INTERAÇÕES

ANTÍGENO-ANTICORPO

Detecção, quantificação e
caracterização dos
anticorpos e seu uso como
ferramenta para pesquisa e
diagnóstico
RESPOSTA DE ANTICORPOS
lEspecificidade
Habilidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ag.
lQuantidade
N° de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após sua
produção.
lIsotipo
Determina a persistência (meia vida in vivo diferente).
A composição determina a função dos Ac e os locais onde são
encontrados.
lAfinidade
Força de ligação do Ag com o Ac, em um único sítio. Quanto maior
a afinidade entre Ac e Ag, menos Ac será necessário.
lAvidez: força total de ligação, nos dois sítios.
Avidez x Afinidade
INTERAÇÕES
lReações reversíveis.
reversíveis

lLigações não covalentes:

Pontes de hidrogênio
Interações hidrofóbicas
Interações de Van der Waals
Ligações iônicas
MÉTODOS

1) Reagentes não marcados

• Reação de precipitação
• Reação de aglutinação

2) Reagentes marcados
• RIA
• ELISA
• Imunofluorescência
• Western Blotting
MÉTODOS
l PRECIPITAÇÃO APLICAÇÕES
- Imunodifusão dupla
- Imunodifusão radial - Pesquisa
- Imunoeletroforese
- Diagnóstico
l AGLUTINAÇÃO
- Soroepidemiologia
- Aglutinação direta e indireta
- Inibição da aglutinação
- Teste de Coombs
l IMUNOENSAIOS
- RIA
- ELISA
- Imunofluorescência e Citometria de Fluxo
- Western Blotting
PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO
lPrecipitação:
Formação de complexos Ag/Ac.

lAglutinação:
É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas
de Ac que se ligam a Ag na superfície de partículas
adjacentes.

lAs reações de precipitação e de aglutinação decorrem,

respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúvel e
particulado.
REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO
l Interação entre Ac e Ag solúvel
l Ac precisa ser bivalente
l Ag precisa ser bi ou polivalente
l A reação pode ser afetada pelo n° de sítios de ligação
que cada Ac possui para seu Ag VALÊNCIA

PRECIPITADO
 É importante levar-se em conta como ocorre a
ligação Ag-Ac em diferentes concentrações dos
mesmos. Observe abaixo:

Anticorpo livre + - -
Antígeno livre - - +

100%--
Percentual
de

complexo
imune

precipitado
Zona de excesso Zona de Zona de excesso
de anticorpo equivalência de antígeno

Quantidade de antígeno adicionado

TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL

IMUNODIFUSÃO
Imunodifusão Dupla:

•Coloca-se agarose sobre uma lâmina:

•Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções

testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo:

Ac
IMUNODIFUSÃO
DUPLA
l As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se
encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela
formação de uma linha de precipitação:
l Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das
proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com
corante
Utilização: muito usada em
pesquisa e diagnóstico de
algumas doenças, como
Ag Ag cisticercose

Ac

Ag Ag Ag Ag

Ac Ac
IMUNODIFUSÃO
RADIAL
l Permite a quantificação do
antígeno ou do anticorpo.
l O processo continua até ser
atingida a zona de equivalência,
com os complexos precipitando-
se em um anel (halo) em torno
do orifício.

Utilização: dosagem
de IgG, IgA e IgM e Poços onde são
proteínas séricas. colocados padrões
e amostras a serem
dosados
Agarose
contendo Halo de precipitação
anticorpos IgG – anti-
anti-IgG humana IgG
IMUNOELETROFORES
E
l Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são
separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica.
l As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de
acordo com os seus PM e cargas elétricas.
l Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se
difunde.
l Ag e Ac formam arcos de precipitação.

1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na canaleta

coluna

Ag
canaleta
+ -
Ag

3- Difusão e precipitação
REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
l Ac + Ag multivalente particulado
l Título:maior diluição que ainda causa aglutinação
(semi-quantitativo)
l Pó-zona: excesso de Ac
l Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga
elétrica (repulsão)
l Agregação visível de
partículas = Eritrócitos,
bactérias, fungos e látex
AGLUTINAÇÃO DIRETA
Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação

Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)

1) Amostra de sangue na placa teste:

2) Reagente (anticorpo anti A, B):

AGLUTINAÇÃO DIRETA
4) Mistura-se:

3) Controle negativo:
AGLUTINAÇÃO DIRETA

5) Leitura do resultado:

negativo positivo

Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível

(aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como ilustrado acima.
AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)
Ag solúveis associados a outras superfícies
(Partículas de látex ou superfície de hemácias)

Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de

Chagas:

•As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação

covalente) e então distribuídas nos poços da placa.

•O soro teste e os controles positivos e negativos,

devidamente diluídos, são adicionados aos poços da
referida placa.

•Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se

aglutiname formam uma camada no fundo do poço.
Quando não existe Ac específico, as células formam um
botão no fundo do poço.
Aglutinação Positiva
Negativa
INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO
Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)

+ Resultado negativo:
Urina Soro anti - hCG (ausência de hCG na
urina).
Partículas Ocorre aglutinação,
Adicionam-se
revestidas com hCG pois os anticorpos
São incubados e anti-hCG não são
colocados numa bloqueados na
placa incubação inicial,
porque não havia o
hormônio na urina.
Resultado positivo: Livres, podem
(presença de hCG aglutinar as partículas
na urina): não ocorre revestidas de hCG.
aglutinação.

Ac se ligaram no hCG da urina,

(ficando bloqueados), na incubação
inicial
TESTE DE
COOMBS
Ac antiimunoglobulinas (Robert
Coombs);
DHRN – mãe produz IgG anti-Rh;
Não aglutinam os eritrócitos;
Direto: Ac ligados aos
eritrócitos fetais;
Indireto: Ac anti-Rh não
aglutinantes no soro materno.
Permite detectar
incompatibilidades Rh, prevenindo
contra DHRN.
IMUNOENSAIOS
l Reagentes marcados (enzimas,
fluorocromos, isótopos)
l Tipos:
- RIA
- ELISA
- IFA / CITOMETRIA DE FLUXO
- WESTERN BLOTTING
IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
Princípio da técnica:

l Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente)

a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por
radiações UV, emite luz no espectro visível.
l Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo
conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e
vice-versa.
l A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas
que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV
(microscópio de fluorescência).
l Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína –
FITC) e rodamina(isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT).
Tipos: direta, indireta ou saduíche.
Microscópio de fluorescência com
epiluminação

fluorescência emitida
luz UV atinge o ma- chega ao observador
terial examinado
TIPOS DE
IMUNOFLUORESCÊNCIA
APLICAÇÃO DA TÉCNICA
IFA direta:
lDetecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes,
em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células
tumorais.

IFA indireta:
lDiagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença
de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-
imunes.

lÉ uma técnica onde se consegue alta sensibilidade (fluorescência é mais

intensa) e especificidade.
IMAGENS
CITOMETRIA DE FLUXO
Ferramenta que detecta e quantifica células individuais passando
em uma corrente através de um feixe de Laser.
Separa as células por fluorescência ativada.
Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente.
É um teste qualitativo e quantitativo.

APLICAÇÕES
Tipo de linfócitos;
Quantidade, tamanho, granulosidade;
Isolamento de populações celulares;
HIV
 Ensaio Imunoadsorvente
Ligado à Enzima - ELISA
O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois
conjugados com enzimas.

Fosfatase
alcalina
Peroxidase
B-galactosidase
O produto final corado surge por ação da enzima que converte
um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato
alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância
indicadora).
A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através
de leitura em fotocolorímetro.
Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e
captura.
TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto

INDIRETO DIRETO OU PLACA

SANDUÍCHE UTILIZADA
 ELISA
Indireto

ELISA Direto ou Sanduíche

 ELISA
Competitivo

ØAplicações do ELISA:
§Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa

ØVantagens:
§Teste de alta sensibilidade
§Permite quantificar Ag ou Ac das amostras
§Seguros e de baixo custo
RADIOIMUNOENSAIO - RIA
Ø Marcações:
l I125: emite raios gama
l H3: raios beta
Ø Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g)
Ø Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo.
Ø Aplicações:
Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios,
proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa
WESTERN BLOTTING
l Eletroforese de
proteínas.
l Identifica
antígenos ou
anticorpos.
WESTERN BLOTTING
WESTERN BLOTTING