica-se caracterizações de frações antigênicas imunodominantes. Identifica a
reatividade específica de anticorpos detectados por um teste de triagem utilizando múltiplas
frações antigênicas. Distingue perfis de especificidade de anticorpo.

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Imunoeletroforese: método qualitativo que combina as técnicas de imunodifusão e
eletroforese. Esta associação permite distinguir maior número de componentes antigênicos de
um líquido biológico. As aplicações mais comuns são a caracterização de proteínas, diagnóstico
de gamopatias monoclonais (mieloma múltiplo). Possui duas etapas:

1º) Eletroforese: separar os Ag

com base na sua carga elétrica

2º) Imunodifusão: cada componente reage com anti-soro específico, formando um arco de
precipitação na linha de equivalência

Contra imunoeletroforese: Tanto o Ag quanto o Ac são submetidos à eletroforese

simultaneamente, em direções opostas, resultando em precipitação num ponto intermediário
entre as duas origens. O Ag é a carga negativa e, quando submetidos a um campo elétrico, sob
determinadas condições de pH e força iônica, migram em sentido contrário ao do anticorpo.
Assim, tanto o antígeno quanto o anticorpo dirigem-se para um determinado ponto e, ao se
encontrarem, formam uma linha de precipitação que indica a positividade da reação.

4. IMUNOHISTOQUÍMICA

Conceito: O processo de identificar antígenos nos tecidos com anticorpos, através de secção
corada é definido como imunohistoquímica. Ac primários são marcados, sendo sua ligação
detectada pela presença da enzima ou fluorocromos. Amostras são esfregaços de medula óssea
e corte de tecido ficado em formol e imerso em parafina. São técnicas realizadas em lâmina de
vidro para visualização microscópica que permitem a detecção e localização de Ag ou Ac em
células ou tecidos. Estas duas técnicas podem ser utilizadas em diversas situações:
 Detectar anticorpos presentes em células e tecidos
 Detectar moléculas do complemento depositados nos tecidos
 Detectar antígenos tumorais

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IMUNOFLUORESCÊNCIA: Ac para a detecção do Ag são marcados com moléculas que emitem
luz fluorescente (fluorocromos). Necessita de um microscópio de fluorescência.

 Direta: Baseia-se na localização do Ag em células ou tecidos utilizando um Ac específico

marcado com fluorocromo.
 Indireta: Baseia-se no uso de um Ac anti-imunoglobulina marcado pelo fluorocromo,
cujo o objetivo é detectar anticorpo.

IMUNOPEROXIDADE: Os Ac para a detecção do Ag são marcados com uma enzima (peroxidase

1 ou fosfatase alcalina 2). Microscopia óptica.

5. IMUNOENZIMÁTICO

ELISA/Radioimunoensaio: Método de análise quantitativa (ordem de picogramas ou

nanogramas). Estes dois métodos apresentam o mesmo princípio técnico com a diferença que
no 1º a revelação é realizada com Ac marcados com enzima (como na imunoperoxidase), e, no
2º, a revelação é realizada com Ac marcados com isótopos radioativos. Estes métodos podem
ser utilizados para a detecção de Ag (hormônios, citocinas, marcadores tumorais) e de Ac (contra
bactérias, fungos, vírus e protozoários).

ELISA: Medida quantitativa da interação Ag-Ac por medida da atividade enzimática sobre um
substrato. Imobilização de um dos componentes (Ag ou Ac) -> Utilização de um conjugado (Ag
ou Ac ligado a uma enzima) -> Substrato -> Visualização da reação colorimétrica e monitoração
por espectofotômetro.

 Amostra: soro ou plasma

 Suporte sólido (poliestireno, poliacrilamida)
 Adsorção do Ag ou Ac na fase sólida
 Bloqueio dos sítios remanescentes com proteína bloqueadora
 Solução de lavagem
 Conjugados (Ag ou Ac ligados covalentemente à enzima)
 Substratos cromogênicos (sob ação enzimática originam produtos coloridos)
 Solução de parada: Ação enzimática é contínua, necessário interromper a reação
colorimétrica por inativação da enzima com soluções ácidas ou alcalinas

Indireto: Pesquisa de anticorpo.

Captura ou sanduíche: Pesquisa de Ag.
Competitivo: Detecção de Ag, compete
com Ag marcado, quantidade de Ag
marcado ligado ao Ac é inversamente
proporcional à quantidade de Ag da
amostra, menos empregados, apresenta
maior especificidade e menor sensibilidade, não adequado para moléculas muito pequenas
(drogas, peptídfeos) e é bom para hormônios, marcadores tumorais, Ag de patógenos.

MEIA – imuno-ensaio enzimático de micropartícula: Fase sólida é formada por micropartículas

de látex

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ELFA - imuno-ensaio enzimático fluorescente: Revelada com a adição de um substrato da
enzima marcado com uma substância fluorescente

6. QUIMIOLUMINESCÊNCIA

Excitação por reação química. Determinação quantitativa de hormônios, drogas e

microorganismos. Tais métodos utilizam-se de anticorpos ligados a um marcador luminescente
(cromógeno) que pode ser o próprio luminol ou derivados de acridina. A energia química gerada
como resultado da dissociação de ligações fracas produz compostos intermediários em um
estado eletronicamente excitado que, quando retornam ao estado de energia inicial emitem luz
que é medida.

 Luminescência: Emissão de luz associada com a dissipação de energia de uma

substância que se encontra em um estado eletricamente excitado.

7. IMUNOCROMATOGRAFIA

 Dispensam uso de reagentes e equipamentos e técnicos especializados

 Testes de triagem (gravidez)
 Emprega corante insolúvel como revelador da interação Ag/Ac
 Corante ligado Ag ou Ac e colocado próximo ao local onde se aplica a amostra
 Aquosa e possibilita a migração da amostra e do conjugado
 Sistema realizado em uma membrana (nitrocelulose)
 Ag ou Ac fixado nesta em forma de linhas e o restante da membrana é bloqueado

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