QUIMIOLUMINESCÊNCIA

Profª: Mestra Isabela Bacelar de Assis

Faculdade de São Lourenço
Curso: Biomedicina
2015
 QUIMIOLUMINESCÊNCIA (RQ)
X
OUTRAS TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS

ELISA

SEMELHANÇA: Mesmo princípio! Ligação Ag/Ac é revelada através de REAÇÃO

QUÍMICA entre enzima+substrato.

DIFERENÇA: Reação química no ELISA gera mudança de cor. E na RQ gera luz!

IMUNOFLUORESCÊNCIA (RIF)

SEMELHANÇA: Ligação Ag/Ac é evidenciada pela emissão de LUZ. A emissão de luz

se dá quando uma molécula sai do seu estado excitado para o seu estado normal.

DIFERENÇA: A reação ocorre devido a uma REAÇÃO QUÍMICA no RQ e não devido a

excitação luminosa (RIF).

RADIOIMUNOENSAIO (RIE)

Primeira técnica a ser desenvolvida para dosagem hormonal e de outras substâncias

presentes em pequenas concentrações em fluídos biológicos, sendo um método muito
sensível para análise quantitativa antígeno-anticorpo.

LIMITAÇÕES DO RIE: envolve material radioativo; a validade desse reagente reativo é curta;
elevado custo de biossegurança, necessidade de sofisticados EPI.  Substituído hoje pela
RQ!
 ELISA INDIRETO

Ac primário (do soro do paciente)

CONJUGADO: Ac secundário + Enzima

Ag (específico para o Ac que se deseja pesquisar) é aderido na fase sólida dos poços
IMUNOFLUORESCÊNCIA (RIF)

1 Ac ! ! ! 2 Acs ! ! ! 2 Acs ! ! !
O qual é o próprio NENHUM DO PACIENTE 1 Ac do paciente (primário)
conjugado! (ambos são fornecidos
pelo KIT!)
+
1 Ac (secundário) conjugado ao
fluorocromo.
 RADIOIMUNOENSAIO (RIE)

Reação de competição por um receptor comum entre uma substância a

ser determinada e a mesma substância marcada radioisotopicamente.

Componentes
•Anticorpo radioativo
•Antígeno radioativo
•Amostra a ser testada
•Leitor radiométrico
Leitor radiométrico
 RIE DE COMPETIÇÃO COM Ag MARCADO
• Inicialmente, uma quantidade conhecida
de anticorpos específicos é colocada na
fase sólida.
• Em seguida, adiciona-se o antígeno
marcado com 125 I.
• Uma amostra de soro de um paciente
suspeito é então acrescentada.
• O antígeno, se presente no soro, compete
com o antígeno radioativo pelos sítios de
ligação nos anticorpos.
Y
Y

Y • A quantificação é feita em aparelho

Antígeno marcado
Antígeno do soro
específico para a leitura de radioatividade.
Y Anticorpo específico
 Características Básicas:
Quimioluminescência (RQ)
• Método imunológico baseado na EMISSÃO DE ENERGIA LUMINOSA a partir de uma
reação química (reação de oxidação).

• Reação de oxidação faz com que ocorra a excitação de uma molécula e assim que ela
retorna ao seu estado normal emite uma certa quantidade de luz visível.

• Quantifica antígeno ou anticorpo presente em fluidos corporais.

• Muito usado para dosagens de hormônios, marcadores tumorais e outras proteínas

séricas.

• Um dos métodos de escolha para substituir o RIE.

• A emissão de luz é detectada por aparelhos (Luminômetro).

Luminômetro
 Quimioluminescência
(RQ)
VANTAGENS:

• Opção de ensaio com elevada sensibilidade e especificidade adequada.

• Exame basicamente AUTOMATIZADO e rápido.

• Várias amostras podem ser analisados e distintas moléculas podem ser

quantificadas de uma só vez.
 Quimioluminescência
(RQ)
COMPOSTOS QUIMIOLUMINESCENTES (substratos) USADOS:

Derivados de Luminol

• Necessita de um catalisador.
• Apresenta uma série de interferências de fundo ao emitir sua luz.
• Reação lenta e gradual.
• Dependente de pH
 Quimioluminescência
(RQ)
COMPOSTOS QUIMIOLUMINESCENTES (substratos) USADOS:

Ésteres de Acridina
• Não requer um catalisador.
• Baixas interferências de fundo.
• Muito estável, grande vida média.
• Tempo de reação rápido – medição mais fácil
• Alta sensibilidade.
 Quimioluminescência
(RQ)
PASSOS DA TÉCNICA:

• A técnica se baseia na ligação de antígeno/anticorpo.

• Um dos dois reagentes é conjugado a uma substância que, quando ativada, emite
luz visível.

• Então, a emissão de luz é proporcional ao reagente pesquisado.

• Os tipos mais utilizados são: competição e sanduíche ( = pesquisa direta).

Enzimas: Peroxidase ou Fosfatase Alcalina
Microesferas de Polietileno
 Exemplo:
RQ tipo sanduíche
 Quimioluminescência
(RQ)
PASSOS DA TÉCNICA:

• Estes fótons são medidos través de um fotomultiplicador (Luminômetro) que tem a

função de transformar a luz emitida pelos fótons em impulsos elétricos.

• Estes impulsos são lidos em “contagens” de luz por segundo (cps). Essa unidade é
proporcional a quantidade de antígenos presentes na amostra.
 1
RQ Tipo Sanduíche
1) Fase sólida em que uma microesfera de poliestireno é revestida com Ac contra o Ag específico.

2) Adição de soro do paciente.

3) O conjunto é incubado com agitação intermitente.

4) Lavagem para retirada de Ag não fixado.

5) Adição de Ac monoclonal, anti-Ag pesquisado, conjugado à enzima. O conjunto é incubado.

2
6) Lavagem para retirada de Ac conjugado à enzima, não fixado.

7) Adição de substrato da enzima.

8) O substrato quimioluminescente sofre hidrólise na presença da enzima, produzindo

3
substâncias que culminam com emissão de luz.

8 7 6 5
 Responda:
• Descreva a diferença da Quimioluminescência (RQ) para: ELISA, RIF e RIE.

• Descreva as Características Básicas da RQ

• Cite as vantagens da RQ.

• Quais os dois Compostos (substratos) Quimioluminescentes mais utilizados? E as

enzimas ?
 Técnicas Imunológicas
• RIE (Radioimunoensaio)  Ligação Ag/Ac é revelada através de RADIOISÓTOPOS (substâncias atômicas com núcleos
instáveis que emitem luz quando se transformam num estado mais estável).  Isto é: Conjugado será Ag OU Ac
marcados com radioisótopos!

• ELISA (Ensaio Imunoenzimático)  Ligação Ag/Ac é evidenciado através de REAÇÃO QUÍMICA (enzima + substrato),
gerando uma coloração após essa reação.  Conjugado: Ag OU Ac marcados com enzima! (Último passo da técnica
deve se adicionar um substrato para reagir com a enzima e gerar a coloração).

• RIF (Imunofluorescência)  Ligação Ag/Ac é revelada por FLUORESCÊNCIA gerada pela luz UV que excitará moléculas
de fluorocromo.  Conjugado é SEMPRE Ac ligado a um fluorocromo (partícula que será excitada e gerará luz na
presença de luz UV fornecida pela microscopia de fluorescência).

• RQ (Quimioluminescência)  Ligação Ag/Ac é revelada por REAÇÃO QUÍMICA que gera luz (NÃO COR, como no
ELISA). A luz emitida é oriunda de reação de oxidação, não por excitação da molécula por luz UV (como acontece no
RIF).  Conjugado é Ag OU Ac ligado a enzima Peroxidase ou FA e o substrato é o Luminol ou Ésteres de Acridina.
 Fixando
Aprendizagem...
Amostra do paciente = raspagem de tecido. Ou seja, teste é realizado diretamente sobre a
amostra fixada em lâmina.
Ag específico para o Ac que se quer pesquisar é fixado na
lâmina.
com RADIOISÓTOPO