Técnicas imunológicas

Valdirene Leão
Interações Ag-Ac
secundárias

PRINCÍPIOS BÁSICOS
 REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO –
PRINCÍPIOS
Í BÁSICOS
Á

• As reações de aglutinação baseiam-se na formação de

agregados/
g g aglomerados
g resultantes da interação
ç Ag-g
Ac, que ocorre em zona de equivalência, quando pelo
menos um desses componentes está na forma
particulada.
particulada

• Pode ocorrer tanto com partículas que apresentam

determinantes antigênicos naturais em sua superfície
(ex.: hemácias, bactérias, vírus), como em partículas
i
inertes
t ((ex.: lát
látex, esferas
f plásticas
lá ti ) ou células
él l que
são recobertas com uma das moléculas, mais
comumente
m m o Ag.
g
 Tipos de Reações de Aglutinação
• Aglutinação
l i ã Di
Direta: Tipagem
Ti sanguínea
í e sorotipagem
i
bacteriana;

• Teste de Inibição da Aglutinação Direta: Rubéola,

Influenza Enterovírus ...
Influenza,

• Aglutinação Indireta ou Passiva:

Hemácias: Toxoplasmose, Chagas ...
Lát x: F
Látex: Fator
t reumatóide
um tóid
Micropartículas de Gelatina: Anti-HTLV
Teste de Aglutinação Passiva
Hemaglutinação
 Uso comum da aglutinação:

Tipagem sanguínea por aglutinação

Aglutinação do látex (Prot.
(Prot C Reativa),
Reativa)
Diagnósticos
g indiretos de infecção
ç
 Detecção de componentes
VDRL - Venereal Disease Research Laboratory - usada para detectar Ac reativo
no teste de sifilis . “False positive test -- such as HIV, Lyme disease, mycoplasma
pneumonia, malaria, and systemic lupus erythematosus. Therefore, this
screening test if found to be positive must be confirmed by a more specific test
for syphilis such as FTA-ABS.”

Floculação – Antígenos cardiolipínicos – suspensão de cristais de

Colesterol-cardiolipina.
RPR – Antígenos cardiolipínicos adsorvidos em partículas de carvão.

http://www.bmb.leeds.ac.uk/mbiology/ug/ugteach/icu8/std/vdrl.html
 Detecção de componentes
TPPA (Treponema Pallidum Particle-Agglutination) test,

Particulas de gelatina com antigenos treponêmicos são aglutinados

ppor anticorpos
p em soros ppositivos.

http://www.bmb.leeds.ac.uk/mbiology/ug/ugteach/icu8/std/tpha.html
Reações de Precipitação

10
• Complexos moleculares gerados a partir da interação de Ag
solúveis com Ac específicos tendem a precipitar em um determinado
meio.

• Este fenômeno permitiu o desenvolvimento de técnicas em que se

observa a formação do precipitado, o que só é possível se o Ac e o Ag
interagirem.

• Técnicas utilizando a precipitação em meio líquido são raramente

utilizadas (e somente em pesquisa),
pesquisa) para verificação da resposta de
um animal a um dado antígeno solúvel.

• Algumas técnicas foram desenvolvidas a partir da observação de que

Ag - Ac precipitam em meio semi-sólido, tipo gel (em geral de
agarose).
)
Ex: - Imunodifusão dupla
- Imunodifusão radial
- Imunoeletroforese 11
 Curva de Equivalência
É importante levar-se em conta como ocorre a ligação Ag-Ac
em diferentes concentrações dos mesmos. Observe abaixo:

Anticorpo livre + - -
Antígeno livre - - +
100%--

Percentual de
complexo
l
imune
precipitado

Zona de excesso Zona de Zona de excesso

de anticorpo equivalência de antígeno

Quantidade de antígeno adicionado

12
 Imunodifusão simples radial
• O Ac é
p
incorporado ao
ágar e colocado
em uma placa de
Petry.
• No centro é ffeito
um orifício e nele
é colocado o Ag
a ser testado.
I
Imunodifusão
dif ã simples
i l radial
di l
 Imunodifusão radial

Um exemplo de sua utilização: dosagem de

imunoglobulinas numa placa disponível no
mercado.
Poços onde são colocados padrões e amostras a serem dosados

Halo de precipitação
IgG – anti-IgG

Agarose contendo anticorpos

anti IgG humana
anti-IgG PLACA PARA DOSAGEM DE IIgG
G HUMANA
 Nefelometria
• É uma medida
dd d da d
dispersão dde lluz d
de uma f
fon-
te luminosa. Em soluções diluídas, a reação de
precipitação
ã entre antígeno
í e anticorpo pro-
duz um aumento da reflexão que pode ser me-
d d pela
dido l ddispersão
ã d de uma lluz incidente.
d

• Ex: Igs,
Igs Complemento
Complemento, proteínas séricas...
séricas
Nefelometria
Raios de uma fonte de
luz de alta intensidade
são dirigidos por lentes
focalizadoras.
Passam através da
amostra contendo o
complexo Ag-Ac. Raios
que emergem num
ângulo de 70° são
dirigidos por outra lente
para o detector
eletrônico e o sinal pode
ser matematicamente
relacionado com a
concentração de Ac ou
Ag da amostra.
Nefelometria/Turbidimetria
 I
Interações
õ A Ag-Ac
A
primárias

PRINCÍPIOS
Í BÁSICOS
Á
Imunofluorescência
IMUNOFLUORESCÊNCIA
Detecção
ç de componentes
p
Imunofluorescencia - usada para detectar Ac reativo no teste de sifilis

FTA ABS = Fluorescent

FTA-ABS Fl t Treponemal
T l Antibody
A tib d Absorption
Ab ti Test
T t

(Treponema pallidum)
http://www.dasit.it/DISEASE/autoimmunita/others.html
Radioimunoensaio
 ELISA – PRINCÍPIOS BÁSICOS
• O ELISA é um teste para identificação e quantificação
de Ag ou Ac presentes em amostras e fluidos biológicos
(como soro ou saliva).

• Seu princípio está baseado numa interação primária Ag-

Ac visualizada através de uma reação enzimática.
Ac, enzimática

•A reação ocorre em meio líquido e a atividade enzimática

é proporcional à concentração de Ag ou Ac da amostra.

• A enzima converte um substrato incolor em produto

colorido ou o substrato alterado pela enzima induzirá
mudança de cor de uma substância indicadora. A leitura
é realizada num fotocolorímetro.
 ELISA – PRINCÍPIOS BÁSICOS

• O teste é, geralmente, realizado em placas plásticas de

microtitulação de fundo chato, com 96 poços, dispostos
em 12 colunas de 8 poços, marcadas lateralmente e na
parte superior
s perior da placa.
placa

Cont. negativo
Cut-off
Cut off
Cont. positivo

• Nos poços são colocadas concentrações adequadas de

Ag ou de Ac no suporte sólido. Adiciona-se a amostra a
ser testada e reagentes, Ag ou Ac, conjugados com
enzimas.
 ELISA “SANDWICH”

Antígeno a ser dosado Anticorpo primário TMB

Outros componentes do soro Anticorpo conjugado Enzima Peroxidase
 ELISA DE CAPTURA

Anticorpo anti-IgM IgM inespecífica TMB

IgM a ser detectada Antígeno biotinilado ST-AV- Peroxidase

 ELISA INDIRETA

IgM a ser detectada Anticorpo conjugado

Antígeno purificado
IgM inespecífica TMB
 ELISA

¾Quantificação de Ag/Ac em ELISA:

ELISA por competição
1. Placa de Elisa revestida com Ac específico

2. Adição de Ag-teste:

Adição de Ag-marcado:
Competição para ligar Ac

3. Lavagem para retirada de excesso de Ag

4. Quanto maior a quantidade de Ag-teste, menor a

possibilidade de ligação do Ag marcado e assim,
menor a intensidade de cor emitida
Equipamento automátco para realização de
“ELISA” modelo “Eti-star” da “Diasorin”

Equipamento automático para

realização de “ELISA”, modelo “
Magia”, da “Merck”
 E a quimioluminescência?
• Quais são os elementos mais utilizados?
Quimioluminescência

http://www.chm.uri.edu/chempeople/ebotonjicdir/luminol.html
 Na quimioluminescência
O substrato quimioluminescente sofre
hidrólise na p presença
ç da enzima,,
produzindo substâncias instáveis que
culminam com emissão de luz.
luz
 IMUNOQUIMIOLUMINESCENCIA

Inicio como no Ensaio Imunoenzimático Convencional

Lavagem para retirada de Ag não

fixado:

Adição de Ac monoclonal, anti-Ag

pesquisado,
i d conjugado
j d à enzima
i .
O conjunto é incubado

Lavagem para retirada de Ac

conjugado à enzima, não fixado
 Adição de substrato da enzima

O substrato quimioluminescente sofre

hidrólise na presença da enzima,
enzima
produzindo substâncias instáveis que
culminam com emissão de luz

O exemplo acima é o que acontece com o substrato luminescente (p.ex.:AMPPD).

A substância luminescente pode ser desestabilizada por uma súbita mudança do
pH e da concentração do meio (éster de acridina) ou ainda um elemento, como
por exemplo o rutênio, dissociado do Ag ou do Ac por uma descarga elétrica no
final da reação, culminando com a emissão de luz. A imunoluminescência pode
atingir uma sensibilidade de 10-15 a 10-16g.
Quimioluminescência

http://www.chm.uri.edu/chempeople/ebotonjicdir/luminol.html
Imunocromatografia
g

http://webdb dmsc moph go th/ifc nih/a nih 2 003c asp?info id=438

http://webdb.dmsc.moph.go.th/ifc_nih/a_nih_2_003c.asp?info_id=438
Padronização de DOT-ELISA
Brucelose
 “Western Blotting”
O desenvolvimento do teste
(como exemplo: detecção de
anticorpos anti – HIV em Vírus HIV
soro):

As proteínas do vírus
HIV são dissociadas em
SDS
35 68 45 12

Separação dos Ag por

eletroforese em gel de
- +
poliacrilamida (PAGE)

Os Ag são eletrotrasnferidos para o

papel de nitrocelulose, onde reagirão
com os Ac do soro do paciente
p

O SDS (dodecil sulfato de sódio)

é um detergente!
Ac anti-Ig humana, ligado a
enzima, detecta as proteínas
produzindo um produto final
que reagirá com o cromógeno
adicionado !
95 45 24

Os equipamentos necessários:
Resultado de um teste
para HIV:
160

PM 41
(KDa)
24
fontes de corrente contínua e cubas uti-
uti
lizadas para a transferência eletroforética Análises ---------- CP CN Teste
 Mini “bloter”
bloter

http://www.immunetics.com/products/miniblotters/minijpeg%20copy.jpg
http://myhome.naver.com/biologian/western_blot.jpg
p y g _ jpg

htt //
http://www.bioon.com/experiment/UploadFiles/200408/20040803130738478.gif
bi / i t/U l dFil /200408/20040803130738478 if

http://www.fermentas.com/techinfo/electrophoresis/img/blotting.gif
Fundamento e técnica do Southern Blot

http://www.bio.miami.edu/dana/250/southern.jpg
 O QUE ACONTECE COM O Európio?

Elemento muito utilizado na imunofluorimetria ...

 Referências
• Antonio Walter Ferreira - Sandra Lago Moraes de Ávila DIAGNÓSTICO
LABORATORIAL DAS PRINCIPAIS DOENÇAS INFECCIOSAS E AUTO-
IMUNES Edição/Ano: 2/2001 nº págs: B/443 .( ultima edição )
• Vaz, A. J.; Takei, K.; Bueno, E.C. Imunoensaios: Fundamentos e
Aplicações. 1 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007
• Janeway, C. and Travers, P. Imunobiologia: O Sistema Imune na Saúde
e na Doença
Doença. 4a ed. ed Porto Alegre: Artes Médicas
Médicas, - ultima edição .
(VEM COM CD ROM)
• Peakman, M. and Vergani, D. Imunologia Básica e Clínica. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 1999 .( ultima edição )
• Roitt, I.; Brostoff, J. and Male, D. Imunologia. 1a ed. São Paulo:Manole,
1999. . ultima edição )
• Stites, D.P., Tem, A.I. and Parslow, T.G. Imunologia Básica e Clínica, 9a
ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000. .( ultima edição )
• Manual de equipamento Abbot
• Site www.labimuno.org.br
• http://quimica_basica.sites.uol.com.br/tabelap.htm