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Imuno-hematologia
Grupos sanguíneos = polimorfismos antigênicos presentes na superfície de eritrócitos.

Sistema ABO
É o sistema de antígenos em eritrócitos humanos mais comumente usado como sistema de grupo sanguíneo para
aplicações forenses.

Dois tipos de antígenos (A e B), dão origem a quatro grupos sanguíneos:

 A: possuem o antígeno A
 B: possuem o antígeno B
 AB: possuem os antígenos A e B
 O: não possuem nenhum dos antígenos

Esses antígenos podem ser encontrados em outros fluidos corporais também, como fluido amniótico, saliva,
sêmen, assim como em muitos órgãos incluindo rim, pâncreas, fígado e pulmão.

Biossíntese dos antígenos

Todos os indivíduos normais produzem o Antígeno O, também conhecido como Antígeno H. Ele é sintetizado
pela fucosiltransferase, uma transferase de fucose codificada pelos genes FUT , que adicionam uma fucose no
fim de um glicolipídeo (em eritrócitos) ou glicoproteína (em tecidos).

Um monossacarídeo adicional é então transferido ao antígeno O por uma transferase codificado pelo lócus ABO.
A especificidade dessa enzima então determina o tipo sanguíneo:

 Alelo A: produz a A-transferase, que transfere N-acetilgalactosamina para o antígeno O e então dá origem
ao antígeno A
 Alelo B: produz a B-transferase, que transfere galactose ao antígeno O, e então sintetiza o antígeno B.
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 Alelo O: possui uma mutação (pequena deleção) que elimina a atividade transferase, então nenhuma
modificação no antígeno O ocorre.

Assim, os antígenos A e B diferem na sua molécula de açúcar terminal.

Subgrupos dos tipos A e B foram descritos, sendo os mais importantes os antígenos A 1 e A2: células contendo
antígenos A1 reagem mais fortemente com anticorpos anti-A do que células com A2. Aparentemente, células com
A1 contêm mais cópias do antígeno A do que células com A2.

Bases moleculares do sistema ABO


Gene ABO
 A-tranferases e B-transferases são codificadas com um único gene, o gene ABO, no cromossomo 9.
 Gene ABO é organizado em 7 éxons.
 Os alelos A e B diferem por quatro substituições de aminoácidos
 Os alelos A1 e A2 diferem em uma única deleção de nucleotídeo
 Subgrupos do tipo O também já foram reportados.

Herança dos antígenos A e B


 Alelos A e B são dominantes
o Em heterozigose com IO
 AO – transferase sintetiza o antígeno A
 BO – transferase sintetiza o antígeno B
o Em heterozigotos AB = codominância – ambas as transferases são expressas
 Homozigotos OO – não produzem nenhuma transferase, então não possuem nenhum dos antígenos

Prova de Coombs
O teste direto de antiglobulina é usado principalmente para determinar se uma anemia hemolítica (tipo de
anemia causado por destruição das hemácias) é provocada por anticorpos ligados a elas. Isso pode ocorrer em
anemias hemolíticas autoimunes, em que a pessoa produz anticorpos contra suas próprias hemácias.

O teste direto de antiglobulina também pode ser usado no diagnóstico de anemia hemolítica do recém-nascido,
resultado da incompatibilidade de grupos sanguíneos entre a mãe e o bebê. Esta era uma causa frequente de
anemia hemolítica em recém-nascidos, mas hoje é rara devido ao tratamento da mãe durante e após cada
gravidez. A incompatibilidade mais frequente entre mãe e bebê é do grupo ABO, especialmente em mães do
grupo O.

O teste direto de antiglobulina também é usado no diagnóstico de reações transfusionais. Quando há suspeita
de reação transfusional hemolítica, o teste é feito para determinar se há anticorpos nas hemácias transfundidas.
Hemácias revestidas com anticorpos são destruídas ou removidas da circulação com maior rapidez que as
hemácias normais.

Coombs direto
 Identifica a presença de anticorpos fixados sobre as hemácias.
 Adição de anticorpos anti-globulina humana
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 Diagnóstico de anemia autoimune (diferencia de outras anemias hemolíticas)


 Diagnóstico de anemia hemolítica do recém-nascido
 Diagnóstico de anemia hemolítica induzida por drogas (resulta na produção de anticorpos contra
eritrócitos)

Coombs indireto
 Identificação de anticorpos antieritrocitários no soro
 Avaliação de gestantes Rh negativo  detecção de anticorpos anti-D circulantes em mães Rh negativo
sensibilizadas
 Triagem de anemias hemolíticas
 Fases pré-transfusionais
 Fenotipagem de hemácias
 Realizado em 4 etapas:
o Fase fria (temperatura ambiente)
o Fase em meio proteico
o Fase quente (37ºC)
o Fase aglutininas IgG e anticorpos fixadores de complemento

Anti-soros do sistema ABO


Padrões de aglutinação de certos eritrócitos: A, B, O.

 Anti-A – ocorre naturalmente no soro de todos os indivíduos do grupo B


 Anti-B – ocorre naturalmente no soro de todos os indivíduos do grupo A
 Anti-A, anti-B – ocorrem naturalmente no soro de todos os indivíduos do grupo O.

São potentes IgM ou IgG e determinam forte aglutinação direta. São capazes de ativar a cascata do complemento,
determinam reação transfusional grave e doença hemolítica peri-natal de forma clínica moderada.

Prova direta
Consiste em pôr em contato soros-teste conhecidos (anti-A, anti-B e anti-AB), com glóbulos vermelhos para se
identificar a presença dos antígenos.

Prova reversa (prova de Simonin)


Pesquisa do anticorpo no soro do paciente. Deve ser feito com hemácias tipadas A e B.
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Antígenos A, B e H das secreções


Além dos eritrócitos, indivíduos cujos antígenos A, B e O podem ser encontrados em outros tipos de fluidos
corporais são chamados de secretores. 80% dos caucasianos são secretores.

O antígeno O é sintetizado por uma fucosiltransferase codificado por genes FUT. O cromossomo 19 contém dois
genes homólogos:

 FUT1 – expresso nos tecidos de origem mesodérmica (tecidos embrionários que servem de precursores
para tecidos hematopoiéticos, músculo, esqueleto, e órgãos internos)  responsável pela síntese do
antígeno O nos eritrócitos. É o chamado “gene H”.
 FUT2 – expresso nos tecidos de origem endodérmica (tecidos embrionários que são precursores do
estômago e outros órgãos internos)  responsável pela síntese do antígeno O nas secreções. É o
chamado gene Secretor.

Não-secretores
Cerca de 20% dos caucasianos são homozigotos para
uma mutação no FUT2, resultando em uma proteína
truncada (alelo não-secretor se). Fluidos corporais de
pessoas tipo A ou B não-secretores (homozigotos para
a mutação no FUT2 - sese) não contêm antígenos A ou
B apesar de conterem transferases A e B ativas.

Esse problema pode ser investigado em casos de


estupro onde o tipo sanguíneo da evidência de sêmen
precisa ser determinada.

No entanto, não-secretores têm antígenos O em


eritrócitos sintetizados pelo FUT1 e então têm os
antígenos A ou B no sangue.

Indivíduos secretores podem ser homozigotos ou heterozigotos (SeSe ou Sese).

A relação entre o sistema ABO e o sistema secretor ABH na saliva e em outro líquidos orgânicos é um exemplo
de interação gênica não-alélica, que ocorre quando dois ou mais genes em lócus diferentes atuam juntos para
produzir um fenótipo. Quando um indivíduo possui o genótipo Sese ou SeSe, secreta os antígenos A, B e H tanto
nas hemácias quando nas secreções; quando possui genótipo sese (portanto, é não-secretor), secreta os
antígenos A, B e H apenas nas hemácias. Assim, o lócus secretor interfere na manifestação do lócus ABO.

Bombaim (Oh) / “Falso O”


Muito raramente, indivíduos carregando mutações homozigóticas (hh) no gene FUT1 (lócus H) produzem
eritrócitos deficientes de antígeno O, nos quais não ocorre expressão dos antígenos A nem B,
independentemente do genótipo ABO. As pessoas de fenótipo hh não produzem a enzima necessária para se
colocar o antígeno O/H na superfície das hemácias.

Desse modo, a sua ausência faz com que essas pessoas não apresentem quer o antígeno A, quer o B, nos
seus glóbulos vermelhos, mesmo que possuam alelos referentes à síntese dessas substâncias.
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Os indivíduos com o fenótipo de Bombaim podem doar sangue


para qualquer membro do sistema ABO (a não ser que outro
fator sanguíneo, como o Rh, seja incompatível), mas não
podem receber de nenhum membro do sistema ABO (cujo
sangue contém sempre um ou mais antígenos A, B e H);
somente recebem sangue de indivíduos com o fenótipo de
Bombaim.

Os testes costumeiros para o sistema ABO os apontam como


integrantes do grupo O, porém incompatibilidades
relacionadas a cruzamentos podem evidenciar o falso "O".

O teste para detectar se uma pessoa é realmente “O” ou falso “O” é feito aplicando-se o anticorpo anti-H em
uma gota de sangue.

 Se houver aglutinação, o indivíduo é um “O” verdadeiro, ou seja, “ii”.


 Se não ocorrer aglutinação, ele é falso “O”, podendo ser IAIA, IAi, IBIB, IBi ou IAIB.

Verificação do caráter secretor


Deve ser observado outro sistema de tipo sanguíneo – o sistema de Lewis, pois o gene que codifica o tipo de
secretor (gene Secretor) também codifica o Sistema Lewis.

No sistema de Lewis, é possível produzir dois antígenos: Lewisa e Lewisb. As pessoas podem ser:

 Lewis A-B+
o Também são secretores
o Os secretores – convertem todos os antígenos Lewisa na forma Lewisb (formando então Lewis B+)
o Genótipo: possuem pelo menos um gene funcional (Le) e um funcional secretor (Se)
 LeLe ou Lele + SeSe / Sese
 Lewis A+B-
o Também são não secretores
o Os não-secretores não convertem – formando Lewis A+
o Genótipo: possuem pelo menos um gene funcional (Le) mas são homozigotos para o Secretor
(sese)
 LeLe ou Lele + sese
 Lewis A-B-
o Não é possível utilizar esse teste. Nunca possuem característica +a ou +b no sangue ou secreções,
pois não têm capacidade de produzir substâncias Lewis.
o Podem ser secretores ou não secretores
o São homozigotos pro alelo recessivo le (lele)
o Possuem anticorpos Lewis, quase sempre IgM.
 Lewis A+B+  muito raro!!!
o São sempre secretoras ABH (SeSe/sese), porque senão não produziriam o B+
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Sistema de Lewis
Os antígenos Lewis fazem parte do esqueleto de proteínas (glicoproteínas) ou lipídeos (glicolipídeos). As
glicoproteínas Lewis podem ser encontradas nas secreções tais como, leite, saliva ou plasma. Glicolipídeos, ao
contrário, são encontrados ou em complexos com lipoproteínas circulantes no plasma, ou inseridos em
membranas celulares com a porção glicídica voltada para o ambiente extracelular. Os antígenos Lewis presentes
nos eritrócitos, plaquetas e macrófagos são adquiridos secundariamente do plasma (são o único grupo de
moléculas sintetizadas por células tissulares e depois absorvidas pelos glóbulos vermelhos).

O locus Lewis inter-relaciona sua genética bioquímicamente com o locus ABO, por tanto, é indispensável ter em
conta este sistema quando se estuda o ABO e os sistemas associados.

A expressão dos antígenos Lewis requer duas diferentes fucosiltrasferases (enzimas Se e Lewis), produtos de dois
diferentes genes (FUT2 e FUT3).

No recém-nascido, os antígenos Lewis são evidenciáveis nas secreções, mas só podem ser determinados nas
hemácias com segurança após os 2-3 anos de idade.

A enzima Lewis pode usar como substrato tanto o precursor tipo 1 como o precursor tipo 2. A enzima Lewis
adiciona uma fucose, em ligação α(1,4), no precursor tipo 1 (galactose) produzindo o antígeno Lea que não pode
ser posteriormente glicosilado. O antígeno Leb é sintetizado quando o antígeno H, gerado pela enzima Se a partir
do precursor tipo 1, é usado como substrato pela enzima Lewis.
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Imunoensaios
ELISA
É um imunoensaio enzimático envolvendo
reação antígeno-anticorpo específico ligado a
uma fase sólida, que se liga ao antígeno a ser
dosado e este por sua vez se liga a um outro
anticorpo específico marcado com uma enzima.
A reação da enzima com a fase sólida é medida
através da intensidade de cor produzida
(colorimétrica) (espectofotométrica) que é
proporcional a quantidade do antígeno presente
na amostra.

O modelo mais simples é conhecido como ELISA indireto, onde um antígeno que encontra-se aderido a um
suporte sólido (placa de ELISA) é preparado e, em seguida, colocado sobre os soros que estão sendo testados,
em busca de anticorpos contra o antígeno.

ELISA Direto ou Sanduíche – pesquisa do antígeno no soro.

Outro método é o chamado ELISA de bloqueio ou competição, em que a presença de anticorpos em determinado
soro é revelada pela competição com um anticorpo específico (mono ou policlonal) dirigido contra o antígeno.
Igualmente, o resultado é dado pela adição de um conjugado, porém a coloração aparecerá nos poços onde não
havia anticorpos.

ELFA
É um ensaio imunoenzimático fluorescente que associa o método sanduíche em duas etapas, com uma detecção
final por fluorescência. A reação antígeno-anticorpo é marcada com um anticorpo associado com uma enzima
fosfatase alcalina, que reagirá com um substrato que produzirá um composto fluorescente. A emissão de
fluorescência é proporcional a quantidade de Antígeno ou (anticorpo) presente na amostra.

Imunocromatografia
O sistema é realizado em uma matriz constituída de membrana de nitrocelulose ou de náilon coberta por acetato
transparente para facilitar a visualização do teste. O antígeno ou o anticorpo é fixado na membrana na forma de
linhas ou pontos e o restante da membrana é bloqueado com proteína inerte como nos testes imunoenzimáticos
(ELISA).

Para detecção de antígenos podem ser utilizados anticorpos fixados na linha de captura e como conjugado um
segundo anticorpo conjugado ao corante. Um dos métodos imunológicos desses testes emprega corante
insolúvel, como ouro coloidal (róseo) ou prata coloidal (azul marinho) como revelador da interação antígeno-
anticorpo.
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Imunofluorescência
Imunofluorescência é definida como uma técnica que possibilita a visualização de antígenos nos tecidos ou em
suspensões celulares, por meio da utilização de anticorpos específicos, marcados com fluorocromo, capazes de
absorverem a luz ultra-violeta (UV), emitindo-a num determinado comprimento de onda, permitindo sua
observação ao microscópio de fluorescência (com luz UV).

Direta
Utiliza-se esta técnica, também conhecida como técnica de camada simples,
para detecção de antígenos em amostras clínicas utilizando-se anticorpos
marcados com fluorocromos.

As indicações desta técnica são: detecção de vírus, parasitas, antígenos de


tumor de amostras ou monocamadas de células do paciente. É utilizado
também na identificação da distribuição de um antígeno no interior de um
tecido ou compartimento de uma célula.

Indireta
Utiliza-se este tipo de imunofluorescência, também
conhecida como técnica de dupla camada, na
detecção de anticorpos no soro do paciente por
meio de antígenos fixados em uma lâmina, na qual
se aplica primeiramente um anticorpo específico
não fluorescente. Por fim, coloca-se um anticorpo
fluorescente com especificidade marcada contra
determinados antígenos do primeiro anticorpo usado para reagir com o antígeno.

Esta técnica tem como vantagem possibilitar uma fluorescência mais evidente, uma vez que os anticorpos
fluorescentes associam-se somente aos anticorpos primários, além de permite trabalhar com diversos anticorpos
primários específicos para distintos tipos de antígenos, sendo capaz de identificar qual a classe a qual o anticorpo
pertence.

Habitualmente, a imunofluorescência indireta é utilizada na detecção de auto-anticorpos, e também, na detecção


de anticorpos anti-nucleares encontrados no soro de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico.

Tipagem sanguínea
Aplicações forenses
Permite excluir suspeitos de uma cena de crime.

Os antígenos A e B são muito estáveis e podem ser identificados em sangue seco mesmo após muitos anos. Eles
também podem ser encontrados no sêmen e outros fluidos corporais dos indivíduos secretores. Assim, em casos
de estupro, por exemplo, o tipo ABO da amostra de sêmen pode ser examinado para identificar o suspeito.