10/09/2018

IMUNOENSAIOS
Prof. Msc. Rodrigo Macedo

Imunoensaios Imunoensaios
Metodologias que utilizam:
Designa o diagnóstico por técnicas imunológicas que
revelam a presença de determinado antígeno (Ag) ou 1) Reagentes não marcados
anticorpo (Ac) no organismo. • Reação de precipitação
• Reação de aglutinação

2) Reagentes marcados
• ELISA
• Western Blot
• Imunofluorescência

Podem ser manuais, semi ou totalmente automatizadas

Imunoensaios NÃO-Marcados
• Imunoprecipitação
➢Meio líquido
➢Precipitação em gel

Imunoensaios NÃO-marcados • Imunoaglutinação

➢Aglutinação direta
➢Aglutinação indireta

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PRECIPITADO

Ac+Ag
Vantagens e Desvantagens Imunoprecipitação
• Técnicas rápidas • Interação Antígeno-Anticorpo solúveis que permite a observação de
• Homogêneas uma rede que desenvolve um precipitado visível.
• Baixo custo Anticorpos (Ac)
• Boa especificidade
+ zona de
• Sensibilidade reduzida pró-zona equivalência pós-zona
➢ Baseia-se na formação de
• Dificultam automação Antígenos (Ag) malha ou rede, alternando
• Problemas com reprodutibilidade moléculas de antígeno
(Ag) e anticorpo (Ac), que
quando atinge o
• Direta – detecta AG equilíbrio (zona de
equivalência) ocorre
• Indireta – detecta AC precipitação.

Imunodifusão
➢Utiliza uma matriz em gel de ágar (agarose)

➢Na matriz pode ser adicionado o antígeno ou anticorpos

➢ A ligação do Ag + Ac forma linha de precipitação visível

➢Imunodifusão Radial Simples

➢Imunodifusão Dupla e Outcherlony

Imunodifusão Simples Radial

Método de Mancini
- Ag ou Ac imobilizado no
gel – Migração do Ag ou Ac
da solução teste no gel, até
atingir região de
concentração equivalente;

A. na placa existe anticorpo que

foi adicionado ao gel (anti-S)
B. incuba-se com antígeno (S),
C. O antígeno espalha-se no gel
D. Reação antígeno e anticorpo (anti-S)

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Imunodifusão Dupla (Outcherlony) Nefelometria

• Ocorre também em gel
• Anticorpos e antígenos são adicionados ao gel
• O encontro dos dois Ac e Ag forma um linha visível no gel

Imunoaglutinação
Ag ou Ac, está adsorvido a partículas ou células, o que facilita em muito a
visualização do complexo Ag-Ac na forma de agregados.

Aglutinação Direta Aglutinação Direta

• Na aglutinação direta, o antígeno faz parte naturalmente da • Aplicações: Identificação de grupo sanguíneo, diagnóstico de
partícula/célula, como por exemplo, antígenos eritrocitários (sistema mononucleose infecciosa, toxoplasmose, brucelose, salmonelose,
ABO) em hemácias humanas, antígenos O, H e Vi na Salmonella, etc. leptospirose.
Antígeno está presente naturalmente na célula
▪ hemácias
▪ bactérias
▪ protozoários
▪ fungos

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Aglutinação Indireta ou Passiva

Partículas ou células são sensibilizadas com antígenos ou anticorpos.

➢EXEMPLO. O teste de VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) utilizado

para diagnóstico da Sífilis usa como suporte colesterol, lecitina e o antigeno
que é a cardiolipina .

Hemaglutinação Passiva
Sinal positivo Sinal negativo

POSITIVO NEGATIVO

Hemaglutinação Passiva Reação de Fixação do Complemento

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Reação de Fixação do Complemento

Imunoensaios Marcados
Detectam ou quantificam ligação Ag – Ac havendo sempre um
reagente marcado que permite a detecção

Imunoensaios Marcados Imunoensaios Marcados

• Alta sensibilidade • ELISA (EIA)
• Boa especificidade • Imunofluorescência (IFA)
• Direta – detecção de antígeno • Western Blot
• Indireta – detecção de anticorpo
• Competição – amostra compete com reagente marcado (dose
conhecida do antígeno ou anticorpo)
• Alto custo

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ELISA Indireto
ELISA
• Enzyme Linked Imunno Sorbent Assay

• Capaz de detectar < [ ] de Ag e Ac.

• Reagente ligado a uma enzima.
ELISA Direto ou Sanduíche ELISA KIT.wmv

• Sensibilidade, especificidade e baixo custo.

• Uso para detecção de doenças, partículas virais, hormônios, tumores

e interleucinas.

Elisa direto de captura ou Sanduíche Elisa direto de Competição

• Lavagem = remoção de

Elisa Indireto Tipos de ELISA

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Vantagens do Elisa Etapas do ELISA goo.gl/pv7RXq

• Qualitativo = visual • 1. Incubação do soro de paciente com antígeno (já está na placa) por
• Possibilita D.O. = quant. Espect. 1h
• Permite titulação. • 2. lavagem da placa com solução fisiológica tamponada (significa que
está em pH neutro), esta etapa retira o excesso de soro.
• 3. Incubação com o anticorpo conjugado com enzima por 1h
• 4. lavagem da placa com solução fisiológica tamponada (significa que
está em pH neutro), esta etapa retira o excesso de soro.
• 5. Incubar com substrato (para nitrofenol fosfato)
• 6. Esperar a formação de cor amarela para positivo

Imunofluorescência Imunofluorescência
Capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a Fluorocromos são substâncias que, quando excitadas com luz
fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno. ultravioleta emitem luz.

Vantagens: estáveis, absorção e fluorescência no espectro visível. • Fluorocromos mais utilizados:

• isotiocianato de fluoresceína FITC

1.Direta- usa só um anticorpo primário marcado • rodamina (RB-200) Texas Red

2.Indireta – usa anticorpo primário + anticorpo secundário conjugado
• R- ficoeritrina
Orange

Imunofluorescência Microscópio Automatizado para IFA

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Imunofluorescência Direta Imunofluorescência Direta

• Anticorpo conjugado com fluorocromo
• Vantagens: alta sensibilidade e especificidade. Pode localizar
antígenos que estão intracelulares.
• Desvantagem: um fluorocromo
para cada antígeno.

Imunofluorescência Indireta
• Uso de anticorpo primário + anticorpo secundário conjugado com o
fluorocromo.

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Western Blotting 1. Separação por Eletroforese

1. A proteínas são colocadas 2. Esta figura mostra as proteínas
em gel de poliacrilamida separando-se
• Immunoblotting ou Imunoeletrotransferência

A técnica de WB baseia-se numa combinação de três métodos muito

aplicados em biologia molecular:
1.a separação de macromoléculas através de eletroforese em gel de
poliacrilamida SDS
2.sua transferência eletrolítica para membranas de nitrocelulose
3.O ensaio de revelação, utilizando anticorpos marcados por enzimas,
radionuclídeos, fluorocrômos,

Eletroforese em Western Blotting 2. Transferência para Nitrocelulose

3. Após a eletroforese as proteínas aparecem em bandas coradas com
Corante Azul de Comassie

Membrana de
Gel de acrilamida
nitrocelulose

3. Revelação

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Radioimunoensaio
• Utilização de isótopos radioativos – I125 ou I131
• Primeira técnica com reagente marcado (1956)
• Vantagens: quantitativo, rapidez, precisão
• Desvantagens: alto custo, baixa vida média, risco operacional
• Uso: marcadores tumorais, hormônios

• O reagente marcado é radioativo e quantifica o Ag ou Ac.

Técnicas Imunoenzimáticas
• Ac ou Ag marcados com enzimas = conjugado

• Processo fácil de ser quantificado

• Estável
• Custo acessível

• Ex: Fosfatase alcalina, peroxidase.

• Pode ser cromogênico, fluorescente ou quimioluminescente.

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