TESTES SOROLÓGICOS

IMUNOENSAIOS OU SOROLOGIA

 Testes que se baseiam da detecção de imunocomplexos

(IC);

 Parâmetros intrínsecos e extrínsecos;

 Reflete a situação clínica do paciente no momento da
colheita da amostra;
 Precisão ser bem avaliado;
 Rápidos;
 Simples;
 Baixo custo operacional
 MÉTODOS

 IMUNOPRECIPITAÇÃO
- Imunodifusão dupla
- Imunodifusão radial
APLICAÇÕES
- Imunoeletroforese
- Nefelometria
- Turbidimetria - Pesquisa
- Diagnóstico
 IMUNOAGLUTINAÇÃO
- Aglutinação direta e indireta
- Soroepidemiologia
- Inibição da aglutinação
- Teste de Coombs
- Floculação

 IMUNOCONJUGADOS
- RIA
- ELISA
- Imunofluorescência
- Western Blotting
- Quimiluminescência
- Imunocromatografia
 PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO

 Precipitação:
Formação de complexos Ag/Ac.

 Aglutinação:
É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas
de Ac que se ligam a Ag na superfície de partículas
adjacentes.

 As reações de precipitação e de aglutinação

decorrem, respectivamente da ligação entre o Ac e Ag
solúvel e particulado.
 REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO

 Interação entre Ac e Ag solúvel

 Ac precisa ser bivalente
 Ag precisa ser bi ou polivalente
 A reação pode ser afetada pelo n° de sítios de ligação
que cada Ac possui para seu Ag VALÊNCIA

PRECIPITADO
 É importante levar-se em conta como ocorre a
ligação Ag-Ac em diferentes concentrações
dos mesmos. Observe abaixo:

Anticorpo livre + - -
Antígeno livre - - +

100%--
Percentual
de

complexo
imune

precipitado Zona de excesso Zona de Zona de excesso

de anticorpo equivalência de antígeno
Quantidade de antígeno adicionado
TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL
IMUNODIFUSÃO
Imunodifusão Dupla:

• Coloca-se agarose sobre uma lâmina:

• Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as

soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo:

Ac
IMUNODIFUSÃO DUPLA
 As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram
em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de
uma linha de precipitação:

 Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das

proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com
corante

Utilização: muito usada em

pesquisa e diagnóstico de
algumas doenças, como
Ag Ag cisticercose

Ac

Ag Ag Ag Ag

Ac Ac
IMUNODIFUSÃO RADIAL

 Permite a quantificação do
antígeno ou do anticorpo.
 O processo continua até ser
atingida a zona de equivalência,
com os complexos precipitando-se
em um anel (halo) em torno do
orifício.

Utilização: dosagem
Poços onde são
de IgG, IgA e IgM e
colocados padrões
proteínas séricas.
e amostras a serem
dosados
Agarose
contendo Halo de precipitação
anticorpos IgG – anti-IgG
anti-IgG humana
IMUNOELETROFORESE
 Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são
separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica.
 As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de
acordo com os seus PM e cargas elétricas.
 Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se
difunde.
 Ag e Ac formam arcos de precipitação.

1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na canaleta

coluna

Ag
canaleta
+ -
Ag

3- Difusão e precipitação
 MÉTODOS

 IMUNOPRECIPITAÇÃO
- Imunodifusão dupla
- Imunodifusão radial
APLICAÇÕES
- Imunoeletroforese
- Nefelometria
- Turbidimetria - Pesquisa
- Diagnóstico
 IMUNOAGLUTINAÇÃO
- Aglutinação direta e indireta
- Soroepidemiologia
- Inibição da aglutinação
- Teste de Coombs
- Floculação

 IMUNOCONJUGADOS
- RIA
- ELISA
- Imunofluorescência
- Western Blotting
- Quimiluminescência
- Imunocromatografia
 REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO

 Ac + Ag multivalente particulado
 Título: maior diluição que ainda causa aglutinação
(semi-quantitativo)
 Pró-zona: excesso de Ac
 Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga
elétrica (repulsão)
 Agregação visível de partículas = Eritrócitos, bactérias,
fungos e látex
 REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO

 Vantagens:
 Elevada sensibilidade;
 Baixo custo;
 Leitura visual;
 Facilidade na execução.

 Desvantagens:
 Reprodutibilidade dos lotes de reagentes;
 Acessibilidade molecular para interação Ag-Ac;
 Estabilidade da ligação Ag- Ac ao suporte.
AGLUTINAÇÃO DIRETA

Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação

Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)

1) Amostra de sangue na placa teste:

2) Reagente (anticorpo anti A, B):

AGLUTINAÇÃO DIRETA
4) Mistura-se:

3) Controle negativo:

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AGLUTINAÇÃO DIRETA

5) Leitura do resultado:

negativo positivo

Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação

visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como
ilustrado acima.

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AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)
Ag solúveis associados a outras superfícies
(Partículas de látex ou superfície de hemácias)

Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de

Chagas:

• As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação

covalente) e então distribuídas nos poços da placa.

• O soro teste e os controles positivos e negativos,

devidamente diluídos, são adicionados aos poços da
referida placa.

• Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se

aglutinam e formam uma camada no fundo do poço.
Quando não existe Ac específico, as células formam um
botão no fundo do poço.
Aglutinação Positiva
Negativa
INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO
Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)

+ Resultado negativo:
Urina (ausência de hCG na
Soro anti - hCG
urina).
Adicionam-se Partículas Ocorre aglutinação,
revestidas com hCG pois os anticorpos
São incubados e
colocados numa anti-hCG não são
placa bloqueados na
incubação inicial,
porque não havia o
hormônio na urina.
Resultado positivo:
(presença de hCG
Livres, podem
na urina): não ocorre aglutinar as partículas
aglutinação. revestidas de hCG.

Ac se ligaram no hCG da urina,

(ficando bloqueados), na incubação inicial
TESTE DE
COOMBS
 Ac antiimunoglobulinas (Robert
Coombs);
 DHRN – mãe produz IgG anti-Rh;
 Não aglutinam os eritrócitos;
 Direto: Ac ligados aos
eritrócitos fetais;
 Indireto: Ac anti-Rh não
aglutinantes no soro materno.
 Permite detectar
incompatibilidades Rh,
prevenindo contra DHRN.
FLOCULAÇÃO
 MÉTODOS

1) Reagentes não marcados

• Reação de precipitação
• Reação de aglutinação

2) Reagentes marcados
• RIA
• ELISA
• Imunofluorescência
• Western Blotting
 IMUNOENSAIOS
 Reagentes marcados (fluorocromos, enzimas,
isótopos);

 Tipos:
- IFA;
- ELISA;
- RIA;
- WESTERN BLOTTING;
- Quimiluminescência;
IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
Princípio da técnica:

 Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo

covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando
excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível;
 Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo
conjugado pode ser usado para detectar um determinado
antígeno e vice-versa;
 A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais
finas que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio
com luz UV (microscópio de fluorescência);

 Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de

fluoresceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil
rodamina – TRICT). Tipos: direta, indireta ou saduíche.
Microscópio de fluorescência com epiluminação

fluorescência emitida
luz UV atinge o ma- chega ao observador
terial examinado
TIPOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
APLICAÇÃO DA TÉCNICA
IFA direta:
 Detecçãodireta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes,
em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células
tumorais.

IFA indireta:
 Diagnósticosorológico de várias doenças infecciosas como a Doença
de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-
imunes.

Éuma técnica onde se consegue alta sensibilidade (fluorescência é

mais intensa) e especificidade.
 ELISA

 Imobilização na placa de Ag ou Ac, utilizando um conjugado (

Ag ou Ac) com enzima.

Fosfatase alcalina
Peroxidase
B-galactosidase

 O produto final corado surge por ação da enzima que converte

um substrato incolor em um produto colorido.

 A quantidade de Ag ou Ac produto final corado,

através de leitura em fotocolorímetro.

 Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e

captura.
TIPOS DE ELISA: DIRETO E INDIRETO

INDIRETO DIRETO OU PLACA

SANDUÍCHE UTILIZADA
 ELISA

 Aplicações do ELISA:
 Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de
Pesquisa

 Vantagens:
 Teste de alta sensibilidade
 Permite quantificar Ag ou Ac das amostras
 Seguros e de baixo custo
 WESTERN BLOTTING
 Eletroforese de
proteínas.
 Identifica
antígenos ou
anticorpos.
WESTERN BLOTTING
WESTERN BLOTTING
RADIOIMUNOENSAIO - RIA
 Marcações:
 I125: emite raios gama

 Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g)

 Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo.
 Aplicações:
Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios,
proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa
-Quimiluminescência
 IMUNOENSAIOS LÍTICOS
 Permite a detecção de Ac ou Ag, apresentado
como produto final, presença ou ausência de
hemólise;

 Dois tipos:
 Ensaio Líticos com Sistema Complemento;
 CH50- Dosagem de Complemento;
 Reação de Fixação de complemento.

 Ensaio Líticos com Toxinas Bacteriana;

 Inibição de hemólise
 SISTEMA COMPLEMENTO
 É constituído de varias proteínas que são
encontradas no plasma ou ligadas como
receptores de membrana.
 COMPLEXO DE ATAQUE À MEMBRANA
MAC
• Proteínas terminais do complemento se unem para formar poros
nas membranas - MAC
C5b,6,7 C5b,6,7 se liga C8 se liga e se C9 se liga e 10 a 16 C9 -
a membrana insere na memb polimeriza poro

Lesão na membrana Lesão na membrana Poro formado - MAC

 DESTRUIÇÃO DE
MICROORGANISMOS PELO MAC

COMPLEMENTO

BACTÉRIA FLUIDOS E SAIS

 CH50-DOSAGEM DE COMPLEMENTO
 Avalia a capacidade funcional do SC pela via
clássica a partir da mensuração da hemólise da
hemácia de carneiro revestido por Ac.
 INIBIÇÃO POR HEMÓLISE
 ASLO ( Pesquisa de
anticorpos
antiestreptolisina O);
 Diagnóstico de
Infecções crônicas por
Streptococcus β-
hemolítico do grupo A

 SLO ( estroptolisina O)
 REFERÊNCIAS
 SILVA, A. G. T. Imunologia Aplicada - Fundamentos,
Técnicas Laboratoriais e Diagnósticos. 1 ed. São Paulo:
Editora Saraiva,2014.
 MARTINS, M. A. et al . Clínica medica - volume 7: alergia e
imunologia clinica, doenças da pele, doenças infecciosas e
parasitarias. 2 ed. São Paulo: Editora Manole, 2009
 VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO. E.C. Imunoensaios:
fundamentos e aplicações. Rio de janeiro: Guanabara Koogan,
2016.
 FERREIRA, A.W., ÁVILA, S. Diagnóstico laboratorial das
principais doenças infecciosas e autoimunes. 2.ed. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.
 PEAKMAN, Mark; VERGANI, Diego. Imunologia básica e
clinica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1999.
 SILVA, Wilmar Dias da. Bier imunologia: básica e aplicada. 5
ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2003.