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Índice Geral
1. Objectivos 2
2. Introdução 3
3. Tipos de Testes de Diagnóstico 5
3.1. Testes Microbiológicos 5
3.1.1. Cultura em placas 6
3.2. Testes Imunológicos 7
3.2.1. Reacções de Aglutinação 7
3.2.1.1. Reacções de Aglutinação Directa 7
3.2.1.2. Reacções de Aglutinação Indirecta 8
3.2.2. Reacções de Precipitação 11
3.2.2.1. Em meio líquido 11
3.2.2.2. Em meio sólido (gel) 11
3.2.2.2.1. Teste de Imunodifusão 11
3.2.3 Reacção de Neutralização 14
3.2.4. Técnicas de Imunofluorescência 16
3.2.4.1. Técnicas de Imunofluorescência directa 16
3.2.4.2. Técnicas de Imunofluorescência indirecta 18
3.2.5. Teste de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 20
3.2.5.1. Teste de ELISA directo 20
3.2.5.2. Teste de ELISA indirecto 23
3.2.6. Testes Imunológicos com pouca aplicação actualmente 24
3.2.6.1. Testes Radioimunológicos (RIA) 25
3.2.6.2. Teste de Imunoelectroforese 25
3.2.6.3. Reacção de Fixação do Complemento 26
3.3. Testes Baseados em Técnicas de Engenharia Genética (TEGs) 27
3.3.1. Southern Blotting 28
3.3.2. Polymerase Chain Reaction (PCR) e Variantes 29
3.3.2.1. Multiplex PCR 30
3.3.2.2. Nested PCR 32
3.3.2.3. MSP-PCR (methylation specific PCR) 34
3.3.2.4. Real-time PCR 38
3.3.3. Utilização de Organismos Geneticamente Modificados (OGMs) 42
3.3.4. Biochips 44
3. 4. Complementação entre técnicas 48
3.4.1. Imunocaptura e transcrição reversa PCR 48
3.4.2. Sondas e Imunocaptura 50
4. Perspectivas Futuras 52
5. Problemas Éticos 54
6. Problemas Sócio-Económicos 58
6.1. Legislação dos TEGs 58
6.2. Perspectivas económicas 60
7. Bibliografia 61
I
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Índice de Figuras
Figura 1 - Representação esquemática de uma reacção de 9
aglutinação
Figura 2 - Kit Ontrak Testcard 9 10
Pormenor do kit Ontrak Testcard 9 10
Figura 3 -
Figura 4 - Teste de Imunodifusão 12
Figura 5 - Resultado de um Teste de Imunodifusão 13
Figura 6 - Teste de neutralização de uma toxina microbiana 14
Figura 7 - Resultado de um teste da neutralização 15
Figura 8 - Esquema de um resultado positivo de um teste de 17
imunofluorescência directa
Figura 9 - Esquema de um resultado positivo de um teste de 18
imunofluorescência indirecta
Figura 10 - Resultado de um teste de imunofluorescência indirecta 19
Figura 11 - Esquema de um resultado positivo de um teste de ELISA 20
directo
Figura 12 - Teste de gravidez 22
Figura 13 - Esquema de um resultado positivo de um teste de ELISA 23
indirecto
Figura 14 - Kit Trinity Biotech SeroCard™ HIV 24
Figura 15 - Southern Blotting 28
Figura 16 - Mapa da região amplificada por multiplex PCR 31
Figura 17 - Rastreio de ratos transgénicos utilizando o kit QIAGEN 32
Multiplex PCR
Figura 18 - Mapa da região amplificada por Nested-PCR do gene de 33
V. vulnificus
Figura 19 - Electroforese dos produtos de amplificação enzimática do 34
DNA de V.vulnificus
Figura 20 - Esquema da técnica de MSP-PCR 35
Figura 21 - DNA isolado do carcinoma prostático (C) e de tecido 37
prostático hiperplástico benigno (B) por MSP-PCR
Figura 22 - Ensaio 5´nuclease 39
Figura 23 - SYBR Fluorescência Verde 40
Figura 24 - Mecanismo geral do Biosensor 43
Figura 25 - Teste da presença de arsénio 43
Figura 26 - Biochip 45
Figura 27 - Microarray AmpliChip CYP450 46
Figura 28 - Princípio da imunocaptura e transcrição reversa PCR 48
Figura 29 - Desenvolvimento natural do cancro cervical 50
Figura 30 - Tecnologia de Hybrid Capture® 51
II
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Índice de Tabelas
Índice de Gráficos
Gráfico 1 - Perspectivas de vendas da indústria Biotecnológica Norte- 60
Americana.
III
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Abreviaturas
Ac - anticorpo
Ag - antigénio
ANA - anticorpos anti-nucleares
Auc - auto-anticorpos
DNA - deoxyribose nucleic acid
ELISA - enzyme linked immunosorbent assay
EUA - Estados Unidos da América
FITC - fluoresceína de isotiocianato
FRET - fluorescent resonant energy transfer
GRAS - generally regarded as safe
hCG - hormona gonadotrofina coriónica
HIV - human immunodeficiency virus
HPV - human papillomavirus
IHS - inibição da hemólise sinérgica
MSP-PCR - methylation specific PCR
OGM - organismos geneticamente modificados
PCR - polymerase chain reaction
PGD - preimplantation genetic diagnosis
RBC - red blood cells
RIA - testes radioimunológicos
RNA - ribose nucleic acid
RT-PCR - reverse transcription PCR
TEGs - testes baseados em técnicas de engenharia genética
UV- ultravioleta
VCT - vírus citrus tristeza
VRS - vírus respiratório sincicial
IV
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
1. Objectivos
No âmbito da disciplina de Aplicações da Engenharia Genética, foram
propostos cinco temas que visam abordar a situação actual e os novos
desenvolvimentos na área da engenharia genética. O tema que este trabalho trata
é: Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise.
2
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
2. Introdução
Com este trabalho iremos abordar as novas tecnologias de
diagnóstico/análise no campo da saúde, do ambiente e da indústria agroalimentar.
3
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
4
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Este trabalho foi estruturado de acordo com a divisão acima referida, sendo
que, para cada teste irá ser apresentado o seu princípio de acção, as vantagens e
desvantagens da sua aplicação e, por fim, um exemplo prático da sua utilização.
Procurámos estabelecer uma ordem cronológica dos mesmos, de modo a permitir
uma melhor percepção dos avanços tecnológicos desta área ao longo do tempo.
5
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Vantagens e limitações:
Exemplo:
6
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Princípio:
Vantagens e limitações:
7
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Exemplo:
Princípio:
8
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Vantagens e limitações:
Exemplo:
9
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Limite de detecção
Drogas a analisar
mínima (ng/mL)
cocaína 300
marijuana 50
barbitúricos 200
benzodiazepinas 100
feniciclidina 25
metanfetaminas 500
antidepressivos 1000
morfina 300
anfetaminas 1000
10
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Princípio:
Vantagens e limitações:
− Teste rápido;
− Apresenta baixa sensibilidade;
− Obtém-se frequentemente falsos negativos, especialmente quando a
concentração de antigénio na amostra é baixa.
Princípio:
11
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Vantagens e limitações:
12
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Exemplo:
13
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Princípio:
Figura 6 - Teste de neutralização de uma toxina microbiana. a)- toxina microbiana, Ac-
anticorpo e RBC-células dos glóbulos vermelhos de ovelhas. Em A, na presença
de uma amostra que contém anticorpos anti-toxina, estes ligam-se à toxina, pelo
que em B, quando se adicionam os eritrócitos, não ocorre lise dos mesmos, sendo
o resultado do teste negativo. Em C, na ausência de anticorpos, a toxina está livre
para lisar os eritrócitos (D).
in: http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/sn/diagram_b.html
Vantagens e limitações:
14
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
O teste de IHS foi desenvolvido, tendo como base o facto de o “factor equi”
aumentar a actividade hemolítica de outras bactérias. Desta forma, esta toxina
actua sinergeticamente com as toxinas produzidas por Corynebacterium
pseudotuberculosis de modo a provocar a hemólise de eritrócitos de mamíferos.
Para efectuar este teste o soro de cavalo é misturado com a toxina de R. equi e,
posteriormente colocado num poço numa placa de agar de sangue, na qual
previamente se inocula uma cultura de C. pseudotuberculosis com uma zaragatoa
traçando linhas no agar.[11]
15
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Excitação Emissão
Fluorocromo Coloração
(nm) (nm)
AMCA 350 450 Azul
Cy3 550 680 Laranja, Vermelho
Cy5 650 680 Laranja, Vermelho
Fluoresceína 495 520 Verde
Hoechst 33258 360 470 Azul
B-ficoeritrina 545, 565 575 Laranja, Vermelho
R-ficoeritrina 480, 545, 565 578 Laranja, Vermelho
Rodamina 539, 574 602 Vermelho
Texas red 558, 594 623 Vermelho
Princípio:
16
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Vantagens e limitações:
Exemplo:
17
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Princípio:
Estes testes são aplicados com vista a detectar numa amostra a presença
de anticorpos específicos após a exposição a um microrganismo (antigénio),
sendo por regra mais sensíveis que os métodos directos. Neste caso, o antigénio
específico é fixado a uma lâmina onde, posteriormente, se adiciona a amostra em
estudo. Se existir na amostra algum anticorpo específico contra o microrganismo,
ocorrerá uma reacção entre os dois dando origem a um complexo.
18
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Vantagens e limitações:
Exemplo:
19
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Princípio:
20
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Vantagens e limitações:
Exemplo:
21
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
R C
T
C
T
22
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Princípio:
Vantagens e limitações:
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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Exemplo:
Figura 14 - Kit Trinity Biotech SeroCard™ HIV. O ponto azul indica um resultado positivo
da presença de anticorpos do HIV na amostra.
in: http://www.trinitybiotech.com/EN/index2.asp?pg=pro_dtls.asp%3Fid%3D370
24
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Princípio:
Vantagens e limitações:
Princípio:
25
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Vantagens e limitações:
Vantagens e limitações:
26
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
27
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Princípio:
Permite a detecção de moléculas de DNA após a sua separação
electroforética, por hibridação com uma sonda cuja sequência é complementar à
sequência de DNA em estudo.
Figura 15 - Southern Blotting. Em que: A- os fragmentos DNA, obtidos por digestão com
enzimas de restrição, são separados electroforeticamente em gel de agarose; B-
coloca-se uma membrana de nitrocelulose ou nylon sobre o gel, ocorrendo a
transferência dos fragmentos de DNA por blotting. O gel está colocado num
tampão que contém compostos alcalinos, os quais desnaturam o DNA. O tampão
é transferido por capilaridade para as folhas de papel absorvente colocadas
sobre a membrana de nylon, promovendo a passagem dos fragmentos de DNA
para a membrana; C- a membrana de nylon é removida e os fragmentos de DNA
ficam na mesma posição que ocupavam no gel; D- coloca-se a membrana num
saco de plástico selado que contém sondas de DNA marcadas radioactivamente
e específicas para os fragmentos de DNA em estudo. Nestas condições é
favorecida a hibridação; E- retira-se a membrana do saco e após lavagem desta,
efectua-se a visualização do DNA hibridado por exposição a raios X.
in: http://www.accessexcellence.org/AB/GG/southBlotg.html&h=536&w=700&pre
v=/images%3Fq%3DSouthern%2BBlotting%2B%26svnum%3D10%26hl%3DptPT
%26lr%3D%26ie%3DUTF-8%26oe%3DUTF-8%26sa%3DN
28
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Vantagens e desvantagens:
− Técnica muito sensível;
− Não é necessário ter informação sobre a função do gene para elaborar o
protocolo de diagnóstico;
− É necessária informação sobre a mutação que dá origem à doença;
− Permite a detecção de um único fragmento de restrição no meio de milhões
de fragmentos.
Princípio:
29
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Vantagens e limitações:
Vantagens e limitações:
30
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Exemplo:
Animais transgénicos, como por exemplo o rato, podem ser detectados por
este método, através da distinção entre o locus wild-type e o locus mutante. Essa
distinção é feita através da utilização de primers especificamente desenhados
para cada caso. [21]
31
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Figura 17 - Rastreio de ratos transgénicos utilizando o kit QIAGEN Multiplex PCR. O kit
possui três primers específicos para o locus do gene 2 da recombinação. Os
primers foram desenhados de forma a originar produtos de PCR de diferentes
tamanhos permitindo a distinção entre o rato homozigoto wild type (wt), o rato
heterozigoto mutante (ht) ou o homozigoto mutante (hm).
in: http://www.biocompare.com/techart.asp?id=679#Kit.
Princípio:
Vantagens e limitações:
Exemplo:
32
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
33
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
A B C D E F G H I
34
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
35
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Vantagens e limitações:
Exemplo:
36
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
37
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Princípio:
Vantagens e limitações:
38
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Figura 22 - Ensaio 5´nuclease. Em que 1- adição de uma sonda que possui um repórter
fluorescente de elevada energia na extremidade 5’, uma molécula de baixa energia
denominada por quencher na extremidade 3’ e uma sequência complementar à
zona intermédia entre os dois primers. Quando a sonda está intacta e excitada por
uma fonte luminosa, a libertação da partícula repórter é suprimida pela partícula
quencher devido à sua proximidade; 2- a polimerase (P) inicia a amplificação em
direcção à sonda; 3- quando a polimerase encontra a sonda, esta é clivada pela
actividade 5´ exonucleolítica da enzima. O afastamento entre as duas partículas
fluorescentes leva a um aumento da fluorescência da partícula repórter e a uma
diminuição da fluorescência da partícula quencher.
in: http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/rtpcr_vs_tradpcr.pdf
Vantagens e limitações:
39
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Vantagens e limitações:
40
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Exemplo:
41
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Princípio:
Vantagens e limitações:
Exemplo:
42
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
qualificada, algo que não está ao alcance dos países subdesenvolvidos. Daí a
importância do desenvolvimento de kits que possam ser facilmente transportados
e que permitam a detecção de baixas concentrações de arsénio.[36],[37]
43
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
3.3.4. Biochips
Princípio:
44
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Figura 26 - Biochip. Os pontos sem fluorescência representam o caso em que não ocorre
hibridação; os pontos fluorescentes azuis resultam da hibridação entre cDNA de
tecido cancerígeno e cDNA fixo ao biochip; os pontos fluorescentes vermelhos
resultam da hibridação entre cDNA de tecido normal e cDNA fixo ao biochip e,
os pontos fluorescentes amarelos resultam da hibridação entre cDNA de ambos
os tipos de tecidos e cDNA fixo ao biochip.
in: www.thelifewire.com/conindex.htm?17
Vantagens e limitações:
45
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Exemplo:
46
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
47
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Princípio:
No caso do ácido nucleico do vírus ser RNA, este tem de ser transcrito em
cDNA pela acção da transcriptase reversa na presença de todos os constituintes
necessários à amplificação por PCR.
A B C D
48
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Vantagens e limitações:
− Pode ser usado para viroses e vírus que não produzem proteínas para a
cápsula viral;
− A PCR é muito sensível e, como já foi referido, é preciso ter cuidado com
contaminações, pois estas podem resultar em reacções que levam ao
aparecimento de falsos positivos;
− É mais oneroso e mais demorado do que o ELISA;
− É necessário conhecer o RNA dos vírus para poder desenhar os primers.
Não é possível utilizar para novos vírus, só usando zonas do RNA
altamente conservadas para certas famílias de vírus.[43]
Exemplo:
O vírus citrus tristeza causa uma das mais perigosas doenças em citrinos e
trata-se do vírus patogénico, economicamente mais importante neste tipo de
colheita.
O CTV pertence ao grupo dos Closterovirus. Estes viriões não têm uma
estrutura rígida e o seu genoma consiste em RNA de cadeia simples não-
segmentado. A sequência do genoma de CTV contém doze janelas de leitura
(ORFs), potencialmente codificadores de, pelo menos, dezassete proteínas. As
ORFs 7 e 8 codificam para proteínas que já foram identificadas como sendo
proteínas da cápsula viral. Vários isolados de CTV foram já totalmente
sequenciados.[44]
49
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
50
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Vantagens e limitações:
51
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
4. Perspectivas Futuras
O futuro do Imunodiagnóstico
52
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
53
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
5. Problemas Éticos
Nesta secção são enunciados alguns dos problemas éticos que se
relacionam com o recurso a tecnologias da engenharia genética, para efectuar o
diagnóstico de doenças humanas, tais como: os benefícios e desvantagens dos
TEGs, quem deve efectuá-los, quais as entidades que devem ter acesso aos
resultados, a eugenia e, por fim, a necessidade do aconselhamento genético.
54
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
indivíduo se sinta impotente, na medida em que não pode controlar o seu estado
de saúde. Nestes casos, os TEGs podem ter um impacto particularmente
negativo. Devido a isto, em 1993, o Instituto de Medicina da Academia Nacional
de Ciências dos EUA, aconselhou contra a realização de testes para as doenças
que não podem ser prevenidas ou que são incuráveis. [49]
55
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Talvez pelo facto de que um indivíduo poder escolher manter hábitos que
aumentam o risco de desenvolvimento de uma doença, mas não poder escolher
os seus genes. Diferenciar o valor do custo de um seguro com base nos
resultados de TEGS seria tão grave quanto fazê-lo com base numa discriminação
racial ou entre géneros.
56
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Aconselhamento Genético
57
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
6. Problemas Sócio-Económicos
6.1. Legislação dos TEGs
58
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
Europa
Em Portugal, não existe nenhuma legislação no que diz respeito aos TEGs.
No entanto, o Ministério da Saúde está a elaborar guias de orientação
relativamente à confidencialidade, privacidade e aconselhamento genético ligados
aos TEGs.[52]
59
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
$ Biliões
55
50
45 Terapêutica (11%)
40
35 Diagnóstico
30 humano (7%)
25 Agricultura (14%)
20
15 Diagnóstico não
10 humano (10%)
5
Outros (13%)
0
2003 2008 2013
60
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
7. Bibliografia
[1] PORTO, J. 1967 Enciclopédia Luso-Brasileira de Cultura Volume 6 Lisboa
[7] http://www.fao.org/docrep/w0049e/w0049e06.htm
(em 22 de Outubro de 2003)
[10] http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-736X199700
0300005&lng=en&nrm=iso&tlng=pt (em 21 de Novembro de 2003)
[11] http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/sn/fig2.html
(em 21 de Novembro de 2003)
[12] http://www.chemicon.com/webfiles/PDF/3125.pdf
(em 21 de Novembro de 2003)
[13] http://www.mds.qmw.ac.uk/biomed/kb/resources/immunology/tests/anf/anf.htm
(em 21 de Novembro de 2003)
[15] http://press2.nci.nih.gov/sciencebehind/genetesting/genetesting26.htm
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[16] http://www.genome.gov/page.cfm?pageID=10506784
(em 31 de Outubro de 2003)
61
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG
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[21] http://www.biocompare.com/techart.asp?id=679#Kit
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[27] http://www.wjgnet.com/1007-9327/9/2202.asp
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[41] http://www.roche-diagnostics.com/media/pdf/press_release/2003/press-
release_25062003.pdf (em 22 de Novembro de 2003)
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background_cyp450.pdf (em 22 de Novembro de 2003)
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(em 22 de Novembro de 2003)
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[49] http://huntingtondisease.tripod.com/genetictesting/id38.html
(em 31 de Outubro de 2003)
[50] http://thomas.loc.gov/cgi-bin/bdquery/z?d108:SN01053:@@@L&summ2=m&
(em 25 de Novembro de 2003)
[51] http://conventions.coe.int/treaty/en/treaties/html/164.htm
(em 25 de Novembro de 2003)
[52] http://europa.eu.int/comm/research/biosociety/pdf/bmh4_ct98_0550_partb.pdf
(em 25 de Novembro de 2003)
[54] http://www.mindbranch.com/catalog/print_product_page.jsp?code=R1-2251
(em 27 de Novembro de 2003)
[55] http://www.biojapan.de/features/globalbt2003.htm
(em 27 de Novembro de 2003)
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