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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Índice Geral
1. Objectivos 2
2. Introdução 3
3. Tipos de Testes de Diagnóstico 5
3.1. Testes Microbiológicos 5
3.1.1. Cultura em placas 6
3.2. Testes Imunológicos 7
3.2.1. Reacções de Aglutinação 7
3.2.1.1. Reacções de Aglutinação Directa 7
3.2.1.2. Reacções de Aglutinação Indirecta 8
3.2.2. Reacções de Precipitação 11
3.2.2.1. Em meio líquido 11
3.2.2.2. Em meio sólido (gel) 11
3.2.2.2.1. Teste de Imunodifusão 11
3.2.3 Reacção de Neutralização 14
3.2.4. Técnicas de Imunofluorescência 16
3.2.4.1. Técnicas de Imunofluorescência directa 16
3.2.4.2. Técnicas de Imunofluorescência indirecta 18
3.2.5. Teste de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 20
3.2.5.1. Teste de ELISA directo 20
3.2.5.2. Teste de ELISA indirecto 23
3.2.6. Testes Imunológicos com pouca aplicação actualmente 24
3.2.6.1. Testes Radioimunológicos (RIA) 25
3.2.6.2. Teste de Imunoelectroforese 25
3.2.6.3. Reacção de Fixação do Complemento 26
3.3. Testes Baseados em Técnicas de Engenharia Genética (TEGs) 27
3.3.1. Southern Blotting 28
3.3.2. Polymerase Chain Reaction (PCR) e Variantes 29
3.3.2.1. Multiplex PCR 30
3.3.2.2. Nested PCR 32
3.3.2.3. MSP-PCR (methylation specific PCR) 34
3.3.2.4. Real-time PCR 38
3.3.3. Utilização de Organismos Geneticamente Modificados (OGMs) 42
3.3.4. Biochips 44
3. 4. Complementação entre técnicas 48
3.4.1. Imunocaptura e transcrição reversa PCR 48
3.4.2. Sondas e Imunocaptura 50
4. Perspectivas Futuras 52
5. Problemas Éticos 54
6. Problemas Sócio-Económicos 58
6.1. Legislação dos TEGs 58
6.2. Perspectivas económicas 60
7. Bibliografia 61

I
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Índice de Figuras
Figura 1 - Representação esquemática de uma reacção de 9
aglutinação
Figura 2 - Kit Ontrak Testcard 9 10
Pormenor do kit Ontrak Testcard 9 10
Figura 3 -
Figura 4 - Teste de Imunodifusão 12
Figura 5 - Resultado de um Teste de Imunodifusão 13
Figura 6 - Teste de neutralização de uma toxina microbiana 14
Figura 7 - Resultado de um teste da neutralização 15
Figura 8 - Esquema de um resultado positivo de um teste de 17
imunofluorescência directa
Figura 9 - Esquema de um resultado positivo de um teste de 18
imunofluorescência indirecta
Figura 10 - Resultado de um teste de imunofluorescência indirecta 19
Figura 11 - Esquema de um resultado positivo de um teste de ELISA 20
directo
Figura 12 - Teste de gravidez 22
Figura 13 - Esquema de um resultado positivo de um teste de ELISA 23
indirecto
Figura 14 - Kit Trinity Biotech SeroCard™ HIV 24
Figura 15 - Southern Blotting 28
Figura 16 - Mapa da região amplificada por multiplex PCR 31
Figura 17 - Rastreio de ratos transgénicos utilizando o kit QIAGEN 32
Multiplex PCR
Figura 18 - Mapa da região amplificada por Nested-PCR do gene de 33
V. vulnificus
Figura 19 - Electroforese dos produtos de amplificação enzimática do 34
DNA de V.vulnificus
Figura 20 - Esquema da técnica de MSP-PCR 35
Figura 21 - DNA isolado do carcinoma prostático (C) e de tecido 37
prostático hiperplástico benigno (B) por MSP-PCR
Figura 22 - Ensaio 5´nuclease 39
Figura 23 - SYBR Fluorescência Verde 40
Figura 24 - Mecanismo geral do Biosensor 43
Figura 25 - Teste da presença de arsénio 43
Figura 26 - Biochip 45
Figura 27 - Microarray AmpliChip CYP450 46
Figura 28 - Princípio da imunocaptura e transcrição reversa PCR 48
Figura 29 - Desenvolvimento natural do cancro cervical 50
Figura 30 - Tecnologia de Hybrid Capture® 51

II
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Índice de Tabelas

Tabela 1 - Tipos de drogas detectadas pelo kit Ontrak Testcard 9 e 10


respectivos limites de detecção mínimos
Tabela 2 - Tipos e características de fluorocromos utilizados nos 16
testes de imunofluorescência

Índice de Gráficos
Gráfico 1 - Perspectivas de vendas da indústria Biotecnológica Norte- 60
Americana.

III
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Abreviaturas
Ac - anticorpo
Ag - antigénio
ANA - anticorpos anti-nucleares
Auc - auto-anticorpos
DNA - deoxyribose nucleic acid
ELISA - enzyme linked immunosorbent assay
EUA - Estados Unidos da América
FITC - fluoresceína de isotiocianato
FRET - fluorescent resonant energy transfer
GRAS - generally regarded as safe
hCG - hormona gonadotrofina coriónica
HIV - human immunodeficiency virus
HPV - human papillomavirus
IHS - inibição da hemólise sinérgica
MSP-PCR - methylation specific PCR
OGM - organismos geneticamente modificados
PCR - polymerase chain reaction
PGD - preimplantation genetic diagnosis
RBC - red blood cells
RIA - testes radioimunológicos
RNA - ribose nucleic acid
RT-PCR - reverse transcription PCR
TEGs - testes baseados em técnicas de engenharia genética
UV- ultravioleta
VCT - vírus citrus tristeza
VRS - vírus respiratório sincicial

IV
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

1. Objectivos
No âmbito da disciplina de Aplicações da Engenharia Genética, foram
propostos cinco temas que visam abordar a situação actual e os novos
desenvolvimentos na área da engenharia genética. O tema que este trabalho trata
é: Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise.

Neste trabalho pretendemos por um lado, dar uma panorâmica dos


testes/técnicas de diagnóstico e análise que se efectuam actualmente,
apresentando uma perspectiva histórica dos mesmos e, por outro, dar a conhecer
um dos testes que se encontra ainda em fase experimental.

Na aplicação e desenvolvimento de testes/técnicas de diagnóstico e


análise, tem que se ter em conta quais os problemas sócio-económicos, assim
como os problemas éticos que lhes estão associados, pelo que também iremos
abordar este ponto.

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

2. Introdução
Com este trabalho iremos abordar as novas tecnologias de
diagnóstico/análise no campo da saúde, do ambiente e da indústria agroalimentar.

A distinção entre análise e diagnóstico não é muito clara, existindo campos


comuns em que estes dois termos se aplicam. Na elaboração deste trabalho
optámos, por uma questão de clareza, destinar a palavra diagnóstico ao campo da
saúde, enquanto que a palavra análise será utilizada para nos referirmos à área
agroalimentar e ambiental.

A palavra diagnóstico vem do grego δια, “por meio de” e γυϖσιζ,


“conhecimento”, ou seja, a arte de conhecer as doenças pela observação dos
sinais ou sintomas que apresentam.[1] O significado desta palavra tem sofrido
alterações ao longo do tempo, de acordo com os avanços científicos.

Inicialmente, o diagnóstico de uma determinada enfermidade consistia na


observação de sinais e sintomas do paciente. Mais tarde, começaram a ser
efectuados exames complementares de diagnóstico, tais como: análises
qualitativas e quantitativas de todos os fluidos do organismo, pesquisa de
microrganismos, radiografia, etc.

Com o desenvolvimento da engenharia genética houve a criação de uma


míriade de testes/técnicas de diagnóstico, os quais passaram a ser utilizados por
exemplo para determinar se um determinado indivíduo tem uma predisposição
hereditária para uma certa doença.

Entende-se por análise como sendo a identificação e doseamento dos


constituintes de carácter químico e biológico de uma amostra, tanto no aspecto
qualitativo como quantitativo. [2]

A necessidade de efectuar testes/técnicas de análise na área ambiental e


agroalimentar, decorre da maior preocupação acerca da qualidade de tudo o que
nos rodeia, desde o ar que respiramos aos alimentos que ingerimos.

As técnicas e os meios utilizados nestas três áreas são em número


crescente e de aplicação cada vez mais complexa. Por vezes, exigem o emprego
de materiais e aparelhos altamente dispendiosos, o que torna o diagnóstico cada
vez mais oneroso, mas também, cada vez mais preciso. A precisão do diagnóstico
está na base de uma terapêutica racional, a qual quando específica, garante
resultados mais perfeitos e rápidos. [1]

Neste trabalho pretendemos abranger os principais testes/técnicas de


diagnóstico/análise utilizados em cada uma das áreas referidas anteriormente,
assim como apresentar exemplos práticos da sua aplicação.

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

É na área da saúde que existe um maior desenvolvimento de técnicas de


diagnóstico, o que se deve em grande parte aos orçamentos avultados nesta área.
Actualmente, é possível o diagnóstico de doenças de índole genética, hereditárias
e não hereditárias (entre os quais os testes pré-natais são o exemplo mais
representativo), assim como diagnosticar a presença de bactérias, vírus e
parasitas em seres humanos e animais. Relativamente ao ambiente, é possível
efectuar análises para verificar a presença de poluentes e de microrganismos
(patogénicos e não patogénicos). Por último, na área agroalimentar é possível
detectar a presença de microrganismos patogénicos e de microrganismos
causadores da deterioração de alimentos.

É importante referir os diversos factores que têm de ser considerados


quando se pretende implementar um teste de diagnóstico/análise:

− fim a que se destina;


− custo do processo;
− tempo necessário para a sua realização;
− sensibilidade;
− capacidade de automatização e aumento de escala;
− nível de qualificação da mão-de-obra necessária.

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

3. Tipos de Testes de Diagnóstico

De entre a grande variedade de testes de diagnóstico e análise existem três


grupos principais: testes microbiológicos, testes imunológicos e testes que têm na
sua base técnicas de engenharia genética (TEGs). Por sua vez, cada um destes
grupos pode ser subdividido em categorias mais específicas.

Este trabalho foi estruturado de acordo com a divisão acima referida, sendo
que, para cada teste irá ser apresentado o seu princípio de acção, as vantagens e
desvantagens da sua aplicação e, por fim, um exemplo prático da sua utilização.
Procurámos estabelecer uma ordem cronológica dos mesmos, de modo a permitir
uma melhor percepção dos avanços tecnológicos desta área ao longo do tempo.

3.1. Testes Microbiológicos

O desenvolvimento do microscópio óptico no início do século XIX, permitiu


a identificação visual dos microrganismos presentes numa determinada amostra.
No entanto, para efectuar estudos pormenorizados acerca da natureza dos
microrganismos, era necessário obtê-los em grandes quantidades e capazes de
se multiplicar quando inoculados num meio que suportasse o seu crescimento.
Para tal, foi necessário reproduzir em laboratório as características essenciais do
meio de origem de cada microrganismo em estudo. Deste modo, surgiu a técnica
de cultura em placas e em meio líquido.

Apesar destes testes serem dos mais antigos na área do


diagnóstico/análise, actualmente ainda encontram bastante aplicação na análise
de alimentos, bebidas e, no diagnóstico clínico. A identificação inequívoca dos
microrganismos patogénicos ou responsáveis pela deterioração de
alimentos/bebidas, passa pelo seu cultivo em meios de crescimento diferenciais,
selectivos ou de enriquecimento, seguido de testes de natureza bioquímica.

Tal como referimos anteriormente, com este trabalho pretendemos incidir


sobre as novas tecnologias de diagnóstico/análise, pelo que, apesar de existir
uma grande variedade de testes microbiológicos, iremos (e apenas por motivos
históricos), mencionar somente a técnica de cultura em placas.

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

3.1.1. Cultura em placas


Princípio:

Consiste na inoculação de uma amostra de um alimento/bebida, num meio


e em condições de incubação que permitam o crescimento de quaisquer
microrganismos (patogénicos ou responsáveis pela deterioração desse
alimento/bebida), que possam estar presentes.

Vantagens e limitações:

− É um método de custos reduzidos;


− Não requer equipamento nem mão-de-obra sofisticada;
− Processo moroso;
− Por vezes é difícil encontrar um meio com as características necessárias
para suportar o crescimento específico de um determinado microrganismo.

Exemplo:

O método de cultura em placas é utilizado para efectuar a análise de


estreptococos fecais em águas para consumo. A ocorrência destes
microrganismos indica a existência de contaminação fecal.

A amostra de água é filtrada com um filtro cujo diâmetro de poro é inferior


ao diâmetro médio das bactérias (0,45 µm). De seguida, o filtro é colocado em
meio de agar de enterococos, procedendo-se à sua incubação durante 48 horas a
37ºC. O resultado é positivo se as colónias forem castanhas, vermelhas ou rosa.
De forma a confirmar que de facto se tratam de estreptococos fecais, algumas
destas colónias são transferidas para meio agar de esculina, canamicina e azida,
sendo os dois últimos inibidores do crescimento de microrganismos que não
sejam estreptococos. Este meio é incubado durante 24 horas a 44ºC. Os
microrganismos do grupo dos estreptococos fecais degradam a esculina
(glucósido fenólico), pelo que o teste é positivo se as colónias apresentarem uma
coloração castanha, verde escuro ou negra.[3]

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

3.2. Testes Imunológicos

Nesta secção, serão referidas as técnicas específicas de diagnóstico e


análise que têm por base reacções imunológicas, ou seja, reacções antigénio-
anticorpo. Estes testes podem-se basear em reacções de precipitação,
aglutinação, neutralização, técnicas de imunofluorescência e na marcação com
uma enzima para detecção da ligação antigénio-anticorpo (testes de ELISA).

3.2.1. Reacções de Aglutinação (Teste de Coombs)

As reacções de aglutinação são promovidas por antigénios na forma de


partículas ou antigénios solúveis associados a partículas. Estes, quando em
contacto com anticorpos, dão origem a aglutinados (muitas vezes é necessário
outro composto adicional para promover a aglutinação). Esta técnica foi pela
primeira vez aplicada em 1945.

3.2.1.1. Reacções de aglutinação directa

Princípio:

A reacção de aglutinação directa permite a detecção de anticorpos contra


antigénios celulares relativamente grandes, tais como os da superfície dos
eritrócitos, das bactérias ou dos fungos.

Actualmente, para efectuar estas reacções utilizam-se placas de


microtitulação, nas quais todos os poços contêm a mesma quantidade de
antigénio. No entanto, a quantidade de anticorpo vai diminuindo ao longo dos
poços, de tal forma que o conteúdo de cada poço contenha metade da quantidade
de anticorpo do poço anterior, permitindo deste modo saber o título do anticorpo
na amostra.[4]

Vantagens e limitações:

− Um único título é de uso limitado para se efectuar o diagnóstico, pois


apesar deste valor indicar o número de anticorpos, não permite saber se
estes foram formados em resposta a uma infecção recente ou,
anteriormente, quando se entrou em contacto com a infecção pela primeira
vez;
− Efectuando vários títulos ao longo do tempo podemos observar a evolução
da concentração de anticorpos e, deste modo, conseguir estabelecer um
diagnóstico mais preciso;

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− É um método sensível e de fácil visualização;


− Existem vários testes e, podem ser utilizados para efectuar um alargado
número de análises/diagnóstico.

Exemplo:

Detecção de anti-anticorpos contra a Leishmania donovani no soro humano


ou canino, através do teste de aglutinação directa da KIT Biomedical Research.

A leishmaniose é uma parasitose (provocada por um protozoário flagelado),


cujo hospedeiro primário são os cães, os humanos e os roedores. As moscas da
areia são o seu hospedeiro intermediário. O ciclo de vida deste parasita tem duas
fases: uma na mosca e outra no cão/humano. Quando o parasita se encontra na
mosca, toma a forma de promastigoto. Quando a mosca pica um animal, o
promastigoto entra na corrente sanguínea, sendo posteriormente ingerido pelos
macrófagos, onde toma a forma de amastigoto. Nesta forma alguns parasitas
ficam no sangue periférico, enquanto outros são transportados para os órgãos
internos provocando a leishmaniose visceral.

A KIT Biomedical Research realizou um tratamento aos promastigotos da


estirpe L. donovani 1S, de modo a torná-los utilizáveis em condições inóspitas,
tais como as que existem nos países subdesenvolvidos. No teste de aglutinação,
estes promastigotos são adsorvidos a poços de placas de microtitulação, onde
posteriormente se coloca a amostra suspeita de conter anti-anticorpos contra a
Leishmania. Estes provocam a aglutinação dos promastigotos, sendo esta
aglutinação visível a olho nu, na forma de um grande floco no topo dos poços da
placa microtitulação. [5]

3.2.1.2. Reacções de aglutinação indirecta

Princípio:

A reacção de aglutinação indirecta permite a detecção de anticorpos contra


antigénios solúveis, quando estes estão adsorvidos a partículas de bentonite,
argila ou, mais frequentemente, esferas de látex (Figura 1).

O mesmo princípio pode ser aplicado de modo inverso, utilizando


anticorpos adsorvidos a partículas para detectar antigénios específicos.

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Vantagens e limitações:

− Os anticorpos aglutinam de forma mais intensa a antigénios adsorvidos do


que a antigénios solúveis (método directo);
− Teste rápido (poucos minutos) e sensível;
− Resultados relativamente fáceis de visualizar;
− Existe uma grande variedade de testes.

Exemplo:

Detecção qualitativa de drogas na urina através do kit Ontrak Testcard 9


(Tabela 1).

O kit acima referido baseia-se na inibição da aglutinação antigénio-


anticorpo por partículas de látex. Esta inibição consiste na competição pelo
anticorpo entre o conjugado droga-látex e qualquer droga presente na amostra a
analisar. A amostra é difundida por capilaridade desde o local onde é colocada até
à zona de validação do teste. Se não existir droga na amostra, o conjugado droga-
látex liga-se ao anticorpo livre formando grandes partículas que aglutinam, dando
origem a uma banda azul. Se a amostra contiver droga, esta irá ligar-se ao
anticorpo livre impedindo a sua associação ao conjugado droga-látex, não se
formando o aglutinado, pelo que se verifica uma ausência de banda. [6]

Figura 1 - Representação esquemática de uma reacção de aglutinação.


Em que (a)- na ausência de droga e (b)- na presença de droga,
sendo que L-látex e D-droga.
in: PRESCOTT L., HARLEY J. e KLEIN D. 1993 Microbiology 2ndEd
Wm.C. Brown Publishers Oxford

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Actualmente, este teste já analisa simultaneamente 9 drogas numa única


amostra.

Tabela 1 - Tipos de drogas detectadas pelo kit Ontrak Testcard 9 e


respectivos limites de detecção mínimos.
in: http://us.labsystems.roche.com/products/drugs/testcard9.shtml

Limite de detecção
Drogas a analisar
mínima (ng/mL)
cocaína 300
marijuana 50
barbitúricos 200
benzodiazepinas 100
feniciclidina 25
metanfetaminas 500
antidepressivos 1000
morfina 300
anfetaminas 1000

Figura 2 - Kit Ontrak Testcard 9 Figura 3 - Pormenor do kit Ontrak Testcard 9.


in: http://npt.mah.roche.com/images/products/ 1- zona de validação do teste,
testcard_9/image_01.jpg 2- resultado positivo (ausência de banda) e
3- resultado negativo (presença de banda azul).
in: http://us.labsystems.roche.com/products/
drugs/testcard9.shtml.

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3.2.2. Reacções de Precipitação

As reacções de precipitação envolvem antigénios solúveis e podem ocorrer


em meio líquido ou meio sólido (gel).

3.2.2.1. Em meio líquido

Princípio:

Estas reacções permitem a identificação de antigénios numa amostra em


estudo. Esta é diluída numa solução que contém anticorpos específicos para o
antigénio a pesquisar. A ligação antigénio-anticorpo origina agregados
moleculares. Desta forma, se ocorrer precipitação o teste imunológico é positivo,
o que significa que a amostra tem o antigénio em estudo. Caso não ocorra
formação de precipitado, o teste é negativo.[4]

Vantagens e limitações:

− Teste rápido;
− Apresenta baixa sensibilidade;
− Obtém-se frequentemente falsos negativos, especialmente quando a
concentração de antigénio na amostra é baixa.

3.2.2.2. Em meio sólido (gel)

3.2.2.2.1. Teste de Imunodifusão

Esta técnica foi pela primeira vez aplicada em 1953.[7]

Princípio:

Este teste consiste numa reacção de precipitação que se efectua em gel de


agar numa placa de Petri ou numa lâmina de microscópio. O princípio do método
é semelhante ao anterior mas, neste caso, a precipitação está dependente da
difusão do antigénio e do anticorpo no agar.

A amostra com antigénio é colocada num dos extremos da caixa de Petri


ou da lâmina de microscópio e, no extremo oposto coloca-se a solução com
anticorpos. No caso do teste ser positivo ocorre precipitação, o que se traduz na
formação de uma linha que corresponde à zona onde os antigénios e os

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anticorpos se encontram e se ligam maioritariamente. O resultado é visível depois


de um ou dois dias.

Figura 4 - Teste de Imunodifusão. Em que: A- adição de anticorpos (Ab) e antigénios (Ag) a


uma placa de agar. B- difusão dos anticorpos e antigénios através do agar. C-
formação de uma linha de precipitação resultante da ligação específica Ag-Ab.
in: http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/agid/diagram.html

Vantagens e limitações:

− Teste mais demorado e mais específico que a reacção de precipitação em


meio líquido;
− Detecta diferenças entre antigénios com alta sensibilidade;
− Para se conseguir detectar antigénios ou anticorpos, estes têm de se
encontrar em altas concentrações.

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Exemplo:

Detecção de anticorpos contra diferentes agentes fúngicos provenientes


dos seguintes géneros: Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum e
Blastomyces dermatitidis, através de Exo-Antigen Identification System da
Immuno-Mycologics, Inc.

Os géneros acima referidos são fungos patogénicos, e:

- Histoplasma capsulatum é responsável pela histoplasmólise (doença


respiratória que se assemelha à gripe);

- Coccidioides immitis geralmente afecta os pulmões, provocando uma


infecção denominada coccidioidomicose (febre de San Joaquin, febre do
vale), a qual pode resultar numa pneumonia.[8]

- Blastomyces dermatitidis causa uma blastomicose (blastomicose norte-


americana, doença de Gilchrist), a qual é uma infecção na pele, pulmões ou
generalizada. [9]

Figura 5 - Resultado de um Teste de Imunodifusão. Nos poços centrais é colocado o


antigénio contra cada um dos agentes fúngicos a detectar. A amostra de controlo
(C) é colocada em poços diametralmente opostos e consiste num soro contendo
anticorpos para cada um dos agentes fúngicos. As amostras de soro do paciente
são colocadas nos restantes poços em redor do poço central. Os testes da
esquerda para a direita são referentes à detecção de anticorpos para Coccidioides
immitis, Histoplasma capsulatum e Blastomyces dermatitidis, respectivamente. O
resultado é positivo (+) se ocorrer formação de linhas de precipitação brancas e é
negativo (-) se não ocorrer a formação das mesmas, pelo que este paciente
apresenta apenas anticorpos para C. immitis.
in: http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/agid/fig3.html

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3.2.3. Reacção de Neutralização

Esta técnica foi pela primeira vez aplicada em 1961.[7]

Princípio:

A reacção de neutralização baseia-se numa reacção antigénio-anticorpo,


na qual os efeitos nocivos de uma exotoxina bacteriana (antigénio) são
bloqueados por anticorpos específicos (antitoxina). A antitoxina ao ligar-se à
exotoxina neutraliza os efeitos desta última e, desta forma, as células não são
danificadas. Conhecendo os anticorpos específicos contra determinado vírus, é
possível usar esses anticorpos para identificar doenças virais ou para determinar o
título dos anticorpos e dos vírus.

Teste Positivo Teste Negativo

Figura 6 - Teste de neutralização de uma toxina microbiana. a)- toxina microbiana, Ac-
anticorpo e RBC-células dos glóbulos vermelhos de ovelhas. Em A, na presença
de uma amostra que contém anticorpos anti-toxina, estes ligam-se à toxina, pelo
que em B, quando se adicionam os eritrócitos, não ocorre lise dos mesmos, sendo
o resultado do teste negativo. Em C, na ausência de anticorpos, a toxina está livre
para lisar os eritrócitos (D).
in: http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/sn/diagram_b.html

Vantagens e limitações:

− Testes de neutralização in vitro são de realização complexa, o que leva ao


seu uso menos frequente em laboratórios clínicos modernos.
Exemplo:

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Teste de inibição da hemólise sinérgica (IHS) que permite a detecção de


anticorpos contra a bactéria Rhodococcus equi, no soro do cavalo.

A bactéria Rhodococcus equi produz uma toxina denominada por “factor


equi” que é composta por duas enzimas: a colesterol oxidase e a fosfolipase C.
Estas enzimas possuem características antigénicas, podendo por este motivo, ser
utilizadas como um antigénio num teste imunológico.[10]

O teste de IHS foi desenvolvido, tendo como base o facto de o “factor equi”
aumentar a actividade hemolítica de outras bactérias. Desta forma, esta toxina
actua sinergeticamente com as toxinas produzidas por Corynebacterium
pseudotuberculosis de modo a provocar a hemólise de eritrócitos de mamíferos.
Para efectuar este teste o soro de cavalo é misturado com a toxina de R. equi e,
posteriormente colocado num poço numa placa de agar de sangue, na qual
previamente se inocula uma cultura de C. pseudotuberculosis com uma zaragatoa
traçando linhas no agar.[11]

Assim sendo, caso o soro de cavalo não contenha anticorpos contra o


“factor equi”, este vai difundir no agar e, vai em sinergia com a toxina de C.
pseudotuberculosis promover a hemólise completa dos eritrócitos, o que se traduz
na presença de um halo (ver Figura 7). Caso o soro de cavalo contenha
anticorpos para o “factor equi”, vai ocorrer a formação de um complexo antigénio-
anticorpo, o que faz com que a toxina de R. equi não esteja disponível para
promover a hemólise completa.

Figura 7 - Resultado de um teste da neutralização, para a determinação da presença de


anticorpos contra a toxina de Rhodococcus equi numa amostra de soro, em que:
a)- poço, b)- halo resultante de hemólise completa.
in:http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/sn/fig2.html

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3.2.4 Técnicas de Imunofluorescência

A técnica de imunofluorescência é muito utilizada na detecção de


microrganismos em amostras e, na detecção de um anticorpo específico em
células e tecidos. Esta técnica foi pela primeira vez aplicada em 1982.

A base deste teste consiste na utilização de um composto fluorescente que


detecta a ligação entre anticorpos e antigénios. Os anticorpos estão associados a
partículas que possuem fluorescência, tais como a fluoresceína, a rodamina,
Texas Red®, citocromo 3 e citocromo 5.

Tabela 2 - Tipos e características de fluorocromos utilizados nos testes de


imunofluorescência.
in: http://www.chemicon.com/resource/litlibrary/ant101.pdf.

Excitação Emissão
Fluorocromo Coloração
(nm) (nm)
AMCA 350 450 Azul
Cy3 550 680 Laranja, Vermelho
Cy5 650 680 Laranja, Vermelho
Fluoresceína 495 520 Verde
Hoechst 33258 360 470 Azul
B-ficoeritrina 545, 565 575 Laranja, Vermelho
R-ficoeritrina 480, 545, 565 578 Laranja, Vermelho
Rodamina 539, 574 602 Vermelho
Texas red 558, 594 623 Vermelho

Quando o anticorpo se liga ao antigénio, observa-se fluorescência da


partícula fluorescente que está associada ao anticorpo.

Existem dois tipos de técnicas de imunofluorescência: a directa e a


indirecta.

3.2.4.1. Técnicas de imunofluorescência directa

Princípio:

Este método baseia-se na adição à amostra em estudo, de anticorpos


específicos associados a partículas fluorescentes.

A amostra é fixada numa lâmina à qual serão adicionados os anticorpos


marcados com a partícula fluorescente. Após incubação, esta é lavada por forma
a retirar os anticorpos que não se ligaram aos antigénios. Desta forma, se nessa
amostra existirem antigénios, observa-se fluorescência quando a amostra é
exposta a radiações UV.

16
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Figura 8 - Esquema de um resultado positivo de um teste de imunofluorescência


directa. Em que: A- adsorção a uma lâmina de uma amostra suspeita de conter
antigénios e, posterior adição de anticorpos (específicos para os antigénios em
estudo) marcados com fluorocromo (F); B- ligação específica dos anticorpos aos
antigénios; C- resultado do teste visto por microscopia de fluorescência. No caso
de não existirem antigénios na amostra, não se observa fluorescência.
in: http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/ifa/iagram_direct.html

Vantagens e limitações:

− Procedimentos rápidos, sensíveis e muito específicos;


− Não é facilmente automatizado;
− Método dispendioso;
− Não fornece resultados quantitativos.

Exemplo:

O vírus respiratório sincicial (VRS) afecta as crianças no primeiros anos de


vida, dando origem a pneumonia e bronquiolites. O kit VRS DFA da Chemicon
International permite a identificação de VRS em culturas de tecidos ou em
soluções de células colhidas da via respiratória, aplicando a técnica de
imunofluorescência directa de anticorpos.

Os anticorpos monoclonais são associados à fluoresceína de isotiocianato


(FITC), que possui uma coloração verde quando exposta ao ultravioleta. Adiciona-
se este complexo à amostra a estudar e, caso existam antigénios específicos para
o anticorpo, ocorre ligação. O complexo anticorpo-FITC que não se ligou ao
antigénio é removido com uma lavagem com tampão. Assim, a amostra quando é
exposta ao ultravioleta só apresenta coloração verde quando contém os
antigénios que se pretendia estudar.[12]

17
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3.2.4.2. Técnicas de imunofluorescência indirecta

Princípio:

Estes testes são aplicados com vista a detectar numa amostra a presença
de anticorpos específicos após a exposição a um microrganismo (antigénio),
sendo por regra mais sensíveis que os métodos directos. Neste caso, o antigénio
específico é fixado a uma lâmina onde, posteriormente, se adiciona a amostra em
estudo. Se existir na amostra algum anticorpo específico contra o microrganismo,
ocorrerá uma reacção entre os dois dando origem a um complexo.

Para que se possa detectar a formação deste complexo, adiciona-se uma


anti-imunoglobulina sérica marcada com fluorescência, que irá por sua vez reagir
com o anticorpo. É importante referir que a anti-imunoglobulina só reage com o
anticorpo quando ele está associado ao antigénio. Depois da incubação, efectua-
se a lavagem da lâmina por forma a eliminar todos os anticorpos que não
complexaram.

Figura 9 - Esquema de um resultado positivo de um teste de imunofluorescência


indirecta. A- adsorção a uma lâmina de um tecido com um antigénio específico
(Ag), seguida da adição da amostra suspeita de conter anticorpos (Ac) para os
quais os antigénios têm especificidade, ocorrendo ligação entre estes e, posterior
adição de anti-anticorpos marcados com fluorocromo (F); B- ligação específica
dos anti-anticorpos ao complexo anticorpo-antigénio; C- resultado do teste visto
por microscopia de fluorescência. No caso de não existirem anticorpos na
amostra, não se observa fluorescência.
in: http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/ifa/iagram_direct.html

18
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Vantagens e limitações:

− Mais sensível que o teste directo;


− Esta técnica pode ser utilizada para detectar vários vírus num único ensaio.
Isto é possível devido ao facto das anti-imunoglobulinas se ligarem a
anticorpos que são produzidos, como reacção à presença de diferentes
vírus da mesma espécie;
− Exige um trabalho laboratorial intenso, não sendo facilmente automatizado;
− Método dispendioso;
− Não fornece resultados quantitativos;
− É difícil obter células alvo ideais para efectuar o teste. Os tecidos humanos
são obtidos através de dadores de órgãos.

Exemplo:

Detecção de Anticorpos Anti-Nucleares (ANA) por imunofluorescência


indirecta. Os ANA são auto-anticorpos que se encontram livres no soro, actuando
contra componentes nucleares nomeadamente, contra o DNA, histonas, vários
complexos de RNA e proteínas (antigénios).

O método consiste na adsorção de um tecido animal a um determinado


suporte com a posterior adição de uma amostra (soro). O tecido deve ser colhido
post mortem de modo a conter células mortas, possibilitando deste modo a
penetração dos auto-anticorpos (Auc), quando presentes no soro, nas estruturas
nucleares. Após uma lavagem, na qual são eliminados os Auc que não se tenham
ligado às estruturas nucleares, são adicionados anti-Auc fluorescentes, os quais
devido à sua especificidade vão ligar-se aos Auc. O ensaio é observado ao
microscópio sob luz ultravioleta. Se os núcleos estiverem verdes fluorescente, o
teste é positivo.[13]

Figura 10 - Resultado de um teste de imunofluorescência indirecta. A presença de


fluorescência no núcleo das células indica a existência de auto-anticorpos contra
os componentes nucleares das células de um indivíduo.
in:http://www.mds.qmw.ac.uk/biomed/kb/resources/immunology/tests/anf/anfcosp
1.jpg

19
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3.2.5. Teste de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Consiste na marcação com uma enzima para detecção da ligação


antigénio-anticorpo. Existem dois tipos de testes ELISA: directo e indirecto, sendo
que o primeiro detecta a presença de antigénios e, o segundo detecta a presença
de anticorpos. Esta técnica foi pela primeira vez aplicada em 1982.[7]

3.2.5.1. Teste de ELISA directo

Princípio:

Um anticorpo específico é adsorvido à superfície dos poços de placas de


microtitulação, aos quais posteriormente é adicionada a amostra que contém o
antigénio a ser detectado.

Após um período de incubação, adiciona-se um segundo anticorpo


específico para o antigénio em estudo e, que se encontra ligado covalentemente a
uma enzima (peroxidase ou fosfatase alcalina) que converte um substrato incolor
num produto com cor. Por fim, adiciona-se o substrato. Se o anticorpo ligado à
enzima, se ligar ao antigénio (no poço), ocorre actividade enzimática, podendo ser
detectada por uma alteração de cor.

Figura 11 - Esquema de um resultado positivo de um teste de ELISA directo. Em que:


1- Ag ligado a Ac específico adsorvido a poços de placas de microtitulação, com
posterior adição de um segundo Ac específico, ligado a uma enzima (E); 2-
ligação do segundo Ac ao Ag; 3- adição do substrato incolor (S) da enzima e
produção do produto (P) colorido.
in:http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/elisa/diagram_Ag.html

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Vantagens e limitações:

− Os resultados podem ser facilmente quantificados por espectofotometria;


− Todo o processo pode ser automatizado e analisado por computador;
− Existência de kits para a população em geral (Ex.:teste de gravidez);
− Necessita de um controlo cuidado, para diferenciar entre reacções
específicas e reacções não específicas.

Exemplo:

Detecção da hormona hCG (gonadotrofina coriónica), através do kit Trinity


Biotech Uni-GoldTM hCG Stick.

A hCG pode ser encontrada na urina de mulheres grávidas e o kit acima


referido permite detectar a sua presença. Este kit é constituído por três áreas:

− área de reacção que contém anti-anticorpos monoclonais (anti-hCG)


ligados a uma enzima mas que não se encontram adsorvidos à
membrana;
− área de teste que contém anti-anticorpos policlonais imobilizados e o
substrato da enzima;
− área de controlo que contém anti-anticorpos de rato e o substrato da
enzima.

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

R C
T

C
T

Figura 12 - Teste de gravidez. 1- O stick é mergulhado na amostra de urina que possui a


hormona hCG; 2- A amostra é arrastada por acção da capilaridade ao longo da
membrana até alcançar a zona de reacção (R), onde a hormona liga-se aos anti-
Ac monoclonais contra hCG, os quais estão livres e ligados a uma enzima. A
hormona ligada ao conjugado anti-Ac/enzima é dissolvida e arrastada por
capilaridade. 3- O conjugado hCG-Ac/enzima alcança a zona de teste (T). Outros
epitopos da molécula de hCG ligam-se aos anti-Ac policlonais imobilizados. 4- Na
zona de controlo (C) os Ac monoclonais não ligados a hCG ligam-se aos anti-Ac
de rato imobilizados. 5- As enzimas fixadas são agora capazes de degradar o
substrato, tanto na zona T como na C, originando um produto com cor. 6- A
presença de uma banda vermelha na zona T indica um resultado positivo (+),
enquanto que uma banda vermelha na zona C indica que a reacção funcionou, tal
como também se verifica para o resultado negativo (-).
in: http://www.whfreeman.com/kuby/con_index.htm?06

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

3.2.5.2. Teste de ELISA indirecto

Princípio:

O seu princípio é semelhante ao do ELISA directo. No entanto, neste teste


pretende-se efectuar a detecção de anticorpos, pelo que se adsorve à superfície
dos poços de placas de microtitulação um antigénio específico. Posteriormente, é
adicionada a amostra que contém o anticorpo a ser detectado. É utilizada a
mesma enzima do método anterior, estando neste caso ligada a um segundo
antigénio específico. A detecção da ligação anticorpo-antigéno é efectuada do
mesmo modo que para o ELISA directo.

Figura 13 - Esquema de um resultado positivo de um teste de ELISA indirecto. Em que:


1- Ac ligado a Ag específico adsorvido a poços de placas de microtitulação, com
posterior adição de um anti-anticorpo ligado a uma enzima (E); 2- ligação do anti-
anticorpo ao Ac; 3- adição do substrato incolor (S) da enzima e produção do
produto (P) colorido.
in: http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/elisa/diagram_Ab.html

Vantagens e limitações:

− Idênticas às referidas para o ELISA directo.

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Exemplo:

Detecção de anticorpos do vírus de imunodefeciência adquirida (HIV) tipo 1


e 2 no sangue humano, através do kit Trinity Biotech SeroCardTM. Este kit consiste
numa matriz sólida à qual estão adsorvidos péptidos sintéticos do
HIV - estes péptidos representam as proteínas da cápsula do HIV-1 e do HIV-2.
Estes péptidos estão num local que tem uma ligação com a janela onde se coloca
a amostra de sangue. Se a amostra contiver anticorpos do HIV, estes irão formar
um complexo com o antigénio do HIV na janela de reacção. De seguida, é
adicionada na janela de reacção uma anti-IgG do HIV, à qual está ligada uma
fosfatase alcalina. Finalmente, adicionando-se o substrato da enzima na janela de
reacção, surge um ponto azul como resultado positivo da presença de anticorpos
do HIV.

Figura 14 - Kit Trinity Biotech SeroCard™ HIV. O ponto azul indica um resultado positivo
da presença de anticorpos do HIV na amostra.
in: http://www.trinitybiotech.com/EN/index2.asp?pg=pro_dtls.asp%3Fid%3D370

3.2.6. Testes Imunológicos com pouca aplicação actualmente


No capítulo sobre os testes imunológicos procurámos incidir sobre os testes
que maior aplicação encontram actualmente. No entanto, existem outros testes
que, apesar de no passado terem tido bastante importância, encontram-se
ultrapassados do ponto de vista tecnológico. De seguida iremos apresentar alguns
destes métodos.

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

3.2.6.1. Testes Radioimunológicos (RIA)

Esta técnica foi desenvolvida em 1977 por Rosalyn R. Yalion.[14]

Princípio:

Este teste tem por base a marcação radioactiva de anticorpos ou antigénios


com iodo (125I) ou hidrogénio (3H), que posteriormente são colocados em contacto
com a amostra em estudo. A existência de ligações antigénio-anticorpo é
determinada por contagem de radioactividade.

Vantagens e limitações:

− Fornece uma informação quantitativa;


− É um método muito sensível, permitindo a detecção de pequenas
quantidades de anticorpo ou de antigénio;
− Exige áreas de trabalho especiais no laboratório clínico;
− O material radioactivo tem de ser descartado.

3.2.6.2. Teste de Imunoelectroforese

Esta técnica foi pela primeira vez aplicada em 1979.

Princípio:

Este teste consiste na combinação da técnica de imunodifusão com a


electroforese, de forma a permitir a identificação de antigénios numa determinada
amostra de modo mais rápido.

Na imunoelectroforese utiliza-se um gel com poços onde é aplicada a


amostra (soro humano) que contém os anticorpos específicos para o antigénio em
estudo. A amostra com antigénios é colocada nesse poço e, por electroforese
consegue-se efectuar a separação das diversas proteínas presentes na amostra.
De seguida, adiciona-se o anticorpo específico que migra em direcção ao
antigénio, dando origem a um precipitado na região de concentração óptima.

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Vantagens e limitações:

− Possui alta resolução pois consegue detectar pequenas diferenças de


carga total entre antigénios;
− Apresenta uma sensibilidade limitada, pois o método é eficaz apenas
quando se utilizam elevadas concentrações de antigénios, apesar de ser
melhor que a do teste de imunodifusão;
− Método barato;
− Mais rápido que o teste de imunodifusão, uma vez que é “acelerado” pela
electroforese.

3.2.6.3. Reacção de Fixação do Complemento


Princípio:

Este teste é utilizado para detectar a presença de pequenas quantidades


de anticorpos contra um antigénio conhecido e consiste em duas etapas.

A primeira etapa consiste na fixação do complemento (grupo de proteínas


séricas) ao complexo anticorpo-antigénio. De modo a confirmar a formação do
complexo anticorpo-antigénio-complemento, segue-se então a etapa de revelação,
na qual adicionam-se eritrócitos e os respectivos anticorpos. Se tiver existido a
fixação de todo o complemento, então não restará nenhum complemento livre
para promover a hemólise dos eritrócitos. [4]

Vantagens e limitações:

− Detecta quantidades muito pequenas de anticorpo;


− A execução do teste exige cuidado e bons controlos;
− O teste necessita de duas etapas.

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

3.3. Testes Baseados em Técnicas de Engenharia Genética


(TEGs)

O que são TEGs?

Os TEGs envolvem a análise do DNA de um indivíduo (retirado de células


de uma amostra de sangue, de fluidos corporais ou de tecidos), recorrendo a uma
grande variedade de técnicas laboratoriais, que permitem a pesquisa de uma
mutação ou polimorfismo que aponte para uma determinada doença ou um
distúrbio fisiológico.

Os três métodos mais utilizados para efectuar os TEGs são: identificação


de alterações na totalidade dos cromossomas; análise de pequenos fragmentos
de DNA marker contidos nos genes ou perto destes e, análise dos produtos da
transcrição e subsequente tradução dos genes (as proteínas).[15],[16],[17]

A execução de TEGs é um processo complexo e, para que sejam utilizados


em diagnóstico ou análises é necessário que haja uma grande fiabilidade dos
procedimentos laboratoriais envolvidos, que os resultados obtidos sejam sujeitos a
uma análise precisa e um grande cuidado na forma como os resultados de um
TEG são transmitidos aos indivíduos afectados e às suas famílias. Os testes
também variam na sua sensibilidade, isto é, na sua capacidade de detectar
mutações ou de avaliar todos os indivíduos que têm, ou que irão desenvolver,
uma determinada doença. [17]

Que informação é que os TEGs podem fornecer?

Os TEGs podem ser utilizados para efectuar uma previsão, avaliando se


um determinado indivíduo tem uma predisposição hereditária para uma
determinada doença antes da manifestação dos sintomas, ou para confirmar um
diagnóstico se os sintomas já estivem presentes. Os TEGs também podem ser
utilizados para determinar se um indivíduo é portador de uma doença, sendo este
diagnóstico importante, pois apesar do indivíduo não desenvolver a doença, pode
vir a passar o alelo mutado à sua progénie. [16]

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

3.3.1. Southern Blotting


Esta técnica foi desenvolvida em 1975 por E. M. Southern.[18]

Princípio:
Permite a detecção de moléculas de DNA após a sua separação
electroforética, por hibridação com uma sonda cuja sequência é complementar à
sequência de DNA em estudo.

Figura 15 - Southern Blotting. Em que: A- os fragmentos DNA, obtidos por digestão com
enzimas de restrição, são separados electroforeticamente em gel de agarose; B-
coloca-se uma membrana de nitrocelulose ou nylon sobre o gel, ocorrendo a
transferência dos fragmentos de DNA por blotting. O gel está colocado num
tampão que contém compostos alcalinos, os quais desnaturam o DNA. O tampão
é transferido por capilaridade para as folhas de papel absorvente colocadas
sobre a membrana de nylon, promovendo a passagem dos fragmentos de DNA
para a membrana; C- a membrana de nylon é removida e os fragmentos de DNA
ficam na mesma posição que ocupavam no gel; D- coloca-se a membrana num
saco de plástico selado que contém sondas de DNA marcadas radioactivamente
e específicas para os fragmentos de DNA em estudo. Nestas condições é
favorecida a hibridação; E- retira-se a membrana do saco e após lavagem desta,
efectua-se a visualização do DNA hibridado por exposição a raios X.
in: http://www.accessexcellence.org/AB/GG/southBlotg.html&h=536&w=700&pre
v=/images%3Fq%3DSouthern%2BBlotting%2B%26svnum%3D10%26hl%3DptPT
%26lr%3D%26ie%3DUTF-8%26oe%3DUTF-8%26sa%3DN

28
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Vantagens e desvantagens:
− Técnica muito sensível;
− Não é necessário ter informação sobre a função do gene para elaborar o
protocolo de diagnóstico;
− É necessária informação sobre a mutação que dá origem à doença;
− Permite a detecção de um único fragmento de restrição no meio de milhões
de fragmentos.

3.3.2. Polymerase Chain Reaction (PCR) e Variantes

A PCR como técnica baseada em engenharia genética data de 1985, no


entanto as primeiras aplicações na área do diagnóstico foram realizadas em
1989.[19]

Princípio:

Numa reacção em cadeia catalisada pela DNA polimerase, é possível


amplificar especificamente um determinado fragmento de DNA, tirando partido das
características da DNA polimerase. A enzima mais utilizada é a Taq polimerase,
extraída da bactéria Thermus aquaticus. Para efectuar a reacção de amplificação
é necessário ter uma pequena quantidade do DNA que se pretende amplificar e,
dois oligonucleótidos sintéticos de DNA (primers) em cadeia simples. Os primers
são complementares às extremidades 3’ dos fragmentos de DNA em cadeia
simples a amplificar e devem ser adicionados à reacção em grande quantidade.
São também necessários nucleótidos livres (dNTPs) para a síntese de novas
cadeias de DNA.

A reacção de PCR consiste numa sucessão de vários ciclos (normalmente


entre 25 e 30 ciclos), em que cada ciclo consiste de três etapas, que
correspondem à incubação da reacção a três temperaturas diferentes. A Taq
polimerase polimeriza novas cadeias de DNA a partir dos primers de DNA, tendo
como molde as cadeias de DNA previamente desnaturadas, às quais os primers
se ligaram especificamente. Este ciclo de três etapas é repetido várias vezes. Em
cada ciclo, o DNA sintetizado no ciclo anterior serve de molde à síntese de novas
moléculas de DNA, de tal modo que a quantidade do fragmento de DNA
pretendido aumenta exponencialmente.

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Vantagens e limitações:

− Técnica rápida e muito sensível;


− Tamanho de DNA a ser amplificado é limitado;
− Dada a elevada sensibilidade da técnica, a ocorrência de contaminações
pode resultar na presença de falsos positivos;
− Perigo de inibições;
− Perigo de ocorrer annealing entre primers.

3.3.2.1. Multiplex PCR


Princípio:

Permite a amplificação de duas ou mais sequências alvo de DNA diferentes


na mesma amostra simultaneamente.

Nos testes de diagnóstico utiliza-se um conjunto de primers para amplificar


um controlo interno para verificar a integridade da PCR e, um segundo conjunto
de primers que amplifica a região de interesse do DNA. Um resultado positivo do
controlo interno, permite garantir que as condições estão optimizadas por forma a
se realizar a PCR e, confirma a integridade e disponibilidade do DNA para a
detecção do gene alvo.

A PCR multiplex é também utilizada em laboratórios clínicos, para a


detecção da existência de diversos microrganismos numa amostra com um único
ensaio, ou seja, a reacção de PCR pode conter, para além da amostra, uma
panóplia de primers que têm como alvo, por exemplo, diferentes estirpes virais.

Vantagens e limitações:

− Analisar a presença de diferentes organismos em simultâneo num único


tubo de PCR;
− A reacção pode tornar-se inespecífica com o aumento de sequências a
amplificar (annealing de primers);
− Obtém-se resultados em menos 24 horas.

30
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Exemplo:

Identificação de animais transgénicos através do kit QIAGEN Multiplex


PCR. O kit QIAGEN Multiplex PCR é o primeiro kit que se baseia no método de
PCR multiplex e, permite uma amplificação padronizada, sendo por esse motivo
de rápida e fácil aplicação.[20]

Este kit contém concentrações pré-optimizadas de HotStarTaq® DNA


Polymerase, de cloreto de magnésio, de dNTPs e de um tampão especial para a
utilização em multiplex PCR, que consiste na combinação de sais e aditivos que
asseguram eficiências de annealing reprodutíveis. A HotStarTaq® DNA
Polymerase aumenta a especificidade, de forma a que à temperatura ambiente
não se formem produtos de PCR inespecíficos, nem dímeros de primers. A
solução Q fornecida neste kit permite a amplificação das zonas ricas em GC ou
alvos com estrutura secundária complexa. [20]

Animais transgénicos, como por exemplo o rato, podem ser detectados por
este método, através da distinção entre o locus wild-type e o locus mutante. Essa
distinção é feita através da utilização de primers especificamente desenhados
para cada caso. [21]

Figura 16 - Mapa da região amplificada por multiplex PCR.


in: http://www.biocompare.com/techart.asp?id=679#Kit.

Na Figura 17, um dos primers está localizado no locus wild-type. Foram


desenhados dois primers reversos, um específico para o locus wild-type e outro
para o locus mutante; dando origem a produtos de PCR com diferentes tamanhos.

31
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Figura 17 - Rastreio de ratos transgénicos utilizando o kit QIAGEN Multiplex PCR. O kit
possui três primers específicos para o locus do gene 2 da recombinação. Os
primers foram desenhados de forma a originar produtos de PCR de diferentes
tamanhos permitindo a distinção entre o rato homozigoto wild type (wt), o rato
heterozigoto mutante (ht) ou o homozigoto mutante (hm).
in: http://www.biocompare.com/techart.asp?id=679#Kit.

3.3.2.2. Nested PCR

Princípio:

Nesta técnica são utilizados dois conjuntos de primers de amplificação, em


que a sequência alvo de um dos conjuntos de primers está compreendida no
produto de amplificação do outro conjunto de primers.

Vantagens e limitações:

− Aumenta a sensibilidade e especificidade da reacção.

Exemplo:

Detecção em amostras clínicas, da bactéria Vibrio vulnificus, por Nested


PCR.

Vibrio vulnificus é uma bactéria halófila de estuário que provoca septicémia


primária fatal e gangrena. A septicémia é uma infecção que ocorre devido à
entrada de bactérias virulentas na corrente sanguínea. Posteriormente,
multiplicam-se e libertam uma substância, a hemolisina, que é capaz de lisar
hemácias e outras células.[22] A infecção desencadeia-se a seguir à ingestão de
marisco cru. V. vulnificus tem um efeito mais nocivo em indivíduos com doenças
hepáticas, com hábitos de elevado consumo de álcool e com HIV.

32
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

O género Vibrio inclui mais do que 30 espécies, das quais 12 são


patogénicas para o Homem, ou têm sido isolados de amostras clínicas humanas.
Oito destas espécies de Vibrio associadas a humanos foram isoladas de amostras
clínicas extraintestinais. Para um diagnóstico preciso, V. vulnificus deveria ser
diferenciada de pelo menos outras sete espécies de Vibrio extraintestinais.[23]

Esta infecção progride de forma bastante rápida e a percentagem de


mortalidade é superior a 50% em apenas um ou dois dias após a sua admissão no
hospital. Mesmo com o equipamento mais sofisticado ou métodos de detecção
presuntivos rápidos que se socorram de meios diferenciais, são necessários mais
do que dois dias para a identificação precisa de V. vulnificus a partir de amostras
de sangue ou tecido. Normalmente, os médicos iniciam uma terapia utilizando
vários antibióticos sem esperar pelos resultados dos testes das culturas, no
entanto, este tratamento não é específico. Para que seja administrada uma terapia
eficaz, é crucial reduzir ao mínimo o tempo necessário para a identificação do
microrganismo responsável pela infecção, de modo que a que se possa iniciar um
tratamento baseado em antibióticos específicos para a septicémia provocada por
V. vulnificus.[23]

A grande vantagem do diagnóstico através do método de nested PCR


consiste no tempo necessário para efectuar o teste, o qual é realizado em cerca
de 6 horas. Para além disso, consegue-se uma melhor sensibilidade e
especificidade nesta técnica quando comparada com a PCR simples.[23]

Figura 18 - Mapa da região amplificada por Nested-PCR do gene de V. vulnificus. O gene


que codifica para a hemolisina (vvh) é clonado no plasmídeo pCVD 702 . O
conjunto de primers externo P1-P2 amplifica um segmento de DNA de 704bp e, o
conjunto de primers interno P3-P4 amplifica o segmento de DNA interno de
222bp. As setas a cheio indicam a direcção e as ORFs dos genes vvh.
in: http://jcm.asm.org/cgi/content/full/36/10/2887

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

A B C D E F G H I

Figura 19 - Electroforese dos produtos de amplificação enzimática do DNA de V.


vulnificus. Esta electroforese foi realizada a partir de amostras de soro de
pacientes com septicémia. A- DNA ladder de 100bp; B- controlo positivo (pellet
de V. vulnificus C7184); C- controlo negativo; D a I- produtos de amplificação do
DNA de amostras de pacientes. A seta indica a banda alvo.
in: http://jcm.asm.org/cgi/content/full/36/10/2887

3.3.2.3. MSP-PCR (methylation specific PCR)


Princípio:

Para distinguir o estado de metilação de uma sequência de DNA, a técnica


MSP apoia-se em modificações químicas diferenciais que ocorrem nos resíduos
de citosina do DNA. Assim, inicialmente, procede-se ao tratamento do DNA com
bissulfito de sódio, o qual converte os resíduos de citosina não metilados em
uracil, mas não altera as citosinas metiladas. Esta modificação cria assim
sequências diferentes de DNA, originando DNA metilado e não-metilado, sendo
estes usados como molde para PCR.

Os primers são desenhados para um determinado locus com 80-250bp e,


com a capacidade para distinguir DNA metilado de DNA não metilado. O número e
a posição de citosinas dentro do dinucleótido CpG determina a especificidade dos
primers para os moldes metilados e não metilados. Tipicamente, 1-3 locais CpG
estão incluídos em cada primer e estão concentrados na região 3’ de cada primer.
Este conjunto de características fornece uma especificidade óptima e minimiza os
falsos positivos que possam ocorrer devido a emparelhamentos errados. [24]

São desenhados dois pares de primers, um par contém sequências cujas

34
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

citosinas não estão alteradas (metiladas no DNA genómico) e o outro par de


primers contém sequências cujas citosinas estão alteradas (não metiladas no
DNA genómico). Uma comparação entre resultados de PCR que utilizem os dois
pares de primers revela o estado de metilação do DNA. Desta forma, se o par de
primers com a sequência alterada der origem a um produto de PCR, então a
citosina indicada estava não metilada. Por sua vez, se o par de primers com a
sequência não modificada originar um produto de PCR, então as citosinas
estavam metiladas pois estavam protegidas da alteração induzida pelo bissulfito
de sódio.

São realizadas duas reacções de PCR com a amostra de DNA. Uma


reacção é feita com o DNA originalmente metilado para o gene de interesse
(amostra suspeita de conter citosinas metiladas) e, outra reacção com o DNA
originalmente não metilado (amostra que não tem citosinas metiladas).

Figura 20 - Esquema da técnica de MSP-PCR.


in: http://www.oncomethylome.com/technology.htm

Para facilitar a análise simultânea das reacções metiladas e não metiladas


de um dado gene feitas num mesmo termociclador, deve-se ajustar o
comprimento dos primers, de forma a originar temperaturas de annealing
semelhantes. Tal facto, resulta num produto não metilado com mais alguns pares
de bases do que o produto metilado, obtendo-se duas bandas diferentes no gel de
electroforese, permitindo assim a sua diferenciação. A presença de uma banda de
um dado peso molecular, indica a presença de alelos não metilados e/ou
metilados na amostra original.[24]

35
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Vantagens e limitações:

− Método rápido e simples;


− Método que apresenta extraordinária sensibilidade, permitindo a detecção
de uma cópia de um gene metilado em 1000 cópias não metiladas,
mantendo a especificidade;[25]
− Depois da amplificação por PCR e da electroforese em gel, os resultados
são obtidos imediatamente sem necessitar de nenhuma análise
complementar;
− Método com custos reduzidos e de fácil execução, permitindo o estudo de
marcadores múltiplos através de uma rápida análise;
− Necessita de pequenas amostras de DNA;
− Esta técnica permite apenas mapear padrões de metilação no DNA.

Exemplo:

Detecção de cancro da próstata por metilação específica-PCR (MSP-PCR).

A metilação do DNA consiste na adição de um grupo metil a certas


citosinas, sendo esta modificação química catalisada por uma enzima denominada
metiltransferase. Em eucariontes superiores o DNA é metilado apenas em certas
citosinas localizadas na extremidade 5’, as quais passam a guanosinas. Em
células normais, a metilação ocorre predominantemente em regiões do DNA que
são pobres em repetições CG. As regiões promotoras de genes que controlam a
expressão de proteínas são normalmente ricas em ilhas CpG (regiões em que os
resíduos CG são predominantes), pelo que em células normais encontram-se
pouco metiladas. [26]

As ilhas CpG encontram-se dentro dos promotores de 60% dos genes


humanos e, normalmente não se encontram metiladas, não obstante o grau de
expressão do gene. A metilação aberrante (hipermetilação) do promotor conduz
geralmente à inibição irreversível da transcrição do gene.[27] A hipermetilação de
regiões promotoras é muitas vezes um factor decisivo na inactivação de genes
supressores de tumores em cancros humanos. Uma vez que os padrões de
metilação são específicos para tumores, o seu mapeamento tem-se tornado numa
importante ferramenta para compreender a expressão dos genes nos tumores.

A hipermetilação dos promotores dos genes pode ser um valioso marcador


de tumores pois:

- Ocorre com muita frequência e são sempre encontrados na mesma posição


de um gene;
- Podem ser usados líquidos acessíveis como amostra (soro, etc.), o que

36
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

elimina a necessidade de ter uma amostra complexa do tumor.[26]

O adenocarcinoma da próstata é o cancro mais frequentemente


diagnosticado entre os homens no mundo ocidental. É uma doença multifactorial,
na qual estão envolvidos diversos factores ambientais e genéticos. A hipermetilação
do promotor do gene GSTP1 (normalmente expresso em tecido epitelial humano
normal, incluindo a próstata) é a alteração mais frequente no DNA em carcinomas
prostáticos, ocorrendo em mais de 90% destes. Esta hipermetilação encontra-se
ausente em tecido hiperplástico prostático normal ou benigno. Como tal, a
frequência de metilação fornece um óptimo marcador molecular de cancro da
próstata.[28]

O gene GSTP1, localizado a 11q13, pertence à superfamília dos genes das


enzimas Glutationa S-transferase (GSTs). Estas enzimas estão envolvidas na
destoxificação de compostos electrofílicos, tais como carcinogeneos e xenobióticos,
por conjugação da glutationa. Pensa-se que estas enzimas estejam envolvidas na
protecção do DNA contra danos oxidativos.[29]

A hipermetilação do promotor do gene GSTP1 é frequentemente associada à


perda de expressão da enzima GSTP, sendo este o efeito mais comum descrito
para o adenocarcinoma da próstata. A inactivação de GSTP1 pode, também, levar
a um aumento da vulnerabilidade celular para danos oxidativos no DNA, podendo
ocorrer uma acumulação de aductos de DNA, os quais originam alterações
genéticas relevantes nas células tumorais.[29]

Figura 21 - DNA isolado do carcinoma prostático (C) e de


tecido prostático hiperplástico benigno (B)
por MSP-PCR.
O DNA foi modificado com bissulfito e foi
realizada uma MSP com 32 ciclos. Os primers
eram específicos para um fragmento de 92bp do
gene GPTP1, derivado da sequência metilada
(azul), ou para um fragmento de 99bp derivado
da sequência não metilada (verde). Os produtos
da PCR foram resolvidos num gel de
poliacrilamida e visualizados usando a detecção
laser-fluorescência. A amostra de carcinoma tem
a presença tanto de sequências metiladas como
não metiladas, devido à presença de células
normais na amostra.
in: http://www.qiagen.com/clinical/applications
/oncology/prostate_cancer_i.asp

37
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

3.3.2.4. Real-time PCR

A primeira experiência tendo por base a tecnologia que daria origem ao


real-time PCR foi executada em 1990, tendo sido desenvolvida e patenteada em
1999.

Princípio:

O sistema de real-time PCR permite a detecção dos produtos de PCR ao


longo da reacção, sendo a informação recolhida na fase exponencial da reacção
de PCR. Apenas nesta fase, a quantidade de fluorescência medida é directamente
proporcional à quantidade de produto amplificado. Esta técnica permite uma
quantificação fácil de DNA e RNA.[30]

Vantagens e limitações:

− Permite a quantificação da amplificação ao longo do processo ao contrário


das PCR convencionais (em que a quantificação só é possível no final da
reacção);
− O processamento dos resultados depois da reacção de PCR é efectuado
por um software adequado;
− Minimiza problemas de contaminação;
− Possui elevada sensibilidade e especificidade;
− Fácil de realizar e com possível automatização;
− Possui maior reprodutibilidade relativamente aos métodos convencionais.

38
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

A quantificação dos produtos da amplificação pode ser feita de duas


formas:

Ensaio da 5´nuclease associada à Fluorescent Resonant Energy Transfer (FRET)

Figura 22 - Ensaio 5´nuclease. Em que 1- adição de uma sonda que possui um repórter
fluorescente de elevada energia na extremidade 5’, uma molécula de baixa energia
denominada por quencher na extremidade 3’ e uma sequência complementar à
zona intermédia entre os dois primers. Quando a sonda está intacta e excitada por
uma fonte luminosa, a libertação da partícula repórter é suprimida pela partícula
quencher devido à sua proximidade; 2- a polimerase (P) inicia a amplificação em
direcção à sonda; 3- quando a polimerase encontra a sonda, esta é clivada pela
actividade 5´ exonucleolítica da enzima. O afastamento entre as duas partículas
fluorescentes leva a um aumento da fluorescência da partícula repórter e a uma
diminuição da fluorescência da partícula quencher.
in: http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/rtpcr_vs_tradpcr.pdf

Vantagens e limitações:

− Hibridação específica entre a sonda e o alvo, o que origina um sinal


fluorescente;
− As sondas podem ser feitas com repórteres diferentes permitindo a
distinção de duas sequências distintas numa só PCR;
− A análise de resultados é simples;
− É necessário construir diferentes sondas consoante a sequência a
analisar.[31]

SYBR Fluorescência Verde

39
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Figura 23 - SYBR Fluorescência Verde. Em que: A- cadeia de DNA desnaturada e


partículas de SYBR verdes livres, o que se traduz numa ausência de sinal; B-
ligação dos primers às cadeias desnaturadas e início da polimerização, com a
incorporação das partículas de SYBR verdes; C- produto da amplificação com
as partículas de SYBR intercaladas dando origem a um sinal fluorescente.
in:http://fermat2.cer.jhu.edu/~as410610/geneorg_summer_2003/lecture_pdf/Rea
l_Time_PCR.PDF

Vantagens e limitações:

− Consegue monotorizar a amplificação de qualquer sequência de DNA em


cadeia dupla;
− Não são necessárias sondas, reduzindo o custo do processo;
− Pode originar sinais falsos positivos, porque a partícula verde de SYBR
liga-se a qualquer cadeia dupla de DNA, inclusive a sequências não
específicas.[31]

40
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Exemplo:

Detecção de Salmonella em produtos alimentares através da utilização do


kit LightCycler foodproof Salmonella.

A espécie Salmonella entrica é nociva, podendo provocar diarreia. Esta


espécie pode ser encontrada em alimentos de origem animal (bife, leite, ovos) ou
vegetal.

O kit de detecção de Salmonella é utilizado para quantificar o DNA de


Salmonella existente numa amostra de comida. Contém primers e sondas de
hibridação (específicas para a zona de detecção), bem como um controlo interno
(CI), de forma a evitar uma má interpretação de falsos negativos. As sondas de
hibridação são desenhadas de forma a se ligarem ao controlo interno, sendo este
detectado a um comprimento de onda diferente do do DNA de Salmonella no
LightCycler Instrument. O kit possui todos os reagentes com a excepção do
material a analisar e por isso minimiza o risco de contaminação. [32]

O processo ocorre em quatro passos:

Passo 1- Utilizando os primers de sequência específica para o controlo


interno e para a sequência característica de Salmonella (na região 16S do rDNA
por ser uma região altamente conservada), a PCR é efectuada num LightCycler
Instrument, permitindo a amplificação e a detecção dos fragmentos dos genes
específicos de Salmonella.

Passo 2- O LightCycler Instrument detecta os fragmentos amplificados em


tempo real, através da fluorescência gerada pela ligação das sondas. Para cada
sequência específica, uma sonda de hibridação é marcada na extremidade 5´ com
o fluoróforo vermelho LightCycler (LightCycler Red 640 ou LightCycler Red 705
para a detecção do controlo interno) e, para evitar a extensão, é modificado na
extremidade 3´ por fosforilação. A outra sonda é marcada na extremidade 3´ com
fluoresceína LightCycler.

Passo 3- Durante a fase de annealing de cada ciclo de PCR, estas sondas


hibridam com uma zona interna da sequência específica. Só quando hibridam
perto uma da outra é que estas sondas originam FRET entre os dois fluoróforos.
Durante a FRET, a fonte luminosa do LightCycler Instrument, excita o fluoróforo
dador (fluoresceína LightCycler) e parte da energia de excitação é transferida para
o fluoróforo aceitador (fluoróforo vermelho LightCycler).

Passo 4- O LightCycler Instrument mede a fluorescência emitida pelo


fluoróforo vermelho LightCycler. [33],[34]

41
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

3.3.3. Utilização de Organismos Geneticamente Modificados


(OGMs)

Princípio:

O avanço da tecnologia em genética permitiu alterar as características


naturais dos microrganismos, transformando-os em organismos geneticamente
modificados. Estes passaram a ser utilizados para a produção de proteínas com
aplicação na medicina (quer em diagnóstico quer em terapêutica), a agricultura
(plantas modificadas), a obtenção de novos produtos alimentares, a tecnologia
associada ao uso de enzimas, a biorremediação e a detecção de poluentes no
ambiente. [35]

A escolha do microrganismo depende de vários factores, sendo sem


dúvida o seu carácter não patogénico um factor primordial. Os outros factores
incluem as características do gene a clonar (frequência dos codões utilizados) e
da proteína codificada (processamento proteolítico, glicosilação, massa
molecular). São igualmente importantes as características fisiológicas do
microrganismo, nomeadamente a taxa de crescimento, as fontes de carbono e
energia e a capacidade de excretar a proteína heteróloga.[35]

Vantagens e limitações:

− Produção em larga escala, eficiente e de baixo custo;


− Para aplicações directamente relacionadas com os seres humanos só é
permitida a utilização de microrganismos considerados seguros (Generally
Regarded As Safe - GRAS).

Exemplo:

Detecção de arsénio biodisponível em águas para consumo através do


Biological heavy metal kit da Aboatox.

O arsénio encontra-se largamente distribuído em toda a crosta terrestre.


Este metalóide é introduzido na água através da dissolução de minerais e
minérios ou de efluentes industriais. A exposição prolongada ao arsénio, através
da ingestão de água contaminada, resulta num envenenamento crónico e provoca
cancro da pele, dos pulmões, da bexiga e do rim, assim como alterações da
pigmentação e espaçamento da pele (hiperqueratose).

A quantificação precisa de arsénio em águas para consumo e em níveis


relevantes para a saúde pública, requer análises laboratoriais através de
equipamentos e técnicas sofisticadas e caras, assim como mão-de-obra

42
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

qualificada, algo que não está ao alcance dos países subdesenvolvidos. Daí a
importância do desenvolvimento de kits que possam ser facilmente transportados
e que permitam a detecção de baixas concentrações de arsénio.[36],[37]

O kit referido consiste num biosensor, ou seja, numa bactéria


geneticamente modificada capaz de medir o arsénio biodisponível, que é a fracção
de arsénio disponível para a assimilação biológica (factor importante para
determinar a toxicidade do metal). Para a obtenção desta bactéria, um gene
repórter (gene que codifica para a luciferase) é acoplado a genes de resistência
ao arsénio e inserido numa estirpe de uma bactéria hospedeira. Na presença de
arsénio, o biosensor emite uma quantidade de luz que pode ser medida e usada
para determinar a concentração de arsénio biodisponível. [37]

Figura 24 - Mecanismo geral do Biosensor.


in: http://www.clu-in.org/download/char/bacterial_biosensors.pdf

Figura 25 - Teste da presença de arsénio. A- o biosensor é adicionado à amostra; B- na


ausência de metal, a síntese de luciferase é reprimida e a bactéria emite pouca
quantidade de luz; C- na presença de metal, a síntese de luciferase é activada e
a bactéria emite uma elevada quantidade de luz.
in: http://www.aboatox.com/environmental_analysis.html

43
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Este teste permite detectar concentrações subtóxicas e, é muito rápido


quando comparado com os métodos laboratoriais, permitindo testar centenas de
amostras diariamente.[38]

3.3.4. Biochips

Princípio:

Em 1998 alguns investigadores conseguiram fazer um "casamento" entre


ferramentas de investigação biológica e a tecnologia dos microprocessadores,
permitindo o desenvolvimento de um número variado de sensores
(micromáquinas), desde “narizes” e “línguas” electrónicas até sensores para a
identificação de moléculas de DNA. Estas micromáquinas conseguem efectuar o
trabalho de muitos técnicos de laboratório, como por exemplo o processamento do
DNA, análises de sangue, testes de doenças genéticas, etc. Assim, um dos
avanços recentes nas técnicas citogenéticas foi o desenvolvimento dos chips
biológicos, biochips ou microarrays, que permitem a análise de uma grande
quantidade de alterações genéticas ao mesmo tempo.

Os biochips são pequenos rectângulos recobertos de vidro, ou silicone, que


servem como plataforma para fixação de DNA. Estes chips foram projectados para
o estudo de DNA, RNA ou outras substâncias orgânicas.

A hibridação entre a sonda fixada ao chip e qualquer sequência de ácido


nucleico presente numa amostra, ocorre quando existe complementaridade entre
estas. A amostra a ser estudada deverá ser marcada então com um fluorocromo e
adicionado ao biochip, permitindo assim a identificação da ocorrência de
hibridação. Posteriormente, o biochip é lavado para que as sequências não
hibridizadas sejam retiradas. As sequências perfeitamente hibridizadas geram
fluorescência intensa, enquanto outras sequências com discordância de uma
única base geram fluorescência de menor intensidade. Programas electrónicos
sofisticados permitem a análise dos resultados.[39]

44
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Figura 26 - Biochip. Os pontos sem fluorescência representam o caso em que não ocorre
hibridação; os pontos fluorescentes azuis resultam da hibridação entre cDNA de
tecido cancerígeno e cDNA fixo ao biochip; os pontos fluorescentes vermelhos
resultam da hibridação entre cDNA de tecido normal e cDNA fixo ao biochip e,
os pontos fluorescentes amarelos resultam da hibridação entre cDNA de ambos
os tipos de tecidos e cDNA fixo ao biochip.
in: www.thelifewire.com/conindex.htm?17

De um modo geral, os biochips apresentam larga aplicação no campo


farmacêutico (farmacogenómica), no estudo das mutações e variações genéticas
(incluindo o diagnóstico de cancro), no diagnóstico preciso de agentes infecciosos
e na identificação de genes responsáveis pela resistência aos agentes
antimicrobianos.

Os biochips são também utilizados para o estudo da estrutura de genomas


inteiros, no estudo da expressão de genes activos, ordenamento e sequenciação
dos genes, determinação das variantes genéticas e várias outras aplicações estão
a ser desenvolvidas.

Vantagens e limitações:

− Necessita de pouco tempo para a execução da técnica;


− Necessita de uma pequena quantidade de amostra;
− Num único chip podem ser analisados milhares de genes simultaneamente;
− A possibilidade de automatização que permite a realização de exames em
larga escala sem prejuízo da fidelidade, podendo contribuir para a
diminuição do custo;
− À medida que aparelhos portáteis para análise dos dados forem
desenvolvidos, os biochips passarão a ocupar também lugar de destaque
nos consultórios médicos;
− O custo actual do equipamento é elevado;
− Problemas de padronização e consistência (variações entre experiências);

45
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

− É necessário um controlo de qualidade rigoroso, para garantir que as


alterações genéticas que são identificadas não são simplesmente devido a
defeitos e variações entre arrays;
− Os níveis de expressão do mRNA não representam necessariamente os
níveis de proteínas nas células. É sabido que as proteínas também podem
ser alteradas por vários processos que ocorrem a seguir à transcrição do
DNA em mRNA ou, a seguir à tradução do mRNA em proteína. Este facto
significa que, quaisquer mudanças com significado sugeridas por uma
experiência de array, têm de ser subsequentemente verificadas por RT-
PCR ou por Northern blot, e Western blot para determinar alterações nos
níveis de proteína;
− Uma amostragem precisa (hora e mês) e capacidade de analisar amostras
de tecido homogéneo são passos cruciais para obter uma análise
precisa.[40]

Exemplo:

Detecção de variações naturais nos genes CYP2D6 e CYP2C19, através


do biochip AmpliChip CYP450.

A 25 de Junho de 2003, a Roche anunciou o lançamento do microarray


AmpliChip CYP450 nos Estados Unidos, o primeiro microarray da companhia para
aplicações clínicas. Este chip permite identificar determinadas variações naturais
(denominadas polimorfismos) em dois genes: CYP2D6 e CYP2C19, membros da
família do citocromo P450, os quais desempenham o papel principal no
metabolismo de fármacos.[41]

Figura 27 - Microarray AmpliChip CYP450.


in: http://diagnostics.roche.com/products_services/amplichip_cyp450.html#links

O biochip AmpliChipTM, feito a partir da tecnologia da Affymetrix usa a


fotolitografia e uma fase sólida química. Cada microarray contém centenas de
milhares de oligonucleotídeos sonda. O chip tem um tamanho semelhante a uma
unha de um dedo da mão.
O citocromo P450 é constituído por uma família de cerca de 60 genes,
sendo conhecidas as mutações ou polimorfismos que ocorrem nestes genes. No

46
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

entanto, apenas alguns genes são responsáveis pela metabolização de fármacos,


nomeadamente 1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1 e 3A4. Estudos já realizados indicam
que o CYP2D6 é um dos genes mais importantes da família do CYP450, pois é
responsável pela metabolização de dezenas de fármacos, incluindo analgésicos,
antidepressivos, antihistamínicos e medicamentos para o coração e para tensão
arterial.[42]

As variações mencionadas, têm um papel crucial na determinação da forma


como uma pessoa processa ou metaboliza vários fármacos. O conhecimento
destas variações, quando consideradas com outros factores que também
contribuem para a doença, pode ajudar o médico a seleccionar o melhor fármaco
e ajustar a dose para o paciente (podendo também levar à redução de custos
relacionados com a saúde), bem como evitar o uso de fármacos que possam
provocar sérias reacções adversas.

Através do reconhecimento de polimorfismos ou mutações comuns no DNA


nos genes já referidos, os chips de DNA podem determinar se uma pessoa é um
metabolizador fraco (MF) ou um metabolizador ultra-rápido (MU). Os MF
apresentam problemas na inactivação e na eliminação de certos fármacos.
Geralmente os MF apresentam um elevado risco para sofrer reacções adversas a
fármacos e risco de toxicidade.

Por outro lado, os MU apresentam cópias adicionais e funcionais dos genes


e, como tal, têm um elevado risco de não apresentarem resposta na presença de
fármacos, pois os MU podem inactivar ou eliminar um fármaco antes que este
tenha a hipótese de alcançar o seu efeito terapêutico.

O processo de hibridação é simples e tem por base as seguintes etapas:

− extracção do DNA presente na amostra (pequena quantidade de


sangue ou células do interior da bochecha);
− amplificação da zona de interesse usando a técnica de PCR;
− marcação do produto da PCR com um fluorocromo;
− aplicação do mesmo sobre o microarray.

O local no chip onde ocorrer o aparecimento de um ponto fluorescente


corresponde ao local de hibridação e, a fluorescência é visível utilizando para tal
uma tecnologia de laser.

47
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

3. 4. Complementação entre técnicas

As técnicas descritas no capítulo dos Testes Imunológicos (3.2.) podem ser


usadas em conjunto com as técnicas de engenharia genética (3.3.) de forma a
criar outros testes, dos quais iremos dar dois exemplos.

3.4.1. Imunocaptura e transcrição-reversa PCR (RT-PCR)

Princípio:

Os anticorpos contra um determinado vírus (partícula antigénica) são


adsorvidos a material plástico. Sobre estes anticorpos adiciona-se a amostra que
contém, hipoteticamente, os antigénios. A este processo dá-se o nome de
imunocaptura. Depois da formação do complexo anticorpo-vírus são necessárias
várias lavagens do mesmo, de forma a remover os constituintes presentes na
amostra que possam interferir na reacção de PCR. Após estas lavagens, a
temperatura é aumentada para que ocorra a desnaturação da cápsula viral e seja
libertado para o meio o ácido nucleico do vírus.[43]

No caso do ácido nucleico do vírus ser RNA, este tem de ser transcrito em
cDNA pela acção da transcriptase reversa na presença de todos os constituintes
necessários à amplificação por PCR.

Os produtos de PCR são analisados por electroforese em gel de agarose.


O seu peso molecular pode ser determinado por comparação com o padrão de
migração dos marcadores de peso molecular.

A B C D

Figura 28 - Princípio da imunocaptura e transcrição reversa PCR. A- imunocaptura, B-


desnaturação por acção térmica, C- transcrição reversa e D- PCR.
in: KOENIG, R. e LESEMANN, D. Plant Virus Identification Encyclopedia of Life
Sciences 2001

48
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Vantagens e limitações:

− Pode ser usado para viroses e vírus que não produzem proteínas para a
cápsula viral;
− A PCR é muito sensível e, como já foi referido, é preciso ter cuidado com
contaminações, pois estas podem resultar em reacções que levam ao
aparecimento de falsos positivos;
− É mais oneroso e mais demorado do que o ELISA;
− É necessário conhecer o RNA dos vírus para poder desenhar os primers.
Não é possível utilizar para novos vírus, só usando zonas do RNA
altamente conservadas para certas famílias de vírus.[43]

Exemplo:

Detecção do vírus citrus tristeza (CTV) em citrinos.

O vírus citrus tristeza causa uma das mais perigosas doenças em citrinos e
trata-se do vírus patogénico, economicamente mais importante neste tipo de
colheita.

O CTV pertence ao grupo dos Closterovirus. Estes viriões não têm uma
estrutura rígida e o seu genoma consiste em RNA de cadeia simples não-
segmentado. A sequência do genoma de CTV contém doze janelas de leitura
(ORFs), potencialmente codificadores de, pelo menos, dezassete proteínas. As
ORFs 7 e 8 codificam para proteínas que já foram identificadas como sendo
proteínas da cápsula viral. Vários isolados de CTV foram já totalmente
sequenciados.[44]

A primeira etapa da análise deste vírus consiste na adsorção de uma


mistura de dois anticorpos monoclonais (3DF1 e 3CA5), capazes de reconhecer
todos os isolados testados de CTV a partir de diferentes colecções internacionais.
De seguida, submete-se a amostra (extracto de citrino previamente tratado com
tampão fosfato) à imunocaptura. Depois desta, os tubos são lavados e a solução
obtida é submetida a uma RT-PCR, com os respectivos primers para o vírus em
questão. [44]

49
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

3.4.2. Sondas e Imunocaptura


Princípio/Exemplo:

Detecção de vírus papiloma humano (HPV) através da tecnologia de Hybrid


Capture®.

O HPV são vírus causadores de tumores que pertencem à família


Papovaviridae. Estudos efectuados demonstram que as infecções do cervix por
HPV originam cancro passado aproximadamente 12 meses. A detecção deste
vírus na fase de progressão (Figura 29) facilita o tratamento deste tipo de
cancro.[45]

Figura 29 - Desenvolvimento natural do cancro cervical.


in: http://www.mlo-online.com /ce/pdfs/mar03.pdf

50
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

O sistema de Hybrid Capture® (HC) é um teste de amplificação de sinal


que utiliza anticorpos para efectuar a captura. A detecção do sinal é efectuada por
luminiscência química. O processo ocorre em 5 passos:

Figura 30 - Tecnologia de Hybrid Capture®. A- amostra em estudo é colocada numa


solução básica de modo a provocar a quebra da estrutura do vírus, levando à
libertação do DNA; B- o DNA é combinado com sondas de RNA específicas,
dando origem a híbridos RNA-DNA; C- estes híbridos são reconhecidos por
anticorpos específicos; D- o complexo formado é reconhecido por anticorpos
conjugados com fosfatase alcalina, amplificando o sinal; E- o sinal é obtido pela
detecção da ligação da fosfatase alcalina, com luminiscente químico (susbtrato
dioxetano). Através da clivagem por fosfatase alcalina, o substrato é convertido
num produto capaz de emitir luz, que é quantificada.
in: http://www.digene.com/lifesciences_2_1_1.html

Vantagens e limitações:

− Resultados de fácil visualização no mesmo dia;


− Fornece dados relevantes de uma forma barata;
− Sensibilidades equivalentes às das tecnologias existentes para a
amplificação de zonas específicas de DNA, mas sem a complexidade das
mesmas;
− Não é necessário um laboratório sofisticado e pessoal especializado;
− O teste pode ser feito com uma amostra pequena, facilitando o processo;
− Não é susceptível a problemas de contaminação.[46],[47]

51
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

4. Perspectivas Futuras
O futuro do Imunodiagnóstico

O desenvolvimento de anticorpos monoclonais revolucionou o diagnóstico


imunológico, pois trouxe a possibilidade de se obter de modo económico, grandes
quantidades de anticorpos específicos. Isso levou ao desenvolvimento de novos
testes, mais sensíveis, rápidos, específicos e de execução mais fácil. A maioria
dos testes mais recentes exige um menor input humano e menos pessoal com
formação especializada. Determinadas técnicas não imunológicas (os TEGs), tais
como PCR e sondas de DNA, estão a ser cada vez mais utilizadas.

Actualmente, a maioria dos testes imunológicos aplica-se à detecção de


doenças, no entanto, num futuro próximo, é provável que sejam desenvolvidas
ainda mais aplicações direccionadas na previsão do desenvolvimento de doenças.
[4]

O futuro dos testes baseados em técnicas da engenharia genética

É provável que os principais factores genéticos envolvidos na


susceptibilidade de doenças comuns, tais como diabetes, doenças cardíacas,
doença de Alzheimer e alguns tipos de cancros, venham a ser descobertos na
próxima década. Para os indivíduos que estão em risco de desenvolver estas
doenças, em alguns casos, uma alteração do seu estilo de vida, alimentação e
uma maior vigilância médica pode ser benéfico. Isto vai favorecer o aparecimento
de uma grande variedade de TEGs que permitam a identificação de
predisposições individuais para uma futura doença, para virtualmente qualquer
indivíduo.[16]

Exemplo de futuras aplicações dos TEGs

- Análise por PCR do esperma para identificar malformações genéticas

A concepção por fertilização in vitro possibilita que seja efectuado o


screening dos embriões através do diagnóstico de pré-implantação (PGD). No
entanto, através desta técnica podem não ser detectadas todas as malformações
genéticas, pois este procedimento envolve a realização de análises laboratoriais a
apenas uma célula dos embriões fertilizados. Os embriões que possuírem genes
com malformações não são transferidos para o útero da mulher. Este descarte de
embriões levanta questões éticas, que não serão abordadas neste trabalho.

52
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

O screening do esperma por PCR, antes da fertilização in vitro, aparenta


ser uma opção ao PGD, podendo efectuar-se a detecção de anomalias genéticas
no esperma a ser injectado nos óvulos. Deste modo, evitar-se-iam os problemas
éticos referidos anteriormente. Este projecto foi apresentado, em Agosto do
corrente ano, no encontro anual da European Society para a Human Reproduction
and Embryology. Existem algumas dúvidas acerca da manutenção da integridade
do esperma após a reacção de PCR, sendo necessário prosseguir a investigação
neste campo.[48]

53
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

5. Problemas Éticos
Nesta secção são enunciados alguns dos problemas éticos que se
relacionam com o recurso a tecnologias da engenharia genética, para efectuar o
diagnóstico de doenças humanas, tais como: os benefícios e desvantagens dos
TEGs, quem deve efectuá-los, quais as entidades que devem ter acesso aos
resultados, a eugenia e, por fim, a necessidade do aconselhamento genético.

Quando é que devem ser efectuados testes baseados em técnicas da


engenharia genética (TEGs):

Actualmente, já existem TEGs que permitem diagnosticar cerca de duas


dezenas de desordens genéticas.[15] Efectuar TEGs para doenças que podem ser
prevenidas ou tratadas pode ser benéfico, na medida em que permite que um
determinado indivíduo receba um tratamento adequado e altere o seu modo de
vida, por forma a reduzir o risco de desenvolvimento da doença.

Por outro lado, o diagnóstico de doenças incuráveis e para as quais não


existe qualquer tipo de tratamento (como por exemplo a doença de Alzheimer),
parece não trazer qualquer tipo de vantagem.[49]

Benefícios dos TEGs

Quando se efectua um TEG, um resultado negativo pode gerar um


tremendo sentimento de alívio e pode eliminar a necessidade da realização de
check-ups e testes com alguma frequência, algo que é necessário por exemplo
em famílias com um elevado risco de desenvolvimento de cancros. [15]

Desvantagens dos TEGs

É importante referir que os TEGs apenas podem dar a probabilidade e não


a certeza de um determinado indivíduo vir a desenvolver uma certa doença ou
patologia. No entanto, o público em geral não tem os conhecimentos científicos
necessários para compreender esta diferença, pelo que tende a pensar que estes
testes são 100% fiáveis.

Um indivíduo cujo resultado de um TEG seja positivo, pode vir a ser


considerado pelos seus pares, como estando doente ou como sendo um potencial
doente. Esta situação pode trazer problemas sociais e psicológicos, tanto ao
indivíduo em causa como aos seus familiares.

Existem outras situações em que, devido a resultados positivos para


doenças incuráveis e para as quais não existe qualquer tipo de tratamento, o

54
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

indivíduo se sinta impotente, na medida em que não pode controlar o seu estado
de saúde. Nestes casos, os TEGs podem ter um impacto particularmente
negativo. Devido a isto, em 1993, o Instituto de Medicina da Academia Nacional
de Ciências dos EUA, aconselhou contra a realização de testes para as doenças
que não podem ser prevenidas ou que são incuráveis. [49]

É também necessário considerar os casos em que devido ao padrão de


hereditariedade de uma mutação genética, o facto de efectuar testes a um
membro de uma determinada família pode ser equivalente a testar todos os
membros da família. Pode ocorrer que um determinado membro da família não
queira ser testado para essa mutação.

Os TEGs também podem criar conflitos entre casais, na medida em que


indivíduos que são testados positivamente para mutações provocadas por
delecções, poderem decidir acerca de terem ou não filhos (Exemplo: Doença de
Huntigton).[49]

Confidencialidade dos resultados dos TEGs

Actualmente, quando preenchemos formulários para seguros de vida ou


seguros médicos, temos de responder a questões acerca do nosso peso, se
fumamos ou bebemos bebidas alcoólicas e sobre a nossa história familiar de
doenças cardíacas. Estas questões são feitas de modo a efectuar uma estimativa
dos riscos de ocorrência de doença no futuro.

A pergunta que surge é, será que com o avanço da investigação científica


no genoma humano e com a criação de mais TEGs para diagnosticar doenças, as
companhias de seguro vão passar a exigir que os seus clientes lhes forneçam os
resultados dos seus TEGs? Ou talvez exijam a cedência de uma amostra de DNA
para que elas próprias possam efectuar os TEGs e, assim estimar o risco de no
futuro os seus clientes desenvolverem essas doenças. Se tal acontecesse, e se
com base nos resultados determinassem o valor que cada indivíduo deveria
pagar, poderiam poupar dinheiro, pois poderiam cobrar mais aos indivíduos que
tivessem genes que predispõem para uma determinada doença.

Esta não é uma ideia nova. Em 1994, um relatório do Concelho Americano


das Seguradoras apoia o direito das companhias de seguro de recusar a
atribuição de seguros de vida a indivíduos, com base nos resultados de TEGs a
genes que predispõem para o cancro. [49]

Uma vez que, tanto os factores genéticos como o modo de vida de um


indivíduo (fumar, beber bebidas alcoólicas em excesso) podem contribuir para o
risco de esse indivíduo vir a desenvolver uma determinada doença, porque é que
basear o valor do custo de um seguro nos resultados de TEGs em vez de nos

55
Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

hábitos do modo de vida de um indivíduo parece ser um problema ético mais


grave?

Talvez pelo facto de que um indivíduo poder escolher manter hábitos que
aumentam o risco de desenvolvimento de uma doença, mas não poder escolher
os seus genes. Diferenciar o valor do custo de um seguro com base nos
resultados de TEGS seria tão grave quanto fazê-lo com base numa discriminação
racial ou entre géneros.

Todavia, foram já registados casos de indivíduos que não puderam obter


um seguro de saúde, que perderam empregos ou promoções, e até de indivíduos
que foram rejeitados como candidatos em processos de adopção, com base em
resultados de TEGs.[15]

Será que os testes pré-natais vão levar à eugenia?

Antes do nascimento de uma criança, a mulher grávida pode efectuar um


grande número de testes para saber se o feto tem alguma doença de natureza
genética. Em alguns locais, como no estado da Califórnia, as mulheres são de
facto encorajadas a serem testadas para defeitos do tubo neural fetal. No entanto,
as entidades competentes baseiam o sucesso do programa no número de
crianças deficientes que não nasceram e não na divulgação feita junto das
mulheres grávidas. Relacionar a prevenção do nascimento de crianças deficientes
ao sucesso obtido, sugere que a eugenia negativa motiva o programa.[49]

Os TEGs também podem ser utilizados no diagnóstico de


pré-implantação. Em mulheres férteis, que apresentam risco do embrião vir a
desenvolver determinada patologia, podem optar por efectuar a técnica de
fertilização in vitro e assim fazer o screening de embriões e, posteriormente,
implantar apenas aqueles que não possuem desordens genéticas. Este teste pode
ser visto como uma alternativa a exames invasivos, tais como a amniocentese e a
análise das vilosidades coriónicas, que por vezes contribuem para o fim
espontâneo da gravidez.

Os testes pré-natais e de pré-implantação levantam demasiadas questões


ético-religiosas que não serão abordadas neste trabalho. Apenas pretendemos dar
uma percepção de quais as opções que as técnicas de engenharia genética
fornecem aos futuros pais, em termos da “gestão” de uma gravidez.

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Aconselhamento Genético

A decisão de efectuar TEGs é uma decisão pessoal e deve ser


absolutamente independente. Após receber aconselhamento genético de
profissionais devidamente especializados, um indivíduo deve concordar em
efectuar os testes não para satisfazer os familiares ou as companhias de seguro,
mas sim porque de facto pretende tomar um conhecimento mais aprofundado do
seu estado de saúde.[15]

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

6. Problemas Sócio-Económicos
6.1. Legislação dos TEGs

Estados Unidos da América

Em Outubro do corrente ano, o Senado americano aprovou uma lei que


proíbe as companhias de seguro e entidades empregadoras de efectuem
discriminação baseada em informações genéticas de determinados indivíduos.[50]

Esta lei proíbe as companhias de recusarem ou efectuarem qualquer tipo


de discriminação em relação a um pedido de registo de um determinado indivíduo
com base nos resultados de TEGs feitos a esse indivíduo; ou a um membro da
sua família; ou por ele se recusar a efectuar TEGs; ou fornecer os resultados de
TEGs. Também estão proibidas de determinar o valor do custo do seguro com
base nos resultados de TEG, assim como, de exigir a sua realização.[50]

A lei acima referida também proíbe que um empregador, uma organização


ou programa de treino, privem um determinado indivíduo de oportunidades de
emprego, com base em informações genéticas. Também torna ilegítima a recolha
de informações genéticas, excepto quando o empregador: fornece serviços de
saúde ou genéticos; necessita de certas informações para cumprir a lei que rege a
licença médica, compra documentos que estão pública e comercialmente
disponíveis e que incluem a história médica familiar ou, quando é necessário
controlar o efeito de substâncias tóxicas no local de trabalho (quando autorizado
pelo empregado ou quando exigido por lei). [50]

De acordo com a lei referida anteriormente, toda a informação genética


deve ser tratada como parte do ficheiro médico confidencial de um indivíduo,
limitando a sua divulgação a certas entidades, incluindo o indivíduo, a sua família,
investigadores da área da saúde ou determinados oficiais do governo. Permite a
divulgação, quando autorizada por ordem de um tribunal ou quando é necessária
para que um trabalhador aja em conformidade com as leis que regem licença
médica. [50]

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

Europa

Em 1997, na Convenção sobre os Direitos Humanos e a Biomedicina do


Conselho da Europa, foram estabelecidas duas directivas: a proibição de qualquer
tipo de discriminação baseada na herança genética de um indivíduo e a
autorização da realização de testes genéticos apenas como um diagnóstico de
previsão ou para investigação científica ligada à área da saúde e sempre sujeita a
aconselhamento genético. Também ficou previsto que a discriminação genética
possa ser alvo de penas na forma de multas ou sentenças de prisão até um
máximo de 6 meses.[51]

Em alguns países, tais como na Aústria, Bélgica, França, Noruega e


Dinamarca, existe legislação que proíbe o uso de informação genética pelas
companhias de seguro. Noutros países, o acesso às informações genéticas é
permitido em determinadas condições, como nos casos em que o prémio do
seguro exceda um determinado limite. Assume-se que o risco de selecção
adversa só é real quando estão em questão montantes de dinheiro muito
elevados, este é o caso da Holanda, onde as companhias de seguro estão
proibidas pelo Medical Examinations Act de procurar a divulgação dos resultados
de TEGs quando estão em questão montantes inferiores a 300.000,00 guilders.
No Reino Unido, apesar de não existir um carácter legislativo, as companhias de
seguro podem ter em conta TEGs que são validados pelo Genetics and Insurance
Committee. [52]

A adopção de uma moratória acerca do uso de informações genéticas tem


sido uma resposta largamente utilizada pela indústria das seguradoras em toda a
Europa, pois o número de TEGs relevantes e precisos, disponíveis é muito
reduzido. As moratórias são indefinidas (por exemplo na Finlândia e na
Alemanha); por um número limitado de anos (por exemplo na França e na Suíça);
ou limitadas a políticas das seguradoras que não ultrapassem um certo valor. [52]

Em Portugal, não existe nenhuma legislação no que diz respeito aos TEGs.
No entanto, o Ministério da Saúde está a elaborar guias de orientação
relativamente à confidencialidade, privacidade e aconselhamento genético ligados
aos TEGs.[52]

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

6.2. Perspectivas económicas


A indústria Biotecnológica tem registado um grande desenvolvimento nos
últimos anos, atingindo-se em 1997 nos Estados Unidos um volume de vendas de
13 biliões de dollars americanos.[53] Em 2001 este valor subiu para 49,9 biliões de
dollars americanos, sendo que as aplicações terapêuticas e de diagnóstico são as
que geram mais lucros. A tendência é para que o volume de vendas continue a
aumentar nos próximos anos. [54]

$ Biliões
55
50
45 Terapêutica (11%)
40
35 Diagnóstico
30 humano (7%)
25 Agricultura (14%)
20
15 Diagnóstico não
10 humano (10%)
5
Outros (13%)
0
2003 2008 2013

Gráfico 1 - Perspectivas de vendas da indústria Biotecnológica Norte-Americana.


Fonte: http://www.consultingresources.net/biotechnology.html

Na Europa, a indústria Biotecnológica tem tido um desenvolvimento mais


lento devido à falta de investimento. No entanto, pensa-se que no futuro esta
situação irá se alterar.[55] A Roche, uma das maiores empresas europeias, estima
que o biochip AmpliChip CYP450 gere receitas superiores a 100 milhões de
dollars americanos anuais, até 2004.[41]

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

7. Bibliografia
[1] PORTO, J. 1967 Enciclopédia Luso-Brasileira de Cultura Volume 6 Lisboa

[2] SANTOS, M. 1964 Enciclopédia Luso-Brasileira de Cultura Volume 2


Lisboa

[3] Protocolos práticos de Microbiologia Alimentar da FCT/UNL, 2003/2004

[4] TORTORA, L., FUNKE B. e CASE C. 2003 Microbiologia Editora Artmed 6ª


edição Brasil

[5] http://www.kit.nl/biomedical_research/html/leishmaniasis_diagnostics.asp (em


15 de Novembro de 2003)

[6] http://npt.mah.roche.com/images/products/ testcard_9


(em 15 de Novembro de 2003)

[7] http://www.fao.org/docrep/w0049e/w0049e06.htm
(em 22 de Outubro de 2003)

[8] http://www.gen-probe.com/PI/coccipi.pdf (em 22 de Novembro de 2003)

[9] http://www.geocities.com/fungopat/Micoses (em 22 de Novembro de 2003)

[10] http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-736X199700
0300005&lng=en&nrm=iso&tlng=pt (em 21 de Novembro de 2003)

[11] http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/sn/fig2.html
(em 21 de Novembro de 2003)

[12] http://www.chemicon.com/webfiles/PDF/3125.pdf
(em 21 de Novembro de 2003)

[13] http://www.mds.qmw.ac.uk/biomed/kb/resources/immunology/tests/anf/anf.htm
(em 21 de Novembro de 2003)

[14] GOLDSBY R., KINDT T. e OSBORNE B, Kuby Immunology 4th Ed W. H.


Freeman New York

[15] http://press2.nci.nih.gov/sciencebehind/genetesting/genetesting26.htm
(em 31 de Outubro de 2003)

[16] http://www.genome.gov/page.cfm?pageID=10506784
(em 31 de Outubro de 2003)

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

[17] http://www.lbl.gov/Education/ELSI/genetic-testing.html
(em 31 de Outubro de 2003)

[18] http://iai.asm.org/cgi/content/full/68/10/5480 (em 29 de Novembro de 2003)

[19] http://140.129.65.94/credit/a1.pdf (em 23 de Novembro de 2003)

[20] http://www1.qiagen.com/Products/Pcr/MultiplexPcrSystem/MultiplexPcr.aspx?
ShowInfo=1 (em 14 de Novembro de 2003)

[21] http://www.biocompare.com/techart.asp?id=679#Kit
(em 14 de Novembro de 2003)

[22] http://reference.allrefer.com/encyclopedia/S/septicem.html
(em 22 de Novembro de 2003)

[23] http://jcm.asm.org/cgi/content/full/36/10/2887(em 22 de Novembro de 2003)

[24] http://www3.mdanderson.org/leukemia/methylation/msp.html
(em 20 de Novembro de 2003)

[25] http://cancerres.aacrjournals.org/cgi/content/full/61/3/939
(em 20 de Novembro de 2003)

[26] http://www.oncomethylome.com/science.htm
(em 20 de Novembro de 2003)

[27] http://www.wjgnet.com/1007-9327/9/2202.asp
(em 20 de Novembro de 2003)

[28] http://www.qiagen.com/clinical/applications/oncology/prostate_cancer_i.asp
(em 20 de Novembro de 2003)

[29] http://cebp.aacrjournals.org/cgi/content/full/11/5/445 (em 20 de Novembro de


2003)

[30] http://www.medmicro.wisc.edu/Employees/Equipment/ABI7700/EssentialsOf
RealTimePCR.pdf (em 21 de Novembro de 2003)

[31] http://dorakmt.tripod.com/genetics/realtime.html
(em 21 de Novembro de 2003)

[32] http://www.roche-applied-science.com/indbio/pdf/salmonella_detection_kit.pdf
(em 21 de Novembro de 2003)

[33] http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/3357449a.pdf
(em 21 de Novembro de 2003)

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

[34] http://www.roche-applied-science.com/biochemica/No.4_02/PDF/p19.pdf
(em 21 de Novembro de 2003)

[35] VIDEIRA, A. 2001 Engenharia Genética, Princípios e Aplicações Editora Lidel


Lisboa

[36] http://www.who.int/inf-fs/en/fact210.html (em 22 de Novembro de 2003)

[37] http://www.clu-in.org/download/char/bacterial_biosensors.pdf
(em 22 de Novembro de 2003)

[38] http://www.aboatox.com/environmental_analysis.html
(em 22 de Novembro de 2003)

[39] http://www.rsbcancer.com.br/rsbc/7mperspectiva.asp?nrev=N%C2%BA%C2
%A07 (em 22 de Novembro de 2003)

[40] BROWN, I., HEYS, S. e SCHOFIELD, A. From peas to “chips” – the new
millennium of molecular biology: a primer for the surgeon World Journal of
Surgical Oncology 2003, 1:21

[41] http://www.roche-diagnostics.com/media/pdf/press_release/2003/press-
release_25062003.pdf (em 22 de Novembro de 2003)

[42] http://www.roche-diagnostics.com/media/pdf/press_release/2003/
background_cyp450.pdf (em 22 de Novembro de 2003)

[43] KOENIG, R. e LESEMANN, D. Plant Virus Identification Encyclopedia of Life


Sciences 2001

[44] http://www.csl.gov.uk/science/organ/ph/diagpro/ctv.pdf
(em 22 de Novembro de 2003)

[45] http://www.mlo-online.com/ce/pdfs/mar03.pdf
(em 22 de Novembro de 2003)

[46] http://www.digene.com/lifesciences_2_1.html
(em 22 de Novembro de 2003)

[47] http://pubs.acs.org/hotartcl/mdd/00/jul/thomas.html#figure%201
(em 22 de Novembro de 2003)

[48] http://www.nature.com/nsu/030804/030804-14.html
(em 25 de Novembro de 2003)

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Novas Tecnologias de Diagnóstico/Análise AEG

[49] http://huntingtondisease.tripod.com/genetictesting/id38.html
(em 31 de Outubro de 2003)

[50] http://thomas.loc.gov/cgi-bin/bdquery/z?d108:SN01053:@@@L&summ2=m&
(em 25 de Novembro de 2003)

[51] http://conventions.coe.int/treaty/en/treaties/html/164.htm
(em 25 de Novembro de 2003)

[52] http://europa.eu.int/comm/research/biosociety/pdf/bmh4_ct98_0550_partb.pdf
(em 25 de Novembro de 2003)

[53] http://www.bio.org/aboutbio/guide1.html (em 27 de Novembro de 2003)

[54] http://www.mindbranch.com/catalog/print_product_page.jsp?code=R1-2251
(em 27 de Novembro de 2003)

[55] http://www.biojapan.de/features/globalbt2003.htm
(em 27 de Novembro de 2003)

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