Aula 4-Microbiologia e Parasitologia (Enfermagem)

Microbiologia e Parasitologia
2022 - 2023
1
Microbiologia e Parasitologia | 1ºAno | 1ºSemestre| 2022-2023
IMUNODIAGNÓSTICO
Diagnóstico laboratorial por meio de técnicas imunológicas
Aglutinação Rápida
Imunofluorescência
ELISA - (Enzyme Linked Imunosorbent Assay)
2
Imunodiagnóstico
3
Reações com anticorpos
Aglutinação A ligação de anticorpos aos microrganismos, ou células infetadas, promove

a sua agregação, formando precipitados visíveis a olho nu
https://www.youtube.com/watch?v=Zsdhe0xFBf4
3 min
4
Imunodiagnóstico
O microscópio utiliza luz UV para a leitura.

Duas formas de imunofluorescência: Direta e Indireta 5
Imunodiagnóstico
Deteção de antigénio
Diagnóstico de enfermidades por Imunofluorescência Direta
❖ Doenças de pele autoimunes (Lúpus eritematoso)
❖ Doenças bolhosas (vasculites)
❖ Doenças sexualmente transmitidas (Chlamydia trachomatis)
❖ Legionella pneumophila
6
Imunodiagnóstico
Deteção de anticorpo
Diagnóstico de enfermidades por Imunofluorescência Indireta
❖ Doenças reumáticas autoimunes (Artrite reumatoide, Artrite psoriática)
❖ Imunodeficiência humana
❖ Hepatites
❖ Esclerose múltipla
❖ Doença celíaca
❖ Doença de Crohn
❖ Raiva
7
Imunodiagnóstico
Espetofotómetro para
leitura dos resultados
(densidade ótica-DO)
8
Imunodiagnóstico
Microplacas após reação para leitura Deteção de Anticorpos
Espetofotómetro para
leitura dos resultados
(densidade ótica-DO)
9
Deteção de Anticorpos
Immunoblotting é uma técnica muito utilizada em biologia molecular para análise de proteínas,
sendo possível obter informações sobre o peso molecular e a quantidade relativa existente
dessa proteína específica numa determinada amostra. Técnica muito sensível e específica.
Diagnóstico confirmativo da infeção por HIV; doença de Creutzfeldt-Jacob, doença de Lyme,
hepatite B e herpes
10
Deteção de Antigénio
11
Métodos moleculares
❖ Os métodos moleculares representam um conjunto de métodos analíticos de diagnóstico,

utilizados em laboratório para analisar amostras obtidas de doentes, permitindo a deteção
e identificação de ácidos nucleicos de agentes microbianos causadores de doença, para
além de outras moléculas nomeadamente, lípidos e proteínas.
❖ As técnicas de PCR (Polymerase Chain Reaction - Reação de Polimerase em Cadeia)

Convencional e Tempo Real, nas suas variedades Simplex e Multiplex, são as ferramentas
básicas mais comuns da biologia molecular, geralmente aplicadas em rotinas de
diagnóstico de doenças infeciosas.
❖ Os métodos moleculares constituem uma alternativa aos métodos convencionais de

diagnóstico, pois são de resposta mais rápida e precisa, abreviando o tempo de resposta.
❖ Podem ser utilizados em microrganismos cultiváveis e não cultiváveis, podendo ser

utilizados diretamente em amostras biológicas ou em culturas puras de microrganismos.
12
Reação em Cadeia da Polimerase

1. Desnaturação (94º - 98ºC durante 20 a 30s)
2. Annealin (50º - 65ºC durante 20 a 40s)
3. Extensão (72ºC)
Eletroforese em gel de agarose

Técnica de separação de moléculas que envolve a Equipamento
Transiluminador
migração de partículas num gel durante a aplicação de
Luz UV
corrente elétrica.
As moléculas são separadas de acordo com o seu
tamanho e as de menor peso molecular migram mais
rapidamente que as de maior peso molecular.
A eletroforese normalmente é utilizada para separar
proteínas e moléculas de DNA e RNA.
13
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real

A reação de polimerização em cadeia em tempo
real combina a metodologia de PCR
convencional com um mecanismo de deteção
baseado no uso de sondas marcadas com
corantes fluorescentes.
A metodologia permite que os processos de
amplificação, deteção e quantificação de DNA
sejam realizadas numa única etapa, agilizando
a obtenção de resultados e diminuindo o risco
de contaminação da amostra e dando maior
precisão.
Comparado com o sistema de PCR
convencional, o PCR em tempo real é
monitorizado dentro do tubo de reação, não
sendo necessário a separação em gel de
eletroforese. 14
15
VÍDEOS - PCR
https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo&list=RDiQsu3Kz9NYo&start_radio=1
VÍDEOS - ELETROFORESE
https://www.youtube.com/watch?v=kjJ56z1HeAc
https://www.youtube.com/watch?v=ZDZUAleWX78
16
CONTROLO DAS INFEÇÕES BACTERIANAS
❖ Compostos Antimicrobianos
❖ Vacinação
ANTIMICROBIANOS
❖ Características gerais
❖ Classificação
❖ Mecanismos de ação
❖ Mecanismos de resistência
17
Controlo das Infeções Bacterianas
Compostos antimicrobianos
A medicina moderna depende de agentes quimioterapêuticos
Destroem os microrganismos patogénicos

Microbicida
(p.e. bactericida, virucida, fungicida)
ou
Inibem o seu crescimento
Microbiostático
(p.e. bacteriostático, virustático, fungistático)
18
Agente antimicrobiano
composto químico que inibe o crescimento de microorganismos
✓ O cloreto de sódio (sal de cozinha) é o mais antigo agente antimicrobiano.

✓ Ácidos orgânicos (acético, benzóico, propanóico e sórbico) são usados como agentes antimicrobianos
em alimentos com baixo valor de pH.
✓ Nitratos e nitritos são utilizados para inibir o crescimento da bactéria Clostridium botulinum em alimentos
que contenham carne crua (linguiça, presunto, bacon e salame).
✓ Dióxido de enxofre e sulfitos são usados para controlar o crescimento de microorganismos em frutas
secas, sucos e vinhos.
✓ Várias plantas aromáticas e especiarias: coentros, manjericão, pimenta, tomilho, etc, são utilizadas
como substâncias antimicrobianas na confeção e conservação de vários tipos de alimentos
19
Antibiótico
qualquer medicamento capaz de combater uma infeção causada por microrganismos que
causam infeções a outro organismo.
✓ Não destroem vírus
✓ O termo antibiótico tem sido utilizado de modo mais restrito para indicar substâncias que
atingem bactérias, embora possa ser utilizado em sentido mais amplo contra outros
parasitas (protozoários, fungos ou helmintos).
As primeiras substâncias descobertas eram produzidas por fungos, como a penicilina.
Atualmente, existem também antibióticos sintetizados ou alterados em laboratórios
farmacêuticos para evitar resistências e diminuir efeitos colaterais.
Colónia de Cultura de Staphylococcus

Penicillium (inibição do crescimento por Penicillium)
20
...
21
Fontes microbianas de alguns antibióticos
Bactérias
Streptomyces spp. Rifampicina
Tetraciclinas
Nistatina
Anfotericina B
Eritromicina
Canamicina
Neomicina
Estreptomicina
Micromonospora spp. Gentamicina

Bacillus spp. Bacitracina
Polimixina
Fungos
Penicillium spp. Penicilina
Cephalosporium spp. Cefalosporinas
22
Antibiótico
❖ Bactericida, quando mata o microrganismo
❖ Bacteriostático, se interrompe a sua multiplicação ou inibe o seu metabolismo
Em Portugal, os antibióticos são classificados como medicamentos sujeitos a

receita médica (MSRM), sendo o Infarmed o instituto público que regulamenta e
fiscaliza a produção, distribuição, comercialização e utilização dos medicamentos
de uso humano e dos produtos de saúde, garantindo a sua qualidade, segurança e
eficácia
23
Antibióticos: Descoberta e Resistência
242022-2023
Microbiologia e Parasitologia | 1ºAno | 1ºSemestre|
Adaptado Harbarth et al, (2015)
Compostos antimicrobianos – Mecanismos de Ação
Inibidores da síntese da parede celular

Penicilina, Ampicilina, Interferência com a síntese do peptidoglicano
Meticilina, Vancomicina ...
Bacitracina Interferência com o transporte transmembranar de

precursores da parede celular
Inibidores da síntese proteíca

Estreptomicina, gentamicina Liga-se à subunidade 30S do ribossoma, inibindo a
síntese proteica e a leitura do mRNA
Cloranfenicol Liga-se à subunidade 50S, bloqueando a formação
de ligações peptídicas
Eritromicina Liga-se à subunidade 50S, bloqueando o
enlongamento das cadeias peptídicas
25
Compostos antimicrobianos – Mecanismos de Ação
Inibidores da síntese de ácidos nucleicos

Quinolonas Inibem a DNA girase bacteriana, interferindo com a
replicação e transcrição do DNA
Rifampicina Bloqueia a síntese de RNA
Provocam a disrupção da membrana celular

Polimixina B Liga-se à membrana plasmática, alterando a sua
estrutura e permeabilidade
Antagonismos metabólicos
Sulfonamidas Inibem a síntese do ácido fólico (elevado índice
terapêutico: os humanos adquirem o ácido fólico a
Trimetoprim partir da dieta, enquando as bactérias têm de
sintetizar este composto)
26
Antibióticos – Mecanismos de Ação
27
Têm de ter uma toxicidade selectiva, ou seja, inibir o crescimento ou eliminar o

microrganismo patogénico, causando o menor dano possível no hospedeiro
Dose terapêutica
Quantidade necessária de fármaco para tratar uma determinada infeção
Dose tóxica
Quantidade em que a fármaco começa a ter efeitos tóxicos no hospedeiro
Índice terapêutico
Razão entre a a dose terapêutica e a dose tóxica e (quando maior melhor!)
Ex: a penicilina apresenta um índice terapêutico elevado porque o seu alvo é uma função
microbiana que não se encontra nos eucariontes (síntese do peptidoglicano/parede celular)
28
Estes compostos podem ainda ser classificados de acordo com os grupos de organismos
contra os quais são activos: antibacterianos, antifúngicos, antiprotozoários e antivirais
Alguns agentes são activos contra mais do que um grupo de organismos (p.e. sulfonamidas
– bactérias e alguns protozoários)
Os compostos antimicrobianos podem ser sintetizados “biologicamente - antibióticos” ou
“sinteticamente” (independente de actividade microbiana)
Exemplos de antibacterianos sintéticos: sulfonamidas e cloranfenicol (este também de origem
biológica)
Um número crescente de antibióticos são semi-sintéticos (antibióticos “naturais” que
sofrem uma modificação química, tornando-os menos susceptíveis à degradação pelos
microrganismos)
Exemplos são a ampicilina e a meticilina
Um composto antimicrobiano pode ter um espectro de ação:

- Largo - atingem grande número de microrganismos nas doses terapêuticas. Ex:
ciprofloxacina
-Estreito - ativos contra um pequeno grupo de microrganismos em doses terapêuticas. Ex:

29
polimixina Microbiologia e Parasitologia | 1ºAno | 1ºSemestre| 2022-2023
Efeitos da antibioterapia na flora comensal
O tratamento com antibióticos pode perturbar a microbiota normal
❖ São prescritos antibióticos de largo espetro quando o agente etiológico

não foi identificado
❖ Uma desvantagem é que um grande número de espécies da microbiota

normal também são mortas
❖ Isto permitirá que outros organismos resistentes e eventualmente

patogénicos se desenvolvam e colonizem o organismo
❖ Os antibióticos de espectro estreito causam menos interferência com a

microbiota comensal e minimizam a probabilidade de resistência a
antibióticos)
30
❖ Alguns pacientes que recebem tratamentos com antibióticos podem
desenvolver infeções secundárias (por exemplo, fungos, tal como
candidíase, uma infeção causada por Candida albicans)
• A Candidiase é uma infeção dolorosa causada por leveduras, permitindo

que espécies como Candida albicans superem a flora normal
• A candidíase vaginal também pode desenvolver-se após perturbação da

microbiota vaginal
• A causa mais comum de candidíase vaginal é o uso de antibióticos
31
• Os antibióticos podem causar desequilíbrio da microbiota intestinal
• Disbiose: desiquilibrio da flora intestinal
• Entre os fármacos mais problemáticas estão a ampicilina, clindamicina,

fluoroquinolonas e cefalosporinas
• Clostridium difficile pode crescer desmesuradamente e causar colite

pseudomembranosa
• Os sintomas podem incluir cólicas abdominais, inchaço, fezes

sanguinolentas, febre e diarréia excessiva
Clostridium difficile
Colite
pseudomembranosa
32
Resistência a fármacos antimicrobianos

Capacidade intrínseca ou adquirida que um microrganismo possui que
lhe permite crescer na presença de um fármaco antimicrobiano. O uso
inadequado de antibióticos conduz ao aparecimento de resistências,
tornando os agentes antimicrobianos menos eficazes.
33
Principais Mecanismos de Resistência aos Antibióticos
342022-2023
Microbiologia e Parasitologia | 1ºAno | 1ºSemestre|
Adaptada Levy & Marshall, 2004
Mecanismos de Resistência aos Antibióticos
Figura 1. Os mecanismos de resistência nas bactérias surgem por mutações espontâneas no seu ADN, que são selecionadas na presença
do antibiótico (A), ou pela aquisição de genes de resistência que provêm de outras bactérias (transferência horizontal de genes) (B).
As bactérias transmitem os seus genes de resistência às células filhas, perpetuando a resistência (disseminação clonal)
35
Amaro et al., Vida Rural, 2019
Antibioterapia das Infeções Bacterianas
36
37
Lista de agentes patogénicos prioritários da OMS para a Pesquisa e desenvolvimento de

novos antibióticos
Prioridade 1: CRÍTICA
• Acinetobacter baumannii, resistente a carbapenemes
• Pseudomonas aeruginosa, resistente a carbapenemes
• Enterobacteriaceae, resistente a carbapenemes, produtoras de ESBL
Prioridade 2: ALTA
• Enterococcus faecium, resistente à vancomicina
• Staphylococcus aureus, resistente à meticilina, com sensibilidade intermediária e resistência à vancomicina
• Helicobacter pylori, resistente à claritromicina
• Campylobacter spp., resistente às fluoroquinolonas
• Salmonellae, resistentes às fluoroquinolonas
• Neisseria gonorrhoeae, resistente a cefalosporina, resistente às fluoroquinolonas
Prioridade 3: MÉDIA
• Streptococcus pneumoniae, sem sensibilidade à penicilina
• Haemophilus influenzae, resistente à ampicilina
• Shigella spp., resistente às fluoroquinolonas 38
39
40
41
42
https://apps.who.int/iris/handle/10665/325036
43
44
Infeções causadas por bactérias resistentes
Este estudo abrangeu 204 países
45
The Lancet, Volume 399, ISSUE 10325, P629-655, February 12, 2022 Microbiologia e Parasitologia | 1ºAno | 1ºSemestre| 2022-2023
46
47
% de isolados/paciente: sexo e grupo etário, por espécie bacteriana
Portugal 2020
WHO/ECDC- Antimicrobial resistance surveillance in Europe 2022 – 2020 data SURVEILLANCE REPORT
48
Consumo de antimicrobianos na comunidade e em ambiente hospitalar na UE em 2020
(expresso em DDD/1000 habitantes por dia)
https://www.ecdc.europa.eu/sites/default/files/documents/ESAC-Net%20AER-2020-Antimicrobial-consumption-in-the-EU-EEA.pdf
49
CAUSAS DA RESISTÊNCIA AOS ANTIBIÓTICOS
50
1. Superlotação e más condições de higiene e sanitárias
51
2. Poluição e alterações climáticas
52
2. Poluição e alterações climáticas
53
3. Alterações demográficas
54
4. O aumento de doentes imunocomprometidos
5. Emergência de infeções que se pensava terem sido combatidas
55
6. Aumento do comércio global de mercadorias e viagens das pessoas
56
7. Excesso de consumo e uso inadequado de antibióticos
57
Utilização por vezes inadequada de antibióticos na produção
animal e nas espécies de companhia
❖ No tratamento metafilático, a administração de antibióticos é feita por um curto

período de tempo, através da alimentação ou água de bebida a animais
saudáveis pertencentes a um bando/rebanho ou manada, onde sejam detetados
animais com sinais clínicos de doença.
❖ No tratamento profilático, a administração de antibióticos é igualmente feita
através da alimentação ou água de bebida a animais saudáveis, quando existe o
risco de infeção.
58
Disseminação da Resistência entre os vários reservatórios
Adaptada, Woolhouse et al, (2015)
https://projects.iniav.pt/ciainvet/
Ilustração de Tânia Salgueiro
2.23 min
59
60
61
62
28 fev 2022
63
Qual o antibiótico adequado?
❖ Identificação do agente patogénico: cultura microbiológica
❖ Avaliação da suscetibilidade aos vários antibióticos: métodos qualitativos e quantitativos
Método quantitativo – Determinação da Concentração Inibitória Mínima
Método qualitativo – Difusão de disco
64
Método de difusão de disco
Agar Mueller-Hinton c/ sangue
Agar Mueller-Hinton Estirpe resistente

colónias crescem no halo de inibição
65
Método de difusão de disco
Leitura dos halos de inibição 66

Método quantitativo – Determinação da Concentração Inibitória Mínima
É a concentração mínima de um antibiótico que inibe o crescimento bacteriano
Unidades = mg/L ou µg/mL
❖ E-teste
❖ Diluição em agar
❖ Microdiluição em caldo
67
https://www.youtube.com/watch?v=Y9WEERSh5G0
1.30 min
PPCIRA
68
Programa de prevenção e controlo de Infeções e de Resistência aos Antimicrobianos
69
Objetivos do PPCIRA
70
71
Vídeos – Resistência aos Antibióticos
https://www.youtube.com/watch?v=mngVeKX8plk
https://www.youtube.com/watch?v=DqfAqIlZDQE
72
ANTIMICROBIANOS - ANTIFÚNGICOS
Compostos Antifúngicos
Arsenal terapêutico antifúngico reduzido, em comparação com os compostos

antibacterianos
Várias substâncias antissépticas têm sido aplicadas topicamente há vários anos,

com uma ação limitada sobre diferentes espécies de fungos (p.e. tintura de
iodo, solução de azul de metileno, solução de permanganato de potássio,
solução de sulfato de cobre, nitrato de prata)
73
Os derivados azólicos são derivados do núcleo do imidazol ou do triazol,

apresentando um espectro de ação largo (fungos filamentosos e leveduras)
Mecanismo de ação: Alteração da permeabilidade da membrana

citoplasmática, por inibição da síntese do ergosterol
Exemplos de derivados azólicos: Itraconazol e fluconazol
74
A griseofulvina, extraída de Penicillium griseofulvum, é considerada o mais antigo

antifúngico ativo por via oral. Espectro de atividade limitado aos fungos dermatófitos, cuja
ação micostático parece dever-se à inibição da mitose
Os antifúngicos poliénicos são extraídos de actinomicetas do género Streptomyces. A

principal ação resulta da ligação das suas moléculas aos esteróis da membrana
citoplasmática, alterando a permeabilidade e causando a saída de sais e outras
moléculas de baixo peso molecular
Exemplos de antifúngicos poliénicos:
Nistatina, produzida por Streptomyces noursei e S. albidus, é ativa contra leveduras
Natamicina, produzida por Streptomyces natalensis, é ativo contra Candida e Aspergillus
Anfotericina B, produzida por Streptomyces nodosus, ativo contra um largo espectro de

fungos (leveduras e filamentosos)
75

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Microbiologia e Parasitologia

Diagnóstico laboratorial por meio de técnicas imunológicas

ELISA - (Enzyme Linked Imunosorbent Assay)

Aglutinação A ligação de anticorpos aos microrganismos, ou células infetadas, promove

O microscópio utiliza luz UV para a leitura.

Diagnóstico de enfermidades por Imunofluorescência Direta

❖ Doenças de pele autoimunes (Lúpus eritematoso)

❖ Doenças bolhosas (vasculites)

❖ Doenças sexualmente transmitidas (Chlamydia trachomatis)

Diagnóstico de enfermidades por Imunofluorescência Indireta

❖ Doenças reumáticas autoimunes (Artrite reumatoide, Artrite psoriática)

Microplacas após reação para leitura Deteção de Anticorpos

❖ Os métodos moleculares representam um conjunto de métodos analíticos de diagnóstico,

❖ As técnicas de PCR (Polymerase Chain Reaction - Reação de Polimerase em Cadeia)

❖ Os métodos moleculares constituem uma alternativa aos métodos convencionais de

❖ Podem ser utilizados em microrganismos cultiváveis e não cultiváveis, podendo ser

Reação em Cadeia da Polimerase

Eletroforese em gel de agarose

Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real

A medicina moderna depende de agentes quimioterapêuticos

Destroem os microrganismos patogénicos

Inibem o seu crescimento

✓ O cloreto de sódio (sal de cozinha) é o mais antigo agente antimicrobiano.

Colónia de Cultura de Staphylococcus

Fontes microbianas de alguns antibióticos

Micromonospora spp. Gentamicina

❖ Bactericida, quando mata o microrganismo

❖ Bacteriostático, se interrompe a sua multiplicação ou inibe o seu metabolismo

Em Portugal, os antibióticos são classificados como medicamentos sujeitos a

Compostos antimicrobianos – Mecanismos de Ação

Inibidores da síntese da parede celular

Bacitracina Interferência com o transporte transmembranar de

Inibidores da síntese proteíca

Compostos antimicrobianos – Mecanismos de Ação

Inibidores da síntese de ácidos nucleicos

Provocam a disrupção da membrana celular

Têm de ter uma toxicidade selectiva, ou seja, inibir o crescimento ou eliminar o

Um composto antimicrobiano pode ter um espectro de ação:

-Estreito - ativos contra um pequeno grupo de microrganismos em doses terapêuticas. Ex:

O tratamento com antibióticos pode perturbar a microbiota normal

❖ São prescritos antibióticos de largo espetro quando o agente etiológico

❖ Uma desvantagem é que um grande número de espécies da microbiota

❖ Isto permitirá que outros organismos resistentes e eventualmente

❖ Os antibióticos de espectro estreito causam menos interferência com a

• A Candidiase é uma infeção dolorosa causada por leveduras, permitindo

• A candidíase vaginal também pode desenvolver-se após perturbação da

• A causa mais comum de candidíase vaginal é o uso de antibióticos

• Disbiose: desiquilibrio da flora intestinal

• Entre os fármacos mais problemáticas estão a ampicilina, clindamicina,

• Clostridium difficile pode crescer desmesuradamente e causar colite

• Os sintomas podem incluir cólicas abdominais, inchaço, fezes

Resistência a fármacos antimicrobianos

Antibioterapia das Infeções Bacterianas

Antibioterapia das Infeções Bacterianas

Lista de agentes patogénicos prioritários da OMS para a Pesquisa e desenvolvimento de

❖ No tratamento metafilático, a administração de antibióticos é feita por um curto

❖ Identificação do agente patogénico: cultura microbiológica

❖ Avaliação da suscetibilidade aos vários antibióticos: métodos qualitativos e quantitativos

Método quantitativo – Determinação da Concentração Inibitória Mínima

Método qualitativo – Difusão de disco

Agar Mueller-Hinton c/ sangue

Agar Mueller-Hinton Estirpe resistente