Processos Biólogicos Avançados - Dezotti Et Al

PROCESSOS BIOLÓGICOS AVANÇADOS
Para tratamento de efluentes

e técnicas de biologia molecular
para o estudo da diversidade microbiana
Copyright© 2011, by MárciaDezotti, Geraldo Lippel Sant'AnnaJr.,
João Paulo Bassin
Direitos Reservados em 201 1 por Editora Int.erclência Lt<ia.
Diagramação: Maria de Lourdes de Oliveira
Revisão Ortográfica: Carlos Alexandre Fernandez
Maria Angélica V. de Melo
Capa: Paula Almeida
CIP-Brasil. Catalogação-na-Font.e
Sindicato Nacional dos Editores de Livros, RJ
P956
Processos biológicos avançados para tratamentos de efluentes e técnicas
de biologia molecular para o estudo da diversidade microbiana / Márcia
Dezotti, Geraldo Lippel Sant'Anna Jr., João Paulo Bassin (orgs.). - Rio de
Janeiro: Interciência, 201 1.
368p.: il.; 25 cm
Inclui bibliografia
ISBN 978-85-7193-276-0
1. Águas residuais - Purificação. 2 . Esgoto. I. Dezotti, Márcia. II.
Sant'AnnaJunior, Geraldo Lippel. III . Bassin, João Paulo.
11-6411. CDD: 628 .3
CDU: 628.2
,
E proibida a reprodução total ou parcial, por quaisquer meios,
sem autorização por escrito da editora.
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Impresso no Brasil - Printed in Brazil

Apresentação
ste livro é fruto das inúmeras discussões no nosso grupo de pesquisa
acerca dos processos biológicos de tratamento de águas residuárias. As
discussões versava1n sobre diversos aspectos, como o volume de lodo ge-
rado, a eficiência do processo, os aglomerados microbianos, a formação
e a eficiência dos biofilmes, como utilizar as informações obtidas pelas técnicas
moleculares, entre muitos outros, mas especialmente focados nos fundamentos
dos processos. ,
O nosso laboratório, Laboratório de Controle de Poluição das Aguas, foi fun-
dado em 197 4, de forma que são mais de três décadas estudando os processos que
empregam micro-organismos para a depuração de poluentes diversos. Mais de 40
dissertações de Mestrado e mais de 30 teses de Doutorado foram orientadas na
temática dos processos biológicos. Os temas das teses e dissertações envolveram os
mais variados processos como o de lodos ativados e de suas variantes (reatores em
batelada sequencial), leito fluidizado, reatores anaeróbios, reatores com membra-
nas (MBR), reatores de leito móvel com biofilme (MBBR) e carvão ativado granu-
lado com biofilme (CAB). Os trabalhos sempre estiveram associados a problemas
desafiadores, efluentes recalcitrantes e à investigação profunda dos fundamentos
envolvidos.
A busca por unidades mais con1pactas e mais eficientes para tratan1ento dos
mais diversos tipos de efluentes tem levado ao desenvolvimento dos processos
biológicos.
No caso do MBR tem-se o acoplamento de dois processos, sendo un1 biológi-
co, que é o de lodos ativados com alta concentração de sólidos com o processo de
separação por membranas. No entanto, o coração do processo é o processo biológi-
co e o seu desen1penho é determinante no sucesso do processo MBR.
Os processos com biofilme, exen1plo de sisten1as compactos, são bastante
eficientes e permitem o desenvolvimento de diversos micronichos, nos quais es-
tão presentes micro-organismos responsáveis por diferentes processos biológicos.
A robustez desses processos é também outro fator de atratividade dos mesmos,
sendo por vezes n1enos suscetíveis à inibição por con1postos diversos quando com-
parados com o tradicional processo de lodos ativados. Nesse último, aglomerados
VI PROCESSOS BIOLÓGICOS AVANÇADOS
microbianos se desintegram mais facilmente, além de estarem mais expostos aos

eventuais compostos inibitórios presentes nos efl uentes.
Há uma imensa gama de tipos de material suporte utilizados para a imobiliza-
ção de micro-organismos. A forma como o material suporte é disposto no interior
do biorreator evidencia o tipo de sistema com biofilme empregado . Recentemente
desenvolvida, a tecnologia de granulação aeróbia apresenta-se como u111 sistema
com biofiln1e que não requer material suporte. Nesse caso, en1 particular, o bio-
filme é constituído de células autoimobilizadas, formando grânulos que sedimen-
tam muito rapidamente. Os grânulos ae róbios são de fato muito promissores no
âmbito da biotecnologia ambiental, justamente por permitirem a ocorrência de
processos simultâneos (remoção de matéria orgânica e de nutrientes, tais como
nitrogênio e fósforo) em um único reator.
A remoção de nutrientes (nitrogênio e fósforo) se tornou imperativa. A evo-
lução dos processos de remoção de nutrientes ao longo dos anos tem permitido o
desenvolvimento de sistemas 111ais econômicos e sustentáveis. O surgin1ento de
novos processos, como o Anammox, por exemplo, abriu um leque de opções para
o tratamento de correntes contendo concentrações elevadas de nitrogênio amo-
niacal, as quai s dificilmente seriam tratadas satisfatorian1ente pelos processos
. .
convenc1ona1s.
Neste livro, também consideramos importante enfatizar as técnicas molecu-
lares ou técnicas de biologia molecular aplicadas à identificação das comunidades
microbianas, uma vez que essas técnicas permitem entender mais minuciosa e
apropriadamente o que se passa no seio dos processos biológicos. Permitem não
somente a identificação, mas também a quantificação dos principais micro-orga-
nismos envolvidos nos processos de depuração de efl uentes líquidos.
Este livro, que se intitula "Processos Biológicos Avançados para Tratamento
de Efluentes e Técnicas de Biologia Molecular para o Estudo da Diversidade
Microbiana", procura justamente descrever esses novos processos com foco nos
funda111entos e suas aplicações.
Consideramos importante que a comunidade científica, assim como os es-
tudantes de diversos cursos de Graduação e Pós-Graduação, tenham acesso às
informações nele contidas.
Essa é nossa contribuição. Esperan1os que vocês leitores tirem p roveito do
texto e o apreciem.
Márcia, Geraldo e João Paulo

Sumário
Capítul o 1
Introdução
(Geraldo Lippel Sant'Anna]r. & Márcia Dezotti) 1
Referências . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Capítulo 2
Biorreatores com Membranas / Membrana Bioreactors - MBR
(Geraldo Lippel Sant'Anna Jr. & Ana Claudia Cerqueira) 9
2 .1 Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2 .2 Tipos de Biorreatores com Membranas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2 .3 Estágio Atual da Tecnologia MBR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2 .4 Fouling em MBRs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...... 23
2 .4.1 Fatores Operacionais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...... 23
2 . 4. 2 Formação do Fouling em MBRs . . . . . . . . . . . . . . ...... 27
2 .4.3 Substâncias Poliméricas Extracelulares e Produtos
Microbianos Solúveis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...... 29
2 .4.4 Modos de Operação e Controle do Fouling . . . . . . . ...... 32
2 .5 Uso de Carvão Ativado en1 MBRs . . . . . . ... . . . . . . . ... . . . 33
2 .6 Conjunção MBBR-MBR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2 . 7 Avanços Futuros da Tecnologia MBR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2 .8 Referências 38
Capítul o 3
Reator de Leito Móvel com Biofilme Moving Bed Biofilm Reactor - MBBR
(João Paulo Bassin & Márcia Dezotti) 43
3 .1 Contextualização e Introdução ao Processo MBBR . . . . . . . . . 43
VIII PROCESSOS BIOLÓGICOS AVANÇADOS
3 .2 Princípio de Funcionamento do MBBR . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3 .3 Suportes Utilizados nos Sistemas MBBR . . . . . . . . . . . . . . . . 53
3 .4 Aspectos Operacionais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 56
3 .4.1 Razão de Recheio (V/VR) ou Fração de Enchimento(%) . . 56
3 .4 .2 Hidrodinâmica do MBBR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 57
3 .4.3 Oxigênio Dissolvido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 59
3 .4.4 Formação do Biofilme nos Suportes Móveis do MBBR .. . 60
3 .4.5 Substâncias Poliméricas E xtracelulares (Exopolímeros) .. . 62
3 .5 Aplicações do MBBR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 64
3 .5 .1 Aplicações do MBBR na Remoção de Matéria Orgânica ... 64
3 .5 .2 Aplicações do MBBR na Remoção de Nitrogênio
(Nitrificação/Desni trificação) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 69
3 .5 .3 Observações Microscópicas do Biofilme . . . . . . . . . . . ... 81
3 .6 Conside rações Finais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
3 . 7 Referências . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
Capítulo 4
Tecnologia de Granulação Aeróbia (Lodo Granular Aeróbio)
(João Paulo B assin) 91
4 .1 Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
4.2 Caracterização Geral da Tecnologia de Lodo Granular . . . . . . . 93
4.3 Processo de Formação de Grânulos Aeróbios . . . . . . . . . . . . . . 99
4.4 Fatores que Afetam a Granulação Aeróbia . . . . . . . . . . . . . . . . 106
4.4.1 Ten1po de Decantação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
4.4.2 Velocidade de Crescimento dos Micro-Organismos . . . . . 108
4.4.3 Estratégia de Aliinentação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
4.4.4 Oxigênio Dissolvido e Intensidade de Ae ração . . . . . . . . 11 O
4.4.5 Tempo do Ciclo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
4.4.6 Configuração do Reator . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
4.4 . 7 Composição e Concentração do Substrato (Carga Orgânica
Aplicada) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 5
4.4.8 Lodo Utilizado como Inóculo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
4.4. 9 Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 7
4.4.l OpH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
4.4.11 Adição de Cátions Divalentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
4.5 Estudos de Caso Envolvendo a Formação de Grânulos Aeróbios . . 118
SUMÁRIO IX
4 .6 Processos de Conversão em Grânulos Aeróbios . . . . . . . . . 134

4 . 7 Aplicação de Grânulos Aeróbios no Tratamento de Águas
R es1"duar1as
, . ........................................ . 143
4.8 Considerações Finais e Perspectivas Futuras ..... . ....... . 161
4 .9 Referências 164
Capítulo 5
Novos Processos de Remoção Biológica de Nitrogênio
(João Paulo Bassin) 171
5 .1 I11trodução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 71
5 .2 Novos Processos de Remoção Biológica de Nitrogênio . . . . . . . . 173
5 .2 .1 Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 73
5 .2 .2 Processo Anammox . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180
5 .2 .3 Processos NOx . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 224
5 .2 .4 Banhados Artificiais (Wetlands) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 4
5 .3 Considerações Finais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228
5 .4 Referências . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 230
Capítulo 6
Técnicas de Biologia Molecular Aplicadas ao Estudo da Diversidade
Microbiana de Sistemas de Tratamento de Efluentes
(João Paulo B assin; Márcia D ezotti & Alexandre R osado) 245
6 .1 Int1·odução....................................... 245
6 .1.1 Diversidade Microbiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245
6 .1.2 Conceitos Básicos de Genética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 7
6 .2 Princípios e Conceitos de Técnicas de Biologia Molecular
Aplicadas ao Estudo da D iversidade Microbiana . . . . . . . . . . . . . . 253
6 .2 .1 Introdução às Técnicas de Biologia Molecular . . . . . . . . . . 253
6 .2 .2 PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268
6 .2 .3 DGGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281
6 .2 .4 Clonagem e Sequenciamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 288
6 .2 .5 FISH (Hibridização Fluorescente In Situ) . . . . . . . . . . . . 292
6 .2 .6 Métodos Alternativos Aplicados no Estudo da D iversidade
Microbiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301
X PROCESSOS BIOLÓGICOS AVANÇADOS
6 .3 , Aplicação das Técnicas de Biologia Molecular no Tratamento

de Aguas Residuárias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 13
6 .3 .1 Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 13
6 .3.2 Aplicação das Técnicas de Biologia Molecular em Estudos
de Caracterização de Comunidades Microbianas Representativas
de Sistemas de Tratamento de Águas Residuárias . . . . . . . . . . 3 13
6 .4 Considerações Finais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 41
6 .5 Referências . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342
Capítulo 1
Introdução
Geealdo Lippel 8anl'L\nna J e.
Márcia Dezolli
uitos têm sido os avanços no tema dos processos biológicos

de t ratamento de efluentes e abordá-los todos, num único
livro, seria u1na tarefa de difícil execução. Optamos, pois, por
focalizar processos e técnicas que, em nossa opinião, estão
encontrando grande difusão e que poderão mudar, em fu t uro próximo, o cenário
do t ratamento de efluentes.
O tema "tratan1ento biológico de efl uentes" nunca adquiriu o status de co-
nhecimento consolidado. Ao contrário, assistimos com frequência o surgimento
de novos conhecimentos, que muitas vezes põem por terra conceitos estabelecidos
e per1nitem desenvolver novas tecnologias para tratar d iferentes tipos de efluen-
tes. À guisa de exe1nplo pode-se citar o avanço dos conhecin1entos referentes ao
tratamento anaeróbio, a partir do final da década de setenta, as descobertas mais
recent es relativas à versatilidade insuspeitada das bactérias nit rificantes e das
novas fo rmas de transfo rmação do nit rogênio e o entendimento da microbiologia
e da bioquímica dos processos de remoção de fósforo e de enxofre.
Essas descobertas e avanços do conhecimento propiciaram desenvolvimentos
tecnológicos importantes. No caso do t ratamento anaeróbio houve excepcional d ifu-
são dos reatores que promovem retenção n1icrobiana (UASB, IC, EGSB) e no caso
da remoção de nitrogênio, diferentes processos foram propostos, entre os quais o
Sharon-Anammox, que vem encontrando interessante nicho de aplicação. Os conhe-
cimentos sobre a remoção de fósfo ro e enxofre, por sua vez, conferem nova ótica ao
tratan1ento de efluentes, que visa não apenas ren1ovê-los, como também, recuperá-los
para serem reutilizados, pois se constituem em importantes insumos químicos.
Como comentado, optamos por abordar neste livro alguns temas selecionados
que consideramos extreman1ente relevantes no contexto atual dos p rocessos bio-
lógicos de tratamento, a saber: Biorreatores com Membranas, Reatores de Leito
Móvel com Biofilme, Novos Processos de Remoção Biológica de Nitrogênio, Tec-
2 PROCESSOS BIOLÓGICOS AVANÇADOS
nologia de Granulação Aeróbia, e Técnicas de Biologia Molecular Aplicadas ao

Estudo da Diversidade Microbiana.
Julgamos que a abordagem desses temas fornecerá aos leitores uma visão da
tendência atual dos processos de tratamento. Certamente, os temas abordados po-
derão nortear a concepção de novas estações de t ratamento, que devem atende r as
crescentes exigências de qualidade dos efluentes tratados e fazer face aos desafios
atuais de não apenas remover macropoluentes, como também, os chamados "po-
luentes emergentes", presentes nos efluentes em concentrações de microgramas
ou nanogramas por litro.
Nesta Introdução gostaríamos de ressaltar a evolução dos p rocessos de tratamen-
to de efluentes, que se deu em função de metas a seren1 alcançadas. Durante muitos
anos os processos de tratamento visaram simplesmente ren1over material particulado
em suspensão (SS - sólidos suspensos) ou matéria orgânica biodegradável (DBO -
demanda bioquímica de oxigênio). Posteriormente, a demanda de oxigênio associada
à oxidação do nitrogênio amoniacal passou a ser requerida e, consequentemente, a
nitrificação foi contemplada na concepção das estações de tratamento.
Com o avançar do tempo verificou-se a necessidade de remover não apenas o
nitrogênio amoniacal como também as formas inorgânicas oxidadas desse elemen-
to (nitrito e nitrato) e o fósforo, visto que causava1n impactos negativos nos corpos
receptores, dentre os quais a intensificação da eutrofização de siste1nas aquáticos.
Houve, então, o desenvolvimento de diferentes processos que combinaram am-
bientes anóxicos e óxicos em diferentes tanques (Processo Bardenpho e outros) ou
em diferentes períodos num mesmo tanque (Sequencing B atch R eactor) .
Mais recentemente os processos de tratamento têm t ido que se adequar às
demandas de ren1oção dos poluentes e1nergentes e de produção de água para reúso.
Em paralelo, como já comentado, tem havido interesse na recuperação de certos
poluentes na forma de insumos industriais, como é o caso do fósfo ro e do enxofre,
ou ainda na produção de outros insumos como ácidos orgânicos e hidrogênio.
No cenário atual, sobretudo o dos países desenvolvidos, exige-se muito dos
processos de t ratamento de efluentes e, nesse contexto, é evidente que a combi-
nação de processos biológicos e físico-químicos se impõe como requisito para a
concepção de modernas estações de tratamento de efluentes.
Na figu ra 1.1 estão apresentadas tendências evolutivas dos p rocessos de t ra-
tamento de efluentes. Nela também fo ram incluídos os processos físico-químicos.
Deve-se considerar que um dado processo como o de lodos ativados pode ainda
ser aprimorado, mas devido à sua consolidação no mercado, a ocorrência de novos
ap rimoramentos deve se dar de modo inc remental ao longo do tempo. Ao surgi-
rem, os novos p rocessos, como os Reato res com Memb ranas (MBRs) ou o Anam-
mox, causam uma espécie de onda de inovação, porén1 a sua consistência e a sua
extensão só serão determinadas ao longo do tempo. As barras horizontais indica-
t ivas de cada processo representado na figura 1.1 fo ram fechadas na sua extremi-
CAPÍTULO 1 O INTRODUÇÃO 3
dade direita. Isto significa que o processo atingiu alto grau de maturidade num
dado período de tempo, porém, aprimoramentos ainda podem e devem ocorrer.
Para fazer face aos desafios de re1nover os chamados poluentes emergentes ou
para se obter água para finalidade de reúso em aplicações que requerem alta quali-
dade, a combinação de processos se configura como imperativa. Assim, a associação
de processos biológicos, filtração em 1nembranas, processos oxidativos avançados
(POAs) e adsorção em carvão ativado, em diferentes esquemas sequenciais, te1n sido
uma tendência adotada em n1uitos países por indústrias e municipalidades.
A adequada concepção de um processo é um passo fundamental para que as
metas de tratan1ento sejam alcançadas, mas não é tudo. Monitorar e controlar o
processo são ações indispensáveis ao seu êxito operacional. O acompanhamento do
processo de tratamento é um trabalho permanente que, infelizmente, não recebe,
em geral, a devida atenção . Embora 1nuitos tipos de sensores e medidores estejam
disponíveis no mercado, o grau de instrumentação e de automação de 1nuitas
plantas de tratamento de efluentes é ainda deficiente.
Se, por um lado, há sensores e equipamentos para medir, on-line ou de modo
expedito (off-line), diversas variáveis de interesse (pH, temperatura, oxigênio dis-
solvido, potencial redox, vazão, p rodução de metano, amônia, nitrito, nitrato,
fósforo e outras) ainda há desafios no que se refere às características do principal
agente dos processos biológicos: a comunidade microbiana.
Um parâmetro útil, mas extremamente limitado, tem sido usado para expri-
mir a quantidade ou concentração de agentes microbianos presentes ,
num dado
processo, a saber: o teor de sólidos em suspensão voláteis (SSV). E incrível que
muitos parân1etros de projeto e de operação de sistemas de tratamento biológico
estejam calcados em um indicador tão pouco consistente. Taxas específicas de
remoção de nitrogênio, de fósforo e de matéria orgânica são comumente expressas
em termos específicos e a variável usada para quantificar a "biomassa" de interes-
se tem, sido os sólidos voláteis.
E correto argumentar que para uma dada amostra de lodo biológico é muito
difícil determinar qual a presença quantitativa de cada grupo microbiano. Por
exemplo, em uma amostra de lodo retirada de um reator que promove remoção de
DBO e nutrientes é difícil exprimir os percentuais de alguns grupos microbianos
de interesse con10 heterotróficas, oxidadoras de amônia, oxidadoras de nitrito e
acumuladoras de fosfato . O mesmo pode-se afirmar de un1a amostra retirada de
um reator anaeróbio quanto às metanogênicas, homoacetogênicas, acetogênicas
e redutoras de sulfato . Em adição e para tornar mais complexo o desafio, além
da quantificação seria importante obter informações sobre o estado fisiológico
dos micro-organismos constituintes desses diferentes grupos. A complexidade do
problema é enorme e os desafios são imensos para que se consiga obter informa-
ções mais minuciosas sobre as comunidades microbianas típicas dos processos de
tratamento de efluentes.
.,::.
1950 1960 1970 1980 1990 2000 2010
Remoção de sólidos Nitrificação e Remoção de N e P Remoção de Nutrientes, Remoção de
Metas em suspensão e DBO Remoção de 080 e Remoção de DBO Poluentes Emergentes, Reúso
Processos
' '' '' ' ''
Físico-Químicos ' ' ' ' '
' ' ' '
Sedimentação 1 ' ' ' '
. ' ' ' '
(surgimento e '
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' Lamelar SQA
Sediment.!ção
''
'
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consolidação) ' 1 ' ' '
' ' '
Coagulação/ Floculação Química ' ' '
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Adsorção em carvão Ativado
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Filtração (leito de areia) 1
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'
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Processos Oxidativos Avançados
' '
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' ' '
1 Filtração /meios compostos e cartuchos) 1 '
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Filtração (filtro prensa e filtro rotativo) 1 • ' '' •
' '
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' ' ' 1Micro, Ultra, Nanofiltração e Osmose Inversa!
'' '
'
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Processos ' ' ' ' ' '
Biológicos
'' '' '' '' '' ''
lagoas (Estabilização, Anaeróbios, Aeróbios) 1 '
'
'
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(surgimento e Filtros Percoladores (Trickling filters convencionais ou com recheio plásticoll '
' ' •'
consolidação) Lodos Ativados j ' '' ' '
Lodos Ativados ' ' ' '
1 com 0 2 l)\Jro ' ' ' '
' ' ' '
•' 1 contactores biológicos rotativos 1 '' '' '' •'
' (R8til ' ' '
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' Reatores Anaeróbicos (FA, UAS8, EGS8, IC) ' '
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'' '' '' Reatores com Biofilme Móvel (MBBR} ''
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' ' ' ' Reatores com Membranas (MBRs)
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'' '' '' 1Reatores batelad~s sequenciais (RBS) 1 '' '' :D
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' ' '' Novos processos e rot<1s para remoção de N; o
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Biofiltros de carvão ativado (BACs)
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U>
Siglas: BACs - "biological activated carbon"; EGSB- "expanded granular sludge bed"; FA- filtro anaeróbio; IC - "internai circulation"; MBBRs - "moving bed biofilm reactors"; MBRs -
"membrane bioreactors"; RBCs - "rotating biological contactors"; RBS- reator batelada sequencial; SQA - sedimentação quimicamente assistida; UASB - "upflow anaerobic sludge bed". ~
-ô
►
e:,
FIGURA 1.1 Tendências evolutivas dos processos de tratamento de efluentes. o
U>
Mas a ciência e a tecnologia têm contribuído para alargar nossa visão sobre
as complexas comunidades microbianas. Isso tem sido feito graças ao desenvolvi-
n1ento de diferentes técnicas moleculares e de microscopia. Neste livro um capí-
tulo específico sobre as técnicas moleculares é apresentado. A título introdutório
e ilustrativo, algumas dessas técnicas estão apresentadas na figura 1.2. A maioria
delas vem sofrendo evolução a partir dos conhecimentos fundamentais sobre as
moléculas de DNA e RNA obtidos a partir da 1netade do século XX. E m especial,
o desenvolvimento da técnica PCR (polymerase chain reaction) e a posterior utiliza-
ção de DNA polimerase termoestável permitiram abrir uma janela de observação
para a diversidade n1icrobiana. A chamada metagenômica é o conhecimento que
permite efetuar a análise funcional das sequências nucleotídicas da coletividade de
genomas microbianos existentes em uma determinada amostra ambiental . Nesse
sentido permite realizar estudos sobre a ecologia microbiana e explorar a diver-
sidade existente en1 comunidades complexas como as encontradas nos processos
biológicos de tratamento.
Se a técnica de PCR permite amplificar o número de fragmentos de DNA de
uma dada amostra, outras operações, ainda são necessárias para caminhar no sen-
t ido da elucidação da diversidade. E preciso separar os fragmentos, identificá-los
e comparar as sequências obtidas com bancos de dados disponíveis na Internet. A
técnica de DGGE (denaturing gel gradient electrophoresis) desenvolvida por Fisher e
Lerman (1983) tem sido a mais empregada para a etapa de separação e obtenção
dos Jingerprints. Muyzer et alii (1993) foran1 p ioneiros no uso dessa técnica apli-
cada a amostras ambientais.
Tal como mostrado na figura 1.2, diversas técnicas têm sido desenvolvidas
e aprimoradas para o estudo da ecologia e da diversidade microbiana, como RQP
(respirato1y quinone profile), FISH (fluorecent in-situ hybridization) e MAR (micro-
autoradiography). Cabe ressaltar a técnica FISH, hoje largamente empregada em
estudos acadêmicos sobre grupos microbianos presentes em sistemas de trata-
mento biológico. A técnica vem ganhando difusão graças ao desenvolvimento e
à comercialização de sondas específicas para os diferentes grupos de interesse. A
sua combinação com a técnica MAR tem se revelado em potente fer ramenta para
o estudo de comunidades microbianas.
O uso das técnicas citadas ainda está restrito aos trabalhos de pesquisa de na-
tureza acadêmica ou de P&D industrial. Sua utilização como ferramenta de moni-
toramento e controle de processos em escala industrial certamente virá em breve.
Novos p rocessos, ap rimoramentos de p rocessos estabelecidos e novas fer ra-
mentas para monitoramento e controle das variáveis e parâmetros de interesse
estão se apresentando no cenário do tratamento de efluentes. Eles serão de grande
valor para que a qualidade dos efluentes tratados seja a melhor possível.
Esse livro está co1nprometido com essa visão de futuro .
1970.--------------------------------,
Estabelecimento dos princípios básicos da técnica PCR (polymerase chain reaction) ,

Kleppe et alii (1971)
1980
Utilização da técnica DGGE (Denaturing Gel Gradient E/ectrophoresis) para separar fragmen tos
de DNA, Fischer e Lerman (1983)
Patenteamento da técnica PCR com emprego de DNA polimerase termoestável, Mui/is ( 1987)
Detecção de polimorfismo de conformação de filamento único (SSCP - Single-Strand

Conformation Polymorphism), Orita et alii (1989)
1990
Desenvolvimento da técnica ARDRA
(Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis), Vaneechoutte et alii (1992)
Desenvolvimento da técnica FISH (Fluorescent in-situ Hibridization),

Lengaueret alii (1992)
Utilização da técnica DGGE para separação de pequenas unidades ribossomais,

Muyzer et alii (1993)
Desenvolvimento da técnica de microarranjos de □ NA (DNA microa"ay), Schena et alii

(1995)
Registro do uso da técnica RQP (Respíratory Quínone Profífe) para caracterização da

microbiota, Hu et alii ( 1997)
Pirossequenciamento,
Ronaghi et alii (1996), (1998)
Desenvolvimento da técnica TRFLP (Terminal Restriction Fragment Lenght

Polymorphism) , Liu et alii (1997)
Análise da região espaçadora intergênica ribossomal (RISA-Ribosomal

lntergenic Spacer Analysis), Borneman e Triplett (1997)
Combinação das técnicas FISH e MAR (Micro Autoradiography) para análise

da ecologia microbiana, Lee et alii (1999)
2000,___ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ___,
FIGURA 1.2 Evolução do desenvolvimento de diferentes técnicas moleculares e de microscopia

aplicadas no estudo da diversidade microbiana.
REFERÊNCIAS
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93, p. 227-234, 1992.
Capítulo 2
Biorreatores com Membranas

Membrane Bioreactors- MBR
Geraldo Lippel &anl'J\.nna Jr.
Ana Claudia Cerqueira
2.1 INTRODUÇÃO
s biorreatores com membranas, mais conhecidos pela sigla de língua

inglesa MBR (Membrane Biological Reactor), resultaram do desenvolvi-
mento dos p rocessos com membranas, que ganharam difusão a partir
de 1960, nas suas vertentes conhecidas como 1nicrofiltração, ultra-
filtração, nanofiltração e osmose inversa. A diálise, que também é un1a operação
co1n n1embranas, precedeu o desenvolvimento das vertentes anteriormente citadas
e se mantém como técnica de separação e purificação importante, com diversas
aplicações, dentre as quais a hemodiálise.
Os fundamentos dos processos com membranas estão bem estabelecidos e
foram objet o de publicações específicas (SCHNEIDER et alii, 2001, HABERT
et alii, 2006). Os MBRs aplicados em tecnologia a1nbiental são, e1n geral, sis-
temas de micro ou ultrafiltração, instalados ou associados a tanques nos quais
ocorrem reações mediadas por micro-organismos e permeação de substâncias
através das n1embranas. A 1naioria dos MBRs ope ra com micro-organismos aglo-
merados na forma de flocos, mantidos em suspensão por agitação mecânica ou
por insuflamento de ar, de forma que a membrana se constitui em barreira se-
letiva para os próprios flocos e, dependendo das características da membrana,
para substâncias de alta massa molar ou com características tais que as impeçam
de transpor essa barreira.
A despeito da relevância da permeação que ocorre nas membranas, deve-se
frisar que são os micro-organismos os agentes responsáveis pela degradação dos
poluentes e, consequentemente, pelos significativos níveis de remoção de matéria
orgânica que ocorrem nos MBRs. Portanto, o conhecimento dos fundamentos que
regem o tratamento biológico de efluentes é de fundamental importância para

o projeto e a operação desses biorreatores. Ademais, como tem sido largamente
evidenciado, as substâncias produzidas pelos micro-organismos, na forma de pro-
dutos microbianos solúveis (SMP) e substâncias poliméricas extracelulares (EPS)
têm papel relevante para o desempenho da permeação, pois estão diretamente
envolvidas no fenômeno denominado fouling (adiante abordado neste texto), cau-
sador da queda de fluxo de permeado ao longo do ten1po ope racional. '
Os biorreatores com n1embranas permitem separar os flocos microbianos
(lodo) da fase aquosa com relativa facilidade. Esse atributo é de grande valor,
pois é sabido que um dos pontos críticos do processo biológico mais utilizado
para tratar efluentes (lodos ativados) é a separação do lodo por sedimentação.
Além de assegurar a obtenção de sobrenadante clarificado, a sedimentação deve
pro1nover certo adensamento do lodo, que é parcialmente recirculado ao reato r
ou tanque de aeração. Porém, a sedimentação do lodo é uma operação relativa-
n1ente delicada e o sedimentador ocupa ap reciável espaço, por conta de sua alta
relação diân1etro/altura.
A figura 2.1 ilustra a mudança de layout da planta de tratamento de efluen-
tes promovida pela substituição do processo convencional de lodos ativados por
um sistema MBR. Verifica-se que a área para a instalação dos equipamentos é
menor no caso da utilização do MBR, pois os sedimentadores secundários não são
necessários nessa configuração. Por outro lado, uma peneira ou dispositivo para
retenção de sólidos finos deve ser instalado a montante do MBR.
Al ém de se obter diminuição do volume do biorreator, visto que o MBR pode
operar com maiores concentrações de lodo, o mais expressivo ganho p roporciona-
do pela configuração MBR é a qual idade do efluente tratado, como será comenta-
do mais adiante neste capítulo.
Um exemplo da redução de área para tratamento é o da estação de tratamento
de esgotos (ETE), localizada em Kaarst (Alemanha). Ela foi projetada para tratar
48 000 m 3/dia correspondente à população de 80 000 habitantes equivalentes
CTUDD, 2006) . A área ocupada pela planta, que inclui um MBR, foi aproximada-
mente metade da área que seria reque rida por uma planta convencional de lodos
ativados.
A melhor qualidade do efluente tratado e a menor demanda de espaço para
instalação se tornaram características muito atrativas do sistema MBR. Mas foi o
desenvolvimento de módulos de membranas mais robustos, com adequados fluxos
de permeação e, sobretudo, comercializados a custos acessíveis, o que possibilitou
a difusão dos sistemas MBR.
1 Neste texto foi mantida a denominação fouling, apesar de alguns autores nacionais defenderen1
o uso do tenno incrustação.
CAPÍTULO 2 ◊ BIORREATORES COM MEMBRANAS / MEMBRANE BIOREACTORS - MBR 11
r----------------~----
1 sediment~?or :
--•• o o __ :,
1 ---------..... secundaria
1
1
1----+..,.....1 tanque de 1----+I
aeração
1
sedimentador
sistema de 1
primário
recirculação de lodo~~ 1
1
'---------------------J
r----------------,
1
1 ---------~ 1
1
1 1
- - +1
O 1--.......il
sedimentador
peneira
'-+--+
primário _________________
MBR _.
FIGURA 2.1 Esquema do processo de lodos ativados nas configurações convencional e MBR - a
linha tracejada delimita o tratamento dito secundário.
Há na literatura registros de que o primeiro MBR foi desenvolvido pela Em-

presa Dorr Oliver en1 1966 (YANG et alii, 2006). E sse sistema constituía-se de
um biorreator com biomassa em suspensão, cujo conteúdo era continuamente
retirado e alimentado a uma peneira rotativa e, em seguida, a um módulo de
membranas de ultrafiltração. Os trabalhos desenvolvidos nas décadas posteriores
contribuíra1n para aprimorar os MBRs e reduzir os seus custos, de sorte que ao
final da década de 1980 e ao longo da década de 1990 a difusão desses reatores
se tornou realidade.
2.2 TIPOS DE BIORREATORES COM MEMBRANAS

Neste capítulo serão apenas abordados os biorreatores concebidos para o tra-
tamento de efluentes. Configurações diversas têm sido propostas para reatores
enziináticos, sistemas extrativos e cultivas de células animais.
Os primeiros MBRs apresentavam a configuração co1n módulo externo, como
ilustrado na figura 2 .2, empregando membranas cerâmicas em alguns casos. Esse
tipo de MBR exige que as velocidades de circulação no módulo sejam elevadas
para reduzir a tendência de fouling. Em decorrência, o consumo de energia tor-
na-se elevado (2,5 a 6 kWh/m 3). A configuração externaAirlift da empresa Pentair
X-Flow reduz significativamente o consumo de energia ao operar com baixa ve-
locidade de recirculação e injeção de ar no módulo para evitar deposição de lodo .
A partir dos anos 90 a configuração que emprega membranas submersas,

atribuída a Yamamoto et alii (1989), passou a ser muito atrativa e foi implanta-
da e1n larga escala em diferentes países, sobretudo para o tratamento de esgotos
domésticos. Entretanto, a configuração de módulos externos com alta velocidade
de recirculação tem sido empregada para efluentes industriais que apresentam
temperatura elevada, alto teor de matéria orgânica, valor de pH distante da neu-
tralidade e alta toxicidade (YANG et alii, 2006).
efluente
afluente (permeado) efluente
afluente --- (permeado)
módulos
módulos externos
internos
'-----'---'---+-ar
a) b)
FIGURA 2.2 Configurações usuais de MBRs usados em tratamento de efluentes: a) módulos
submersos, b) módulos externos.
Mais recentemente foi proposta a instalação dos módulos de membranas em

tanque separado do biorreator. Assim, algumas configurações em uso operam se-
gundo o esquema apresentado na figura 2 .3. Em plantas de grande capacidade,
os módulos são distribuídos em tanques que operam em paralelo, o que aumenta
a flexibilidade operacional durante os procedimentos de limpeza e manutenção. A
transferência de lodo entre os tanques normalmente se dá por bombeamento e o
retorno por gravidade, ou vice-versa. A vazão de reciclo é definida com base no ba-
lanço de sólidos suspensos e na concentração desejada nos tanques de me1nbranas.
Tal mudança facilita a lin1peza e a manutenção do sistema, com possibilidade
de pern1itir que o módulo de membranas opere num ambiente n1ais protegido do
que aquele que recebe o efluente a tratar, que apresenta teores mais elevados de
sólidos e de matéria orgânica. Com isso pretende-se reduzir ou minorar o fouling.
E ssa configuração vem tendo aceitação e pode ser adequada para efluentes
que contenham sólidos, coloides e macromoléculas, que tenderiam a intensificar
o fouling, se alimentados próximos aos módulos de membranas. No primeiro tan-
que, pode ocorrer a transformação parcial ou total desses poluentes, protegendo-se
os módulos de membranas instalados no segundo tanque, pois nesse ambiente os
poluentes mencionados estaria1n presentes en1 concentrações n1enores.
CAPÍTULO 2 ◊ BIORREATORES COM MEMBRANAS/ MEMBRANE BIOREACTORS - MBR 13
afluente, Q efluente (permeado)
o o o
o o0 o o ~
o o ºo ºº
o
o~ ~ó'o Q\510
submersos
~
~o
Jt
éólo
$:
<>°e%
~ r enagem
oo,gi:e 8Jlp ~
'b% o~ &9 ~ ~o Jb9 de lodo
ar ar
reciclo, Qreciclo
FIGURA 2.3 Configuração de MBR com dois tanques.
Os sistemas de múltiplos tanques utilizados para remoção de matéria or-

gânica e de nitrogênio, que combinam ambientes anóxicos e óxicos, permitem a
instalação de módulos de membranas no último estágio do processo, assegurando
a obtenção de un1 efluente tratado que apresenta maior padrão de qualidade. A
figura 2 .4 ilustra a incorporação de membranas ao estágio final de um sistema
concebido para remover nitrogênio amoniacal no tanque aeróbio (nitrificação) e
nitrato no tanque anóxico (desnitrificação), em adição à demanda bioquímica de
oxigênio (DBO).
!afluente efluente (permeado)
oººo 0
0 g
~ renagem
e%% ~ Jb5' ~ de lodo
TT T
L------------ - --------- -- ------ J
tanque tanque tanque de
anóxico aeróbio membranas
FIGURA 2.4 MBR acoplado a sistema concebido para remoção de DBO e de nitrogênio.
Além do reciclo para manter e controlar a concentração de lodo nos tanques,

é necessário o reciclo de lodo do tanque aeróbio para o tanque anóxico para re-
n1oção de nitrato. Na figura 2 .4 estão representadas as duas possibilidades de
reciclo. O reciclo diretamente do tanque de membranas para o tanque anóxico é
mais simples operacionalmente, reduz a quantidade de equipamentos instalados
e o consumo de energia. O reciclo do tanque de membranas para o tanque aeróbio
e deste para o tanque anóxico apresenta n1aior fl exibilidade operacional con1 a
possibilidade de ajuste de vazões de reciclo diferentes.
Outra configuração distinta de MBR recebe na literatura a denominação em
inglês MABR (Membrane Aerated Biofilm Reactor). Nesses reatores, biofilmes se
forman1 sobre membranas permeáveis e o oxigênio é transferido ao biofilme atra-
vés da membrana e sem formar bolhas na fase líquida. A transferência de oxigênio
é muito eficiente nesse sistema e os MABRs seriam adequados para efluentes, cujo
tratamento demanda altas taxas de consumo de oxigênio. Na figura 2 .5 encontra-se
un1a ilustração de um reator desse tipo.
efluente
biofilme sobre
fibra oca
módulo de
fibras ocas
afluente
0 2 ou
ar enriquecido
bomba
recirculação
FIGURA 2.5 Esquema il ustrativo de um MABR.
A aplicação de men1branas microporosas de fibras ocas em MABRs tem sido

investigada (BRINDLE et alii, 1997; PANKHANIA et alii 1999; SEMMENS
et alii, 2003) empregando-se oxigênio puro, que é transferido através dos poros
de membranas hidrofóbicas. Entretanto, membranas densas, alén1 de poderem
operar com ar enriquecido em oxigênio, não apresentam os problen1as operacio-
nais verificados com o uso de membranas porosas, a saber: baixo ponto de bo-
lha e interrupção da transferência de oxigênio por saturação dos poros com água
(AHMED et alii, 2004). A despeito dessas vantagens, as membranas homogê-
neas densas podem apresentar alta resistência à transferência de oxigênio. As
CAPÍTULO 2 ◊ BIORREATORES COMMEMBRANAS/ MEMBRANE BIOREACTORS- MBR 15
membranas compostas densas, altament e permeáveis, na forma de fibras ocas,

podem operar com ar en riquecido em oxigênio e se constituem em interessante
alternativa para os MABRs, como evidenciou o t rabalho de Cerqueira (2005).
O biofilme deposit ado na fibra oca pode ser visualizado nas figuras 2 .6 e 2 . 7. A
despeito de suas vantagens, os MABRs não t ive ram ainda inserção no mercado .
FIGURA 2.6 Fotomicrografia de amostras da fibra oca com biofilme em Microscópio Eletrônico de
Varredura, Cerqueira (2005).
FIGURA 2.7 Fotomicrografia de uma amostra da fibra oca envolta pelo biofilme - aumento de
100 X, Cerqueira (2005).
Outra modalidade de biorreator com membranas tem sido investigada para

processos anaeróbios de tratamento. O desenvolvimento desses reatores não se deu
com a mesn1a rapidez verificada para os MBR aeróbios. Nesses últ in1os a aeração
tem se mostrado um mecanismo mitigador do fouling. Nos processos ru1aeróbios a
util ização do biogás para cumprir a função que o ar exerce nos MBRs aeróbios é mais
complexa e requer alguns cuidados. Ade111ais, há ainda pouca informação sobre as
características e os mecanismos dofouling em 111eios anaeróbios. Entretanto, algum
sucesso comercial vem sendo obtido com um biorreator anaeróbio con1 membrana
(AnMBR) desenvolvida pela Empresa Kubota. Tal sistema, ilustrado na figura
2 .8, consiste em um tanque utilizado para solubilizar componentes dos efluentes
e, possiveln1ente, permitir algum grau de hidrólise de substâncias orgânicas de alta
massa molar, seguido de um tanque anaeróbio operado em condições termofílicas.
Esse tanque, no qual ocorre a metru1ogênese tem um subcompartimento onde estão
instaladas as 111emb ranas, na forma de módulos submersos. Os detentores da pa-
tente desse processo argumentam que as membranas são muito efetivas para reti-
rar, por permeação, o nitrogênio amoniacal, prejudicial ao processo e, para manter
no interior do biorreator concentração de sólidos voláteis cerca de três a cinco vezes
maior do que a encontrada nos digestores anaeróbios usuais.
/
,----------------- ~'
/ - - -+ b~gás \
membranas
submersas
efluente
1---r--;-
fermentação _ _ efluente
anaeróbia
tratado
equalização
, \ solubilização tratamento
pre- , de lodo / 1
tratamento ' - _ _ __ _ __ __ ____ _ _ __ .,,,
FIGURA 2.8 MBR anaeróbio: sistema desenvolvido pela Empresa Kubota.
Esclarecimentos adicionais sobre esse processo podem ser encontrados na

literatura (KANAI et alii, 2010). E sses autores informaram que até 2008 havia
quinze unidades industriais em operação, quatorze no Japão e uma na América
do Norte. Essa tecnologia está sendo utilizada principalmente por indústrias de
alimentos e destilarias de bebidas (tratamento de vinhaças).
Na figura 2 .9 encontra-se o esquema de um modelo de AnMBR proposto por

Wu e Wang (2004) (apud WANG et alii , 2008), no qual o biogás é parcialmente
recirculado ao reator na base de um gas-lift interno ao digestor, onde se situa o
módulo de membranas. Segundo os autores, as bolhas de gás auxiliam no cont role
do fouling e promovem a m istu ra dos sólidos em suspensão.
biogás
biogás
efluente
►
bomba de
sucção
r..
tanque
alimentação
,.,..,.,,.,.t~+:..-,1-t-7 gas-lift
+ módulo de
llll~-t-t1 membranas
bomba
compressor
FIGURA 2.9 Modelo de AnMBR com gas-lift e módulo de membranas submerso (adaptado de
WANG et alii, 2008).
Os tipos de MBRs citados anteriormente são os que têm tido forte inserção no
mercado de tratamento de efluentes ou potencial para tal . Porém, outros modelos e
outras configurações têm sido estudadas e propostas para dive rsas aplicações. Vale
a pena citar os modelos de MBR que vê1n sendo investigados para remover nit rato
de águas para abastecimento, que incl uem os extrativos, os de t roca iônica e os de
t ransferência de gás, conforme apresentados na revisão de McAdam e Judd (2006) .
2.3 ESTÁGIO ATUAL DA TECNOLOGIA MBR

Vários trabalhos têm abordado a difusão da tecnologia MBR no mundo ou em
regiões específicas (JUDD, 2006; YANG et alii , 2006 ; WANG et alii, 2008) . Os
t rabalhos publicados in ternacionalmente revelam p reponderância de investigação
sobre os MBRs que en1pregam módulos subn1ersos. Relato de 2006 indicava a
existência de 25 8 instalações MBR, em escala real na América do Norte e cerca
de 2 200 no mundo (YANG et alii, 2006) . Em sua maioria essas instalações cor-
respondem a sistemas com módulos submersos aplicados ao t ratamento de esgotos
domésticos.
A difusão dos MBRs na China tem sido muito expressiva com a participação
de empresas internacionais e nacionais. O levantamento constante da publicação de
Wang et alii (2008) dava conta de 2 54 plantas MBR instaladas, das quais 11 7 para
o tratamento de efluentes industriais e lixiviados de aterros sanitários (chorumes).
A capacidade das plantas MBR instaladas se situa numa ampla faixa, segun-
do os autores citados, variando de 1 a 1 000 m 3/d para as indúst rias americanas
e de 5 a 25 000 m 3/d na China, sendo que a planta chinesa de maior capacidade
foi instalada num parque petroquímico. As plantas municipais podem atingir ca-
pacidades de 80 000 m 3/d como a de Beijing (até 201 O a maior do mundo) . Esses
números evidenciam a recente e notável difusão mundial da tecnologia MBR.
Diversas empresas comercializam MBRs de módulos submersos, entre elas as
in ternacionais Kubota, Zenon (adquirida pela GE em 2006), Siemens, Mitsubishi
Rayon , To ray e Koch . A tabela 2 .1 fornece características dos módulos de mem-
b ranas comercializados por algumas dessas empresas. Os dados dessa tabela de-
vem se r vistos com certa reserva, pois as empresas têm alt erado as característ icas
dos seus produtos em busca de maior eficiência e de menores custos.
TABELA 2.1 Características de módulos de membranas comercializados por algumas empresas

internacionais (Fontes: JUDO, 2006; STOWA, 201 O; WANG, 2008)
1
Kubota Puron Zenon1 Toray
Tipo de módu lo Placa plana Fibra oca Fibra oca3 Placa plana
Configuração Submersa Submersa Submersa Submersa
Material membrana PE 2 - PVDF 4 PVDF 4
Tamanho poro (µm) 0,4 0,05 0,04 0,08
Diâmetro interno (mm) - 1,2 0,8 -
Diâmetro externo (mm) - 2,6 1,9 -
Comprimento da fibra (mm) - 1 800 2 000 -
Largura placa (mm) 490 - - 515
Altura placa (mm) 1 000 - - 1 608
Área (m2) 0,8/placa 30/elemento 31,6/módulo 1,4/placa
Fluxo de projeto (U m2 •h) 25 - 40 - - 8,3 - 62
1A Zenon Environmental INC. foi adquirida pela General Electric Coem 2006; 2 polietileno
clorado ; 3 modelo ZeeWeed 500d; 4 fluo reto de polivinilideno.
Na figura 2 .1O são apresentados alguns sistemas comerciais de módulos sub-

mersos, correspondendo à configu ração das membranas na forma de placas planas
e na forma de módulos de fibras ocas. Num desses módulos as fibras são seladas
e livres numa das extremidades e, segundo os detentores dessa tecnologia (Koch
Puron), isso evita acúmulo de sólidos e de lodo nos espaços entre as fibras .
(a)
(b)
FIGURA 2.10 Módulos de membranas empregados em MBRs: (a) placas planas - Kubota;
(b) fibras ocas- GE; (e) fibras ocas com pontas livres e seladas - Koch. (continua)
ar
♦
permeado
suporte
Feixe de membranas Conjunto de feixes (elemento) Módulo
(c)
FIGURA 2.10 Módulos de membranas empregados em MBRs: (a) placas planas - Kubota;
(b) fibras ocas - GE ; (e) fibras ocas com pontas livres e seladas - Koch . (continuação)
Os volumes de ar utilizados são significativos, como revelam dados de insta-

lações-piloto e de escala plena, que apontam consumos nas faixas de 10 a 90 e 10
a 65 m 3 de ar/m 3 de permeado, respectivamente CTUDD, 2006) . Os custos de aera-
ção incide1n de modo expressivo nas despesas operacionais dos MBRs ae róbios.
Uma das principais modificações feitas nos módulos de placas foi o empilhamento
em dois ou três estágios superpostos. Nos módulos de fibras, a aeração intermi-
tente reduz o consumo de ar.
A configu ração de MBR com módulo externo emp rega, en1 geral, membra-
nas multitubulares. Há configu rações que ope ran1 com alta velocidade de recir-
culação através do módulo; e outras que operam com injeção de ar para evitar
o fouling . A figura 2 .11 mostra o módulo t ubular da Pentair-X-flow e as confi-
gurações Crossjlow e Airlift . Algu1nas caracte rísticas de módulos de membranas
mult i tubulares são fornecidas na tabela 2 .2 .
A despeito da intensa difusão dos MBRs, a tecnologia ainda tem desafios a
enfrentar e muitos dos problen1as operacionais desses reatores estão associados
ao fouling . Outros problemas relatados na literatura são: a baixa eficiência de
transferência de oxigênio no biorreator, os custos de energia associados à aeração,

a formação de espuma e a complexidade de alguns procedimentos de limpeza das
n1embranas.
Embora os MBRs estejam sendo crescentemente utilizados para o tratamento
de efluentes industriais, a sua inserção tem se dado preponderantemente nos setores
alimentícios, farmacêuticos, de celulose e papel e no processamento de lixiviados de
aterros sanitários. Efluentes industriais co1nplexos como os de refinarias de petró-
leo, indústrias de solventes orgânicos e indústrias de síntese química poden1 apre-
sentar desafios para o seu tratamento. A presença de sólidos em suspensão, material
oleoso, sais ou solventes, por exemplo, pode contribuir para o incremento dofouling
ou até mesmo danificar os materiais con1ponentes dos módulos de membranas.
Assim, pode-se afirmar que ainda não há experiência totalmente consolidada de
utilização de MBRs para o tratamento de efluentes de alguns setores industriais.
Mas, acredita-se que, com o te1npo, soluções técnicas estarão disponíveis para sanar
problemas e ampliar a gama de utilização desses reatores.
No mercado de tratamento de esgotos domésticos a inserção dos MBRs foi
rápida e ampla. Os dados de desempenho desses reatores alimentam a sua difusão.
U1n exemplo a comentar é o do MBR implantado em Porlock (Grã-Bretanha),
que em 2008 completou 10 anos de operação . Com vazão de 1 970 m 3/d, o MBR
desta estação de tratamento de esgotos contém 3 600 painéis de membranas, com
área de 2 880 m 2 • Os resultados operacionais médios desse período revelam DBO
do efluente tratado menor do que 5 mg/L e DQO média de 22 mg/L. A remoção
de coliformes foi maior do que 5 ,8 log. Nesse período, as limpezas químicas fo-
ram feitas a cada oito meses, em média, e apenas 6% dos painéis foram trocados
(KUBOTA, 2008) .
As características das 3 7 maiores plantas MBR da Europa foram sun1arizadas
por Lesjean et alii (2009). Capacidade instalada maior do que 5 000 m 3/d foi o
critério adotado para a classificação das plantas nessa categoria. Dessas plantas,
32 tratavam esgoto sanitário e cinco processavam efluentes industriais. Os custos
de implantação (capital) dessas plantas variaran1 de 200 a 400 Euros/habitante
equivalente e o consumo de energia se situou entre 0,6 e 1 kWh/m 3 tratado. Das
32 plantas voltadas ao tratamento de esgotos sanitários, 20 foram fornecidas pela
empresa Zenon (GE desde 2006) e 12 pela Empresa Kubota. Confirmando a ten-
dência, já comentada, de confi namento dos módulos de membranas num tanque
próprio para tal, como ilustrado na figura 2 .3, 18 das instalações da Zenon e oito
da Kubota adotaram essa configuração.
(a)
(c)
(b)
FIGURA 2.11 (a) Módulos de membranas tubulares Pentair-X-flow empregados em MBRs ;
(b) configuração crossflow; (e) configuração Airlift.
TABELA 2.2 Características de alguns módu los externos para MBRs (Fonte: JUDO, 2006)
1
Berghof Pentair X-Flow Novasep
Tipo de módulo tubular tubular placas planas

Material membrana PES, PVDF PVDF PAN 1
Diâmetro de poro (µm) - 0,03 -
Cutoff (Daltons, Da) 250 - 40
Dimensões do módulo
Comprimento (mm) - 3 000 2 610
Diâmetro ou largura (mm) 225 200 438
Diâmetro dos tubos (mm) 11 ,5 5 2-8

'
-
Área/módulo (m2) 11 ,8 33-27 702
1 2 para
poliacrilonitrila; módulo com 1 710 mm de profundidade.
Os autores mencionam a construção p revista de plantas de grande capacidade

em Oman (78 000 m 3/d) e nos E1nirados Árabes Unidos (269 000 m3/d), pelas
empresas
,
Kubota e GE, respectivamente. A planta projetada para os Emirados
Arabes superará em muito a capacidade da planta de Beijing, considerada a maior
do mundo até o início de 201 O. Observa-se que outras empresas vêm conseguindo
implantar plantas MBR de grande capacidade como Pentair-X-Flow (1 7 000 m 3/d,
Dubai) e Koch/Puron (15 000 m 3/d, França, 30 000 m 3/d, Austrál ia).
Desses relatos depreende-se que a tecnologia MBR avançou muito nos últi-
mos anos e cabe ainda mencionar a importância dessa tecnologia nas sequências
de tratamento de efluentes visando o reúso de água. Os processos a jusante do
MBR, que seriam necessários para obter água com qualidade adequada para reúso,
podem ser simplificados, visto que a qual idade do efluente do MBR é superio r à
dos processos biológicos de tratamento convencionais.
2.4 FOUL/NG EM MBRs
2.4.1 FATORESOPERACIONAIS
O aumento gradual da resistência à permeação é um fato inconteste e que

tende a se agravar quando a operação se dá com fluidos complexos como é o caso
dos efluentes. As 1nembranas dos MBRs estão inseridas em meios que contêm
sólidos en1 suspensão como os flocos biológicos, células m icrobianas, debris ce-
lulares, coloides, macromoléculas e uma gama variada de substâncias orgânicas
solúveis. Para assegu rar operação prolongada, sem a necessidade de frequentes
limpezas químicas, ope ra-se os MBRs com fluxos de permeação moderados.
Alguns autores empregam a noção de fluxo crítico, ou ainda, a de fluxo sus-

tentável, para designar condições operacionais que assegurem operação de longo
termo se1n necessidade de intervenções de limpeza invasivas.
Quando a operação se dá a fluxo constante, observa-se gradual incremento
da pressão transmembrana (TMP), devida aofouling. Com fluxos baixos, pode-se
prolongar a operação, sem que haja prematuro e abrupto aumento da TMP, como
ilustrado na figura 2 .12 .
TMP
•
tempo de operação
FIGURA 2.12 Variação da TMP com o tempo de operação para diferentes fluxos (F1 > F2 > F3).
Segundo Le-Clech et alii (2006a) o fluxo crítico corresponde àquele a par-

t ir do qual incrementos adicionais do fluxo causam rápido aumento do fouling
(abrupto aumento da TMP). O fluxo sustentável é o resultante de uma solução
de compromisso entre fouling e produtividade (volume de efluente efetivamente
tratado diariamente) . Como a operação com fluxos elevados intensifica o fouling,
a n1aioria dos MBRs opera com fluxos baixos. Nesse contexto, o fluxo sustentável
é aquele para o qual a TMP aumenta a uma taxa aceitável de modo que a lin1peza
química não se faça necessária.
Muitos estudos foram feitos a respeito do fouling em MBRs, mas, a despeito
do esforço investigativo empreendido, ainda não há consenso sobre causas e meca-
nismos desse fenômeno . Ademais, constata-se complexa interação entre os fatores
considerados causadores do fouling.
Un1 dos parâmetros que mereceu grande atenção foi a concentração de sóli-
dos em suspensão no reator. Dentre as vantagens apregoadas dos MBRs estava
a de poder operar com altas concentrações de lodo biológico, com decorrente re-
dução do volume reacional. Observou-se, entretanto, uma tendência de redução
dos níveis reco1nendados para o teor de biossólidos, de até 30 g/L nas prin1eiras
propostas de MBRs, para níveis na faixa de 8 a 12 g/L. Essa mudança se deveu

a alguns problemas operacionais observados, a saber: aumento da viscosidade do
n1eio reacional, aumento do aporte de ar para manter em suspensão os sólidos,
intensificação do jàuling.
Apesar de haver controvérsia sobre os efeitos da concentração de sólidos em
suspensão nofouling das membranas, o seu aumento é, em geral, considerado fator
prejudicial ao fluxo de permeado (menor fluxo ou maior TMP). Sombatso1npop
et alii (2006) observara1n au1nento significativo da taxa de fouling quando os teo-
res de sólidos em suspensão voláteis (SSV) passaram de 6 a 15 g/L. Declínio do
fluxo de permeado com o aumento do teor de SSV foi observado por Scharz et alii
(2006) para níveis de até 5 g/L. Para valores usuais em MBRs (acima de 5 g/L) os
autores afi rmaram que o manejo do fluxo, de modo a evitar intensa fo rmação de
torta sobre as membranas, revelou-se n1ais importante do que a variação da con-
centração de SSV. Por outro lado, a operação com maiores concentrações de SSV
causou prejuízo à transferência de oxigênio.
Um parâmetro de grande Ílnportância para o processo biológico é a idade do
lodo ou tempo de retenção do lodo (SRT - sludge retention time). Uma das vanta-
gens dos MBRs é a de operar com valores elevados desse parâmetro, o que gera
menor produção de biomassa no processo e também assegura maior tempo para a
atuação de linhagens microbianas que apresentam baixa taxa de crescimento, mas
que são efetivas para a degradação de certas classes de poluentes. Entretanto, a
operação com elevados valores de SRT leva a maiores teo res de SSV no reator, com
as consequências já comentadas.
Há controvérsias sobre o efeito da idade de lodo no fouling em MBRs. Le-Clech
et alii (2006a) reportam aumento de 1O vezes na taxa de fouling quando a idade de
lodo passou de 1O para dois dias. Han et alii (2005) observaram aumento do fouling
quando a idade de lodo passou de 30 para 100 dias. Assim, parece que há efeitos
prejudiciais ao processo quando a idade do lodo assume valores extremos. A ideia
vinculada no início do desenvolvimento dos MBRs de que a idade de lodo poderia ter
valores tendendo ao infinito não se mostrou p ratican1ente viável. É necessário retirar
lodo do reator, pois alén1 da acumulação dos sólidos biológicos no seu interior, ocorre
também acúmulo de materiais inertes e não biodegradáveis que podem danificar as
membranas e os módulos.
Uma variável operacional de grande relevância para o controle do jàuling é
a vazão de ar injetado na base dos módulos com me1nbranas. O movimento das
bolhas de ar próximas à superfície das membranas provoca tensões cisalhantes e
turbulência que incrementam o retrotransporte de materiais e substâncias depo-
sitadas para o seio do líquido. No caso de módulos de fibras ocas, as bolhas de ar
também provocam moviinentação das fibras com possibilidade de desprendimento
de material aderido. Entretanto, acima de um valor limite, o aporte de ar não
mais contribui para a supressão do fouling e, ademais, passa a contribuir para
aumentar os custos de energia para o processo de tratamento. Como já comenta-

do, as empresas que comercializam MBRs têm investido em módulos superpostos
para melhor utilizar o ar injetado, ben1 como em sistemas de distribuição de ar
mais eficazes.
No caso de MBRs com módulo externo, a velocidade tangencial do fluido
é um parâmetro Ílnportante para a minoração do fouling. Nesse caso, o efeito
positivo da velocidade tambén1 pode estar restrito a uma faixa, visto que a ação
cisalhante que ocorre na operação de bombeamento, intensificada em altas vazões,
provoca rompimento dos flocos e geração de materiais e substâncias que podem
atuar como agentes causadores do fouling. Uma alternativa que vem sendo ado-
tada é a injeção de ar na linha de recalque da bon1ba, de modo que o escoamento
junto às membranas seja bifásico (ar e líquido), podendo-se nesse caso operar com
vazões de líquido menores.
Outro parâmetro operacional que afeta o fouling é o nível de oxigênio dissolvi-
do (OD) no reator. Na realidade, o nível de OD interfere em vários outros fatores
que governam o processo e, em especial, na estrutura dos biofilmes, na distri-
buição de tamanho dos flocos e na secreção de exopolímeros (EPS) e de produtos
microbianos solúveis (SMP). Em geral, níveis elevados de OD permitem operar
com boa fil trabilidade e meno res taxas de fouling, en1 deco rrência da for111ação de
tortas com menores resistências, por conta do maior tamanho dos flocos e de sua
estrutura mais porosa (LE-CLECH et alii, 2006a).
A relação entrefouling e propriedades das membranas é bastante complexa e
na literatura há resultados controversos. Ao se alterar as características das mem-
branas em un1 dado experimento, outras variáveis são necessariamente modifica-
das, tornando-se difícil identificar e discriminar os efeitos associados unicamente
às membranas.
Há, em geral, predominância do conceito de que membranas hidrofílicas têm
menos propensão ao fouling do que as hidrofóbicas. E m experiências em escala de
bancada com membranas de ultrafiltração de diferentes naturezas (hidrofílica e hi-
drofóbica), Maximous et alii (2009) cone} uíram que a hidrofilicidade da membrana
não parece ser um atributo vantajoso no que se refere à propensão aofouling. Porém,
é um atributo vantajoso quando se considera a reversibilidade da resistência da
torta. A natureza da membrana pode ter algum efeito na fase inicial do fouling, mas
esse parâmetro pode ter pouca influência para longos períodos de operação . Como
será comentado adiante, na superfície da membrana se acumulam substâncias e
partículas, que alteram suas características originais ao longo do tempo.
Os efeitos do tamanho e da distribuição de poros na 111en1brana também são
controversos, sobretudo em função da variedade de características dos efluentes
tratados. A formação de camadas dinâmicas sobre as membranas com o decorrer
da operação também dificulta a avaliação da propensão ao fouling de membra-
nas com diferentes distribuições de ta111anhos de poros. No entanto, o fouling
irreversível, causado pela deposição de material orgânico e inorgânico na entrada

e no interior dos poros contribui de modo significativo para as baixas peiformances
de membranas de poros 1naiores (LE-CLECH et alii, 2006a).
2.4.2 FORMAÇÃO DO FOULING EM MBRs
Como já comentado, a natureza complexa dos meios líquidos contidos nos

MBRs torna a elucidação da fonnação do fouling uma difícil tarefa. Há consenso
estabelecido entre os pesquisadores de que há forte interação entre os principais
parâmetros envolvidos na formação do fouling. Nesse sentido ele é o resultado de
complexas interações e não é o produto da ação de um único parâmetro ou variável
operacional.
Na figura 2.13 encontra-se uma ilustração do gradual bloqueio dos poros de
uma membrana, o que leva, na operação a fluxo constante, ao aumento da TMP.
Segundo Zhang et alii (2006) o fouling ocorre em três estágios, a saber: i) condicio-
namento da n1embrana limpa com concomitante aumento da TMP por um curto
período, ii) fouling lento durante o qual a TMP cresce linearmente ou apresenta
fraco crescimento exponencial, iii) fouling rápido com abrupto aumento da TMP.
o o
o O
o 0
o o ºo
o o o o o
oº
(a) (b) (e)
FIGURA 2.13 Ilustração do gradual bloqueio dos poros pela ação de macromoléculas (pequenos
círculos vazados) e flocos microbianos (elipses escuras). Adaptado de Le-Clech et alii (2006).
Vários eventos contribuem para a ocorrência desses estágios. Os flocos micro-

bianos, as substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e os produtos microbianos
solúveis (SMP) são agentes essenciais para a ocorrência do fouling.
No primeiro estágio ocorre condicionamento da superfície da membrana por
macromoléculas, o que representa fator de atração para os micro-organismos, so-
bretudo os não floculados (células planctônicas). Os flocos também podem chegar
à superfície e a ela aderir reversivehnente, deixando ao sair t raços de material exo-
polin1érico, que contribuem para o condicionamento da superfície da membrana.
Bloqueio de poros começa a ocorrer.
No segundo estágio vários eventos têm curso: restrição e bloqueio de poros;

depósitos de flocos em regiões onde há pouco cisalhamento; formação de biofilmes
finos e de torta em algumas regiões da membrana. O fouling ocorre mesn10 quan-
do se opera com fluxos inferiores ao crítico e nessa fase a contribuição dos EPS é
significativa.
No terceiro estágio, o fenômeno dofouling se torna autoacele rado . Poros são
totalmente bloqueados e o fluxo e1n poros ainda abertos se torna muito elevado e
maior do que o fluxo crítico, o que leva ao bloqueio desses canais. O fouling não é
uniforme na superfície das membranas e pode haver crescimento mais acentua-
do de torta em alguns locais, com possibilidade de colapso da próp ria torta e
dispersão de debris sobre as membranas. O resultado desses eventos é o rápido
e, praticamente, exponencial aumento da TMP, como anteriormente ilustrado
na figura 2 .1 2 . Alguns dos modelos propostos na literatura para descrever os
eventos que levam ao abrupto aumento de TMP fora1n sumarizados no trabalho
de Le-Clech et alii (2006a).
Um modelo comumente adotado para descrever a queda de fluxo de permea-
do com o tempo operacional é o de resistências em série. A resistência total (R1)
seria a soma das seguintes parcelas: resistência da membrana (Rm), medida com a
membrana liinpa e água deionizada; resistência reversível da torta (R), causada
pela deposição de torta sobre a superfície da men1brana; resistência do fouling
irreversível (Rr), causada pela adsorção de materiais e substâncias nos poros e na
superfície da membrana.
Ao investigar os efeitos da inclusão de u1n agitador mecânico no tanque con-
tendo o módulo de membranas, Khan et alii (2008) verificaran1, em condições
operacionais estáveis, que a resistência da torta (R) correspondeu a aproximada-
mente 98% da resistência total . O aumento da velocidade de agitação, nos níveis
investigados, não pron1oveu queda significativa na resistência total à permeação.
Sombatsompop et alii (2006), em experimentos com MBRs operados com
concentrações de SSV de 6, 10 e 15 g!L, verificaran1 razões R/Rt de 0,95; 0,97
e O, 97, respectivamente. Em adição, concluíram que a razão acima foi pouco
afetada pela concentração de sólidos no reator. Chang et alii (2005), por sua vez,
observaram queda de Rc com a diminuição da concentração de sólidos.
O fato de ser muito significativa a resistência da torta (R) en1 condição ope-
racional estabelecida não retira importância do papel desempenhado pelas subs-
tâncias poliméricas extracelulares (EPS) e produtos microbianos solúveis (SMP)
no evento defouling, como será visto a seguir.
2.4.3SUBSTANCIAS POLIMfRICAS EXTRACELULARES EPRODUTOS MICROBIANOS SOLÚVEIS
Cabe primeirrunente conceituar as duas classes de substâncias (EPS e SMP).

As EPS são uma classe relativamente ampla de substâncias de alta massa molar,
que se encontram nas matrizes constituintes dos biofilmes ou dos flocos microbia-
nos. Quanto à natureza química, essas substâncias são preponderantemente polis-
sacarídeos, proteínas, fosfolipídios e ácidos nucleicos. Algumas delas, en1 especial,
os polissacarídeos e as proteínas podem estar firmemente ancoradas nas superfí-
cies das células, fracamente ligadas a elas ou retidas nos interstícios 1natriciais.
São determinadas empregando-se técnicas de extração e separação.
Essas mesmas técnicas pern1item determinar as SMP, mas é evidente que a
sua diferenciação dos EPS é dependente dos métodos empregados para a sua ob-
tenção e caracterização. As SMP são compostas por diversas substâncias solúveis
na fase líquida, tais como: polissacarídeos e proteínas excretados pelas células
microbianas; produtos de decomposição da matriz constitutiva dos flocos e das
células; substâncias presentes no efluente (modificadas ou não) .
Um esque1na passível de ser e1npregado para a extração e a determinação de EPS
e SMP foi apresentado por Le-Clech et alii (2006a) e encontra-se na figura 2 .1 4.
água
deionizad1
centrifugação mistura aquecimento
l-f 5 min, 5 OOOg rf~l'-- --+l • f _1_o_m_in_1- r 10 min, 80ºC b -f
LJ
amostra
LJ~ l::::::J LJ centrifugação
1O min, 7 OOOg
LJ
doMBR
filtração 0 filtração ~ J
1,2 µm l 1.2 µm l
~M~ ~EP~
( SMPp) ( SMPc) (eEPSp) (eEPSc]
FIGURA 2.14 Esquema do método de extração para determinação de EPS e SMP (fonte: LE-
CLECH et alii, 2006a).
Como ilustrado na figura, determinam-se as substâncias poliméricas extra-

celulares passíveis de extração pelo método (eEPS) e as substâncias livres na fase
aquosa, consideradas nesse caso como produtos microbianos solúveis (SMP).
Uma vez obtidas as frações eEPS e SMP os seus conteúdos podem ser expres-
sos em teores de proteínas (eEPSp, SMPp) ou de carboidratos (eEPSc, SMPc),
empregando-se para tal os clássicos protocolos analíticos propostos por Lowry
(proteínas) e Dubois (carboidratos).
Investigando os exopolímeros presentes em lodos ativados com auxílio das

técnicas de cromatografia por exclusão de tamanho e microespectroscopia infra-
vermelha, Gõmer et alii (2003) verificaram que os EPS apresentam vários picos.
As massas moleculares das proteínas se situaram entre 45 e 670 kDa, enquanto
a dos polissacarídeos (presentes em t rês picos) foram menores, da ordem de 0,5 e
1 kDa. Ademais, os autores observaram forte associação entre proteínas e polis-
sacarídeos.
Deve-se se1npre considerar o papel desempenhado pelas substâncias de ele-
vada massa molar na formação do jàuling. A barreira imposta pela membrana
permite reter essas substâncias no n1eio reacional . Con10 a biodegradação dessas
moléculas se dá de modo relativamente lento, há tempo suficiente para que elas
alcancem os poros e a superfície das membranas.
E studo fe ito por Zhang et alii (2006) permitiu identificar substâncias de
massa molar superior a 5 kDa no meio (denominado sobrenadante), correspon-
dendo a um valor de carbono orgânico total (COT) de 20,8 mg/L. No permeado
o COT atingiu apenas 0,3 mg/L. No caso das substâncias com 1nassa molar in-
ferior a 5 kDa, os valores de COT no sobrenadante e no permeado foram de 1,6
e 1,2 mg/L, respectivamente. Portanto, a me1nbrana em operação teve grande
capacidade de reter macromoléculas, embora se tratasse de un1a n1embrana plana
de microfiltração com tamanho nominal de poro de 0,2 µm . Os autores utilizaram
a técnica de cromatografia líquida com detecção de carbono orgânico (LC-OCD)
para caracterizar as n1assas molares dos compostos solúveis e os respectivos teores
de carbono acima mencionados.
Camadas de fouling (segundo estágio) removidas das n1embranas apresenta-
ram teores de EPS de natureza polissacarídica maiores do que os teores de EPS
de natureza proteica. Ade1nais, a razão EPS/SSV foi maior na camada de fouling
do que na biomassa em suspensão no reator. Zhang et alii (2006) concluíram que
os polissacarídeos parecem ser os principais agentes do fouling.
Viero et alii (2007) verificaram maiores concentrações de polissacarídeos do
que de proteínas no sobrenadante de um MBR e atribuíram aos polissacarídeos
papel importante no fouling via formação de camada gelatinosa sobre as membra-
nas de fibras ocas. Posterio rmente, Viero et alii (2008) confirmaram os maiores
teores de polissacarídeos no sobrenadante de um MBR aplicado ao tratamento
do efluente de uma refinaria de petróleo e ressaltaram a forte contribuição dessas
substâncias para o fouling da membrana.
Okamura et alii (2009) investigaram a formação de fouling em n1en1branas
de ultrafiltração por meio de ensaios com amostras coletadas do interior de dife-
rentes MBRs e filtradas em papel-filtro (1 µ m). Esses pesquisado res estudaram a
formação dofouling por SMP em ensaios de curta duração (70 min) . Os resultados
revelaram correlação positiva entre os teores de sacarídeos e ácidos urônicos na
fase aquosa e a resist ência à filtração . Para o material proteico não foi observada
co rrelação. Os autores assinalaram que houve fo rmação de camada gelatinosa so-
b re as membranas e que as concentrações de sacarídeos e ácidos urônicos n essa
camada foram cerca de 50 vezes maiores do que as respectivas concentrações em
fase líquida. Concluíram que os causadores do fouling da membrana fo ram polis-
sacarídeos contendo ácidos urônicos na sua con1posição.
Na literatura há, entretanto, discrepância de resultados referentes ao pa-
pel desempenhado por proteínas e polissacarídeos no fouling das membranas.
Discordâncias exist em até mesmo quanto aos teores de p roteínas e de polissa-
carídeos encontrados nos sob renadru1tes dos MBRs. A tabela 2 .3 mostra alguns
resultados selecionados de diferentes publicações, que evidenciam a variedade de
registros dessas concentrações feitas por pesquisadores do tema.
TABELA 2.3 Teores de proteínas e polissacarídeos nos sobrenadantes de MBRs
1
eEPSp eEPSc SMPp SMPc Referência
11- 16 7-40 0,5-34 3-33 Le-Clech et alii, 2006a

(mg/gSSV) (mg/gSSV) (mg/L) (mg/L)
47,1 21 ,5 Maximous et alii, 2009

- -
(mg/L) (mg/L)
22,1-36,4 6,2-7,5 2,1-3 ,1 8,4-9,5 Khan et alii, 2008

(mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L)
59,5-78,7 19,7-31 ,9 2,2-7,7 7,4-12,9 Sombatsompop et alii,

(mg/gSSV) (mg/gSSV) (mg/gSSV) (mg/gSSV) 2006
0-20 0-200 Viero et alii, 2008

- -
(mg/L) (mg/L)
0-18 10-80 Viero et alii, 2007

- - (mg/L) (mg/L)
4,5-9,4 3,7-7,3 20-45 39-65 Arabi et alii, 2009

(mg/gSSV) (mg/gSSV) (mg/L) (mg/L)
Arabi et alii (2009) investigaram o efeito de cátions mono e divalentes na

produção de EPS e SMP, no tamanho dos flocos e na taxa defouling e1n MBRs de
bancada munidos de módulos de fibras ocas com membranas com tamanho médio
de poros de 0,04 7 µm . O aumento da concentração de sódio de 140 para 645 mg/L,
para uma razão entre cátions mono e divalentes igual a t rês, causou diminuição
no tamanho dos flocos e aumento na taxa defouling. Nessa condição houve dimi-
nuição do teor de eEPS e aumento do teor de SMP.
2.4.4 MODOS DE OPERAÇÃO ECONTROLE DO FOULINC
A operação a fluxo constante é mais co1num do que a operação a TMP

constante. A formação do fouling a fluxo constante tem sido mais investigada e
foi discutida no item 2 .4.2. No primeiro estágio do fouling a variação da pres-
são é gradual, porém pequena. Levantamento apresentado por Le-Clech et alii
(2006a) indica para esse estágio durações entre 48 e 1 200 h e taxas de variação
de pressão transmembrana de O, 004 a O, 104 kPa/h para fluxos operacionais de
4 a 30 L/m2 .h . As faixas são amplas por conta de os dados serem provenientes
de distintos trabalhos conduzidos em diferentes condições.
Em função das características de formação do fouling num dado MBR di-
versas medidas podem ser adotadas. A chamada limpeza física das membranas é
praticada para restaurar o fluxo de permeado e remover o fouling. Em princípio
ela é definida pelo fabricante do MBR, visto que os dispositivos para fazê-la,
majoritariamente automáticos, devem estar disponíveis na unidade. A lin1peza
química é praticada com menor frequência, mas revela-se extremamente necessá-
ria, quando a limpeza física não consegue mais restaurar fluxos adequados para a
operação do MBR.
Dentre as formas de limpeza física a "relaxação" consiste na parada do fluxo
de permeação por períodos curtos (1 a 2 min) . Com a continuidade da aeração,
substâncias causadoras de fouling retroceden1 da superfície da membrana para o
seio da fase líquida. Esse procedimento é repetido, con1 frequência, em interva-
los de 8 a 1 S min. A relaxação pode ser combinada com a chamada retrolavagem.
Como o próprio nome indica, a retrolavagem consiste na injeção de efluente
tratado no sentido inverso ao do fluxo de permeado. Os fluxos injetados são de
cerca de uma a três vezes o fluxo de permeado e ocorrem com intermitência. Cada
episódio de retrolavagem pode durar alguns segundos e eles são repetidos em inter-
valos de alguns minutos. Durações típicas dos períodos de filtração/retrolavagem
de 1 0min/4Ss, 3n1in/l Ss e 8-16min/25-4Ss foram relatadas por Le-Clech et alii,
2006b.
É importante considerar que quando efetuada com o permeado, a retrola-
vagem afeta a produtividade do processo e o consun10 de energia. Volumes de
permeado de S a 30% do volume de efluente tratado podem ser gastos quando as
retrolavagens são frequentes e longas.
Uma alternativa para reduzir o consumo de permeado é realizar a retrolava-
gem com ar (VISVANATHAN et alii, 1997, VIERO et alii, 2007). A operação
de um MBR empregando-se períodos de filtração de 15 mine retrolavagem com
ar por 30 s, mostrou-se adequada para o controle do fouling, como verificado por
Viero et alii (2007).
A eficácia da limpeza física tende a decrescer ao longo do te1npo de operação
do MBR e o fouling irreversível adquire relevância significativa e a limpeza química
se impõe como necessária. Ela pode ser feita empregando-se baixas concentrações
de agentes químicos na forma de retrolavagem e com frequência diária. Pode tam-
bém ser feita com maior concentração de agentes químicos, de modo preventivo,
semanalmente, ou ainda, pode ser conduzida de forma intensiva un1a ou duas vezes
ao ano. A limpeza preventiva pode durar 30 n1in e empregar NaClO da ordem de
0,01 % e a limpeza química intensiva emprega NaClO com concentração de 0 ,2 a
0,3% e ácido cítrico (0,5 a 1 %) ou oxálico (0,5 a 1 %) (LE-CLECH et alii, 2006a).
A frequência de limpeza durante a operação dos MBRs é definida em função
de n1últiplas variáveis, como as características do efluente, do lodo e do sistema
de membranas utilizado. A pressão transmembrana é o parâmetro principal para
definir o protocolo e a frequência de limpeza que, na prática, pode variar de três
meses a um ano.
2.5 USO DE CARVÃO ATIVADO EM MBRs

Muitos estudos foram realizados com o emprego de carvão ativado em pó
(PAC) ou granular (GAC) e1n lodos ativados e os resultados obtidos foram, em
geral, positivos para o desen1penho do processo.
Dentre as vantagens apregoadas para o uso de carvão ativado em lodos ati-
vados pode-se citar: i) crescimento de biofilmes sobre as partículas e proteção dos
micro-organismos contra substâncias inibidoras e tóxicas p resentes no meio; ii)
permanência no reator de micro-organismos de crescimento lento, porém ativos
na degradação de substâncias mais recalcitrantes; iii) intensificação da adsorção
de poluentes na p resença de carvão ativo e biofilmes; iv) melhoria nas caracterís-
t icas de sedimentabilidade e de desaguamento dos lodos ge rados.
Entretanto, o custo de utilização do carvão ativado, associado às altas dosa-
gens empregadas em muitos trabalhos, não mereceu tanta atenção dos pesquisa-
dores como as vantagens acima citadas. Como observado por Munz et alii (200 7),
o custo de utilização do carvão ativado tem limitado as suas aplicações en1 insta-
lações de lodo ativado em escala real, embora bons resultados tenham sido obtidos
nas escalas de bancada e piloto.
Para os MBRs a viabilidade da utilização de carvão ativado é aparentemente
maior, pois a sua contribuição à filtrabilidade, verificada em diversos trabalhos,
tem como decorrência a diminuição da frequência das limpezas físicas e químicas,
com consequente economia de energia e de insumos químicos.
Pirbazari et alii (1996) relataram que o emprego de 1 % de PAC reduziu a
queda de fluxo, atribuída aofouling, em um MBR com módulo externo de ultrafil-
tração utilizado no tratamento de lixiviado de aterro sanitário.
Kim et alii (1998) observaram 1naiores permeabilidades no módulo de ul-
t rafiltração, quando PAC foi incorporado ao lodo. Verificaran1 diminuição no
tamanho dos flocos biológicos e menor teor de EPS no seu interior quando PAC
foi incorporado ao sistema. A adição de PAC causou decréscimo da compressibili-
dade dos flocos, au1nento da porosidade da torta fo rn1ada e consequente aumento
do fluxo permeado.
Efeitos benéficos da utilização de PAC foram registrados por Park et alii
(1999) em um reator anaeróbio acoplado a um módulo de ultrafiltração. A resis-
tência da torta e o fouling decrescerain com o aumento da dose de PAC (até 5 g!L) .
Segundo os autores, o uso de PAC contribuiu para gerar torta incompressível e as
partículas de carvão exerceram abrasão ou atrito na superfície das membranas, o
que auxiliou na remoção dos depósitos acumulados sobre elas. Ademais, o carvão
ativo atuou como adsorvente e coagulante de substâncias orgânicas e de material
coloidal . Os autores também observaram maior estabilidade operacional face às
cargas de choque quando PAC foi utilizado.
Li et alii (2005) compara ram reatores MBRs de módulo submerso operados
em condições similares em experimentos com e sem a adição de PAC (1,2 g!L). A
utilização de carvão ativado en1 pó contribuiu de modo significativo para aumen-
tar o fluxo de permeado (32% maior no sistema com PAC) e diminuir a taxa de
aumento da TMP, o que permitiu aumentar em 1,8 vezes o intervalo operacional
sem ações de liinpeza.
Ying et alii (2006) verificaram que o emprego de PAC na concentração de
O, 75 g/L teve efeitos positivos na operação de MBR aplicado ao tratamento de
esgotos sanitários, dentre os quais; redução da resistência da torta e do fouling
irreversível. Decréscimo na taxa defouling também foi observado por Munz et alii
(2007) en1 MBR aplicado ao tratan1ento de efluente industrial (curtun1e), quando
PAC foi empregado nas concentrações de 1,5 e 3,0 g!L.
Lesage et alii (2008) ao empregarem 1 g!L de PAC num MBR verificaram
aumento da fil trabilidade do sobrenadante e argumentaram que o carvão ativado
alterou as propriedades dos flocos biológicos e, sobretudo, reduziu as concentra-
ções de carboidratos e de proteínas na fase líquida, que passaram, respectivamen-
te, de 81 e 71 mg!L (sem adição de PAC) para 20 e 40 mg/L (após a adição de
PAC). Ademais, os autores verificaran1 que no sistema com PAC a biomassa resis-
tiu bem a um choque tóxico provocado pela adição de 2 ,4-dimetilfenol ao reator.
Dos trabalhos publicados na literatura o carvão ativado em pó (PAC) tem
sido majoritariamente emp regado ao invés da sua variante granulada (GAC) . Isso
porque um dos principais intuitos de sua utilização é o de interferir nas taxas
de formação de fouling, que ocorre em regiões delgadas junto às membranas. Em
especial, o carvão em pó pode alterar as características de compressibilidade e
permeabilidade das tortas, o que dificilmente ocorreria se fosse suprido na for-
ma granular. Além disso, há certa preocupação procedente quanto aos danos que
poderiam ser provocados às membranas pelos choques de partículas de carvão de
maior tamanho. A abrasão reduz a vida útil das membranas e, portanto, há que
se encontrar uma solução de compromisso entre os benefícios advindos do uso do

carvão ativado e os eventuais danos e custos a ele associados.
Co1no foi visto, o uso de PAC tem apresentado efeitos benéficos para a opera-
ção dos MBRs, resta avaliar se os ganhos advindos de sua utilização compensam
o seu custo.
2.6 CONJUNÇÃO MBBR-MBR

O amadurecimento das tecnologias MBBR (moving bed biofilm reactor) e MBR
(membrane bioreactor) levou à proposta de conjunção de ambas sob a denominação
MBBR-MBR. A sugestão de combinar os dois tipos de reatores ou processos foi
apresentada em 2001, como se depreende da publicação posterior dos proponen-
tes (LEIKNES e ODEGAARD, 2007). O conceito norteador da proposta é de
que a predominância da biomassa fixa em suportes, como ocorre no MBBR, pode
diminuir a tendência ao Jouling das membranas. Ademais, os MBBRs, por terem
capacidade de operar com altas cargas orgânicas, poderiam levar a instalações
mais compactas.
No trabalho acima citado os autores submeteram o MBBR (munido de "bio-
medias" AnoxKaldness) a diferentes cargas orgânicas via variação do te1npo de
retenção hidráulica (TRH) e mantiveram no MBR (en1 tanque ou compartimento
próprio) um valor baixo dessa variável, visto que ele promoveria preponderante-
mente a separação da biomassa. Os resultados desse trabalho mostraram que a
taxa de Jouling foi maior quando o MBBR foi operado com alta carga orgânica e
tal resultado foi atribuído à variação na distribuição do tamanho das partículas
presentes no compartimento do MBR. Houve diminuição relativa da fração de
partículas com tamanho inferior a 1 µ m quando menores cargas orgânicas foram
aplicadas. Segundo os autores, se o papel dessas partículas para a for1nação do
Jouling for preponderante, espera-se a sua intensificação quando o processo operar
.
com cargas maiores.
Lee et alii (2006) realizaram expe rimentos com um módulo de fibras ocas
in1erso num vaso que continha "biomedias" comerciais de poliuretana (cubos de
13 mm) impregnadas com carvão ativado. Investigaram os efeitos causados pela
vazão de ar (5-9 Umin) e pela quantidade de suportes, expressa em percentagem
volumétrica (5, 1O e 20%), na variação da TMP, no tamanho dos flocos e na con-
centração de eEPS. Os resultados revelaram queda no tamanho dos flocos tanto
com o aumento da aeração como com o aumento da fração volumétrica de "biome-
dias". O acréscimo da TMP com o tempo de operação foi mais acentuado para as
menores vazões de ar e menores frações volumétricas. Quanto aos teores de eEPSp
e eEPSc, nenhuma das variáveis investigadas teve influência significativa nos
teores desses constituintes. Um resultado interessante foi observado quando uma
malha de aço foi instalada em torno do módulo de membranas, de modo a evitar

o choque das "biomedias" com as fib ras ocas. A taxa de variação da TMP com o
tempo operacional fo i muito 1naior quando a malha de aço envolveu o 1nódulo
de membranas. A TMP de 30 kPa (limite operacional) foi alcançada em 33 n1in
quando a malha esteve presente e em 155 min quando ela esteve ausente. Os au-
to res concluíram que as colisões das "biomedias" nas membranas criam forças de
atrito que causam atenuação da formação de torta e, em decorrência, preservam
por mais tempo a permeabilidade das membranas.
Sombatsompop et alii (2006) empregaram em seu trabalho MBR com dois
compartimentos comunicáveis. No segundo compartin1ento ficou instalado o mó-
dulo de fibras ocas e, no primeiro, duas condições foram investigadas: uso de bio-
massa em suspensão e uso de biomassa fixa a suportes (anéis de polipropileno).
Nesse trabalho as "biomedias" não tinham acesso ao compartimento onde ficava
o módulo, de modo que não havia choques entre elas e as fibras ocas. No que se
refere ao fouling, observou-se que a resistência da to rta caiu de forn1a significativa
quando o primeiro compartimento foi operado como um MBBR. A viscosidade do
lodo também foi menor sob essa forma de ope ração.
Acredita-se, co1n base nos resultados pro1nissores obtidos, que a conjunção
MBBR-MBR poderá ganhar maior difusão. As variantes até agora investigadas
contemplam a utilização de dois tanques comunicáveis e a de um único tanque,
conforme ilustrado na figura 2 .15.
A despeito de terem sido reportados bons resultados con1 a variante de um
único tanque, ilustrada na figura 2 . l 5b, deve-se ressaltar que as "biomedias"
empregadas no estudo de Lee et alii (2006) foram feitas de material não rígido,
contrariamente ao que ocorre com as p rincipais "biomedias" comerciais usadas
nos MBBRs. Há certamente necessidade de maior investigação, sobretudo, em
experimentos de longa duração, para avaliar possíveis danos causados às membra-
nas expostas a constantes choques com as "biomedias" . Por outro lado, a variante
ilustrada na figura 2 .15a te1n condições de se iinplantar com maior facilidade no
mercado de tratamento de efluentes.
efluente
afluente permeado afluente
peneira efluente
biomedias ~ . biomedias
permeado
módulo
membranas
ar---- - - ar
(a) (b)
FIGURA 2.15 Modelos de MBBR-MBR: (a) dois tanques e confinamento das "biomedias", (b) um
único tanque.
2.7 AVANÇOS FUTUROS DA TECNOLOGIA MBR

O progresso alcançado nos últimos anos, em especial, pelos reatores que em-
pregam módulos submersos conferiu um admirável grau de amadurecimento à
tecnologia MBR, mas, certamente, avanços são necessários, em especial, para re-
dução dos custos operacionais (energia e insumos químicos). Para tal, atenção
ten1 sido dada à mitigação do fouling, que é considerado consensualmente como o
aspecto mais crítico da tecnologia MBR e diretamente relacionado com os custos
. .
operac1ona1s.
Dentre os desafios que se apresentam para os MBRs, Yang et alii (2006) rela-
tan1: melhor entendimento do fenômeno do fouling e desenvolvimento de métodos
de fácil utilização para o seu controle e a sua redução; desenvolvimento de métodos
de pré-tratamento que garanta1n operação segura; aumento da vida útil das 1nem-
branas (maior estabilidade química e mecânica); redução de custos (membranas,
mão-de-obra e energia); projeto e implantação de plantas com grande capacidade.
A íntima relação que se observa entre fluxo e fouling levou os MBRs mais uti-
lizados (membranas submersas) a operarem com fluxos modestos. Como registrado
por Lesjean et alii (2009), embora o fluxo máxin10 de projeto para operação com
esgotos sanitários esteja na faixa de 14 a 50 L/m2 ·h, com médias de 29 a 32 L/m2 ·h,
os fluxos reais de funcionamento se concentram num intervalo de 8 a 25 L/m2 ·h.
Embora tais fluxos já viabilizem a instalação e a operação dos MBRs de grande
capacidade ( > 5 000 m 3/d), o desenvolvimento de novas membranas que assegu-
rem maior fluxo, sem aumentar o fouling, é um t ema a ser perseguido para tornar
a tecnologia ainda mais atrativa.
Avanços foram alcançados na aeração, tanto pela utilização de módulos su-

perpostos, como pelo projeto de aeradores mais eficientes ou ainda pelo uso de ar
de for1na cíclica ou intermitente.
A adição de produtos químicos ao reator para modificar as características
da biomassa e aumentar a filtrabilidade também tem se constituído em tema de
investigação. Sulfato de alu1nínio e cloreto férrico têm sido testados. Co1no é de
conhecimento geral, essas substâncias são coagulantes e conseguen1 remover da
fase líquida coloides, partículas em suspensão e alguns tipos de SMP. Um produto
comercial (MPE, Nalco), polímero catiônico, está no mercado com o atributo de
aumentar o desempenho das n1embranas. Ce rtan1ente novos produtos serão lança-
dos para tal finalidade, pois ofouling causado por coloides, EPSs e SMPs é crítico
para o funcionamento dos MBRs.
A adição de um adsorvente, como o carvão ativado, aos MBRs, já mereceu
vários estudos, mas os efeitos benéficos decorrentes dessa utilização necessitam
ser confirmados em operação prolongada, que trunbém considere a realização de
detalhada avaliação econômica. Outra opção promissora para gerar sobrenadru1tes
clarificados é a combinação do chamado lodo aeróbio granular e MBR. A qualidade
dos sobrenadantes dos lodos aeróbios granulares gera expectativas de que a sua
associação com MBRs poderá contribuir para a redução do fouling e o ap rimora-
mento da qualidade do efluente tratado.
Por fim, cabe comentar o êxito, até agora restrito a poucos estudos, sobre-
tudo, em escala-piloto ou real, da combinação MBBR-MBR. Por associar duas
tecnologias que tiveram grande difusão nos últimos ru1os e adquiriram bom nível
de consolidação, deve-se considerar o possível sucesso comercial do acoplamento
dos reatores com biofilme com os MBRs.
2.8 REFERÊNCIAS
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Capítulo 3
Reator de Leito Móvel com Biofilme

Moving Bed Biofilm Reactor - MBBR
João Paulo Ba<5<5in
Márcia DezotU
3.1 CONTEXTUALIZAÇÃO EINTRODUÇÃO AO PROCESSO MBBR
crescimento exponencial e abrupto dos grandes centros urbanos gera

sempre um questionamento: onde haverá espaço para a instalação de
estações de tratamento de efluentes gerados pela população e pela in-
dustrialização em desenvolvimento? Embora essa seja uma pergunta
difícil de ser respondida no momento, é coerente in1aginar que no futuro próximo
será dada ênfase à construção de plantas de tratamento que privilegiem instala-
ções compactas, ocupando o menor espaço físico possível, e que consigam manter
uma operação estável e com impacto ambiental reduzido. Neste contexto que se
configura doravante, é fundamental que as tomadas de decisões de p rojeto sejam
fruto de discussões de diversos segmentos da sociedade, incorporando não so-
mente o aspecto técnico, mas o aspecto administrativo e o apoio financeiro a ele
interligado, sempre no intuito de se atingir os objetivos almejados.
Nos últimos anos, tem se observado um aumento crescente no interesse por
processos com biofilmes destinados ao tratamento de águas residuárias municipais
e industriais, justamente pelo fato de que estes processos atendem à expectativa de
futuro anteriormente ressaltada. São inúmeros os motivos pelos quais os reatores
com biofilme vên1 sendo alvo de preferência em detrimento aos outros processos
convencionais com biomassa dispersa. Entre eles, destacam-se a possibilidade de se
trabalhar com alta concentração de biomassa, o que, por consequência, permite ope-
rar o reator com maior carga; boas eficiências de remoção de compostos orgânicos;
maior estabilidade a variações da composição do afluente e a choques de carga,
de temperatura e de toxicidade; e menor preocupação em relação à separação de
sólidos a jusante do reator.
A atratividade dos processos com biofilme é evidenciada pela forma mais

compacta que estes sistemas apresentam, ocupando menos espaço físico, que mui-
tas vezes representa um fato r crítico e1n estações de tratan1ento de efluentes.
0degaard et alii (1994) chegam a afirmar que os sistemas que apresentam bio-
massa aderida a algum meio suporte, além de dispensarem o tradicional reciclo de
lodo encontrado em sistemas convencionais, possibilitam que a biomassa perma-
neça sen1pre dentro do meio reacional, fator esse que a torna mais especializada à
função a que se destina.
Quando se fala de processos com biofil mes, é plausível que se tenha em men-
te o que constitui um biofilme . De modo geral, um biofiln1e pode ser entendido
como un1a estrutura complexa de células e produtos celulares, dispondo-se de
forma imobilizada em uma matriz de substâncias poliméricas extracelulares que,
de forma espontânea, são capazes de formar grânulos densos, crescendo aderidos
a superfícies sólidas estáticas ou a suportes n1óveis. Tanto a formação quanto a
acu1nulação de biofilmes em meios aquosos resulta de processos de natureza física,
química e biológica (NICOLELLA et alii, 2000) .
O desenvolvimento microbiano no biofilme é obtido graças ao transporte dos
componentes necessários (Inatéria orgânica, oxigênio e nutrientes). E stes compo-
nentes essenciais são prin1eiramente adsorvidos na superfície do biofilme, sendo
posteriormente transportados por processos de difusão, inicialmente através do
filme líquido, passando pela interface líquido/biofilme e, por fim, através do pró-
prio biofilme, para serem metabolizados pelo conjunto microbiano. Os produtos
finais da biodegradação possuem fluxo no sentido inverso, sendo direcionados ao
exte rior do biofilme . A figura 3 .1 apresenta um esquema dos principais processos
envolvidos no transporte e na degradação de substratos em biofilmes.
Tendo em vista a natureza dos p rocessos envolvidos no desenvolvin1ento do
biofilme, faz-se necessário levar em consideração a possibilidade de ocorrer limi-
tações difusivas à transferência de massa, as quais podem reduzir a velocidade
global da reação nesses sistemas heterogêneos. Diante dessas circunstâncias, a
minimização desses efeitos difusivos é crucial para a melhoria do desempenho de
biorreatores com biomassa in1obilizada.
Para uma célula bacteriana, são inúmeras as vantagens de estar contida em
um material suporte formando biofilmes, particularmente no que se refere à pro-
teção contra agentes agressivos, a exemplo de compostos recalcitrantes encontra-
dos en1 diversos efluentes industriais. Adicionalmente, o conjunto microbiano
pode mostrar-se resistente à desidratação, face à alta hidratação da matriz de
exopolímeros (EPS) excretados naturalmente pelos próprios micro-organismos, e
também a predadores, como protozoários (BASSIN e DEZOTTI , 2008). Outro
ponto a ser considerado é que os p rocessos com biofilme, em geral, podem apre-
sentar maior potencial de depuração de matéria orgânica, o que se deve, primor-
dialmente, à alta atividade e variedade n1icrobiana existente nesses ambientes.
CAPÍTULO 3 ◊ REATOR DE LEITOMÓVELCOM BIOFILME / MOVING BED BIOFILM REACTOR - MBBR 45
Líquido Fi lme
(substrato) líquido Biofilme Interface
Interface ar 1• 1il• -1 meio suporte
Hidrólise
Adsorção
'---> \
Difusão
Difusão
- . Reação
Difusão
Camada do
✓
líquido em <--...,lsubprodutos
movimento
<---_,
Erosão
Matéria
particulada
envolvida
FIGURA 3.1 Representação esquemática dos processos envolvidos no transporte de degradação

em biofil mes (Adaptado de Gonçalves et alii, 2001 ).
Entre os reatores com biofilme mais utilizados t anto para fins de tratamento
secundário (remoção de material orgânico) quanto terciário (remoção de nutrien-
tes - N e P), encontram-se os filtros biológicos de percolação, os biofiltros sub-
mersos de leito fixo, os reatores de leito fluidizado e os discos biológicos rotativos.
Todos apresenta1n vantagens e desvantagens. O filtro de percolação não possui
volume efetivo e falhas 1necânicas são frequentes nos discos rotativos biológicos.
Por sua vez, os reatores de leito fluidizado frequentemente apresentam instabili-
dade hidráulica, e a dificuldade de alcançar distribuição uniforme do biofilme na
superfície do suporte é um dos inconvenientes dos biofil tros subme rsos de leito
fixo (RUSTEN et alii, 2006; RUSTEN et alii, 1995).
No intuito de superar essas dificuldades operacionais, surgiu o compacto
e inovador reator de leito móvel com biofilme, também muito conhecido pela
sua denominação em inglês, Moving bed biofilm reactor, a qual dá origem à sigla
MBBR. E ssa tecnologia foi desenvolvida na Noruega no final dos anos 1980 e
início dos anos 1990 (Eu ropean Patent nJa 0,57 5,31 4, US Patent nJa 5,458,779),
período no qual as autoridades responsáveis pelo controle de poluição norueguês
optaram pelo desenvolvimento de projetos de estações de tratamento de esgoto
pequenas, mas com grande capacidade, baseando-se em processos biológicos e quí-
micos. A motivação para estes novos desenvolvimentos estava alicerçada na ideia
de aproveitar a maioria das estações de tratamento existentes (em to rno de 70%
do total), uma vez que se t ratava de plantas de pequeno porte, atendendo popula-
ções que variavam de 50 a 2 000 pessoas.
Neste contexto, começou-se a trabalhar com biofilmes aderidos a diferentes

suportes (biomedias) no interior do reator. O tratamento biológico foi combinado
co1n pré-tratamentos de grandes tanques sépticos e con1 unidades de pós-trata-
mento, lançando mão de reagentes químicos atuantes no processo de coagulação/
floculação. Foi neste período que a companhia norueguesa Kaldnes Miljoteknologi
desenvolveu a tecnologia MBBR. Para tanto, contou com a colaboração de um
grupo de pesquisa universitário, representado pela NTNU/SINTEF (NTNU -
Universidade de Ciência e Tecnologia da Noruega, SINTEF - Fundação para
Pesquisa Científica e Industrial, da Universidade da Noruega. Além disso, o
desenvolvimento do p rocesso MBBR recebeu apoio financeiro da Agência de
Controle de Poluição da Noruega (SFT) e do Conselho de Pesquisa da Noruega
(NRF) (RUSTEN et alii, 1998).
Em julho de 2002, ocorreu a junção entre a companhia norueguesa Kaldnes
Miljoteknologi, detentora da tecnologia MBBR, e a companhia sueca Anox AB,
justamente para consolidar a sua posição no mercado mundial de tratamento de
águas residuárias. A empresa passou a ser denominada AnoxKaldnes em junho
de 2004. A empresa AnoxKaldnes foi comprada pela Veolia em julho de 2007,
embo ra a nomenclatura das biomedias não tenha sido alterada.
A primeira experiência com esta nova tecnologia foi realizada durante o
outono de 1992, em duas estações de tratamento existentes (0DEGAARD et
alii, 1993) . Os resultados obtidos já forneciam um indicativo da capacidade deste
novo sistema em n1elhorar o desempenho de estações de tratamento já existentes.
No que se refere à remoção de nutrientes, particularmente nitrogênio e fósforo,
constatou-se que seria necessário aumentar a quantidade de recheio, representada
pelo meio suporte, ou então inserir etapas físico-químicas para auxiliar na sua
remoção (0DEGAARD et alii, 1993).
A tecnologia MBBR vem se consolidando em sucesso con1ercial, com um
número crescente de plantas espalhadas pelo mundo (RUSTEN et alii, 2006).
Vale ressaltar que, apesar da grande quantidade de plantas emp regando tal
tecnologia, a quantidade de estudos visando à remoção de material orgânico e
nutrientes (nitrogênio e fósforo) nesses sistemas é pequena quando se compara,
por exemplo, con1 os respectivos estudos aplicando lodos ativados ou outros
reatores convencionais. Adicionalmente, embo ra as pesquisas comprovem o seu
bom desempenho, tanto na remoção de matéria orgânica quanto de nutrientes,
observa-se que a aplicação do processo ainda é incipiente no Brasil.
CAPÍTULO 3 ◊ REATOR DE LEITOMÓVEL COM BIOFILME / MOVING BED BIOFILM REACTOR - MBBR 47
3.2 PRINCÍPIO DE FUNCIONAMENTO DO MBBR

O desenvolvimento do processo MBBR esteve vinculado à ideia central de
congregar, em um único sistema, as melhores características do processo de lodos
ativados e as melhores características dos processos con1 biofilmes, deixando de
lado as características indesejáveis de cada processo (RUSTEN et alii, 2006) .
Diferente1nente da maioria dos reato res com biofilme, o sistema MBBR uti-
liza todo o volume útil do reator para o crescimento do consórcio microbiano,
apresentando algumas vantagens em relação a seus concorrentes. A perda de carga
é bastante reduzida, o que lhe confe re grande vantagem em relação aos sistemas
de leito fixo, os quais apresentam perda de carga relativan1ente alta e podem so-
frer entupimento ou colmatação do meio filtrante . Contrariamente ao sistema de
lodos ativados, o MBBR não necessit a de reciclo de lodo, visto que o crescimento
da biomassa se dá em suportes que se movem livremente no volume reacional.
E stando a bion1assa fixada sobre un1 meio suporte, consegue-se ter um n1aior con-
trole sobre a retenção celular no reator biológico em comparação com os sistemas
convencionais de biomassa dispersa, sobretudo quando a perda de células nestes
últimos sisten1as, decorrente de más condições de sedimentabilidade do lodo no
decantador secundário, é um fator preponderante. Por conseguinte, a eficiência de
remoção de poluentes dos sistemas com biomassa imobilizada pode atingir índices
mais expressivos do que os obtidos com p rocessos tradicionais.
Outro ponto positivo do siste1na MBBR é que, para o t rata1nento de um
dado volume de água residuária, a dimensão deste sistema pode ser menor que
a requerida por um processo convencional de lodo ativado e, como já ressaltado,
não há necessidade de um tanque te rciário de sedimentação, nem tampouco de
lavagens pe riódicas. Além disso, reatores já existentes podem ser equipados e
adaptados para a configuração MBBR com n1odificações relativamente pequenas
(SALVETTI et alii, 2006).
Como qualquer processo, o reator MBBR apresenta algumas desvantagens.
Entre elas, encontram-se os custos operacionais relativamente altos, especialmen-
te no que tange ao critério consumo de energia. Em adição, a necessidade de dis-
positivos que propiciem aeração adequada e a movimentação dos suportes móveis,
contribui para o encarecimento do processo.
A tecnologia MBBR pode ser aplicada em sistemas aeróbios, anóxicos ou
anaeróbios. A figura 3 .2 ilustra as configurações possíveis.
Peneira
•-
•
.
mm,
..
•• ~
11!,LUf • •
•• 1e •
Ar o o
--,.. --t:::=::=::::::::::::!=::::::=::::::=~::.J
(a) Reator aeróbio (b) Reator anóxico ou anaeróbio
FIGURA 3.2 Funcionamento das variantes do processo MBBR (adaptado de RUSTEN et alii, 2006).
Nos sistemas aeróbios, a própria aeração é responsável pela movimentação

dos suportes. Dessa forma, os aeradores desempenham dupla função, isto é, são
responsáveis pela oxigenação dos micro-organismos degradadores e pela manuten-
ção dos suportes em movimento no meio reacional. Por conseguinte, maior aporte
de ar se faz necessário, o que contribui para o aumento dos custos de operação,
notadamente no que tange ao critério de energia.Já em sistemas anóxicos/anaeró-
bios, faz-se necessário um dispositivo de agitação mecânica para desempenhar tal
função . O projeto adequado dos aeradores, no caso dos sistemas aeróbios, é de fun-
damental importância para o melhor dese1npenho do processo MBBR (RUSTEN
et alii, 2006; 0DEGAARD et alii, 1994). A representação dos suportes 1nóveis
em movimento no interior de um reator aeróbio de leito móvel com biofilme de
escala laboratorial está ilustrada na figura 3 .3 .
A representação esquemática de uma das possíveis configurações de sistemas
MBBR, em escala industrial, pode ser observada na figura 3 .4. Observa-se que a
aeração é realizada por meio de tubos inox perfurados colocados na base do reator.
Esse tipo de sistema de aeração é o mais utilizado em reatores operados em escala
industrial, uma vez que, além de propiciar adequada movimentação dos suportes
móveis no interior do reator, per1nite boas condições de transferência de oxigênio
para o meio líquido.
A figura 3 .5 apresenta fotos ilustrativas de sistemas MBBR em escala in-
dustrial de tratamento. Em relação à configuração representada na figura 3 .Sa,
pode-se observar um único tanque de grande dimensão, provavehnente destina-
do à remoção de matéria orgânica. A ocorrência de nitrificação neste reator, em
particular, vai depender de diversos fatores, entre eles a concentração de material
orgânico do afluente e o tempo de residência hidráulico (TRH). Caso este último
parâmetro apresente valores muito baixos, o desenvolvimento de bactérias n it ri-
ficantes fica comprometido, especialmente se a concentração de material orgâni-
co for elevada. Nestas condições, ocorre somente o desenvolvimento de bactérias
heterotróficas, as quais apresentam velocidades de crescimento muito superior

àquelas apresentadas pelo consórcio autotrófico responsável pela nitrificação. Em
contrapartida, sistemas caracterizados por aeração prolongada, com altos valores
de TRH, podem propiciar a ocorrência do processo nitrificante, uma vez que se
dispõe de tempo suficiente para a remoção do material orgânico, permitindo o
acondicionamento de bactérias quimiolitoautotróficas atuantes na nitrificação.
FIGURA 3.3 Foto ilustrativa dos suportes em movimento no interior de um MBBR aeróbio de
escala laboratorial.
FIGURA 3.4 Representação esquemática de uma das possíveis configurações de MBBR (Fonte:
adaptado de http://www.cleanwatertech.com/mbbr.html).
(a) Configuração com único tanque (b) Configuração com tanques em série
(c) Único tanque mostrando em detalhes o (d) Simples estágio

suporte móvel (biomedia)
FIGURA 3.5 Fotos ilustrativas de reatores de leito móvel com biofilme em escala industrial
(Cortesia Veolia).
Para contornar o problema existente na configuração com único tanque, po-

de-se trabalhar em processos multiestágios, dividindo o tanque reacional em se-
ções de modo a criar reatores em série, conforme mostrado na figura 3 .Sb. Nesta
configuração, a remoção de matéria orgânica é realizada nos primeiros tanques,
onde a concentração de material orgânico é maior. Nos últimos tanques da série,
pode-se realizar a nitrificação uma vez que grande parte do n1aterial orgânico já
foi metabolizado nos reatores anteriores. O sistema de aeração, normalmente re-
presentado por tubos inox perfurados, localizados na base do reator, está ilustrado
na figura 3.6.
Em sistemas que requerem condições anóxicas, os aeradores são substituídos
por agitadores mecânicos, responsáveis pela movimentação dos suportes móveis
no reator. A figura 3 . 7 ilustra alguns tipos de agitadores utilizados em sisten1as
de escala industrial.
CAPÍTULO 3 ◊ REATOR DE LEITO MÓVEL COM BIOFILME / MOVING BED BIOFILM REACTOR - MBBR 51
FIGURA 3.6 Sistemas de aeração util izados em sistemas MBBR (Cortesia Veolia).
FIGURA 3.7 Diferentes agitadores utilizados em sistemas MBBR de escala industrial (Cortesia
Veolia).
Um dispositivo, usualmente chamado de peneira, é instalado na saída do

reator, impedindo que os suportes saiam do mesmo (RUSTEN et alii, 2006). O
projeto das peneiras deve ser realizado de forma apropriada não somente para
reter os suportes mas também para evitar problemas hidrodinâmicas. A figura
3.8 apresenta algumas configurações de peneiras utilizadas no âmbito industrial.
-==-
(a) Peneira cilíndrica montada horizontalmente (b) Peneira sob a forma de malha
-
(c) Peneira cilíndrica montada verticalmente (d) Peneira cilíndrica fixada na parede do
reator pela sua porção central
FIGURA 3.8 Configurações distintas de peneiras utilizadas em sistemas MBBR em escala

industrial (Cortesia Veolia).
De forma resumida, a tabela 3 .1 sumariza algumas das principais vantagens

e desvantagens oferecidas pela tecnologia MBBR.
CAPÍTULO 3 ◊ REATOR DE LEITO MÓVELCOM BIOFILME / MOVING BED BIOFILM REACTOR - MBBR 53
TABELA 3.1 Principais vantagens e desvantagens apresentadas pelos reatores de leito móvel
com biofilme (MBBR)
Vantagens Desvantagens
Pode ser aplicado em estações de tratamento Alto gasto energético com aeração, a qual é
já existentes, sendo muitas vezes utilizada responsável não somente pelo suprimento de
para melhorar o desempenho destas estações oxigênio para o consórcio microbiano, mas
também pela movimentação dos suportes no
interior do reator
Diferentemente do processo convencional de Caso o sistema não seja bem projetado,
lodos ativados, não necessita da etapa de podem ocorrer problemas de natureza
reciclo de lodo, visto que a biomassa cresce hidrodinâmica, como a formação de regiões
aderida a suportes móveis estagnadas
Permite a redução do custo de implantação, O investimento inicial na construção do reator

justamente por dispensar etapas existentes e principalmente na aquisição de suportes
nos processos convencionais móveis (biomedias) patenteados, muitas vezes
dificulta a sua implantação
Contrariamente aos reatores de leito fixo, não
há colmatação do leito, o que dispensa ciclos
de limpeza
Possibilidade de se utilizar sistemas reduzidos

e compactos, além de dispor de grande
flexibilidade
Menor sensibilidade a choques de carga

orgânica e hidráulica
O biofilme aderido aos suportes é mais
resistente a variações na composição do
afluente, choques de carga, pH , temperatura e
toxicidade
3.3 SUPORTES UTILIZADOS NOS SISTEMAS MBBR

Os suportes n1ais utilizados têm sido desenvolvidos pela empresa deten-
tora do processo MBBR, AnoxKaldnes®. Feitos de polietileno com densidade
de O, 9 5 g/cm3 , possuem diferentes diâmetros e alturas, geralmente apresentando
uma cruz no interior que os divide em setores circulares e aletas longitudinais na
sua superfície externa (SALVETTI et alii, 2006; RUSTEN et alii, 1998). Os su-
portes móveis, també1n denominados de biomedias, apresentam-se sob diversos ti-
pos. A tabela 3 .2 apresenta as características de alguns suportes. Vale lembrar que
está descrita somente a área superficial efetiva para adesão de biofiln1e de cada tipo
de suporte, visto que a biomassa cresce majoritariamente na superfície protegida,
inserida dentro dos suportes. A área superficial total transcende enormemente a
54 PROCESSOS BIOLÓGICOSAVANÇADOS
área superficial efetiva de biofilme (RUSTEN et alii, 2006 ; 0 DEGAARD et alii,

1994). A figura 3.9 ilustra alguns dos suportes descritos na t abela 3 .2 .
Tabela 3.2 Características de alguns suportes AnoxKaldnes18 (adaptado de RUSTEN et alii, 2006
e http://www.anoxkaldnes.com)
Tipo de suporte
AnoxKaldnes®
Natrix Natrix BiofilmChip BiofilmChip
K1 K2 K3 p
C2 F3 M
Diâmetro nominal 9,1 15 25 36 64 48 45
(mm)
Comprimento 7,2 15 12 30 50 2,2 3,0
nominal (mm)
Densidade aparente 150 95 100
- - - -
(kg/m3)
'
Area específica 500 350 500 220 200 1 200 900
superficial (m 2/ m3)'
Área específica 300 210 300 132 132 720 540

superficial a 60%
enchimento (m 2/ m3)""
* Área total teoricamente disponível para adesão microbiana/volume do reator, completamente

preenchido com o suporte (leito fixo)
** Área total teoricamente disponível para adesão microbiana (60% leito)/volume do reator
Fonte: Adaptado de Rusten et alii, 2006.
K1 K3 BiofilmChip P BiofilmChip M
FIGURA 3.9 Suportes AnoxKaldnes® empregados no sistema MBBR. Da esquerda para a direita,
os tipos K1 , K2, K3, BiofilmChip P e BiofilmChip M (Cortesia Veolia).
A comparação entre as diferentes áreas específicas dos suportes Kaldnes®

mencionados anteriormente está ilustrada na figura 3 .10 .
;;
ü eoo
'E
t ,40()
~" 200
o
K1 K3 Naulx C2 Naullc F3 Ctlp M Chip P
FIGURA 3.1 O Áreas superficiais referentes aos suportes Kaldnes®.
É válido ressaltar que um inconveniente dos suportes AnoxKaldnes®é apre-

sença da seção reta na base e no topo dos mesmos. Com relativa frequência, a
seção reta do suporte pode tocar a parede do reator e nela ficar retido, acabando
por prejudicar a hidrodinâmica do sistema. A figura 3 .11 ilustra a ocorrência des-
sa situação em um reator de bancada, confeccionado em acrílico. Em reatores de
dimensões muito maiores, operados em escala industrial, esse problema pode ser
mais crítico, com provável surgimento de zonas estagnadas no interior do reator.
FIGURA 3.11 Retenção dos suportes em uma das paredes laterais de um MBBR de escala
laboratorial (REIS, 2007).
Suportes de formato esférico, como o desenvolvido por Wang et alii (2006),

praticamente eliminam esse problema. Outro ponto positivo é que estes suportes
permite1n que se opere o reator com altas razões de preenchimento com os supor-
tes (V5/V R), fator este que será discutido no item 4.1. Em contrapartida, a área
específica de adesão oferecida por este suporte é de apenas 192 m 2/m3 , valor este
muito inferior aos apresentados pelos suportes da AnoxKaldnes®.
Recente1nente, uma grande variedade de supo rtes vem sendo desenvolvida
por diversas empresas, as quais sempre estão voltadas ao aperfeiçoan1ento desses
materiais de forma a propiciar o melhor rendimento possível quando aplicados em
sistemas reais de tratamento. De todos os suportes disponíveis con1ercialmente,
os supo rtes AnoxKaldnes®apresentam uma vantagem relevante frente aos den1ais,
até mesmo pelo fato de esta companhia ter sido a precursora do processo MBBR.
Embora apresente algumas limitações, como todos os outros, estes suportes são
capazes de se adaptar a diferentes configurações de reatores e a dife rentes classes
de efluentes, uma vez que são produzidos nas mais diferentes formas e tamanhos.
Vale ressaltar que a aquisição do material suporte (biomedias) representa
um dos p rincipais entraves na instalação de plantas com a tecnologia MBBR,
tendo em vista seu custo consideravelmente elevado, al iado ao fato de que suas
fabricação e comercialização sejam realizadas por poucas empresas. Tal fato tem
contribuído para que outras empresas e instituições ganhem interesse pelo pro-
cesso MBBR, de forma a desenvolver seus p róprios suportes para aplicação dessa
tecnologia.
3.4 ASPECTOS OPERACIONAIS
3.4.1 RAZÃO DE RECHEIO (V/VJ OU FRAÇÃO DE ENCHIMENTO (%)

,
E bastante comum referir-se à quantidade de suporte adicionada ao reator
como uma fração de enchimento com estes suportes (razão entre o volume ocupa-
do pelos suportes (leito estático) e o volume total do reato r - VsfVR), que muitas
vezes é denominada simplesmente de razão de recheio.
Uma vantagem do sistema MBBR é que esta fração de enchimento pode ser
alterada conforme desejado, embora seja1n recomendadas frações de enchimento
n1enores que 70% de modo a permitir condições adequadas de mistura e propiciar
boa movimentação dos suportes, evitando problemas relacionados à hidrodinâmi-
ca (RUSTEN et alii, 2006; SA.L VETTI et alii, 2006). Segundo Sokól (2003),
a razão V5/VR recomendada é de 0,55 . Alguns trabalhos mostram, no entanto,
que MBBRs pode1n ser operados com razões de recheio maiores (0,6 e até 0,7).
Entretanto, como já apontado, altas frações de enchin1ento podem prejudicar a
hidrodinâmica do reator, que por sua vez apresenta efeito decisivo na espessura do
biofilme e consequentemente no desempenho do processo.
Un1 ponto interessante a ser destacado é que, para saber a quantidade ade-
quada de suportes que se deve introduzir no tanque de aeração, é necessário que se
conheça a superfície específica disponível para o crescimento microbiano, a qual
está condicionada ao tamanho e ao desenho do suporte. Tendo em vista que, tanto
a razão de recheio (V /V R), em termos de volu1ne do tanque de aeração, quanto a
superfície específica de cada suporte determinam a área disponível para adesão do
biofilme, caso a planta de tratamento necessite maior capacidade em virtude do
aumento da carga, pode-se adicionar mais suportes móveis ao reator, aumentando
dessa maneira a área superficial disponível para adesão microbiana (RUSTEN et
alii, 1995). Se a área específica de leito do suporte for de SOO m 2/m3 e a fração
de enchimento for de 50%, a área supe rficial disponível para o crescimento do
biofiln1e é de 250 m 2/m 3 do reator (SALVETTI et alii, 2006) .
3.4.2 HIDRODINÃMICA DO MBBR

De maneira similar a qualquer processo com biofilme, a difusão dos compos-
tos para dentro e para fora do biofihne tem papel relevante no sistema MBBR,
particularmente devido ao fato de que a t ransferência de 1nassa envolvida em
tais sistemas está diretamente vinculada a efeitos difusivos (RUSTEN et alii,
2006) . Na verdade, a maioria das características atribuídas ao crescimento mi-
crobiano em biofilmes pode ser explicada po r meio de fenô1nenos de transferência
(STEWART, 2003) .
Em sistemas com biomassa em suspensão, o transporte de solutos do meio
líquido para a célula é um p rocesso relativamente rápido, não consistindo na
etapa lin1itante do bioprocesso que ocorre na célula. Em contrapartida, agrega-
dos microbianos presentes nos biofilmes são ambientes densamente empacotados,
onde o fluxo de líquido é limitado (STEWART, 2003). Em agregados microbianos
relativamente espessos, as distâncias difusionais são suficientemente grandes para
que o transporte de solutos e1n direção ao interior das células microbianas se torne
lento quando comparado às cinéticas de biodegradação. Diante dessas circunstân-
cias, a possibilidade de que gradientes de concentração de solutos possam vir a se
estabelecer no biofilme é um fato a se r conside rado (XAVIE R et alii, 2003) .
Sendo assim, a espessura efetiva de biofiln1e, que designa a profundidade do
biofilme na qual os substratos penetram, possui grande relevância. Uma vez que
esta profundidade deve ser meno r que 100 µ,m para que a penetração de substrato
seja completa, o biofilme ideal precisa ter u1na espessura fina e estar distribuído
uniformemente na superfície interna do suporte. Para atingir tais características,
a turbulência no reator juntamente com a ação das forças de cisalhamento por
ela originadas é de fundamental importância, tanto no transporte dos substratos

para o biofilme quanto na manutenção de um biofilme pouco espesso (RUSTEN
et alii, 2006).
O movimento caótico dos suportes no biorreator, ocasionado pela turbulên-
cia advinda do fluxo de ar, permite que ocorra um desprendimento natural do
biofilme, fazendo com que ocorra uma renovação em sua composição. Em outras
palavras, as bactérias mortas se desprenden1, cedendo lugar para que o suporte
seja colonizado por novas bactérias. Diante de tais circunstâncias, enfatiza-se a
importância de se assegurar boas condições hidrodinâmicas, as quais não se refe-
rem única e exclusivan1ente ao modelo de mistura da fase líquida (n1istura perfeita
ou não), mas também ao campo de velocidades no interior do reator, à ocorrência
de segregação do suporte e ao surgimento de zonas estagnadas.
Em se tratando do modelo de 1nistura da fase líquida, é bastante usual a
realização de testes hidrodinân1icos preliminares para determinar se o biorreator
apresenta ou não comportamento de mistura perfeita. Esses ensaios, normal-
mente realizados com auxílio de traçadores (NaCl, por exemplo), são do tipo
estímulo-resposta, isto é, uma quantidade conhecida do traçador é adicionada
junto ao afluente do biorreator no início do ensaio. A adição de traçador pode
ser realizada de forma instantânea (adiciona-se pequeno volume da solução de
traçador, em intervalo de tempo muito curto) ou de forma contínua (alimenta-se o
reato r durante um período de tempo equivalente a pelos menos três vezes o tempo
de residência hidráulico). Em seguida, mede-se continuamente ou em intervalos
de tempo predeterminados, a concentração de traçador no efluente, isto é, na
saída do reator. Dessa forma, é conhecida a massa total de traçador adicionada e
sua concentração inicial . Como resposta, é obtida a concentração de traçador no
efluente em função do tempo transcorrido desde o início do ensaio. Assim, pode-se
efetuar uma comparação entre as curvas de distribuição de tempos de residência
obtidas durante os ensaios hidrodinâmicos utilizando traçador salino e as curvas
referentes ao modelo de 1nistura perfeita.
No caso do MBBR, en1 particular, esses testes prelin1inares podem ser inicia-
dos com o reator apresentando certa fração de enchimento com os suportes e, em
seguida, esta fração pode ser gradativamente aumentada para observar se existe al-
guma percentagem de recheio na qual o reator deixe de apresentar co1nportamento
ideal. Caso exista, tal percentual de enchimento deve ser evitado para impedir
gradientes de concentração e para não prejudicar o comportamento hidráulico do
reator.
Um dos fatores que pode afetar substancialmente a hidrodinâmica do biorrea-
tor é o aumento de escala (scale up) . Apesar de a fase líquida apresentar costun1ei-
ramente con1portamento de mistura perfeita, em grande parte devido às vazões de
ar relativamente elevadas que são empregadas, a turbulência e a decorrente pos-
sibilidade de choques entre as partículas pode apresentar diferentes intensidades
em escalas distintas. De qualquer modo, independente da escala em que se está

operando o reator (escala laboratorial, piloto ou real), quanto mais intensa for a
turbulência aplicada ao sistema, maior será o desprendimento do biofilme, o que
leva a um aumento da concentração de sólidos em suspensão na fase líquida.
Tavares et alii (1995), operando um sistema de leito fluidizado trifásico,
verificaram que a velocidade superficial do ar influenciou no acúmulo de biofilme
em um suporte polimérico esférico de 2, 7 mm de diâmetro e densidade equivalen-
te a 1 180 kwm3 • Empregando efluente sintético e aplicando uma carga orgânica
de 8 kgDQO/(m3 • d), verificaram que o acún1ulo de biofilme no suporte decresceu
com o aumento da velocidade do ar, que variou na faixa de 0-20 m/h, embora a
eficiência de remoção de DQO não tenha diminuído. Provavelmente, com a apli-
cação das maiores velocidades de ar houve maior desprendimento do biofilme com
consequente aumento da concentração de sólidos em suspensão.
3.4.3 OXIGENIO DISSOLVIDO
O oxigênio dissolvido consiste em uma variável limitante dos processos bio-

lógicos de tratamento. Geralmente adota-se a concentração de 2 mgfL como sendo
a mínima concentração necessária para se operar reatores biológicos destinados
à remoção de material orgânico (METCALF e EDDY, 1991). O fato é que siste-
mas com biofilme, em particular, podem requerer maior concentração de oxigênio
dissolvido, justamente devido às questões de limitação difusiva inerente a esses
processos, conforme já abordado no item anterior (3.4.2) .
A biomassa dos sistemas com biofilme é bastru1te ativa e com grande diversi-
dade microbiana, podendo ocorrer intenso crescimento do biofilme e presença de
flocos em suspensão. No caso particular dos reatores de leito móvel com biofilme,
o fornecimento de oxigênio por borbulhamento de ar é responsável não somente
por fornecer oxigênio para metabolização aeróbia dos poluentes, mas também pela
n1ru1utenção dos suportes em suspensão. Diante de tal conjuntura, é bastante fre-
quente que a taxa de ar empregada nos sistemas MBBR para manter o suporte em
suspensão seja muito superior à requerida para a biodegradação aeróbia dos cons-
t ituintes orgânicos. Levando-se em consideração a dupla função da aeração nesses
reatores, o projeto dos aeradores deve ser realizado de tal maneira que as bolhas de
ar por eles geradas não sejam muitos grandes, o que levaria à queda substancial do
coeficiente de transferência de oxigênio (kLa), tampouco muito pequenas, uma vez
que, embora favoreçam o transporte de oxigênio do meio difusor para o meio líqui-
do, apresentam a desvantagem de não propiciarem boa movimentação dos suportes.
Diante de tais fatos, é conveniente que sejam determinadas as melhores con-
dições de fornecimento de ar, o que envolve não somente a questão do projeto dos
aeradores, mas também a configuração do reator, justamente para se atingir um
ponto ótimo de operação (boa transferência de oxigênio para o meio líquido e ade-
quada movimentação dos suportes) e para impedir a desagregação dos biofilmes e
a possível liberação de sólidos e filamentos para a fase líquida, o que certamente
refletiria negativamente nos índices de eficiência do biorreator.
3.4.4 FORMAÇÃO DO BIOFILME NOS SUPORTES MOVEIS DO MBBR
É bastante peculiar o modo como o biofilme vai sendo formado no MBBR,

isto é, a forma como a biomassa vai fixando-se aos suportes móveis (biomedias) .
No início, o p rocesso de fo rmação do biofil me é bastante lento, sobretudo quando
a turbulência propiciada pela aeração é elevada, fator este que aumenta a taxa
de cisalhamento dificultando a fixação dos micro-organismos no meio suporte.
Geralmente, o start-up do processo é realizado com inóculo de uma cultura mista de
bactérias, muitas vezes proveniente de sistemas de lodos ativados que tenham um
bom desempenho e que não estejam impactados com instabilidades operacionais.
Co111 o decorrer do te111po de ope ração do biorreator, a biomassa vai se adap-
tando paulatinamente às condições impostas, sobretudo no que se refere a nature-
za do efluente a ser tratado. Algumas vezes, em virtude da grande heterogeneidade
de substâncias presentes no efluente e de suas possíveis características recalcitran-
tes ou inibitórias, o desenvolvimento da biomassa aderida às biomedias torna-se
dificultoso, fato este diretamente vinculado aos efeitos nocivos destas substâncias
sobre os sensíveis processos biológicos.
Em geral, o biofilme formado nos suportes de MBBR destinados à remoção
de maté ria orgânica é n1ais espesso do que o biofilme fo rmado em ,
sistemas volta-
dos para a remoção de nitrogênio (nitrificação/desnitrificação). E fácil compreen-
der tal assertiva, justamente pelo fato de que, nos primeiros sistemas, o teor de
matéria orgânica e a quantidade de micro-organismos são bastante superiores em
comparação com os sistemas nitrificante$/'desnitrificantes. Além disso, acrescen-
ta-se o fato de que as bactérias autotróficas nitrificantes são bastante sensíveis a
alterações do meio. Desse modo, a ocorrência de problemas durante a operação dos
sistemas nitrificantes, em particular, pode acarretar em consequências irreversí-
veis, até mesmo com perda substancial do biofilme.
No caso de reatores com biofilme onde ocorre simultaneamente a remoção de
matéria orgânica e a nitrificação, além da competição por substrato, as bactérias
heterotróficas e nitrificantes competem por espaço, gerando uma estratificação na
estrutura do biofilme. O crescin1ento n1ais rápido das bactérias hete rotróficas faz
com que esse conjunto microbiano fique localizado nas can1adas mais externas do
biofilme, onde a concentração de substrato e o desprendimento da biomassa são
maiores, enquanto as bactérias nitrificantes ficam localizadas nas camadas mais
profundas do biofilme. Desta forma, un1a camada heterotrófica pode se formar
sobre a população nitrificante, o que constituiu uma desvantagem a essa última,

especialmente quando a concentração de oxigênio dissolvido (OD) no meio líquido
é pequena. Essa limitação de OD, que é resultado do consumo e da resistência
à transferência de massa através da camada heterotrófica, afeta negativamente o
desen1penho da nitrificação. Em contrapartida, se a concentração de OD é gran-
de o suficiente para se sobrepor às limitações difusivas no biofilme, a camada
heterotrófica pode ter um efeito posit ivo no consórcio microbiano nitrificante,
protegendo-o do desprendimento (FURUMAI & RITTMAN, 1994).
Vale lembrar que a presença concomitante de bactérias heterotróficas e au-
totróficas nitrificantes prejudica o desenvolvimento deste último grupo . O en-
riquecimento do sistema com bactérias au totróficas torna-se dificultoso, tendo
em vista as baixíssimas velocidades de crescimento celular apresentadas por esse
grupo microbiano em comparação com as heterotróficas. Uma alternativa seria a
separação da biomassa heterotrófica da autotrófica, desenvolvendo a nitrificação
a nível terciário de tratamento, buscando se obter maior atividade das bactérias
nitrificantes.
A figura 3 .12 apresenta diversos tipos de suporte AnoxKaldnes®empregados
na operação de MBBRs, contendo biofilme aderido.
Visão frontal: K1 Visão frontal: Biofil m-Chip P Visão lateral: K1

FIGURA 3.12 Diferentes tipos de suporte AnoxKaldnes®com biofil me aderido. (Fonte: http://www.
anoxkaldnes.com/Eng/c1 prodc1 /mbbr.htm).
Fonte: Cortesia Veolia.
A figura 3 .1 3 ilustra os detalhes de suportes móveis AMB® e Kaldnes K3

com e sem biomassa aderida, provenientes de reatores de leito móvel com biofilme
submetidos a baixas cargas orgânicas e voltados à nitrificação.
(a) (b)
(c) (d)
FIGURA 3.13 Detalhe dos suportes móveis (biomedia) AMB® (a) e Kaldnes K3 (e) desprovidos de
biomassa e dos suportes AMB® (b) e Kaldnes K3 (d) contendo a biomassa imobilizada (biofilme) ,
ambos retirados de sistemas MBBR voltados à nitrificação.
Como se pode observar a partir da figura 3 .13b, o biofilme aderido é relati-

vamente fino, o que, como já ressaltado, é característico de sistemas voltados à
nitrificação. No item 3.5 .3 serão mostradas microfotografias do biofilme obtidas
por meio de microscopia óptica e microscopia eletrônica.
3.4.5 SUBSTANCIAS POLIM~RICAS EXTRACELULARES (EXOPOLIMEROS)
As substâncias poliméricas extracelulares (EPS), produzidas pelos próprios

micro-organismos, apresentam funções importantes no funcionamento do pro-
cesso biológico. No que se refere ao processo de lodos ativados, os exopolímeros
são responsáveis pela estabilidade mecânica dos flocos (DAVIES et alii, 1998). Já
nos processos com biomassa imobilizada, a adesão microbiana aos suportes ocorre
co1n intensa part icipação de E PS, sobretudo de polissacarídeos (CAMMAROTA e
SANT'ANNA, 1998). Neste último caso, os exopolín1eros funcionam como ver-
dadeiros agentes de cimentação ("cola"), auxiliando a fixação dos micro-organis-
mos ao meio suporte e entre si .
Há, no entanto, situações onde a concentração de EPS é tão elevada que pode
acarretar problemas operacionais. As substâncias exopoliméricas interferem no
valor da DQO bruta, além de contribuir para aumentar a turbidez do efluente
t ratado. Com isso, a qual idade do efluente fi nal é p rejudicada. Muitas vezes, no
intuito de ren1over o excesso de exopolímeros excretados pelos micro-organismos,
torna-se necessário o acoplamento de uma etapa físico-química, como coagulação/
floculação, ao processo biológico. Obviamente que esta solução não é muito apre-
ciada, uma vez que contribui no encarecimento do custo global de tratamento.
Reis (2007), operando um MBBR submetido a altas cargas orgânicas (4,4 a
8 ,6 k.gDQ0/(m 3 • d)), verificou elevada produção de polissacarídeos.
São dive rsos os estudos que demonstram estar inclusos diversos mate riais na
categoria de polissacarídeos extracelulares. Entre esses se encontram proteínas,
lipídeos e ácidos nucleicos (FR0LUND et alii, 1996). A complexidade da ma-
triz de exopolímeros dificulta a sua caracterização e requer não somente algumas
etapas preliminares de extração e coleta desses exopolissacarídeos, mas também
procedimentos analíticos bem definidos.
A complexidade das características dos biofil mes, conforme se observa na
literatura, está vinculada a diversos fatores, entre os quais estão a natureza dos
substratos, a diversidade das espécies microbianas presentes no processo e as
características do material supo rte (FLEMMI NG e WINGLINDER, 2001 ). É
necessário salientar que, embora n1uitas pesquisas tenham sido realizadas, não
há conhecimento consolidado sobre os processos com biofilme. O que se tem na
verdade é um grande número de variáveis a serem exploradas, sempre se buscan-
do maior compreensão a respeito destes processos. O mesmo acontece no que se
refere à composição das substâncias exopoliméricas que, em virtude de sua com-
plexidade, vem sendo motivo de estudo para diversos pesquisadores. O estudo da
produção destes exopolímeros e de suas forn1as de caracterização dota-se de funda-
mental importância quando se pretende aprofundar o entendimento dos processos
que ocorrem no biofilme.
A caracterização das substâncias poliméricas extracelulares de sistemas bioló-
gicos de tratamento de efluentes mostra uma variação considerável da composição
e da quantidade de substâncias. Estas variações podem se r atribuídas às diferentes
respostas obtidas nos n1étodos de extração dessas substâncias dos flocos 1nicro-
bianos e biofilmes, e aos diferentes métodos analíticos usados para quantificar as
diferentes frações (FR0LUND et alii, 1996) .
Em particular, a influência dos métodos de extração sobre a composição dos

exopolímeros é marcante, como evidenciam vários resultados da literatura. Assim,
quando se faz con1parações de con1posição de sistemas diferentes é in1portante ter
em mente que métodos distintos poden1 levar a resultados muito diferenciados.
É sempre importante enfatizar que os métodos analíticos utilizados nestas
determinações podem levar a resultados diferentes quanto à recuperação de subs-
tâncias poliméricas extracelulares. Para exemplificar esta afirmação, tem-se como
exemplo o trabalho desenvolvido por FrÇ21l und et alii (199 6) . Estes autores, ava-
liando diferentes métodos para quantificação de proteínas, obtiveram, pelo méto-
do de Lowry (LOWRY et alii, 1951 ), concentração quase cinco vezes superior à
determinada pelo método de Bradford (BRADFORD, 1976). Em geral, o método
de Bradford é normalmente mais recomendado do que o método de Lovvry, tendo
em vista que apresenta maior sensibilidade, além do fato de que é menos sujeito à
interferência de outros componentes (DANIELS et alii, 1994).
3.5 APLICAÇÕES DO MBBR

O reator de leito móvel com biofil me (MBBR) tem sido aplicado no t rata-
mento de efluentes para remoções de materiais orgânicos, nitrogênio (nitrificação/
desnitrificação) e eventualmente fósforo . Quando há imposição restritiva da le-
gislação ambiental aos limites de descarte deste último elemento, como oco rre na
Europa, o MBBR se apresenta como alternativa interessante quando combinado
co1n processos físico-químicos, a exemplo da precipitação química.
3.5.1 APLICAÇÕES 00 MBBR NA REMOÇÃO OE MAT~RIA ORGÃNICA
Os trabalhos relacionados à remoção de material orgânico, em geral, têm

buscado as melhores condições para adaptar o processo convencional de lodos
ativados à configuração MBBR ou ainda combinar esses e outros p rocessos no
intuito de melhorar o desempenho de unidades de tratan1ento biológico já existen-
tes. A aplicação da tecnologia MBBR agregada a sistemas de lodos ativados ajuda
a absorver oscilações e choques de cargas nas correntes de alimentação, evitando
danos ao consórcio microbiano atuante no sistema biológico. Em processos opera-
dos com altas taxas, pode-se utilizar o MBBR como etapa posterior ao tratamento
biológico, juntamente com o processo de coagulação/floculação. Nesses casos, o
tempo de residência hidráulico fica abaixo de 1 hora (0 DEGAARD et alii, 2004).
Nas figuras 3 .1 4, 3 .15 , 3 .16 e 3 .1 7 estão ilustradas algun1as possibilidades
das combinações ressaltadas anteriormente. Particularmente no que se refere à
figura 3 .14, o número de reatores em série necessários vai depender do pré-trata-
mento e das características do afluente do processo.
CAPÍTULO 3 ◊ REATOR DE LEITOMÓVELCOM BIOFILME / MOVING BED BIOFILM REACTOR - MBBR 65
Coag/Floc
.. T lo ..
FIGURA 3.14 MBBR seguido de decantador (retirada de biomassa) , com inclusão de uma etapa
físico-química (coagulação/floculação) para quando se deseja remover fósforo (adaptado de
0DEGAARD, 2006).
Coag/Floc
.. ..
FIGURA 3.15 MBBR para sistemas com altas cargas orgânicas seguido de coagulação/floculação e
separação da biomassa (adaptado de 0DEGAARD, 2006).
FIGURA 3.16 MBBR aplicado como pré-tratamento para o sistema de lodos ativados de plantas
existentes, buscando aumentar a capacidade da unidade ou melhorar a eficiência do processo
(adaptado de 0DEGAARD, 2006).
li li
FIGURA 3.17 Combinação do processo de lodos ativados e do sistema MBBR onde o suporte
é colocado na última parte do reator objetivando aumentar a eficiência de remoção de poluentes
(adaptado de 0DEGAARD, 2006).
A introdução dos suportes na parte terminal do tanque de aeração, como

mostrado na figura 3 .1 7, visa obter maior área superficial para o desenvolvimen-
to da biomassa. Desta forma, neste espaço destinado ao reator de leito móvel, a
atividade biológica será mais intensa do que a configuração sem a inclusão dos
suportes, embora o volume total do reator tenha permanecido inalterado. Em
consequência, a capacidade de remoção da carga orgânica e da carga nit rogenada se
torna maior. A aplicação dessa configuração é oportuna e vai de encontro à realida-
de de inúmeras estações de tratamento existentes no país, as quais se encontram
sobrecarregadas e carecem de espaço físico para ampliação . Obviamente que neste
sistema híbrido (lodos ativados + MBBR) devem ser asseguradas condições que
permitam que os suportes sejam retidos no tanque de aeração (instalação de pe-
neira na saída) e que mantenham estes suportes em suspensão sem ocorrência de
zonas estagnadas (uso de aeradores que propiciem alta vazão de ar).
Nos casos onde se opta pela combinação da tecnologia MBBR com o processo
de lodos ativados no mesmo tanque de aeração, a nitrificação é favorecida, uma
vez que, além de ser possível controlar o tempo de retenção de sólidos, são for-
n1ados n1úl tiplos an1bientes para o enriquecimento de bactérias especializadas em
diversos aspectos do tratamento.
Vale lembrar que a tecnologia MBBR, além de poder ser acoplada ao sistema
convencional de lodos ativados, pode ser aplicada como pós-tratamento de lagoas,
funcionando neste caso como um polímento para remoção das substâncias nitro-
genadas, podendo igualmente prover a remoção da matéria orgânica residual.
Outra vertente dos reatores híbridos é a combinação da tecnologia MBBR
com os reatores operados em bateladas sequenciais (RBS), advindo dessa junção
o reator que responde pela sigla RBBS (reator com biofilme operado em bate-
ladas sequenciais). Este sistema híbrido vem sendo empregado no tratamento
de águas residuárias contendo elevadas concentrações de compostos orgânicos e
cargas flutuantes, garantindo maior estabilidade ao processo, uma vez que se con-
segue maior área superficial para o crescimento microbiano fixo, o que auxilia na
manutenção de alta concentração de biomassa no interior do reator.
Os sistemas RBBS, em particular, têm sido muito utilizados no tratamento
terciário de efluentes visando à ren1oção de nutrientes, co1no nitrogênio, uma vez
que, além de propiciar o desenvolvimento e a manutenção de bactérias de cresci-
mento lento, a exen1plo das bactérias nitrificantes, permite que coexistam fases ae-
róbias e anaeróbias/anóxicas no mesmo tanque, condição essa muito favorável para
uma operação sequencial na qual os processos passam a ser sequências no tempo .
A operação do RBBS é semelhante à do RBS, contando com fase de en-
chimento, reação (aeróbia ou anaeróbia/anóxica) e descarte do efluente tratado.
Nota-se que neste processo a tradicional fase de decantação do RBS não se faz
presente, o que se justifica pelo fato de que no RBBS a biomassa encontra-se
aderida aos suportes móveis (biomedias) . Esta condição é especial1nente relevante
em virtude do fato que não há perda de células como pode ocorrer em um RBS,
notadamente quando as condições de sedimentabilidade da biomassa suspensa
presente neste reator são desfavoráveis. De fo rma similar ao RBS, a duração das
fases é determinada a priori, sendo que o desempenho do reator, em termos de

eficiência de remoção de poluentes, pode ser intensificado quando se dispõe de
controladores automáticos que permitam o controle dos tempos relativos a cada
fase do processo .
As eficiências de remoção de matéria orgânica de esgotos sanitários em siste-
mas MBBR descritas na literatu ra são semelhantes às do p rocesso convencional
de lodos ativados, atingindo valores equivalentes a 95% (0 D EGAARD et alii,
1993, 1994). O desempenho do processo é diretamente dependente da disponibi-
lidade de material-supo rte e, consequentemente, da formação de biofilme .
É importante frisar que um dos parâmetros que apresenta maior influência
no desempenho de processos biológicos visando à remoção de material orgânico
é a carga volumétrica de alimentação. No caso da tecnologia MBBR , além da
influência da carga orgânica volumétrica, o desempenho do processo está ligado
à aplicação de adequada carga orgânica superficial, definida como a razão entre
a carga orgânica alimentada e a área superficial total advinda do meio suporte
(RUSTEN et alii, 1998). Esses parân1etros vão determinar a escolha do p rocesso
a ser util izado, seja aeróbio ou anaeróbio. Nos p rocessos aeróbios, a velocidade
de transferência de oxigênio para as células microbianas é um fator limitante,
que pode detenn inar a velocidade de conversão biológica. A disponibilidade de
oxigênio para os micro-organismos é dependente da sua solubilidade no meio, da
transfe rência de massa, bem como da velocidade com que o oxigênio dissolvido é
utilizado.
Os tempos de residência nos reatores MBBR para remoção de matéria or-
gânica são pequenos (15-90 min), dependendo, é claro, da carga orgânica apli-
cada. A matéria orgânica solúvel é rapidamente degradada e a matéria orgânica
particulada é parcialmente captu rada, sofrendo a seguir hidrólise e degradação
(0 DEGAARD, 2006) .
0 degaard et alii (2004), aval iando o desempenho de algumas plantas MBBR
destinadas ao tratamento de efluentes domésticos e industriais, observaram boa
remoção de n1atéria orgânica, mesmo quando as unidades foram subn1etidas a
altas cargas orgânicas e alimentadas com efluentes com altas concentrações de ma-
terial orgânico . O fluxo de ar, além de propiciar a manutenção da concentração de
oxigênio necessária para a biodegradação das altas cargas orgânicas aplicadas (em
torno de 3 mgOjL), foi também responsável por prevenir o acúmulo excessivo de
biomassa nos suportes, colaborando para a 1nanutenção de biofilmes fi nos.
Sistemas com biomassa em suspensão, como as lagoas aeradas de mistura
perfeita e o processo de lodos ativados, são os sistemas mais aplicados no t ra-
tamento de efluentes da indústria de celulose e papel. Em geral, esses sistemas
exigem grandes volumes, o que, consequentemente, exige grandes áreas para ins-
talação. Além disso, favorecem o cresciinento de flocos que, e1n função de suas
características, podem ser arrastados do biorreator, ocorrendo a lavagem das célu-

las (washout) . Essa perda de biomassa foi evidenciada no tratamento de efluentes
da indústria de papel (GUDLAUSKI, 1996) e em inún1eros outros sistemas de
tratamento de efluentes, principalmente aqueles que tratam efluentes industriais.
Neste contexto, tendo em vista os bons resultados obtidos durante a operação de
sistemas MBBR no tratamento de efluentes domésticos e de indústrias alimentícias
(0DEGAARD et alii, 1993 e RUSTEN et alii, 1992), Rusten et alii (1994)
avaliaram o desempenho desses reatores no tratamento de efluentes da indústria de
celulose e papel. Esses autores utilizaram quatro efluentes provenientes de indústrias
distintas, com DQO total na faixa de 360-1 250 mg/L. Em todos os casos, foi
utilizado o mesmo suporte cilíndrico de polietileno KMT® Kl, com área específica
de 350 m 2/m3, densidade na faixa de 0,92-0,96 g/cm3 e dimensões equivalentes a
1O mm de diâmetro e 7 mm de altura. As porcentagens de recheio 01/V R) foram
de 0,3 7 e 0,4 7 para os reatores anaeróbios e aeróbios, respectivamente. Foram
desenvolvidas diversas configurações, incluindo não son1ente a diferenciação entre
reatores aeróbios/anaeróbios, mas também o acoplamento de etapas físico-químicas
(coagulação/floculação), flotação e decantação.
Para o efluente com DQO total igual a 360 mg/L, foi testada a configuração
contendo três sistemas MBBR aeróbios, dispostos em série, seguidos por uma
etapa de coagulação/floculação. O tempo de retenção hidráulico conferido ao con-
junto de reatores foi de 40 minutos. No tratamento físico-químico, foram empre-
gados sulfato de alumínio (7% m/v) e cloreto férrico (3% m/v), e ainda 1 g/m3 de
polímero aniônico. A re1noção de DQO total, que era de 45% quando o tratamen-
to era realizado somente com os três reatores biológicos, passou para 78% com a
inserção da etapa físico-química de coagulação/floculação. Diante desses resulta-
dos, a empresa Stora Papyrus Gycksbo AB, da Suíça, implementou esse sistema de
t ratamento com investimentos na ordem de US$ 350.000.
Para o efluente con1 DQO de 5 50 n1g/L, foi testada configuração com três
MBBRs em série seguidos por coagulação/floculação e flotação. Neste caso, optou-se
por iniciar o tratamento com um reator anaeróbio buscando avaliar a sua capa-
cidade de ren1over con1postos clorados. O tempo de retenção hidrául ico foi de 28
minutos por reator, conferindo um TRH global de 1,4 horas. As cargas volumé-
tricas aplicadas variaram na faixa de 8 a 1O kg · DQO,!(m3 • d). Na etapa de coagu-
lação/floculação foi utilizado apenas polímero aniônico como floculante, na faixa
de concentração variando de 1,3 a 2,0 g/m3 • Os percentuais de remoção de DQO
total, de DQO solúvel e de compostos clorados foram de 50, 85-90 e 90%, respec-
tivamente. Adicionalmente, o efluente da unidade-piloto não apresentava nenhu-
ma turbidez, e1nbora sua toxicidade fosse elevada, notadamente em decorrência
dos con1postos químicos envolvidos, os quais, por sinal, se identificavam como
potenciais inibidores do processo biológico. Os resultados permitiram concluir
que grande parte da remoção da matéria orgânica foi obtida graças à incorporação
das etapas de coagulação/floculação e flotação, o que fez com que a empresa Stora
Cell Industri AB, de Skutskãr, na Suíça, continuasse os trabalhos investigativos,
sempre em busca de un1 processo que apresentasse 1nelhor desempenho.
Para o efluente com DQO equivalente a 1 250 mg!L, foi testada uma con-
figuração na qual foram dispostos três MBBRs aeróbios em série. O tempo de
retenção hidráulico para este conjunto variou de 0,9 a 1,9 horas. As cargas
volumétricas aplicadas variaram na faixa de 1 7 a 2 8 kgDQO/(n1 3 • d) e de 6 a
11 kgDB0 7/(m3 • d). O percentual de remoção de DQO foi baixo para a faixa
de TRH adotada, apresentando valores equivalentes a 28-38%. Estes baixos
índices de remoção foram atribuídos às altas cargas orgânicas aplicadas ao sis-
ten1a biológico. Para um TRH de 1,2 hora, a carga no primeiro reator foi de
7 5 kgDQO/ (m3 • d), enquanto para o conjunto formado pelos três reatores a car-
ga seria de um terço desse valor.
Reis (2007), aplicando cargas orgânicas na faixa de 4,4 a 8,6 kgDQO/(n13 ·d)
a um reator MBBR de escala de bancada, verificou eficiências globais de remoção
de matéria orgânica acima de 90%. Em adição, observou-se que a variação da car-
ga orgânica, na faixa investigada, não alterou o desempenho do reator.
3.5.2APLICAÇÕES DO MBBR NA REMOÇÃO DE NITROG[NIO (NITRIFICAÇÃO/DESNITRIFICAÇÃO)
Antes de iniciar a discussão referente às aplicações da tecnologia MBBR na

remoção de nitrogênio, dar-se-á uma breve descrição a respeito do processo con-
vencional re1noção de nitrogênio, constituído pelas etapas de nitrificação e desni-
trificação.
3.5.2.1Nitrificação
A nitrificação é entendida como a etapa limitante do processo convencional

de remoção de nitrogênio, sendo realizada pela ação de dois grupos de bactérias. O
primeiro grupo, responsável pela nitritação, isto é, a oxidação da amônia a nitrito,
pertence predominantemente ao gênero Nitrosomonas . Já o segundo grupo, perten-
cendo predo1ninantemente ao gênero Nitrobacter, promove a conversão do nitrito
em nitrato, etapa designada por nitratação (RAMALHO, 1983; METCALF e
EDDY, 1991). As etapas do processo nitrificante estão descritas nas equações 3 .1
a 3.3 (BENZE et alii, 1997, MADIGAN et alii, 1997).
1. Geração de nitrito
(3 . 1)
2 . Geração de nitrato
- - (3.2)
NO2 + (1/2)02 ➔ NO 3
3. Reação global
(3.3)
As bactérias atuantes no processo nitrificante são autotróficas e utilizam

carbono inorgânico (CO 2) para a síntese celular. Desta forma, independem de
compostos orgânicos como fontes de carbono. São igualmente denominadas qui-
miolitotróficas, uma vez que oxidam compostos inorgânicos para obtenção de
energia (METCALF e EDDY, 1991).
As bactérias responsáveis pela nitrificação apresentam velocidades de cresci-
mento celular bastante reduzidas, fato que pode trazer co1nplicações na operação
dos sistemas biológicos de tratamento. Em virtude de a bio1nassa ser produzida
em pequenas quantidades, a sensibilidade do processo é aumentada, o que, de
forma subsequente, acarreta o aumento da suscetibilidade à inibição (SORIA e
CHAVARRIA, 1978; HÁNEL, 1988).
Por falar em inibição, a nitrificação é considerada o processo mais sensível
dentre os processos de remoção biológica de nutrientes de águas residuárias, sendo
a biomassa autotrófica nitrificante aproximadamente 1O vezes mais sensível que a
biomassa heterotrófica aeróbia CTULIASTUTI et alii, 2003).
Entre os principais fatores que exercem influência direta na atividade nitri-
ficante encontram-se: pH, temperatura, alcalinidade, concentração de oxigênio
dissolvido e relação C/N. A tabela 3.5 apresenta os valores considerados ideais de
alguns parâmetros importantes no processo nitrificante, segundo diversos pesqui-
sadores.
TABELA 3.5 Valores considerados ideais, segundo diversos autores, para alguns parâmetros
importantes no processo de nitrificação
Autor pH T (2C) Oxigênio dissolvido
Surampalli et alii (1997) 7,5-9,0 25- 35 2 C > 2mg/ L
EPA (1993) 7,5-8,5 35ºC p/ Nitrosomonas

35 - 42 2 C p/ Nitrobacter
Henze et alii (1997) 7 ,5-8,0 30-35ºC 3-4 mg/L
Metcalf & Eddy {1991) 7 ,5-8,0 Acima de 28ºC

Entre os principais agentes inibidores da nitrificação estão compostos quími-

cos, metais pesados, altas concentrações salinas e os próprios substratos.
São dive rsas as águas residuárias que ap resentam compostos capazes de exer-
cer efeito inibitório ao processo nitrificante, sobretudo as advindas de indústrias
químicas, as quais empregam uma infinidade de substâncias em seus processos.
Fatores, como pH, concentração do inibidor, concentração de sólidos sus-
pensos, idade do lodo, solubilidade do inibidor e a concentração de outros cá-
t ions e moléculas presentes, influenciam o grau de inibição. Segundo Grunditz
e Dalhammar (2001), o fato de as bactérias responsáveis pela nitrificação serem
restritas a poucos gêneros, associado ao seu lento crescimento celular, tornam esse
processo mais suscetível à inibição.
3.5.2.2 Desnitrif icação
No que concerne à desnitrificação, etapa subsequente à nit rificação no p ro-

cesso convencional de remoção de nitrogênio trata-se de u1n processo no qual
bactérias heterotróficas anaeróbias facultativas reduzem o nitrato gerado na ni-
t rificação a nitrogênio molecular (MADIGAN et alii, 1997). É um p rocesso de
grande in1po rtância, visto que, consistindo e1n u1na etapa integrante do processo
de remoção de nitrogênio de efluentes líquidos, contribui para mitigar os diversos
danos causados por esse elemento nos corpos d'água.
A desnitrificação é Ílnpo rtante especialmente para afluentes com baixa al-
calinidade natural . A perda de alcal inidade pela liberação de íons H + d urante a
nitrificação pode ser contornada pela desnitrificação Alén1 disso, concentrações
elevadas de nitrato podem provocar lodo ascendente na fase de decantação, preju-
dicando o processo de decantação (VON SPERLING, 1996).
Além dos fatores inseridos no processo global de remoção de n1atéria nitro-
genada ressaltados, a importância da desnitrificação está vinculada ao fato de o
nitrato ser um dos fatores que mais contribuem para a aceleração do fenômeno
da eutrofização nos corpos receptores. A re1noção desse composto du rante o p ro-
cesso desnitrificante ganha ainda 1nais relevância em deco rrência de o nitrato
ser um poluente prioritário devido a sua toxicidade relativa à metemoglobinemia
(síndrome do "bebê azul") e à possível fo rmação de nitrosaminas no sistema gás-
t rico, conhecidas pelo seu efeito carcinogênico no organismo
,
(WHO, 2003 apud
ROCCA et alii, 2006, McADAM e JUDD, 2007) . Areas rurais caracterizadas
pela atividade agrícola intensiva são os locais mais suscetíveis à contaminação por
nitrato . A quantidade expressiva de fe rtilizantes à base de nitrogênio empregados
nestas áreas cor responde à maior fonte de contaminação dos reservató rios de água
subterrâneos (ASLAN e CAKI CI, 2007). Além disso, indústrias de fertilizantes,
explosivos, metais e indústrias nucleares geram resíduos com alta concentração de

nitrato (N-NO3 > 1 000 mg/L) (GLASS e SILVERSTEIN, 1998).
Embora exista1n técnicas, como osmose inversa, troca iônica e eletrodiálise,
para a remoção de nitrato de águas residuárias, o método comumente emprega-
do em estações de tratamento de águas para atingir os padrões de descarte de
nitrogênio orgânico e inorgânico é baseado no metabolismo microbiano desses
compostos, transformado-os em nitrogênio gasoso . A aplicação da desnitrificação
biológica possui a vantagem de ocorrer naturalmente sob certas condições, além
de consistir em um processo muito mais vantajoso economicamente em compara-
ção com os outros assinalados (TILL et alii, 1998; TAKAYA, 2002).
No processo de desnitrificação, alguns grupos de bactérias oxidam um
substrato, que consiste em compostos de carbono orgânico, como carboidratos,
álcoois orgânicos, aminoácidos e ácidos graxos. Assim, a ocorrência da desni-
trificação está ligada à presença de um substrato oxidável e uma concentração
adequada de nitrato, que atua como aceptor de elétrons nesse processo (VAN
RIJN et alii, 2006).
De forma simpl ificada, a redução do nitrato ocorre em etapas sequenciais,
conforme a reação 3 .4. Du rante esta sequência de t ransformação de NO3 para N 2 ,
passando pelos óxidos gasosos, o estado de oxidação do nitrogênio passa de +5
para O (ASLAN e CAKICI, 2007; SOUZA e FORESTI, 1999).
(3 .4)
De forma mais detalhada, cada uma das reações e as enzimas catalisadoras

estão rep resentadas nas equações 3 .5 a 3 .8.
Nitrato redutase (3 .5)
Nitrato redutase (3 .6)
Óxido Nítrico redutase (3 . 7)
Óxido Nítrico redutase (3 .8)

As duas primeiras etapas, nas quais o nitrato é reduzido a nitrito e a redução

do nitrito a óxido nitroso, são realizadas, respectivamente, mediante a ação da
enziina nitrato redutase e nitrito redutase (SOUZA e FORESTI, 1999). O conhe-
cimento da atividade dessas enzimas é um bom indicativo da taxa de desnitrifi-
cação, além de auxiliar no entendimento da regulação do processo que é mediado
pelos micro-organismos (NAIR et alii, 2007).
3.5.2.3 Aplicações
A nitrificação em sistemas MBBR tem sido estudada tanto utilizando águas

residuárias sintéticas quanto águas residuárias municipais. Como qualquer pro-
cesso com biofilme, as taxas de nitrificação são influenciadas pela carga orgânica
aplicada, concentração de oxigênio dissolvido no reator, concentração de nitrogê-
nio amoniacal, temperatura, pH e alcalinidade (RUSTEN et alii, 2006).
Em virtude dos efeitos difusivos existentes em sistemas com biofilme, as con-
centrações do substrato principal (nitrogênio amoniacal) e de oxigênio dissolvido
apresentam influência ainda maior sobre a velocidade com que o processo nitri-
ficante ocorre. Normalmente, o oxigênio se rá limitante em altas concentrações
de nitrogênio amoniacal. Em contrapartida, o nitrogênio amoniacal ocupará o
posto de limitante da reação quando estiver em baixas concentrações (RUSTEN
et alii, 2006).
As configurações dos sistemas MBBR destinadas à remoção de nutrientes,
particularmente de nitrogênio, podem ser concebidas de diversas maneiras, a
exemplo do que foi mostrado nas figuras 3.14-3 .1 7, nas quais se procurou ilustrar
alguns diagramas de fluxo representando combinações entre o processo convencio-
nal de lodos ativados e o reator MBBR, an1bos destinados à remoção de matéria
orgânica, n1as que também podem desenvolver a atividade nitrificante. A figura
3 .18 representa un1a configuração na qual o MBBR é aplicado a jusante do pro-
cesso de lodos ativados, como forma de prover a nitrificação terciária.
FIGURA 3.18 MBBR colocado após planta de lodo ativado convencional para fins de nitrificação
terciária.
Caso se pretenda realizar a desnitrificação, obviamente se faz necessário a

adição de outro MBBR, subsequente ao reator nitrificante (pós-desnitrificação).
Nesse reator, em particular, devem ser asseguradas condições anóxicas para pos-
sibilitar a atuação do consórcio microbiano desnitrificante. Em substituição à
aeração, agitadores mecânicos são geralmente empregados para prover a circula-
ção dos suportes móveis do MBBR anóxico voltado à desnitrificação. Vale lembrar
também que na configuração de pós-desnitrificação há a necessidade de adição de
uma fonte externa de carbono orgânico (ácidos orgânicos, álcoois e outros), uma
vez que esse foi pratican1ente metabolizado e1n sua total idade nas etapas ante-
riores do processo. Esse requisito certamente resulta no incremento dos custos
de operação do processo. A figura 3 .19 apresenta o esquema da configuração de
pós-desnit rificação.
FIGURA 3.19 Configuração de pós-desnitrificação.
De forma alternativa à pós-desnitrificação, pode-se realizar a desnitrifica-

ção antes da nitrificação (configuração de p ré-desnitrificação), aproveitando dessa
maneira o carbono orgânico ren1anescente do tratan1ento secundário. Para tanto,
devem ser realizadas recirculações internas do nitrato formado no MBBR nitrifi-
cante para o MBBR anóxico desnitrificante, o que acarreta o aumento dos custos
operacionais, conforme mostrado na figura 3 .20 .
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,, .
'
Recirculação de lodo
FIGURA 3.20 Configuração de pré-desnitrificação.
Há ainda uma terceira possibilidade de operação para promover a nitrificação

e a desnitrificação em um único reator. Trata-se dos reatores com biofilme ope ra-
dos e1n bateladas sequenciais (RBBS), que, conforme mencionado anteriormente,
constituem configuração híbrida resultante da junção entre a tecnologia MBBR e
o princípio de funcionamento dos reatores batelada sequencial (RBS) . O MBBR

ope rado em regime contínuo, ilustrado nos diagramas de fluxo anteriores, pode
ser substituído por u1n ou mais RBBS operados em série ou em paralelo, os quais
possuen1 operação dividida em ciclos de enchimento, reação e drenagem. No caso
desses reatores, a etapa de sedimentação não é necessária uma vez que a biomassa
se encontra aderida aos supo rtes, e não dispersa (em suspensão) no meio líquido.
A etapa de reação pode intercalar períodos aerados, para possibilitar a nitrifica-
ção, e períodos anóxicos, para promover a desnitrificação. Obviamente que um
controle rigoroso das etapas é fundamental para o bom funcionament o do siste-
ma, lembrando que se faz necessária a adição de compostos orgânicos nas etapas
anóxicas do RBBS.
Hem et alii (1994) demonstraram que a velocidade de nitrificação em um
sistema MBBR não depende somente das concentrações e cargas de substratos
presentes e1n un1 dado momento, mas ta1nbém sofre infl uência do histórico do
biofilme, isto é, das condições sob as quais o sistema fo i submetido anteriormente.
Foi verificado que quando o biofilme foi aclimatado com alta carga de nitrogênio
amoniacal, a taxa de nitrificação obtida no estado estacionário foi aproximada-
mente duas vezes maior en1 co1nparação com a respectiva taxa obtida quando o
biofilme foi aclimatado com baixas cargas de nitrogênio amoniacal .
Os mesmos autores aplicaram o sistema MBBR para est udar a nitrificação,
tanto em escala labo rato rial, utilizando efluente sintético, quanto em escala-
piloto, utilizando como alimentação efluente doméstico proveniente do
tratamento primário ou secundário. Os resultados mostraram que , quando a
alcalinidade está presente em excesso e não h á presença de matéria orgânica,
tanto o íon amônio quanto a concentração de oxigênio dissolvido podem ser
limitantes da velocidade de nitrificação . O íon amônio deixou de ser lin1itante
quando a razão concentração de oxigênio/concentração de amônio foi menor
que aproximadamente 3 gO 2 /gNH 4 -N, nessas condições o oxigênio passou
a ser limitante . A concentração de OD exerceu grande influência no processo
nitrificante, sobretudo nas condições en1 que foi limitante da taxa de reação
(HE M et alii, 1994).
Foi observado também que o aumento da carga orgânica ocasionou o decrésci-
mo nas taxas de nitrificação. Quando a carga orgânica excedeu 5 gDBO 7 /(m2 • d),
a nitrificação foi insignificante. Quando o sistema foi alimentado com efluente
secundário, taxas de nitrificação de O, 7-1,0 gNOx-N/(m2 • d) foram atingidas em
concentrações de oxigênio dissolvido entre 4,5 e 5 gO2 /m3 (H EM et alii, 1994).
Rusten et alii (1995) estudaram a nitrificação de uma água residuária pre-
viamente tratada e de uma água residuária bruta, em um sistema com recircu-
lação e pré-desnitrificação inserido em uma planta MBBR-piloto com suportes
dotados de 3 1O m 2/m3 de área superficial . Nestas condições, as t&"Cas máximas de
nitrificação atingidas com a água residuária pré-tratada foram 20 a 25% maiores

em comparação com as respectivas taxas obtidas com a água residuária bruta no
sistema com recirculação.
Rusten et alii (1995) observaran1 também que, sob condições de limitação de
oxigênio, o efeito da temperatura no processo nitrificante foi insignificante na fai-
xa de temperatura compreendida entre 7 e 18°C, em virtude do aumento da con-
centração de OD em baixas temperatu ras, isto é, a perda de eficiência do p rocesso
com a diminuição da temperatura foi contrabalançada pelo aumento do nível de
OD. Para se ter uma ideia, foram atingidas taxas de nitrificação que variaram de
300 a 400 gNH 4 -N/(m3 · d) a l0ºC, o que vem a contemplar os bons resultados
obtidos na operação de sistemas MBBR voltados à nitrificação.
Rusten et alii (1995) também avaliaram a t ransição da limitação da taxa de
nitrificação ocasionada pela concentração de nitrogênio amoniacal para lin1itação oca-
sionada pelo OD. Quando presente em concentração equivalente a 2 mg!L, o oxigênio
tornou-se limitante para concentrações de amônio maiores que 0,5 mgNH 4-N/L. Em
contrapartida, quando a concentração de oxigênio foi equivalente a 6 mg!L, a
transição da limitação pelo amônio para limitação pelo oxigênio ocorreu quando o
a1nônio atingiu a concentração de 1, 7 mgNH 4 -N/L.
Lançando mão da tecnologia MBBR, Welander et alii (1997) avaliaram a pos-
sibilidade de realizar a nitrificação de chorume proveniente de aterro sanitário mu-
nicipal, contendo 460-600 mg!L de N-NH; e DQO na faixa de 800-1 300 mg!L.
Para tanto, operaram três reatores de escala laboratorial, cada um preenchido com
determinado tipo de material suporte : suporte A (tubos extrudados de polietileno
dotados de significativa rugosidade com din1ensões de 8 1nm de altura e 8 1nm de
diâmetro); suporte B (tubos de polietileno com dimensões de 10 mm de altura e
8 n1m de diâmetro); suporte C (pequenos cubos com 3 mm de lado fabricado com
celulose microporosa). As áreas superficiais dos suportes A, B e C eram de 200, 390
e 1 700 m 2/m 3 , respectivamente . Já as frações de enchimento com esses mesmos
suportes em relação ao volume do reator foram de 60, 60 e 10%, respectivamente.
Foram investigados os efeitos da temperatura e do tempo de residência hi-
dráulico (TRH) na taxa volumétrica de nitrificação. As taxas de nitrificação em
estado estacionário foram obtidas após aproximadamente um mês de operação. Os
valores desse parâmetro mostraran1 menor dependência con1 a temperatura, sendo
a taxa de nitrificação obtida a 5ºC sendo aproximadan1ente 77% da taxa obtida a
20°C. A menor influência com a temperatura está relacionada ao fato de que a ni-
trificação é geralmente limitada pela difusão de oxigênio para o biofilme, de modo
que a diminuição da taxa específica de reação e1n baixas temperaturas é contraba-
lançada com uma n1aior penetração de oxigênio no biofihne, resultando em maior
quantidade de micro-organismos nitrificantes ativos (OKEY e ALBERTSON,
1989 apud WELANDER et alii, 1997; 0DEGAARD et alii, 1994).
O TRH teve um efeito mais pronunciado na taxa de nitrificação, sendo

observado um considerável aumento da taxa com o decréscimo do TRH. O efei-
to considerável do TRH na taxa de nitrificação está relacionado à maior carga
de amônio em baixos valores desse parâmetro, levando a uma maior taxa de
nitrificação. Vale ressaltar que, embora as maiores taxas de nitrificação fossem
atingidas durante operação com o menor TRH, o nível de descarte de nitro-
gênio amoniacal nessas condições não atingiu o padrão de lançamento exigido
( < 10 mgN-NH; /L). Desse modo, na prática, o p rocesso deveria ser operado
em maiores TRH (\NELANDER et alii, 1997).
Apesar do fato de o suporte A apresentar somente metade da macrossuper-
fície para adesão microbiana em relação ao suporte B, ambos apresentaram de-
sempenhos similares. Esse resultado está relacionado ao fato de a superfície do
suporte A apresentar 1naior rugosidade em relação ao suporte B, resultando no
alargamento da superfície do biofilme em uma "microescala". Esse efeito pode
estar fortemente relacionado ao biofilme bastante fino desenvolvido na superfície
dos suportes (de difícil observação a olho nu), tendo em vista que é pouco provável
que a área superficial de um biofilme seja maior en1 uma superfície rugosa em
relação a uma superfície lisa, especialmente quando a espessura do biofilme é con-
sideravelmente maior que o desnível da superfície (WELANDER et alii, 1997).
Já o suporte C pern1itiu a obtenção de maiores taxas volumétricas de
nitrificação. Para os dois primeiros suportes, o menor TRH que permitia atingir
os níveis de descarte de nitrogênio amoniacal (1 O mgN-NH; /L) a 20°C foi de
4-5 dias, enquanto o suporte C possibilitou atingir concentrações ainda menores
desse substrato em um TRH de apenas 22 h . Além disso, a maior eficiência
foi atingida com o uso desse suporte, co1n o qual a máxima taxa de nitrificação
(40 N-NH; /m 3 • h) foi obtida a 20ºC e TRH de 14 h (WELANDER et alii, 1997).
O melhor desempenho do suporte C foi clara1nente devido à sua estrutura
porosa e ao fato de o biofilme bastante fino não bloquear os poros do suporte.
Dessa forma, a área superficial efetiva do biofilme era maior do que a área da
"macrossuperfície" do suporte, fator que pode explicar as taxas volumétricas de
nitrificação consideravelmente n1aiores atingidas com o suporte Cem con1paração
com o suporte B, apesar da "macrossuperfície" disponível por unidade de volume
ter sido maior no reator B (234 m 2/m3 a 60% de enchimento) do que no reator C
(170 m 2/m3 a 10% de enchimento) (WELANDER et alii, 1997).
Segundo Pastorelli et alii (1997), a nitrificação em reatores MBBR pode ser
operada em processos multiestágios, a fim de se alcançar um progressivo enri-
quecimento com micro-organismos autotróficos. Nos primeiros estágios, ocorrerá
liinitação de oxigênio, em grande parte atribuída à competição entre n1icro-orga-
nismos heterotróficos e autotróficos. A relação linear entre as taxas de nitrifica-
ção e de consumo de oxigênio dissolvido implica em alto consumo energético na
aeração do processo . Entretanto, o processo nitrificante pode ser controlado pelo

aumento da concentração de oxigênio dissolvido (OD) em altas cargas de amônia
ou em baixas te1nperaturas. Nos últiinos estágios é provável que a concentração de
amônia se torne a etapa limitante do processo, e não mais o OD. Desta n1aneira,
menores taxas de nitrificação são atingidas nestes estágios.
Seguindo nessa direção, Pastorelli et alii (1997) estudaram a nitrificação
em un1 MBBR de fluxo contínuo, constituindo de três estágios. Os testes de
nitrificação foram realizados em concentrações meno res que 2 ,6 mgNH; -N/L
e também em concentrações acima de 4,0 mgNH; -N/L. Na primeira situação
(2,6 mgNH; -N/L), três diferentes situações puderam ser observadas. A primeira
situação, correspondendo a cargas de nitrogênio an1oniacal menores que
0,8 gNH; -N/(m2 • d), permitiu a obtenção de taxas de nitrificação de
+
0,47 gNH 4 -N/(1n2 ·d). A segunda, correspondendo a cargas de nitrogênio
amoniacal entre 0,8 e 1,4 gNH; -N/(m2 • d), propiciou a obtenção de taxa de
nitrificação de 1,07 gNH; -N/(m2 • d) (PASTORELLI et alii, 1997).
A condição representada por cargas menores que 0,8 gNH; -N/m2 (cargas bai-
xas) não mostrou nenhum aumento na t&"Ca de nitrificação com o aumento da con-
centração de oxigênio dissolvido. Desta forma, pôde-se inferir que não oco rreram
problemas de limitação difusiva. Já para cargas entre 0,8 e 1,4 gNH; -N/(m2 • d)
(cargas altas), de maneira diametralmente oposta à situação de cargas de nitrogê-
nio an1oniacal baixas, a penetração do oxigênio no biofilme não foi total, sendo a
taxa de n it rificação infl uenciada pela concentração de oxigênio. Para concentra-
ções de nitrogênio amoniacal acima de 4,0 gNH; -N/(m2 · d), a difusão no filme
líquido também constituiu a etapa limitante do processo. É interessante ressaltar
que, para concentrações de OD abaixo de 2-3 mgOifL, não ocorreu nitrificação
(PASTORELLI et alii, 1997).
Seguindo na mesma tendência de aplicação de processos mult iestágios, YU
et alii (2007) operaram um sistema MBBR de dois estágios de escala laboratorial
no intuito de remover N-NH; em concentrações razoáveis (50-400 mg(L), de
uma água residuária sintética. A concentração de OD foi mantida em 2-3 mg(L
e a temperatura ambiente variou de 23-29ºC. Atingiu-se um percentual de 99%
de remoção de N-NH; quando a concentração afluente de N-NH; foi menor que
300 mg!L, sendo a concentração desse parâmetro no efluente do processo me-
nor que 1 mg!L. Verificou-se que, mesmo com o aumento da concentração de
N-NH; para 400 mg(L, o que correspondeu a un1a carga orgânica volumétrica
de 0,6 kgNH; -N/(m3 • d), a eficiência de remoção foi mantida aciina de 95%.
+
Nestas condições, a concentração de N-NH 4 do efluente do processo foi menor
que 1 S mg!L. Os mesmos autores constataram que a composição de nitrogênio
oxidado (NOx) foi bastru1te influenciada pela amônia livre, sendo o intermediário
nitrito presente em concentrações significativas quando a concentração de amônia
livre foi maior que 2 ,5-3 ,O n1g,'L.
Rodgers e Xin-Min (2004) avaliaram o desempenho de um sistema composto
de seis reatores de leito móvel verticais com biofilme, com altas taxas de recircula-
ção entre os mesmos, destinados à remoção biológica de nitrogênio. Foi utilizado
efluente sintético cuja concentração de N-NH; variou entre 75 e 136 mg,'L e
DQO em torno de 600 mg,'L. Os quatro últimos tanques da série eram aeróbios, e
os dois primeiros eram anóxicos. A remoção do material orgânico, avaliada em ter-
mos de DQO bruta, atingiu índices de 94-96%, e a remoção global de nitrogênio
variou de 77 a 88% . Nos reatores anóxicos, a eficiência de desnitrificação variou
de 94 a 98%, tendo a taxa de desnitrificação por área de suporte apresentado va-
lores que variaram na faixa de 2,9-3,8 gN-NO3 /(m 2 ·d). O percentual de nitri-
ficação nos tanques aeróbios apresentou índices maiores que 95% . Neste caso, a
taxa máxima por unidade de área de suporte variou de 1,3 a 1,8 gN-NH; /(m 2 • d).
Luostarinen et alii (2006) investigaram a remoção de DQO residual e de
nitrogênio dos efluentes de um reator anaeróbio operado a baixas temperaturas
(efluente 1) e de um efluente de granja de frangos (efluente 2). O sistema era
composto de quatro MBBRs em série, operados em regime de bateladas sequen-
ciais, com e sem aeração. Nos intervalos sem aeração (regime anóxico), agitadores
mecânicos eram ativados para manter a homogeneidade do sistema. A fase anóxica
era atingida 30 a 40 n1inutos depois de interrompida a aeração, quando se atingia
uma concentração de OD de 1,0 mg/L. A te1nperatura operacional média foi de
20ºC para o efluente 1 e l0ºC para o efluente 2. O ciclo operacional de todas as
etapas do sistema foi de 1,8-2 ,2 dias. Considerando-se o acoplrunento do sistema
(UASB + MBBRs), foi obtida uma remoção de matéria orgânica, nitrogênio total
e de fósforo equivalente a, respectivamente, 90%, 60- 70% e 80%. Para o efluente
de granja de frango houve completa remoção da matéria orgânica e para todos os
reatores a remoção de nitrogênio variou entre 50 e 60%. Foi atingida completa
nitrificação, embora a desnitrificação tenha sido comprometida en1 virtude da
falta de fonte de carbono no meio.
Bassin et alii (2 O11) investigaram a nitrificação terciária de esgoto doméstico
tratado com altos níveis de salinidade, em um reator MBBR de escala laborato-
rial. A salinidade do esgoto tratado foi aumentada de 1 000 a 8 000 mgCl-/L. Os
resultados mostrarrun grande adaptação da bion1assa aderida aos suportes móveis,
atingindo-se mais de 90% de remoção de nitrogênio amoniacal mesmo para a con-
dição mais crítica de salinidade testada.
Os mesmos autores, após averiguarem o aumento gradual da salinidade no esgoto
tratado, começou a alimentar o reator com a mistura de esgoto (8 000 mgCl-!L) e um
efluente industrial tratado (coletado após o decantador secundário) . O efluente
industrial apresentava composição bastante complexa, uma vez que era oriundo de
uma indústria química produtora de defensivos agrícolas, entre eles herbicidas, in-
seticidas, fungicidas e acaricidas. O fato é que, embora este efluente tenha passado
pelo sistema convencional de lodos ativados, ainda assim apresentava muitas subs-
tâncias potencialmente inibidoras da nitrificação, as quais eram remanescent es do
tratamento biológico convencional. As percentagens deste efluente adicionadas à
alimentação fo ram gradualmente aumentadas de 10 a 100%. A concentração de
amônio no afluente era de aproximadamente 50 mgNH; -N/L. O que se observou
com os resultados obtidos nestes novos regimes de alimentação foi que, embora te-
nham ocorrido perdas de eficiência de nitrificação, notadamente quando ocorria o
aumento do pe rcentual de efluente industrial mistu rado ao esgoto tratado, o siste-
ma biológico conseguiu se recuperar e se adaptar a cada condição, alcançando-se mais
de 85% de eficiência de nitrificação em todos os regiines operacionais avaliados.
Assim, é coerente pensar que a configu ração do sistema MBBR tenha exercido
papel relevante nos resultados obtidos, uma vez que permitiu o desenvolvimento
e o acondicionamento do consó rcio n1icrobiano nitrificante, mesmo sob condições
inibitórias (BASSIN et alii, 2011 ).
Labelle et alii (2005) investigaram a desnitrificação, usando MBBR com
suporte esférico de polietileno, o qual dispunha de uma área específica de biofilme
equivalente a 100 m 2/m3 • Como fonte de carbono, utilizou metanol variando a
relação C/N. A concentração de N-N0 3 foi reduzida de 53 mgjL para 1,7 mg/L,
sendo a taxa de desni trificação máxima correspondente a 1 7, 7 + 1, 4 g N/(m2 • d- 1),
taxa esta atingida quando a razão DQO/N empregada foi de 4,2.
São inúmeros os trabalhos que descrevem como vantajosa a remoção biológica
de compostos contendo fósforo de efluentes. Helnes e 0 degaard (2001) desenvol-
veram o "MBBR para remoção de fósforo", seguindo os princípios que regem o
funcionamento do reator batelada sequencial (RBS) .
\~Tang et alii (2006) avaliaram um processo combinado de precipitação quí-
mica (coagulação/floculação) em um MBBR. Tal reator foi igualmente utilizado
para a remoção de nitrogênio pelo p rocesso de nitrificação e desnitrificação simul-
tâneas (SN D). O processo fo i estabilizado com uma concentração de OD acima
de 2 mg/L, obtendo-se pe rcentuais de remoção de nitrogênio em torno de 90%. O
suporte utilizado neste sistema possuía for1nato esférico, com área específica de
320 m 2/m 3 , o que conferiu ao sistema boas condições hid rodinâmicas. Na precipi-
tação química, destinada à remoção de fósforo (P), foi utilizado fe rro II na razão
de 1: 1,3 (P:Fe) . As remoções obtidas fora1n significativas, viabilizando o sistema
para futuras aplicações e1n escala industrial.
Kermani et alii (2009) avaliaram a ren1oção de nutrientes de água residuária
sintética em um sistema de leito móvel com biofiln1e (MBBR) de escala labora-
torial. A unidade experimental foi composta de quatro reatores em série, sendo
um anaeróbio, dois anóxicos e um aeróbio, não existindo reciclo de lodo entre os
reatores. Esses reatores foram operados em regime contínuo, sendo submetidos a
diferentes cargas de nitrogênio e fósforo e a diferentes TRH. O reator anaeróbio

(Rl) foi destinado à remoção biológica de fósforo, enquanto o primeiro reator
anóxico (R2) foi responsável pela minimização do efeito do nitrato da água resi-
duária que entrava no reator anaeróbio. Parte do líquido desse último reator era
retornado para o reator anaeróbio, de modo a aumentar a remoção de DQO e per-
mitir condições ideais para a remoção de fósforo. O segundo reator anóxico (R3),
subsequente ao primeiro reator anóxico (R2), recebia a recirculação de nitrato do
reator aeróbio (R4) para permitir a remoção da maior parte do nitrato do proces-
so. O reator R4, por sua vez, era responsável pela nitrificação. Todos os reatores
foram mantidos à ten1peratura constant e de 28 + 1ºC.
A concentração de N-NH; e P-PO~- e a DQO foram mantidas em 25-125 mg!L,
5-25 mg!L e 500-2 000 mg!L, respectivamente. O TRH variou de 8 -48 h, de-
pendendo da vazão de alimentação utilizada (10 - 60 L/d). Em condições ideais
(500 1ngDQO/L e 62 ,68181 N-NH; / L), p raticamente completa nitrificação ocor-
reu com eficiência de remoção de N-NH; de 99, 72% no reator aeróbio. Nesse
reator, a taxa específica média de nitrificação foi de 1, 92 gN-NOx (N-NOx =
N-N O2 + N-NO3) p roduzido/kg SSV.h) . Os autores ainda verificaram que a taxa
de desnitrificação aumentou com o aumento da carga de N-N Ox no segundo reator
anóxico. Em condições ideais (500 mgDQO/L e 12 ,5 P-PO~-/L), as eficiências
totais médias de remoção de nit rogênio e fósfo ro foram de 80,9% e 9 5 ,8%, res-
pectivamente (KERMANI et alii, 2009) .
3.5.3 OBSERVAÇÕESMICROSCOPICASDO BIOFILME
O biofilme fo nnado nos suportes de sistemas MBB R, alé1n de conter células

bacterianas responsáveis pela depuração do material orgânico e inorgânico, pode
ap resentar uma microfauna bastante dive rsificada, caracterizada pela presença de
inúmeros micrometazoários e p rotozoários.
Muitas vezes, em virtude de sua sensibilidade às variações das condições do
meio (concentração de substrato e de oxigênio dissolvido e p resença de substân-
cias tóxicas), os protozoários e 1n icrometazoários são utilizados como indicadores
das condições de depuração do sistema biológico, servindo como parâmetro na
aval iação da eficiência do processo. Além disso, alimentam-se de bactérias livres,
reduzindo a turbidez e consequentemente a DBO do efluente tratado, auxiliando
també1n na remoção de bactérias patogênicas.
A figu ra 3 .2 1 apresenta algu1nas microfotografias, obtidas por meio de 1nicros-
cópio óptico, do biofilme retirado dos suportes provenientes de sistemas MBBR e
RBBS, submetidos a baixas cargas orgânicas e voltados à nitrificação de efluentes sin-
téticos contendo concentrações de nitrogênio amoniacal de 100 a SOO mg!L. Como
pode-se observar, o biofihne é colonizado por protozoários fixos ou pedunculados
(figuras 3 .21a, 3 .2le e 3.21i), ciliados livres (figura 3 .21b), vermes cilíndricos
ou nematoides (figura 3.23c), rotíferos (figura 3 .23d), tecamebas (figuras 3 .2 lf e
3.2li), bactérias filan1entosas (figura 3.21g) e an1ebas (figura 3.21h).
(a) (b) (e)
•
(d) (e) (f)
(g) (h) (i)

FIGURA 3.21 Microfotografias obtidas por meio de microscopia óptica da biomassa aderida aos
suportes do MBBR (ampliação de 400x).
Lançando mão de microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi possível

observar a estrutura e a composição do biofilme aderido aos suportes dos mesmos
reato res mencionados quando da apresentação das microfotografias obtidas em
microscópio óptico. A figura 3 .22a apresenta a estrutura do biofilme caracteri-
zada por aglomerados microbianos dispostos na matriz de exopolissacarídeos. As
figuras 3 .22b e 3.22c ilustram o emaranhado de células bacterianas envolto no
CAPÍTULO 3 ◊ REATORDE LEITOMÓVELCOMBIOFILME/ MOVINGBEDBIOFILM REACTOR- MBBR 83
material polimérico extracelular e tecamebas situadas entre as bactérias dispostas

na matriz de EPS, resp ectivamente. A figura 3 .22d evidencia a complexidade
organizacional do biofil me, n1ostrando seus dife rentes níveis. Microalgas (diato-
máceas) e cianobactérias (cianofíceas ou algas azuis) podem ser visualizadas nas
figuras 3 .22e e 3 .22f, respectivamente.
(a) aumento 75x (b) aumento 7 500x
(c) aumento 5 000x (d) aumento x
(e) aumento 3 500x (f) aumento 5 000x
FIGURA 3.22 Microfotog rafias obtidas em microscópio eletrônico de varredura do biofilme aderido
aos suportes de um sistema MBBR voltado à nitrificação.
As figuras 3 .23a e 3 .23b ilustram, respectivamente, um protozoário ciliado

(família Euplotidae) e protozoários pedunculados (gênero Vorticella) . Um verme
cilíndrico (nematoide) pode ser visualizado na figura 3 .23c e inúmeras tecamebas
(gênero Euglypha) podem ser vistas na figura 3.23d. Por sua vez, as figuras 3.23e
e 3.23f ilustram, respectivamente, protozoários ciliados (família Euplotidae) dis-
postos em diferentes posições.
(a) aumento 1 500x (b) aumento 1 000x
(c) aumento 500x (d) aumento 1 000x
(e) aumento 1 000x (f) aumento 2 000x

FIGURA 3.23 Microfotografias obtidas em microscópio eletrônico de varredura do biofilme aderido
Na figura 3 .24a estão ilustrados protozoários Epystilis, considerados indi-

cadores de efluente tratado de boa qualidade e que ocorre1n em siste1nas de tra-
tamento operados em condições estáveis e com aeração permanente (CANLER et
alii, 1999 apud ~TOOLF et alii, 2001 ). Detalhe representando um pool de células
bacterianas pode ser visualizado na figura 3 .24b, enquanto a estratificação da
estrutura do biofilme e a disposição das bactérias na matriz de exopolissacarídeos
podem ser visualizadas nas figuras 3.24c e 3.24d.
(a) aumento 2 OOOx (b) aumento 7 500x
(c) aumento 5 000x (d) aumento 5 000x
FIGURA 3.24 Microfotografias obtidas em microscópio eletrônico de varredura do biofilme aderido

É importante ressaltar que muitas vezes a visualização de micrometazoá-

rios e protozoários presentes no biofilme, detectados por microscopia óptica,
não é conseguida por meio de microscopia eletrônica de varredura. Na realidade,
o próprio procedimento de preparação da amostra para visualização em MEV,
constituído por inúmeras etapas de lavagem, fixação, pós-fixação, desidratação e

secagem, pode contribuir para o arraste desses organismos do biofilme. Nessas cir-
cunstâncias, enfatiza-se a iinportância de uma investigação polifásica do biofilme,
lançando mão tanto de microscopia óptica para observação quase que imediata
das características do biofilme em determinado momento quanto de microscopia
eletrônica de varredura, a qual propicia a aquisição de imagens com alta resolução
e pern1ite igualmente a visual ização de elementos integrantes do biofilme que
somente por meio de microscopia óptica não seriam detectados e identificados.
3.6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Observa-se que a implantação de estações de tratamento de efluentes, sejam
domésticos sejam industriais, que utilizam a tecnologia MBBR, vem aumentando
no mundo inteiro.
O processo MBBR apresenta algumas vantagens em relação aos processos
biológicos convencionais, con10 o de lodos ativados. De fato, o espaço requerido
para a sua implantação é menor e o seu desempenho nos processos de nitrificação
e desnitrificação são excelentes, o que o faz, sem dúvida, ganhar espaço no mer-
cado, inclusive em aplicações industriais. Esse bom desempenho na nitrificação
e desnitrificação vem ao encontro com o que vem sendo in1posto pelas legislações
ambientais, que é a redução do lançamento de nutrientes nos corpos receptores.
As configurações de sistemas MBBR ainda podem congregar etapas físico-quími-
cas, possibilitando também a remoção de fósforo, outro nutriente con1 potencial
poluidor dos recursos hídricos.
Os processos com biofilme, em geral, apresentam boas eficiências na remoção
de matéria orgânica presente em um efluente. No entanto, quando a carga é muito
alta, comumente é observada uma perda de eficiência. Isso não é dife rente com o
processo MBBR, no qual se observa uma perda de eficiência com cargas mais altas
e o frequente desprendimento do biofilme, gerando lodo a ser tratado e disponibi-
lizado. Dessa forma, é plausível afinnar que o MBBR é mais adequado para tratar
menores cargas de DQO.
Outro ponto a ser solucionado é em relação à aeração do sistema, que é uti-
lizada tanto para fornecimento de oxigênio aos micro-o rganismos quanto para
mante r as biomedias en11novimento, o que se t raduz en1 alto custo de operação .
Em suma, o processo MBBR requer a condução de estudos que possibilitem
melhor compreensão da relação entre material suporte, dispositivo de aeração e
biomassa imobilizada nos suportes móveis.
É necessário gerar mais conhecimento sobre a sua aplicação e1n efluentes in-
dustriais, uma vez que a literatura apresenta poucos exemplos e certamente será
muito útil para a remoção de nitrogênio, principalmente quando o MBBR for
aplicado para o polimento de um efluente industrial.
O conhecimento cada vez mais profundo dos processos com biofilmes aju-
dará a estabelecer as melhores condições para sua operação. Há de se considerar
que o processo de remoção de nitrogênio é bastante sensível a n1udança no n1eio
e, portanto, deve ser foco de estudos nesses sistemas com biomassa imobilizada,
viabilizando a sua aplicação nos mais diversos tipos de efluentes.
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Capítulo 4
Tecnologia de Granulação Aeróbia

(Lodo Granular Aeróbio)
4.1 INTRODUÇÃO
maioria dos sistemas de tratamento de águas residuárias, tais

como o tradicional processo de lodos ativados, requer grandes
áreas para a sua implantação, o que se deve principalmente à
necessidade de sedimentadores e às baixas concentrações de sóli-
dos nos tanques de aeração. Desvantagens como excesso de produção de biomassa,
pequena flexibilidade em relação a flutuações da carga aplicada e capacidades de
conversão volumétrica relativamente baixas (0,5-2 ,O kg DQO/m3 ·d), repercutem
negativamente nas características apresentadas pelos processos tradicionais.
O desempenho do processo de lodos ativados depende fundamentalmente das
características de sedimentabilidade do lodo presente no reator. Os flocos micro-
bianos devem ser separados da água residuária tratada em decantadores e un1a
porção deles é retornada ao reator. Entretanto, em alguns casos, podem surgir
flocos que apresentam problemas de sedimentação, o que acarreta o arraste de
lodo juntamente com o efluente tratado, diminuindo a qualidade do mesmo. Na
maioria das vezes, essa perda de lodo junto com o efluente tratado é ocasionada
pelo crescimento excessivo de micro-organismos filamentosos, fator que influencia
negativamente as propriedades de sedimentação do lodo. A configuração do reator
e a estratégia de operação ta1nbém podem influenciar nas características do lodo.
No caso específico de determinadas águas residuárias, algumas vezes se torna di-
fícil a formação de flocos com boas propriedades de sedimentação .
O incremento substancial do número de habitantes, na maioria dos casos
concentrados em áreas urbanas densamente povoadas, aumentou a necessidade
de se realizar o aprimoramento de plantas de tratamento de águas residuárias já
existentes ou a construção de novos sistemas que sejam compatíveis com a quan-

t idade crescente de produção de águas residuárias pela população. Geralmente,
a disponibilidade de espaço para essas construções é lin1itada, fazendo com que
essas novas instalações devam, impreterivelmente, ocupar a menor área possível.
Diante desse contexto, verificou-se uma significativa evolução nos siste-
mas de tratamento de águas residuárias, em resposta às maiores exigências de
qualidade do efluente t ratado e à necessidade de minimização do espaço uti-
lizado, de simplificação da operação e de redução dos custos de investimento.
Nesse meio-tempo, a pesquisa relativa ao desenvolvimento de novas formas de
aglomeração de biomassa foi intensificada, com o objetivo de facilitar e melhorar a
retenção de biomassa nos processos biológicos de tratamento, fundamental quan-
do se deseja reduzir o volume das unidades de tratamento. Tendo em vista que
nesses sistemas a biomassa atua como biocatalisador para a degradação de 1nate-
riais orgânicos e nutrientes (N e P), é evidente que reter uma alta concentração da
mesma no reator significa obter n1aior capacidade de remoção de poluentes. Para
tanto, é de fundamental importância dispor de biomassa com boas propriedades
de sedimentação, essenciais para o bom funcionamento dos processos biológicos
destinados ao tratamento de águas residuárias.
Nos últ imos anos, diversos reatores com biofilmes operados de forma contí-
nua foram desenvolvidos, nos quais a biomassa se encontra imobilizada em um
material suporte que pode estar fixo ou em movimento. Como exemplo, pode-se
mencionar os filt ros de percolação ou biofilt ros, contactares biológicos rotativos
(RBC) e os reatores de leito móvel com biofilme - MBBR (tecnologia descrita no
capítulo 4) . Entre algumas vantagens oferecidas por esses processos está a redu-
zida área de implantação, dispensando, em alguns casos, a necessidade de decan-
tadores (pode ser necessário um decantador, no entanto, com dimensões muito
n1enores), e a capacidade de supo rtar altas cargas volumétricas e orgânicas.
Representando-se u1na inovação ainda mais recente e1n relação aos reato-
res con1 biomassa in1obilizada em material suporte (reatores com biofilme) e
caracterizando-se como alternativa aos processos tradicionais na tentativa de su-
perar algumas limitações intrínsecas a esses últimos, surgiu a tecnologia de gra-
nulação aeróbia, também conhecida como tecnologia de lodo granular aeróbio.
Considerado-se un1 caso especial de biofilme composto de células autoimobiliza-
das, o lodo aeróbio granular constitui uma das biotecnologias promissoras aplica-
das ao tratamento de águas residuárias que dispensa o uso de n1aterial suporte. A
sua primeira patente foi concedida a Heijnen e Van Loosdrecht (1998) .
É interessante ressaltar que o lodo granular foi inicialmente concebido para
sistemas estrita1nente anaeróbios em 1980, sendo a fo rmação dos grânulos anaeró-
bios realizada com n1aior frequência em reatores anaeróbios de fluxo ascendente e
manta de lodo (Upjlow Anaerobic Sludge Blanket - UASB), os quais apresentam al-
tas eficiências de remoção de matéria orgânica biodegradável de águas residuárias
CAPÍTULO 4 ◊ TECNOLOGIADEGRANULAÇÃO AERÓBIA(IODOGRANULAR AERÓBIO) 93
mun1c1pais e industriais (LETTINGA et alii, 1980). As limitações oferecidas

pela tecnologia de granulação anaeróbia, dentre as quais se incluem longo tempo
de partida, temperaturas de operação relativamente altas, inadequação para águas
residuárias contendo baixas concentrações de matéria orgânica e baixa eficiência
de remoção de nutrientes (nitrogênio e fósforo), impulsionaram o desenvolvimen-
to da tecnologia de grânulos aeróbios, tornando-a foco de discussão para engenhei-
ros vinculados à área ambiental (ADAV et alii, 2008) .
Nos últimos dez anos, muitas pesquisas vên1 sendo realizadas visando ao
estudo dos grânulos aeróbios, tanto para obter informações adicionais a respeito
da formação dessas estrutu ras microbianas compactas, como também devido à
possibilidade de a tecnologia de grânulos aeróbios formar a base de um novo e
compacto sistema de tratamento de águas residuárias.
Podendo representar a solução para a operação de alguns reatores nos quais
está presente lodo floculento con1 más características de sedin1entabilidade, a tec-
nologia de granulação aeróbia ainda representa uma economia de investimento
inicial, uma vez que não requer o uso de material suporte. Além disso, a formação
de um gradiente de oxigênio e a p resença de uma ampla gama de micro-organis-
mos no interior dos grânulos aeróbios possibilita1n a remoção simultânea de 1naté-
ria orgânica, nitrogênio e fósforo . Nesse contexto, a granulação aeróbia vem sendo
alvo de inúmeras pesquisas, na maioria empregando sistemas em escala laborato-
rial, surgindo recentemente as p rimei ras aplicações em escala p iloto e industrial .
4.2 CARACTERIZAÇÃO GERAL DA TECNOLOGIA DE LODO GRANULAR

Os grânulos consistem em agregados microbianos altamente empacotados,
contendo milhões de micro-organismos por grama de biomassa, os quais repre-
sentan1 diferentes espécies bacterianas, cada qual con1 sua função específica na
degradação dos diversos poluentes presentes en1 águas residuárias complexas (LIU
e T AY, 2004) . Podem ainda ser considerados "mini ecossistemas", dotados de po-
pulação microbiana mista, a qual pode se r manipulada por meio da aplicação de
condições operacionais específicas de n1odo a selecionar os organisn1os don1inan-
tes desejados (DE KREUK et alii , 2005a).
A definição de grânulos aeróbios, estabelecida no congresso da IWA designa-
do "Lodo Ativado Granular" (Aerobic Granular Sludge), realizado e1n Munique,
Alen1anha, em 2004, sugere que os n1esn1os sejam entendidos como agregados
de origem microbiana que não coagulam em reduzidas tensões hidrodinâmicas
e que possuem velocidade de sedimentação superior aos flocos de lodo ativado
(DE KREUK et alii, 2005a) . Nesse mesn10 congresso, fo i determinado que, para
que um agregado possa ser considerado um grânulo aeróbio, o mesmo deve apre-
sentar uma estrutura na qual a posição dos micro-organismos não seja alterada
rapidamente como nos flocos de lodo ativado, sendo a estrutura do grânulo cons-
t ituída por biomassa e polímeros extracelulares. Além disso, além de sedimentar
rapidamente, o agregado deve se r for1nado se1n a necessidade de n1ateriais suporte,
devendo apresentar diâmetro de, no mínimo, 0,2 mm. A classificação dos grânu-
los deve se r realizada com o auxílio de peneiras, técnica que pode ser usada para
expressar a quantidade de grânulos presente no total de biomassa. O processo de
granulação estará concluído quando a quantidade de grânulos corresponder a 80%
dos sólidos presentes no reator (DE KREUK et alii, 2005a).
Apresentando forma externa esférica cujo diâmetro pode variar de 0,2 a 5 ,O mm,
os grânulos caracterizam-se po r possuir densidades muito superiores em compa-
ração com aquelas apresentadas pelo lodo ativado convencional (ADAV et alii,
2008), o que os tornam detentores de inúmeras características interessantes.
Entre algumas das principais características dos grânulos aeróbios destacam-se
(ADAV et alii, 2008; LIU e TAY, 2004; BEUN et alii, 1999; D E KREUK e VAN
LOOSDRECHT, 2004):
♦ Excelente sedimentabilidade, facilitando a separação do efluente tratado
do lodo granular.
♦ Forma regular, lisa e praticamente arredondada.
♦ São visíveis e formam uma fase separada no líquido durante as fases de
aeração e sedimentação.
♦ Propiciam grande retenção de biomassa no reator, aumentando a capaci-
dade de supo rtar altas cargas orgânicas.
♦ Estrutura microbiana densa e forte.
♦ No seu interior há a presença de zonas aeróbias e anóxicas, o que permite
que diferentes processos biológicos sejam realizados no mesmo sistema.
♦ Capazes de suportar altas velocidades de fluxo.
♦ Menos vulneráveis à toxicidade de compostos químicos e metais pesados
em comparação com lodo em suspensão .
♦ Não necessitan1 de material suporte (requerido em outros sisten1as com
biofilme), diminuindo os custos de investimento.
♦ Proporcionam redução do custo de operação de uma planta de tratamento
em pelo menos 20% e din1inuição do espaço requerido em 7 5%.
A atratividade dos reatores de lodo granular é realçada justamente por estes

sistemas serem capazes de reter grande quantidade de micro-organismos no seu
interior, permit indo dessa maneira a rápida metabolização dos poluentes, além
de propiciar melhorias no desempenho e estabilidade do reator. Por conseguinte,
grandes volumes de resíduos líquidos podem ser tratados em reatores compactos.
Em virtude de apresentarem maior tamanho e maior densidade quando compa-
rados com o lodo ativado convencional, os grânulos apresentam sedimentação
rápida, o que certamente facilita a separação entre o efluente tratado e a biomassa.
CAPÍTULO 4 ◊ TECNOLOGIA DE GRANULAÇÃO AERÓBIA (IODO GRANULAR AERÓBIO) 95
Os grânulos aeróbios são cultivados preferencialmente em reatores batelada se-

quencial (RBS), cujo modo de operação é dividido em ciclos temporais. Esses, por
sua vez, são caracterizados pelas fases de enchin1ento, reação (aeróbia, anóxica ou
anaeróbia), sedimentação e descarte do efluente tratado (sobrenadante). O princípio
de funcionamento dos RBS facilita a retenção de altas concentrações de lodo granular
no meio reacional e dispensa o uso de sedimentadores visando à separação entre a
biomassa e o efluente tratado, bem como o retorno de lodo ao reator biológico.
Em sistemas descontínuos, a excelente capacidade de sedimentação do lodo
granular aeróbio, além de melhorar a separação entre a biomassa e a água resi-
duária tratada, possibilita que um período de tempo maior de cada ciclo de opera-
ção seja destinado à fase de reação, isto é, ao tratamento biológico propriamente
dito. Nos RBS destinados ao cultivo de grânulos aeróbios, geralmente os tempos
de ciclo são de poucas horas (3-6 h). No início de cada ciclo certa quantidade
de água residuária (real ou sintética) é adicionada ao reator, sendo, em seguida,
iniciada a fase de reação, seja aeróbia, anóxica ou anaeróbia, na qual ocorrem as
conversões. Por sua vez, o final de cada ciclo é n1arcado pela sedimentação rápida
dos grânulos (retendo-os no reator), sendo que essa etapa consiste em um critério
primário de projeto (BEUN et alii, 1999). Somente as partículas que possuem
certo tan1anho e densidade, capazes de sedimentar rapidamente, são retidas no
reator. Em contrapartida, partículas com velocidades de sedimentação menores,
tais como os flocos microbianos, são arrastadas do sistema, per1nitindo somente o
desenvolvimento de grânulos aeróbios (LIU e TAY, 2002; BEUN et alii, 1999).
Após o período de sedimentação, inicia-se a etapa de drenagem/esvaziamento, na
qual a parte superior do conteúdo do reator é removida como efluente clarificado.
Dessa forma, os processos de ren1oção de matéria orgânica e nutrientes (N e P) e a
etapa de sedin1entação do lodo ocorrem no mesn10 reator, resultando em un1 úni-
co tanque contendo alta concentração de lodo granular, o que, por consequência,
possibilita se atingir altas taxas de conversão volumétrica. Em outras palavras,
é possível se obter altas eficiências de ren1oção de poluentes em um único reator.
Em adição, a dinâmica do processo faz com que os micro-organismos presentes no
RBS sejam capazes de resistir a flutuações de carga (BEUN et alii, 1999).
A etapa física de sedimentação é responsável por selecionar a biomassa,
exe rcendo uma "pressão de seleção" (LIU e TAY, 2002). Desta forma, o tempo
destinado à sedin1entação apresenta grande influência na granulação aeróbia e
consiste, conforme já mencionado anteriormente, em um critério fundamental
de projeto (BEUN et alii, 1999). Pequenos tempos de sedimentação propiciam
arraste da biomassa suspensa e retenção somente de grânulos densos (QIN et alii,
2004). A figura 4.1 apresenta as diferentes fases do ciclo de um reator batelada
em sequencial do tipo coluna de bolhas, de escala laboratorial, destinado ao culti-
vo de grânulos aeróbios. Conforme pode ser observado, a razão altura/diâmetro do
reator é elevada (120 cm/6,5 cm = 18,5). Como será discutido posterior1nente,
essa característica apresenta grande influência quando da aplicação da tecnologia

de granulação aeróbia, tendo e1n vista que a velocidade de sedimentação é um dos
critérios de seleção de grânulos e1n detrin1ento a flocos microbianos pobremente
sedimentáveis.
(c) Sedimentação e Retirada

(a) Enchimento (b) Reação
de sobrenadante
FIGURA 4.1 Reator batelada em sequencial do tipo coluna de bolhas utilizado para o cultivo de
grânulos aeróbios em diferentes fases de um ciclo operacional.
Por meio da figura 4. lc, pode-se observar como o efluente tratado (sobrena-
dante) que está sendo d renado é praticamente desprovido de sólidos em suspen-
são, evidenciando a rápida e eficiente sedimentação do lodo granular aeróbio. Para
se ter uma ideia, no caso da operação do reator mostrado na figura 4.1 , o tempo
destinado à sedünentação dos grânulos é de apenas 3 min . Pequenos flocos são
arrastados do reator a cada ciclo, fazendo com que a concentração de sólidos no
reator, representados majoritariamente pelos grânulos, aumente com o decorrer
da operação .
Para efeito de comparação das características de sedimentabilidade apresen-
tadas tanto pelo lodo ativado convencional quanto pelo lodo granular aeróbio, a
figura 4 .2 apresenta a decantação dos mesmos em diferentes intervalos de tempo.

Conforme pode-se observar, após 30 segundos os grânulos já decantaram comple-
tamente. Os flocos de lodo ativado, no entanto, levara1n 20 minutos para atingir
o mesmo nível de sedimentação do lodo granular.
FIGURA 4.2 Comparação da sedimentação, ao longo do tempo, apresentada pelo lodo ativado
convencional e pelos grânulos aeróbios. (a) Inicio; (b) 30 seg; (c) 12 min; (d) 20 min.
Tendo em vista que a limitação difusiva au1nenta quando o crescin1ento da

biomassa deixa de ser em suspensão e passa a ser na forma de biofilmes/grânulos,
esse último tipo de biomassa sempre crescerá mais lentamente em comparação
com a bio1nassa em suspensão. E1n outras palavras, é plausível assumir que as
bactérias preferem crescer em suspensão e não na forma de biofilmes ou grânulos,
justamente pelo fato de esses últimos enfrentarem limitações difusivas para todos
os tipos de componentes envolvidos. Dessa forma, somente in1pedindo o acúmulo
de células suspensas ou flocos por meio da aplicação de reduzidos ten1pos de se-
dimentação, serão formados grânulos adequados (BEUN et alii, 1999; BEUN et
alii, 2002). É importante lembrar que bactérias de crescimento lento e de baixo
fator ele conversão substrato em células (Yx/ tais como as nitrificantes, apresen-
5
),
tam maior tendência em crescer na forma de biofihnes/grânulos em relação às

bactérias heterotróficas aeróbias, as quais apresentam crescimento rápido (BEUN
et alii, 2002).
Um parâmetro que pode ser variado para controlar a etapa de sedimentação
é a velocidade de sedin1entação mínin1a (v u,), que pode ser obtida dividindo-se a
111
altura de sedimentação pelo tempo de sedimentação, sendo este último escolhido

e fixado conforme desejado. O tempo ele retenção hidráulico (TRH) també1n pode
ser variado uma vez que esse parâmetro influencia o arraste (washout) da bio1nassa
suspensa. O TRH deve ser n1enor que 1/µ,máx para suprimir o crescin1ento da bio-
massa em suspensão (BEUN et alii, 1999).
Tendo em vista que na maioria dos casos os grânulos apresentam altas veloci-
dades de sedimentação, o tempo despendido na etapa de sedimentação é bastante
curto, pern1itindo n1aior tempo para os processos de degradação de poluentes.
Como já ressaltado anteriormente, tal característica certamente aumenta a atrati-
vidade do modo de operação descontínuo, isto é, em bateladas sequenciais.
Um fato a ser destacado é justamente referente ao tamanho dos grânulos.
Obvian1ente que, quanto maior o tamanho da partícula, maior a sua velocidade
de sedimentação. Nesse caso, em particular, o cultivo de grânulos maiores é favo-
rável. Entretanto, deve-se levar em consideração os efeitos difusivos que podem
estar presentes dependendo do diâmetro apresentado pelo grânulo. Quando se
pretende, por exemplo, criar condições anóxicas no interior dos grânulos para per-
mitir a desnitrificação, grânulos maiores tendem a ser os mais indicados. Nesses,
a difusão de oxigênio para o interior do grânulo se torna limitada, especialmente
se estivere1n presentes populações microbianas que causem un1a diminuição da
concentração de oxigênio dissolvido (n1icro-organisn1os heterotróficos ou nitrifi-
cantes, por exemplo). Desse modo, deve ficar claro que o cultivo dos grânulos está
intimamente relacionado aos objetivos de cada processo, de forma individual.
Co1no destacado previrunente, a etapa de sedimentação do lodo granular em
reatores em batelada sequencial não repercute em n1aiores dificuldades, justamen-
te devido às velocidades de sedimentação dos grânulos serem muito superiores
àquelas apresentadas pelo lodo ativado convencional . Entretanto, como em qual-
quer processo de tratamento, existem obstáculos a serem enfrentados. No caso
da operação dos reatores de lodo granular, o principal entrave técnico se refere à
instabilidade dos grânulos aeróbios, que pode advir do crescimento de bactérias fi-
lamentosas, capazes de deteriorar a sua capacidade de sedimentação e ocasionar o
seu arraste do reator, bem como dificultar e limitar a sua aplicação no tratamento
de águas residuárias. No entanto, como será visto e1n alguns trabalhos presentes
na literatura envolvendo grânulos aeróbios, o crescimento de organismos filamen-
tosos em pequenos ou moderados níveis não ocasiona problemas. Pelo contrário,
podem contribuir na estabilização da estrutura do lodo granular, servindo como
suporte na for1nação desses aglomerados microbianos.
Enquanto a "pressão de seleção" é o principal fator para a seleção de grânulos
em detrimento às partículas menores em suspensão, a velocidade de crescimento
dos micro-orgru1ismos, por sua vez, representa um dos principais fatores respon-
sáveis pela densidade de grânulos ou biofilmes. Organismos que apresentam altas
velocidades de crescimento formam grânulos menos densos em comparação com
organismos cuja velocidade de crescimento é baixa (VILLASENOR et alii, 2000).
Para exemplificar, micro-organismos nitrificantes formam biofilmes muito mais
densos do que heterotróficos sob as mesmas circunstâncias. Dessa forma, a dimi-
nuição da velocidade de crescimento bacteriano contribui para o aumento da den-
sidade de biofilmeigrânulos (VAN LOOSDRECHT et alii, 1995), e, como será
visto posteriormente, propicia a obtenção de grfu1ulos estáveis mesmo em baixas

concentrações de oxigênio (DE KREUK e VAN LOOSDRECHT, 2004). Para
conseguir tais objetivos, algumas condições de operação deve1n ser asseguradas.
No item relativo aos fatores que afetam a granulação aeróbia (item 4.4), maiores
detalhes serão abordados sob essa perspectiva.
Outro fator também possivelmente relacionado à formação de grânulos aeró-
bios está relacionado às tensões de cisalhamento, conforme será descrito no item
4.4. A hidrodinâmica do sisten1a está intimamente relacionada ao desenvolvimen-
to de agregados densos, tais como biofilmes. Do ponto de vista microbiológico,
biofilmes e lodo granular podem ser considerados como sendo iguais, embora
existam diferenças óbvias do ponto de vista técnico. Diante dessa consideração, as
hipóteses criadas na tentativa de caracterizar os biofilmes se tornaram úteis quan-
do da elucidação das condições requeridas para a formação de grânulos aeróbios
estáveis e com as características desejadas.
Em decorrência de suas características singulares, a tecnologia de granulação
aeróbia foi recentemente destinada ao tratamento de águas residuárias altamente
concentradas contendo compostos orgânicos, nitrogênio, fósforo, substâncias tóxi-
cas e xenobióticos (TIANG et alii, 2002; MOY et alii, 2002; TAY et alii, 2002b;
LIN et alii, 2003; ADAV et alii, 2007 a,b; ADAV e LEE, 2008).
Antes de serem apresentados alguns estudos envolvendo inúmeras aplicações
dos grânulos aeróbios (item 4. 7), é pertinente destacar o processo de granulação
aeróbia e as diferentes fases que compõem esse processo gradual de transformação
de lodo ativado convencional em grânulos aeróbios (item 4 .3). Os principais fa-
tores que infl uenciam a granulação aeróbia, alguns estudos de caso envolvendo a
formação de lodo granular aeróbios e os processos de conversão que ocorrem nos
grânulos aeróbios serão abordados nos itens 4.4, 4.5 e 4.6, respectivamente.
4.3 PROCESSO DE FORMAÇÃO DE GRÂNULOS AERÓBIOS

Existem diferentes ideias e hipóteses a respeito da formação de grânulos ae-
róbios, conforme apresentado, de forma ilustrativa, na figura 4.3. Na literatura,
existem inúmeros estudos que propõem mecanismos na tentativa de descrever o
processo de granulação, embora não haja um consenso a respeito do processo de
evolução do lodo ativado para lodo granular.
Primordialmente, a biogranulação envolve interações entre células, contem-
plando fenômenos biológicos, físicos e químicos, os quais estão relacionados com
a formação de associações multicelulares bastante estáveis e contíguas. Para que
as células bacterianas presentes em uma cultura se agreguem, diversas condições
devem ser asseguradas (LIU e TAY, 2004).
Desprend·
irnento
Hidrofobicidade
Velocidade de
crescimento
~ ? ?
• Formulação de·
lodo granular
~
•? 'l
• •
FIGURA 4.3 Diferentes ideias e hipóteses relacionadas à formação de lodo granular.
Tay et alii (2001 a) descreveram que a granulação aeróbia é um processo de

autoimobilização que não requer uso de material suporte. Posteriormente, Liu e
Tay (2002) propuseran1 as seguintes etapas correspondentes ao processo de gra-
nulação aeróbia:
1) Contato entre micro-organismos para formar agregados por forças hidro-
dinân1icas, difusivas, gravitacionais e/ou termodinân1icas.
2) Estabilização dos contatos multicelulares resultantes das forças de atra-
ção inicial, as quais compreendem forças físicas (van der Waals, atração
de carga oposta, forças termodinâmicas, tensão superficial, hidrofobicida-
de), forças químicas (emparelhan1ento iônico, ligação interpartículas) ou
ainda forças bioquímicas (fusão da membrana celular, atração de receptor
celular, desidratação da superfície celular).
3) Maturação da agregação celular por meio da produção de polí1neros extra-
celulares, crescimento de grupainentos celulares e 1nudanças metabólicas,
os quais facilitam a interação entre células e resultam em uma estrutura
microbiana organizada.
4) Formação e estabilização da estrutura tridimensional do agregado micro-
biano no estado estacionário por meio de forças de cisalhamento hidrodi-
A •
nan11cas.
Em suma, a granulação aeróbia consiste em um processo gradual envolvendo

a transformação de lodo ativado em agregados compactos, os quais posteriormen-
te adquirem a forma de lodo granular e finalmente de grânulos maduros (TAY et
alii, 2001a) . Nesse contexto, muito além de um simples processo de aglomeração
aleatória de bactérias, a formação de biogrânulos constitui um processo de evolu-

ção microbiana. Na figura 4.4 pode-se observar a estrutura de grânulos maduros,
em diferentes a1npliações, cultivados em um RBS do tipo coluna de bolhas, ali-
mentado com efluente sintético contendo acetato como fonte de carbono.
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(a) (b) (e)

FIGURA 4.4 Grânulos aeróbios formados em RBS do tipo coluna de bolhas. (a) Tamanho original ;
(b) Aumento de 7,5x; (e) Aumento de 20x.
Em geral, as estruturas de biofilmes/grânulos consistem en1 ecossistemas

altamente complexos, no que se refere à microbiologia e à morfologia. Nesses
sistemas, a estrutura influencia a atividade, que, por sua vez, exerce influência
na estrutura. Devido à complexidade das estruturas dos biofil mes e grânulos, se
torna difícil encontrar as causas e os efeitos em questões envolvendo a morfogê-
nese (VAN LOOSDRECHT et alii, 2005). Além disso, deve-se atentar ao fato
de que, sob a ótica da engenharia, os eventos que ocorrem durante a granulação
microbiana pode1n ser identificados e de certa forma co1npreendidos. De forma
diametralmente oposta, os eventos que acontecem a nível molecular ou genético
requerem um entendimento mais profundo de seus mecanismos.
Embora diversas teorias a respeito dos fatores cruciais para o desenvolvimen-
to de grânulos venham sendo intensivamente discutidas, na grande maioria dos
estudos envolvendo lodo granular tem sido negligenciada a possível contribuição
de protozoários e fungos no processo de formação dos grânulos e as suas interações
com bactérias. Entretanto, esses organismos eucarióticos apresentam diversas
funções importantes em sisten1as de lodos ativados (conversão de biomassa e cla-
rificação de água) (CURDS et alii, l 969; FRIED e LEMMER, 2003) e estão en-
volvidos na formação e estruturação de biofilmes aplicados em processos que vão
além da esfera dos sistemas de tratamento de águas residuárias (HARTMANN et
alii, 2007).
Diante desse contexto e levando-se em consideração observações preliminares
de grânulos, nos quais ciliados dotados de talo e fungos estiveram presentes em
nún1ero significativo, Weber et alii (2007) investigaram a função apresentada por
protozoários ciliados e fungos na formação da estrutura de grânulos microbianos a

partir de lodo ativado convencional . Os autores analisaram a estrutura e o desen-
volvimento de diferentes tipos de grânulos aeróbios, cultivados em três reatores
operados em bateladas sequenciais (RBS), de escala laboratorial. Esses sistemas
foram alimentados, respectivamente, com água residuária rica em particulados
contendo 111alte e obtida pela mistura de pó de cevada com água (RBS 1), com água
residuária de indústria cervejeira (RBS2) e com meio sintético (RBS3 ) .
Uma visão detalhada da arquitetura e con1posição dos grânulos foi consegui-
da lançando-se mão de microscopia eletrônica de varredura (MEV), microscopia
óptica e microscopia confocal de varredura a laser. As observações microscópicas
revelaram que os grânulos consistiram em bactérias, de substâncias poliinéricas
extracelul ares (Extracellular Polymeric Substances - EPS), de protozoários e, em
alguns casos, de fungos. O desenvolvimento do lodo granular, a partir de lodo
ativado até a obtenção de grânulos maduros, foi dividido em três fases. Durante
a primeira fase, protozoários ciliados contendo talo da subclasse Peritrichia esta-
belece ram-se e111 grande quantidade nos flocos de lodo ativado, formando novos
talos. Em seguida, esses protozoários começaram a proliferar e formaram grandes
colônias, enquanto ao mesmo tempo, seus talos foram colonizados por bactérias.
A colonização foi intensificada pelo 111ovimento de seus cílios, os quais propicia-
ram fluxo contínuo de nutrientes em direção às células bacterianas formado ras do
biofiln1e. Depois de poucos dias, muitas células de ciliados fixarrun-se à superfície
dos flocos microbianos. A maioria das colônias de ciliados formadas apresentou
forma de árvore e foi composta pelos gêneros Opercularia e Epistilys (WEBER et
alii, 2007).
Durante a segunda fase, os flocos de lodo agruparan1-se entre si e un1 gran-
de crescimento dos ciliados foi observado . Ao mesmo tempo que eram formados
flocos volumosos, ocorreu a formação de uma zona central que consistiu de restos
de talos de ciliados e bactérias responsáveis pela produção de EPS. Os talos dos
ciliados servira111 co1110 suporte para o desenvolvimento dos grânulos, uma vez que
as bactérias os utilizaram como substrato para o seu crescimento. Os flocos que se
agregaram foram considerados como sendo os precursores dos grânulos (WEBER
et alii, 2007).
Subsequentemente, com o início da terceira fase, os ciliados foram igual-
mente colonizados por células bacterianas e ficaram embutidos no biofilme em
expansão. Após determinado período, foram completamente cobertos por bacté-
rias, não conseguindo sobreviver. Algumas células de ciliados livre-natantes sem
talo surgiram e deixaram o biofilme. Nessa fase, grânulos bacterianos compactos
foram formados, os quais foram colonizados, pouco a pouco, pelos ciliados livres
que conseguiram sobreviver. Esses formaram novos talos e colônias, utilizados
co1110 substrato para o crescimento microbiano . Dessa forma, evidenciou-se a im-
portância dos ciliados no processo de formação da estrutura dos grânulos, uma
vez que os mesmos serviram como base para o crescimento do biofilme microbiano
(WEBER et alii, 2007) .
Em relação aos fungos, o seu papel no processo de granulação esteve relacio-
nado ao fato de que os seus filamentos (hifas), juntamente com os talos de ciliados,
funcionaram como suporte para que as bactérias pudessem crescer, aumentando
dessa manei ra a área disponível para a colonização bacteriana (WEBER et alii,
2007); Beun et alii (1999), conforme 1nencionado no item 4.5, també1n relata-
ram a possível contribuição de fungos como suporte na formação de grânulos,
sobretudo durante as fases iniciais do p rocesso de granulação.
\i\Teber et alii (200 7) ainda relataram que os grânulos n1aduros formados com-
preenderam diversas camadas n1icrobianas, compostas por espécies de bactérias
distintas responsáveis por diferentes processos (nitrificação, desnitrificação, entre
outros) . Nesses grânulos observou-se uma região central densa contendo células
bacterianas e EPS e uma porção externa estruturada de fonna livre consistindo
em ciliados e bactérias ou filamentos de fungos (WEBER et alii, 2007).
O material exopolimérico excretado pelos próprios micro-organismos tem sido
detectado em quantidades significativas tanto em grânulos aeróbios quanto anae-
róbios, forn1ando uma matriz tridimensional na qual bactérias e outros materiais
particulados estão presentes conjuntamente (GROTENHUIS et alii, 1991 ). Essas
substâncias poliméricas extracelulares (EPS), as quais compreendem polissacarí-
deos, proteínas, ácidos nucleicos, ácidos húmicos e lipídios que auxiliam na adesão
celular e na formação de bioagregados (biofilmes e flocos de lodo), possuem papel
iinportante no processo da granulação aeróbia, sendo vantajosas e1n diversos aspec-
tos relacionados à sobrevivência das células n1icrobianas nas mais variadas circuns-
tâncias e tornam possível a operação estável de processos de lodo granular aeróbio
justamente por estarem intimamente relacionadas com a estabilidade dos grânulos
(SCHMIDT e AHRING, 1994; LIU et alii, 2004b; NIELSEN e JAHN, 1999). A
in1portância das EPS é tan1bém realçada tendo em vista que o bloqueio de sua sínte-
se pode prejudicar ou ainda interromper a agregação microbiana, conforme relatado
por Cammarotta e Sant'Anna (1998) e por Hwang et alii (2006).
É válido apontar que os polissacarídeos são os únicos componentes do 1nate-
rial exopolimérico que são sintetizados extracelularmente para uma determinada
função específica, enquanto proteínas, lipídios e ácidos nucleicos estão presentes
na rede polimérica extracelular devido à excreção de polímeros intracelulares ou
ainda como resultado da lise celular (DURMAZ e SANIN, 200 1). Apesar de
estar presente em todos os tipos de agregados microbianos, tais como bioflocos e
biofilmes, são nos grânulos anaeróbios e aeróbios que os materiais exopoliméricos
estão em maior quantidade (TAY et alii, 2001a). A composição de EPS é variável,
estando relacionada às espécies mic robianas presentes e sua complexidade, ao
estado fisiológico das bactérias e às condições operacionais nas quais ocorre o de-
senvolvimento dos grânulos.
Do ponto de vista microbiológico, as substâncias poliméricas extracelulares

podem ajudar a estabilizar a estrutura da membrana e servir como barreira prote-
tora. Liu et alii (2004) descreveram a hipótese de que esses exopolímeros unem as
células e outros materiais particulados em agregados, facilitando a sua interação e
fornecendo extensiva área superficial para a ligação microbiana, funcionando dessa
maneira con10 verdadeiras "colas" biológicas. Os exopolímeros estão intimamente
relacionados com a coesão e a adesão das células, apresentando função crucial na
fisiologia microbiana e manutenção da integridade da estrutura de comunidades
de células imobilizadas. Em adição, podem estar envolvidos com a regulação do
metabolisn10 energético das bactérias. Altas tensões de cisalhamento estimulam as
bactérias a secretar mais 1naterial exopolimé rico, contribuindo dessa maneira para
a formação de grânulos com estruturas compactas e fortes. Em condições normais
de operação, não há necessidade de os micro-organismos excretaren1 quantidades
excessivas de EPS. O aun1ento da produção de EPS observado em biogrânulos é
induzido pelo estresse presente nas condições operacionais. Nesse contexto, diver-
sos são os parâmetros operacionais capazes de estiinular as bactérias a secretarem
mais essas substâncias. Entre eles, pode-se mencionar a configuração do reator,
a composição do substrato, a carga de substrato alimentada, o tempo de retenção
hidráulica, forças hidrodinâmicas, tempo de sedin1entação e1n reatores operados
em bateladas sequenciais e temperatura (LIU e TAY, 2004; LIU et alii, 2004).
Uma vez que as EPS acumulam-se na superfície celular como mate rial cap-
sular, algumas características das células, tais como hidrofobicidade, densidade de
carga, sítio de ligação e morfologia podem ser afetados. Tem sido proposto que o
material polimérico extracelular pode diminuir a carga negativa das superfícies
celulares, diminuindo a repulsão entre as células microbianas vizinhas, favore-
cendo a ligação entre elas e com outros materiais particulados inertes e fazendo
com que sedimentem em agregados e não em células individuais (SHEN et alii,
1993; SCHMIDT e AHRING, 1994). Já a interação hidrofóbica é reconhecida
como fundamental no p rocesso de biogranulação, tendo em vista que a 1naioria
das bactérias mantém contato com superfícies hidrofóbicas ou com outras células,
embora não se liguem a superfícies hidrofílicas (GHIGO, 2003) . A figura 4.5
ap resenta, de fo rma esquemática, a biogranulação auxiliada pela presença das
substâncias poliméricas extracelulares, as quais atuam como agentes de ligação
entre células vizinhas e entre células e materiais particulados inertes.
Responsável pela integridade estrutural dos grânulos aeróbios, o material
exopolimérico tem sido considerado como não prontamente biodegradável pelo
seu próprio produtor, isto é, os micro-organismos, mesmo no caso de ausência
de substrato (SUTHERLAND, 1999). Já outros estudos mostran1 que em pe-
ríodos sem disponibilidade de substrato houve a indução da degradação de EPS
pelos próprios micro-organismos, o que resultou no desprendimento de bactérias

(ZHANG e BISHOP, 2003; RUIJSSENAARS et alii, 2000) .
Bactérias individuais
(!
Ligação Formação
de agregado
Cadeia polimérica de EPS
FIGURA 4.5 Ilustração do processo de biogranulação auxiliado pela presença de substâncias

poliméricas extracelulares (EPS), evidenciado pela formação de pontes de ligação entre microflocos
e filamentos (adaptado de LIU et alíí, 2004).
Apesar de não existir um consenso a respeito do papel de diferentes compo-

nentes que fazem parte da matriz de EPS na estabilidade estrutural de grânulos
aeróbios e da controvérsia que existe sobre esse assunto, um estudo interessante
foi realizado por Adav et alii (2008). Esses autores procuraram observar a contri-
buição de diversos componentes das substâncias poliméricas extracelulares (EPS),
de forn1a individual, na estabilidade estrutural de grânulos aeróbios aliinentados
com água residuária contendo fenol como única fonte de carbono. Os grânulos
foram cultivados em reator em batelada sequencial, com ciclo de operação de 6 h
(5 min de enchimento, 320 min de aeração, 30 min de sedimentação e 5 min
de drenagem) e com alta razão entre altura e diâmetro (H/D = 24). Os grânulos
apresentaram diâmetro médio de 900 µ,m (ADAV et alii, 2008).
As funções de proteínas, a- e ~-polissacarídeos e lipídios foram avaliadas
por meio de sua hidrólise seletiva utilizando-se enziinas específicas para cada
componente das substâncias polimé ricas extracelulares (proteinase K para pro-
teínas; lipase para lipídios; a-amilase para a-polissacarídeos e ~-amilase para
~-polissacarídeos) e as mudanças estruturais dos grânulos foram observadas utili-
zando-se marcação fluorescente in situe 1nicroscopia confocal de varredura a laser.
As concentrações de proteínas, carboidratos e lipídios nos grânulos-controle (sem
adição de enzimas) foram de 240,0 + 13, 61,0 + 9,4e51, 1 + 7 ,8 mg/gSSV, res-
pectivamente . A relação proteína/carboidrato dos grânulos alimentados con1 fenol
foi de aproximadamente 3,9 (ADAV et alii, 2008).
Os autores observaram, por meio dos resultados obtidos por n1arca-
ção fluorescente dos grânulos controle com diferentes marcadores específicos
para cada componente das EPS, que as proteínas e as células mortas ficaram
distribuídas principalmente no centro do grânulo, enquanto as células ativas e

os a -polissacarídeos ficaram localizados na porção externa do lodo granular. Os
~-polissacarídeos ficara1n localizados tanto no centro quanto nas regiões externas
dos grânulos (ADAV et alii, 2008).
A hidrólise enzimática seletiva de proteínas, lipídios e a-polissacarídeos oca-
sionou um efeito mínimo sobre a integridade estrutural tridimensional dos grânu-
los, não ocasionando a desintegração dos mesmos. Entretanto, a hidrólise seletiva
de ~-polissacarídeos causou a fragmentação dos grânulos, sendo geradas pequenas
partículas com tamanho de 1O - 80 µm . Esse resultado reforçou a proposição
de Wang et alii (2005), a qual afirmava que os ~-polissacarídeos consistiam nos
componentes mais importantes para a estabilidade dos grânulos. A esses com-
ponentes da matriz de polímeros extracelulares foi atribuída a função de servir
como suporte principal da estrutura dos grânulos, na qual proteínas, lipídios,
a-polissacarídeos e células estão interligados para garantir estabilidade 1necânica
e integridade estrutural dos grânulos. Adav et alii (2008) ainda afirmaram que
uma adequada resistência mecânica pode ser conseguida utilizando quantidades
limitadas de ~-polissacarídeos, afirmação suportada pelo fato de os grânulos serem
estáveis mesmo apresentando alta razão proteína/polissacarídeo (3, 9) .
4.4 FATORES QUE AFETAM AGRANULAÇÃO AERÓBIA

O processo de granulação aeróbia é afetado por diversos parâmetros operacio-
nais, entre os quais pode-se n1encionar o ten1po destinado à decantação dos grâ-
nulos em reatores operados em bateladas sequenciais, velocidade de crescimento
dos micro-organismos, estratégia de alimentação, concentração de oxigênio dissol-
vido, intensidade de aeração, configuração do reator, composição/concentração do
substrato, ten1peratura e pH . Nesse contexto, pode-se imaginar que o cultivo dos
grânulos aeróbios será realizado com sucesso caso determinadas condições favorá-
veis sejam estabelecidas (LIU e TAY, 2004).
A seguir serão apresentados os p rincipais fatores que afetam a formação de
grânulos aeróbios, abordando a influência de cada um, de forma individual, nesse
processo. A sequência como são apresentados esses fatores representa, de certa
forma, a ordem de importância dos mesmos na fo rmação do lodo granular. Vale
lembrar que algu1nas vezes os fatores que influenciam decisivamente a granulação
aeróbia podem estar relacionados, influenciando uns aos outros. Dessa forma, é
sempre conveniente realizar uma análise global de todos esses fatores e não sepa-
rá-los como se agissem de forma independente no processo de formação de lodo
granular, até mesmo porque a combinação deles parece ser o fator crucial para se
obter grânulos estáveis.
4.4.1TEMPO DE DECANTAÇÃO
Embora o mecanis1no de fonnação de grânulos aeróbios en1 sistemas ope ra-

dos em batelada sequencial não tenha sido totalmente esclarecido, a maioria dos
t rabalhos na literatura aponta que o tempo de sedimentação é um dos principais
fatores de fo rmação de grânulos estáveis e densos. Como já comentado no item
4.2, reduzidos tempos de decantação causam forte "pressão de seleção" sobre a
biomassa presente no reator. Na verdade, quando são aplicados longos períodos de
sedimentação, flocos pobremente sedimentáveis não são efetivamente removidos
dos reato res, sendo capazes de superar o crescimento de grânulos, fato que certa-
mente dificulta a granulação aeróbia. Desse modo, é coerente pensar que grânulos
aeróbios serão formados quando os períodos de sedimentação são inferiores a um
determinado valor crítico.
Alguns estudos apontam que reduzidos tempos de decantação contribuem
para o aumento da granulação aeróbia GIANG et alii, 2002; LIN et alii, 2003;
HU et alii, 2005) . Tay et alii (2002b) avaliaram a granulação de bactérias nitrifi-
cantes em diferentes "pressões de seleção" e verificaram a necessidade da aplicação
das mesmas para a obtenção dos grânulos. \~Tang et alii (2007) verificaram que a
estabilidade do grânulo pode ser melhorada com aumento gradual da pressão de
seleção .
P rocu rando de1nonstrar a in1portância da pressão de seleção e o efeito do
ten1po de sedimentação no mecanismo de forn1ação dos grânulos aeróbios, Liu et
alii (2004) operaram quatro reatores R.B S (RBS, - RBS 4 ) de 2 ,5 L, cuja altura e
diâmetro eram de 127 cm e 5 cm, respectivamente. O ciclo de operação de cada
reator era semelhante, com 4 h de duração, sendo a única diferença refe rente à
duração da etapa de sedimentação. Numa primeira fase, no intuito de avaliar o
efeito do tempo de decantação na formação de grânulos, o mesmo fo i mantido em
20, 15, 1 O e 5 min no RBS 1 - RBS 4 , respectivamente . A concentração de biomas-
sa foi de 5,3; 4,9; 5,5 e 5,4 g/L no RBS 1 - RBS 4 , respectivamente. N o reator no
qual o tempo de sedimentação foi menor (RBS4), verificou-se excelente formação
de grânulos, com ausência de flocos de lodo. No entanto, nos demais reatores, a
percentagem de grânulos foi de apenas 10% no RB S" 15% no RBS2 e 35% no
RBS3 (LIU et alii, 2004).
Após ser atingido o período de estabilização dos grânulos, o tempo de sedi-
mentação foi reduzido de 20 min para 5 min no RBS l' 15 min para 2 min no
RBS2 e de 10 min para 1 min no RBS 3 . Esse procedimento acarretou em elevada
perda de biomassa por arraste. No entanto, uma vez restabelecido o equilíbrio nos
reatores, os flocos de lodo foram substit uídos integralment e por grânulos aeró-
bios. Os auto res ainda verificaram que, quanto menor o tempo de sedimentação
aplicado, menor o IVL obtido e maio r a hidrofobicidade da superfície das células,
contribuindo para a formação de grânulos estáveis (LIU et alii, 2004) .
Seguindo na mesma tendência, Qin et alii (2004) procuraram avaliar o efei-

to do tempo de sedimentação no processo de granulação em RBS . Os autores
verificaram que grânulos aeróbios foram cultivados con1 sucesso e tornaram-se
dominantes somente quando os reatores foram submetidos a tempos de decanta-
ção menores que 5 min. Em contrapartida, quando o tempo de sedimentação foi
maior que esse valor, foi obtida uma mistura de grânulos e lodo em suspensão.
4.4.2VELOCIDADE DE CRESCIMENTO DOS MICRO-ORGANISMOS
Conforme brevemente mencionado no item 4.2, a formação de grânulos aeró-

bios densos e estáveis é baseada, entre outros fatores, na diminuição da velocidade
de crescimento dos micro-organismos. Um método para atingir tal característica
em sistemas alimentados com substratos facilmente biodegradáveis é convertê-los
em polímeros armazenados dentro da célula, tais como poliidroxibutiratos (PHB).
Uma das melhores maneiras para alcançar tal conversão consiste em subn1eter
os reatores de lodo granular a dois regimes característicos: o regüne feast (com
disponibilidade de substrato) e o regimefamine (substrato totalmente consumido)
(DE KREUK e VAN LOOSDRECHT, 2004). A combinação desses dois regimes é
conhecida como regimejeast-famine, denominação que se rá utilizada até o final do
capítulo para descrevê-los. O regime feastjamine periódico, que na verdade repre-
senta uma espécie de seleção microbiana, é facilmente obtido em reatores operados
de modo descontínuo, tais como os reatores em batelada sequencial (RBS) . Tal
característica igualmente justifica e evidencia a preferência pelo uso desses siste-
mas no cultivo de grânulos aeróbios, ratificando o que já foi relatado no item 4.2.
Durante a fasejeast, altas concentrações de substrato altamente biodegradá-
vel estão presentes no meio líquido e são armazenadas intracelularmente pelos mi-
cro-organismos. Quando o regime feast é anaeróbio, são selecionados organismos
acumuladores de fosfato (PAO - responsáveis pela remoção de fósforo) ou organis-
mos acumuladores de glicogênio (GAO), dependendo da disponibilidade de fósforo
no afluente (BRDJANOVIC et alii, 1998; D E KREUK e VAN LOOSDRECHT,
2004) . Em contrapartida, quando o regime feast é aeróbio, o crescimento de ou-
tros micro-organismos heterotróficos é favorecido . Os substratos armazenados
podem ser utilizados pelos micro-organismos durante o período famine (sem dis-
ponibilidade de substrato externo) para o crescünento e a manutenção. A veloci-
dade de crescimento durante o regimefamine é geralmente menor que a respectiva
velocidade quando substratos externos altamente biodegradáveis estão presentes.
Dessa maneira, a formação de polímeros armazenados intracel ularn1ente favo rece
o desenvolvünento de lodo granular aeróbio denso e estável (BEUN et alii, 2002),
embora não garanta a estabilidade quando a concentração de oxigênio é reduzida
(MOSQUERA-CORRAL et alii, 2005). Para tal, outras condições operacionais
devem ser asseguradas, conforme evidenciado por De Kreuk e Van Loosdrecht

(2004). É importante mencionar que, quando ocorre a seleção de bactérias tais
co1no PAO e GAO em sistemas anaeróbios-aeróbios, o fator te1npo de decantação
(descrito no item 4. 1) se torna menos importante devido ao fato de essas bacté-
rias apresentarem a tendência inerente de formar agregados microbianos (DE
KREUK et alii, 2005a).
P icioreanu et alii (1998) postulou que biofil mes estáveis são formados quan-
do a razão entre a ta."Ca de crescimento da biomassa e o transporte difusivo é baixa
(pequenos gradientes de substrato e oxigênio) . Quando essa razão é elevada, isto é,
quando os gradientes são elevados, estrutu ras em forma de flocos irregulares são
predominantes. Essa suposição foi descrita por meio de um número característico
G (growth), conforme mostrado na equação ( 4 .1) .
2 µ mc.,·m
G = Ly · - - - (4 .1)
Onde G representa parân1etros que afetan1 consideravelmente as estruturas

de biofilmes e grânulos; C50 é a concentração de nutrientes solúveis no meio líqui-
do; D s corresponde ao coeficiente de difusão; C.nn representa a máxima densidade
da biomassa no biofilme; µ,,, é a taxa específica máxima de crescimento microbia-
no; LY corresponde à espessura do biofilme ou raio do grânulo.
Um pequeno valor de G resulta em biofilmes mais estáveis e homogêneos
ou ainda em melhor fo rmação de grânulos, o que significa que a formação está-
vel desses últimos em baixas concentrações de oxigênio deve ocorre r quando os
micro-organismos apresentarem baixa velocidade de crescimento (PICIOREANU
et alii, 1998). Essa hipótese foi demonstrada experimentalmente no trabalho de
De Kreuk e Van Loosdrecht (2004), descrito no item 4 .5 .
4.4.3 ESTRAT~GIADE ALIMENTAÇÃO
Como mencionado no item 4. 2, a adoção do regime feast-famine está dire-

tamente relacionada à seleção de micro-organis1nos cuja velocidade de cresci-
mento é reduzida, os quais são capazes de converter integralmente substratos
facilmente biodegradáveis em polímeros intracelulares. Esses micro-organismos,
por sinal, estão ligados ao desenvolvimento de grânulos aeróbios densos e estáveis,
inclusive e1n baixas concentrações de oxigênio dissolvido (DE KREUK e VAN
LOOSDRECHT, 2004).
Embora alguns trabalhos evidenciem que períodos sem substrato não tenham
sido considerados pré-requisitos para a granulação aeróbia (LI U e TAY, 2008;
LIU et alii, 2007), aumentos na hidrofobicidade devido à falta de material car-
bonáceo têm sido reportados (CHEN e STREVETT, 2003; KJELLEBERG e
HERMANSON, 1984). Durante a operação de RBS, períodos de aeração sem
disponibilidade de substrato propiciam o desenvolvimento de bactérias 111ais hi-
drofóbicas, facilitando a adesão microbiana. Esta última, por sinal, parece ser
uma estratégia efetiva dos micro-organismos contra a falta de substrato, os quais,
sob estas condições, mudam as características de suas superfícies (KJELLEBERG
e HERMANSON, 1984; TAY et alii, 200 1a). Segundo a visão termodinâmica,
o aun1ento da hidrofobicidade das superfícies celulares acarreta na diminuição da
energia de Gibbs em excesso da superfície, o que resulta numa maior interação
entre células e numa estrutura densa e estável. Além disso, células presentes em
colônias submetidas a períodos sem al ünentação podem fo rmar fibrilas que for-
talecem a interação e a comunicação intercelular (VARON e CHODER, 2000).
Diante desse contexto, fica evidente que períodos sem disponibilidade de substra-
to favorecem a formação de grânulos com alta capacidade de agregação microbia-
na, os quais se to rnam cada vez n1ais densos e resistentes, apresentando estrutura
compacta ao longo dos ciclos de operação dos reatores batelada sequencial.
Contrariamente à estratégia de adoção de um regime feast -famine, existem
na literatura evidências de que un1 longo período de aeração sem disponibilida-
de de substrato pode levar à diminuição da estabilidade do grânulo (WANG et
alii, 2006). McSwain et alii (2004) obtiveram um aumento no desempenho da
granulação aeróbia quando optaram pelo sistema de alimentação intermitente,
contando con1 diversas fases de enchin1ento. Nessas circunstâncias, a formação de
grânulos aeróbios densos e compactos foi favorecida.
4.4.4 OXIGENIO DISSOLVIDO EINTENSIDADE DE AERAÇÃO
Grânulos aeróbios podem ser formados em concentrações de oxigênio dissol-

vido reduzidas, tais como O, 7 a 1,0 mg/L (DANGCONG et alii, 1999), ou ainda
acima de 2 mg/L (TAY et alii, 2002a; BEUN et alii, 1999, BEUN et alii, 2002;
DE KREUK e VAN LOOSDRECHT, 2004) . Em alguns casos, foi reportado que
a estabilidade de grânulos aeróbios é afetada negativamente co111 a diminuição
da concentração de oxigênio dissolvido (DE KREUK e VAN LOOSDRECHT,
2004) . Maiores detalhes da influência desse parâmetro serão descritos quando da
ap resentação dos estudos de caso envolvendo a formação de lodo granular ae róbio
(item 4.5).
A intensidade de aeração e a velocidade ascensional de ar estão relacionadas
com a questão hidrodinâmica e com as tensões de cisalhamento (ADAV et alii,
2008; BEUN et alii, 1999). Essas, por sua vez, podem estimular a produção
de polissacarídeos extracelulares (TAY et alii, 200 1b), os quais, conforme men-
cionado no ite1n 4.3, estão relacionados com a coesão e a adesão de células. Por
conseguinte, consistem en1 importantes agentes responsáveis pela manutenção da
integridade estrutural de comunidades de células imobilizadas, segundo observa-
do por Tay et alii (2001 c) .
Dessa forma, a formação de grânulos aeróbios pode se r favorecida quando os
mesmos são submetidos a elevadas forças de ruptura, representadas, nesse caso,
por elevadas intensidades de aeração e velocidades ascensionais de ar. Além disso,
o desenvolvimento de bactérias filamentosas, capaz de deteriorar a excelente capa-
cidade de sedimentação do lodo granular, é minimizado.
Adav et alii (2007b) compararam processos de granulação em três reatores
idênticos alimentados com água residuária contendo fenol e submetidos a dife-
rentes intensidades de aeração (1-3 L ar/min). Em baixas vazões de ar (1 L/min),
não foram for1nados grânulos. E1n contrapartida, na maior vazão de ar testada
(3 L/min), foram obtidos grânulos maduros e estáveis (1-1,5 mm) com interior
compacto. Em vazões de ar intermediárias (2 L/min), se desenvolveram grânulos
grandes (3 -3,5 mm) dotados de filamentos abundantes. Os mesmos autores afir-
maram que níveis de aeração intermediários não são capazes de fornecer oxigênio
suficiente nem de quebrar filamentos presentes de forma abundante, acarretando
possíveis perdas de rendimento do RBS (ADAV et alii, 2007b).
No trabalho realizado por Tayet alii (2001a), procurou-se avaliar o efeito das
forças de cisalhamento na granulação aeróbia. Os autores iniciaram a operação de
um RBS alimentado con1 glicose como fonte de carbono submetido a duas veloci-
dades superficiais de ar (0,008 e 0,025 m/s). Na menor velocidade de ar aplica-
da, foram formados somente flocos macios, não sendo observados grânulos. Em
contrapartida, quando o sistema foi submetido à velocidade de ar de 0,025 m/s,
conseguiu-se obter grânulos con1 forma regular. Os autores ainda complementam
que, segundo as leis da termodinân1ica, as tensões de cisalhamento ocasionadas
pela aeração de fluxo ascendente podem forçar os agregados densos periodicamen-
te submetidos a condições de falta de substrato (considerado como fator importan-
te na granulação aeróbia conforme discutido no item 4.3) a formar grânulos com
forma regular, os quais apresentam mínima energia livre de superfície.
Liu et alii (2005) submeteram dois reatores airlift operados em bateladas
sequenciais a diferentes velocidades ascensionais de ar, 2 ,2 e 3 ,3 cm/s, respec-
tivamente. No reator no qual foi utilizada a menor velocidade, ocorreu um de-
créscimo no valor do IVL de 103 ,5 para 4 7 ,2 n1L/g após o aparecin1ento dos
primeiros grânulos. Não obstante, poucos dias depois apareceram organismos
filamentosos que ocasionaram o aumento do IVL para 1 70 mUg, e, consequen-
temente, arraste de biomassa do reator. Em contrapartida, no reator cuja veloci-
dade ascensional aplicada foi de 3 ,3 cm/s, a diminuição do IVL foi ainda maior,
passando para 26,5 mL/g. Nesse reator a quantidade de bactérias filamentosas foi
bastante pequena, sem contar que os grânulos formados apresentaram estrutura
bem definida.
4.4.5 TEMPO DO CICLO
Outro fator importante no processo de granulação se refere ao tempo do ciclo

do RBS, que ta1nbém exe rce uma pressão de seleção hidráulica sobre a comunida-
de microbiana. Ciclos de curta duração podem suprimir o crescimento de sólidos
suspensos em virtude do arraste frequente de material suspenso. Entretanto, caso
o RBS seja operado em tempos de ciclos extremamente pequenos, pode ocorrer
perda de lodo, especialmente quando o crescimento é incapaz de compensar essa
perda. Como resul tado, os sólidos são arrastados do reator, dificultando a gra-
nulação microbiana. Sendo assim, o tempo do ciclo deve ser tal que restrinja o
crescimento dos sólidos en1 suspensão, embo ra seja suficientemente longo para
permitir o crescimento e a acumulação dos micro-organismos (LIU e TAY, 2004).
Liu e Tay (200 7a) verificaram que, quando o tempo do ciclo aumentou de 1,5
para 8 horas, a velocidade específica de crescimento da biomassa diminuiu de 0,266
para 0,031 d- 1, enquanto o fator de conve rsão de substrato em células diminuiu de
0,316 para 0,063 gVSS/gDQO. Os maiores grânulos foram cultivados em ciclos de
1,5 h enquanto a estrutura dos grânulos cultivados en1 4 h foi a mais compacta.
Tay et alii (2002b) investigaram o efeito da pressão de seleção hidráulica, por
meio da variação do te1npo de ciclo, no desenvolvimento de grânulos nitrificantes
em RBS em formato de coluna. A granulação nitrificante não foi observada no
maior tempo de ciclo testado (24 h) devido à baixa pressão de seleção hidráulica,
tampouco no menor tempo de ciclo aplicado (3 h), no qual o lodo nitrificante foi
arrastado do reator. No entanto, nos ciclos de duração intermediária em relação
aos dois anteriores, particularmente 6 e 12 h, obteve-se sucesso na formação de
grânulos nitrificantes (TAY et alii, 2002b) .
4.4.6 CONFIGURAÇÃO DO REATOR
Outro fator que influencia o processo de formação de grânulos aeróbios é a

configuração do reator, a qual possui impacto no fluxo do líquido e na agregação
microbiana no reator (BEUN et alii, 1999). A granulação aeróbia, quando reali-
zada em reatores em forn1ato de coluna com fluxo ascendente, difere da realizada
em reatores perfeitamente agitados, especialmente em virtude das propriedades
hidrodinâmicas de cada sistema, que modificam as interações entre fluxo e agrega-
dos microbianos. Os reatores em formato de coluna, cuja relação altura/diâmetro
é elevada, propiciam uma trajetória de fluxo circular longa, permitindo que os

agregados de micro-organismos sejam constantemente sujeitos a atritos hidráu-
licos e elevada turbulência (iguahnente ocasionada pelo fluxo ascendente de ar),
tendendo a formar grânulos de forma regular. Em contrapartida, nos reatores
perfeitamente agitados, os agregados microbianos se movimentam com fluxo dis-
perso em todas as direções, e são sujeitos a tensões de cisalhamento, t rajetória de
fl uxo ascendente e colisões aleatórias variáveis. En1 tais condições, a for1nação de
grânulos com forma e tamanho irregulares é favorecida (LIU e TAY, 2002).
Tendo em vista que a velocidade de sedimentação é um impo rtante crité rio
de seleção de grânulos, uma alta razão altura/diâmetro em reato res em forma de
coluna é vantajosa. Em primeiro lugar, assegura longa trajetória circular que per-
mite fricção hidráulica entre os agregados. Em segundo lugar, quando associada
à ausência de um decantador secundário, tal característica resulta em um reator
compacto.
\iVinkler et alii (2011), operando u1n reator de lodo granular com alta razão
altura/diâmetro destinado à remoção simul tânea de nitrogênio e fósforo, observa-
ram uma segregação da biomassa ao longo do leito de lodo. Por meio da análise de
hibridização por fluorescência in situ (FISH), os autores observaram que na base
do leito de lodo havia mais organisn1os acumuladores de fosfato (PAO), enquanto
o topo do leito do lodo era dominado por organismos acumulados de glicogênio
(GAO) . Esses últimos apenas competem com PAO pela matéria orgânica afluente,
não contribuindo para a remoção de fósforo . Por conseguinte, sua permanência
no reato r é indesejável . Por meio da remoção seletiva de lodo a partir do topo do
reator para o controle da retenção de sólidos, foi possível reduzir a quantidade
de GAO e propiciar que PAO se tornassem dominantes no sistema. Dessa forma,
foi possível obter boas eficiências de remoção de fósforo mesmo sob operação a
30º C, favorável ao desenvolvimento de GAO (LOPEZ-VAZQUEZ et alii, 2008) .
Os autores enfatizam que a segregação de biomassa ao longo do leito de lodo ofe-
rece uma possibilidade extra de influenciar a competição entre diferentes micro-
-organismos no intuito de se obter a população microbiana desejada.
De Kreuk e Van Loosdrecht (200 4) compararam duas configurações de rea-
tores de lodo granular (airlift - SBAR e coluna de bolhas - SBBC), que, por sinal,
são as mais utilizadas no cultivo de grânulos aeróbios. Em reatores SBBC com-
binados com regime de alimentação na forma de pulso sob condições aeróbias,
grânulos instáveis fo ram formados (BEUN et alii, 2000; LIU e TAY, 2002). A
estabilidade atingida em SBAR é provaveln1ente devida ao fato de esse último
reator possuir maiores tensões de cisalhamento locais. Quando a alimentação foi
realizada em condições anaeróbias em um reator SBBC, foi possível formar lodo
granular estável, embora o período de start-up do reator tenha sido maior. Ao que
tudo indica, diminuindo a máxima velocidade de crescimento dos micro-organis-
mos devido à seleção de PAO e GAO, o que induziu a conversão de todo o acetato
em PHB, a importância da tensão de cisalhamento na formação de grânulos pare-

ce se tornar menos crítica. Dessa forma, as características dos grânulos formados
tanto en1 SBBC quanto e1n SBAR foram semelhantes. Entretanto, o fato de que
o tempo destinado para a obtenção de grânulos tenha sido maior no SBBC em
detrimento ao SBAR é uma indicação que as forças hidrodinâmicas nesse último
reator são preferidas. No item 4 .5 serão descritas maiores informações a respeito
da comparação dessas duas configu rações de reatores (tabela 4.1 ).
TABELA 4.1 Comparação entre três diferentes tecnologias de reatores (SBAR, SBBC e BAS)
utilizadas em diferentes pesquisas envolvendo lodo granular (adaptado de BEUN et alii, 2000)
SBAR SBBC
BASR
(Sequencing batch airlift (Sequencing batch bubble
(Biofilm airlift suspension)
reactor) collumn)
D Sistema alimentado de D Sistema alimentado de D Sistema alimentado de

forma descontínua forma descontínua forma contínua
D Substrato: Acetato D Substrato : Etanol O Substrato : Acetato
□ Sem necessidade de □ Sem necessidade de o Sem necessidade de

sedimentador secundário sedimentador secundário sedimentador secundário
□ Requer riser □ Não requer riser o Requer risere separador

trifásico
D Não requer suporte D Não requer suporte D Requer suporte
□ Variável de seleção: tempo □ Variável de seleção: tempo o Variável de seleção: TRH

de sedimentação de sedimentação
□ Desprendimento □ Desprendimento o Desprendimento

determinado principalmente determinado principalmente determinado principalmente
por condições por condições pela concentração de
hidrodinâmicas hidrodinâmicas suportes
D Ocorrência de nitrificação e D Sem ocorrência de

desnitrificação desnitrificação
D Concentração de biomassa : D Concentração de biomassa: D Concentração de biomassa:

4 g/L 3 g/L 0,7 g/L
D Densidade da biomassa: D Densidade da biomassa : D Densidade da biomassa :

48 gil. 12 g/L 15 gil
D Diâmetro médio dos D Diâmetro médio dos D Diâmetro médio das
grânulos: 1,0 mm grânulos: 2,0 mm partículas de biomassa:
0,35 mm (diâmetro do
suporte : 0 ,26 mm)
D Área específica superficial D Área específica superficial o Área específica superficial

dos grânulos no reator: dos grânulos no reator: dos grânulos no reator:
785 m2/m3 340 m2/m3 1 700 m2 /m 3
Vale ressaltar que a possibilidade de se utilizar um reator do tipo coluna de

bolhas em grande escala ao invés de um reator airlift significa vantagens econômi-
cas, tendo em vista que a construção do priineiro reator é mais fácil e representa
menor custo. Adicionalmente, a drenagem do efluente pode ser mais facilmente
implementada no SSBC, uma vez que no SBAR a presença de riser exige maior
atenção para permitir igual descarte do tubo de subida (riser) e do tubo de descida/
coluna descendente (downcomer) . Caso esse detalhe de projeto não seja levado em
consideração, é possível que o lodo granular seja arrastado do reator (DE KREUK
e VAN LOOSDRECHT, 2004) .
4.4.7 COMPOSIÇÃO ECONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO (CARGA ORGÃNICA APLICADA)
São diversos os substratos que já foram utilizados para o cultivo de grânulos

aeróbios. Entre os principais encontram-se glicose, acetato, fenol, amido, eta-
nol, melaço, cana-de-açúcar e outros componentes sintéticos (LIU e TAY, 2004;
TAY et alii, 2002a; BEUN et alii, 1999; ZHENG et alii, 2005; ADAV et alii,
2007a,b). Informações a respeito do cultivo de grânulos com água residuária real
também foram reportadas (SCHWARZENBECK et alii, 2004; ARROJO et alii,
2004; CASSIDY e BELIA, 2005; INIZAN et alii, 2005; TSUNEDA et alii,
2006; FIGUEROA et alii, 2008). Diante dessas pesquisas realizadas, pode-se
afirn1ar que a grande 1naioria da águas residuárias contendo quantidade suficiente
de matéria orgânica biodegradável é passível de tratan1ento por meio da tecnologia
de lodo granular.
Tay et alii (2001 a) avaliaram as características dos grânulos cultivados em
dois reatores operados em bateladas sequenciais, sendo um alimentando com gli-
cose (RBS 1) e outro co1n acetato (RBS2) como fonte de carbono. Ambos os reatores
foram inoculados com lodo ativado proveniente de uma planta de tratamento de
água residuária. O IVL do lodo utilizado como inóculo era elevado, corresponden-
do a 230 mUg, valor associado à presença significativa de bactérias filan1entosas.
Após uma semana de operação, observou-se que os filamentos gradualmente de-
sapareceram do reator alimentado com acetato, embora tenham permanecido no
reator alimentado com glicose. O IVL dos agregados compactos formados no RBS 1
e no RBS2 foi de 190 mUg e 1 78 1nUg, respectivan1ente.
Após duas sen1anas de operação, observou-se a formação de grânulos com
forma externa redonda em ambos os reatores. Bactérias filamentosas continuaram
a predominar no reator alimentado com glicose. Já no reator alimentado com ace-
tato, tais bactérias responsáveis pelo intumescimento do lodo desapareceram por
completo. Apesar disso, o processo de formação dos grânulos aeróbios apresentou
um padrão similar em ambos os reatores. O IVL apresentado pelos grânulos nessa
etapa do processo de granulação aeróbia diminuiu para 115 mUg no RBS 1 e para
114 mUg no RBS 2 (TAY et alii, 2001a).
Após três semanas de operação, grânulos maduros foram obtidos em ambos

os reatores. Os grânulos alimentados com glicose apresentaram uma superfície
externa macia, fato provavehnente relacionado à predon1inância de bactérias fila-
mentosas nesses aglomerados microbianos, em particular. O IVL dos grânulos ob-
t idos nessa etapa do processo de granulação situou-se na faixa entre 51 -85 mL/g
no RBS, e entre 50-80 mUg no RBS2 • O diâmetro médio dos grânulos cultivados
nesses dois reatores foi de 2,4 e 1,1 m1n, respectivamente (TAY et alii, 2001a) .
A diversidade microbiana dos grânulos alimentados com glicose e acetato
apresentou diferenças. O primeiro tipo consistiu principalmente em bactérias de
formato redondo, notadamente na sua porção interna, e algumas bactérias em for-
mato de bastonete na superfície, juntamente com filamentos; o segundo foi repre-
sentado predominantemente por bactérias em formato de bastonete. Em relação à
velocidade de sedimentação, parâmetro importante a ser levado em consideração
quando se trata da tecnologia de granulação aeróbia, obtiveran1-se os valores de 3 5
e 30 m/h para os grânulos cultivados no RBS, e RBS 2 , respectivamente. As altas
velocidades de sedimentação apresentadas pelo lodo granular estão intimamente
relacionadas com a estrutura mic robiana densa apresentada por esses agregados
microbianos.
A concentração de substrato também pode ter implicações no crescimento de
bactérias filamentosas . Em geral, grânulos cultivados em RBS recebem concen-
t rações constantes de substratos orgânicos, em termos de DQO (DANGCONG et
alii, 1999; BEUN et alii, 1999; TAYet alii, 2001a) . Após a formação de grâ-
nulos maduros, a concentração de biomassa no reator se encontra tipicamente na
faixa de 1O a 20 g!L. Em sistemas operados em regime de batelada, a relação entre
concentração inicial de substrato e concentração de bion1assa inicial (S0 /X 0 ) pode
ser utilizada para descrever a disponibilidade de substrato para os micro-organis-
mos (LIU e LIU, 2006). Liu e Liu (2006) demonstraram que com o decorrer da
operação de RBS com lodo granular, a concentração de biomassa aumentou, resul-
tando no decréscimo da relação S0 /X 0 • Nessas condições de pouca disponibilidade
de substrato e alta concentração de biomassa, os autores observaram significativo
crescimento de micro-organismos filamentosos .
4.4.8 LODO UTILIZADO COMO INOCULO
A qualidade do lodo inoculado aos reatores visando à formação de grânulos

aeróbios está relacionada às suas características macroscópicas, sedimentabilidade,
propriedades de superfície (hidrofobicidade e densidade de carga) e atividade n1i-
crobiana (LIU e TAY, 2004). Na maioria dos estudos, os grânulos aeróbios foram
cultivados com inóculo proveniente de sisten1as de lodos ativados, sendo a atua-
ção da comunidade bacteriana presente no inóculo essencial para o processo de
granulação. Bactérias hidrofílicas tendem a se ligar menos aos flocos microbianos

em comparação com as bactérias hidrofóbicas, as quais constituem a maioria das
bactérias livres no efluente de plantas de tratamento (ZITA e HERMANSSON,
1997). A hidrofobicidade das células, por sinal, influencia o processo de granu-
lação, conforme já discutido no item 4.3. Quanto maior o número de bactérias
hidrofóbicas no inóculo, mais rápida será a formação dos grânulos e melhores
se rão as características de sedin1entabilidade dos mesmos (WILEN et alii, 2007).
4.4.9TEMPERATURA
A formação de grânulos estáveis é afetada pela temperatura. Em geral, a

maioria dos estudos lançando mão da tecnologia de lodo granular aeróbio foi
realizada em ten1peraturas an1bientes (20-2S ºC). De Kreuk et alii (2005c) in-
vestigaram o efeito da variação de temperatura na estabilidade dos grânulos
aeróbios e nos processos de conversão que ocorrem no interior dos mesmos.
Para tanto, operaram um reato r em batelada sequencial, o qual foi sub1netido a
mudanças de temperatura em curto e longo prazos. A partida do reator, quando
realizada à temperatura de 8ºC, resultou na formação de grânulos com estrutura
irregular e no crescimento de organis1nos filamentosos, levando à perda substancial
de bion1assa por arraste e à instabilidade operacional. De Kreuk et alii (2005c)
ainda observaram que, quando o start-up do reator foi realizado a 20ºC, tornou-se
possível operar o sistema de forma estável, mesmo quando a temperatura foi dimi-
nuída para 1 SºC e posterior1nente para 8ºC. Os resultados obtidos por esses autores
evidenciam a importância de se realizar o start-up de reatores de lodo granular de
escala-piloto ou real, em períodos de temperatura elevada, como no verão. A capa-
cidade desnitrificante e a velocidade de remoção de nutrientes foram reduzidas em
baixas te1nperaturas (DE KREUK et alii, 2005c), assunto que será abordado quan-
do da apresentação das aplicações da tecnologia de lodo ativado granular (item 4. 7).
4.4.10 pH
O pH do meio afeta significativamente a velocidade de crescimento micro-

biano. A oxidação em condições de altas cargas orgânicas produz quantidades
suficientes de CO 2 para reduzir o pH em soluções não tamponadas (McSWAIN et
alii, 2004). Fungos crescem bem em condições de pH reduzido e podem contri-
buir significativamente para a granulação inicial, conforme ressaltado no item 4.3
(McSWAIN et alii, 2004; BEUN et alii, 1999). Esses organismos são capazes de
liberar prótons em troca de NH; em solução, contribuindo dessa maneira para
o decréscimo do valor de pH (DEACON, 2006 apud ADAV et alii, 2008) . Yang
et alii (2008) observaram que a granulação aeróbia em pH 4,0, na presença de

fungos, favoreceu a formação de grânulos cujo tamanho foi de aproximadamen-
te igual a 7 n1m. Em contrapartida, em pH 8,0, condição na qual a granulação
foi controlada por bactérias, o tamanho do grânulo alcançou somente 4,8 mm.
Apesar dessas evidências, os efeitos do pH na granulação aeróbia não foram com-
pletamente elucidados (ADAV et alii, 2008).
4.4.11 ADIÇÃO DE CÃTIONS DIVALENTES
A granulação aeróbia pode ser influenciada pela adição de cátions divalentes,

tais como ferro e cálcio. Segundo alguns pesquisadores, concentrações elevadas
desses cátions poden1 acelerar a formação de grânulos, aumentar a sua estabili-
dade e resistência e melhorar suas características de sedimentação (LIU e TAY,
2004; DE KREUK et alii, 2005a). Os cátions divalentes aderem aos grupos
de carga negativa na superfície das bactérias e das moléculas de polissacarídeos
extracelulares, atuando como pontes de ligação. Essas, por sua vez, propiciam a
aglomeração microbiana (LIU e TAY, 2004).
Jiang et alii (2003) observaram que a adição de cálcio no meio de alimenta-
ção em concentrações de 100 mgCa2 +/L, possibilitou que a formação dos grânulos
fosse realizada de forma mais rápida (16 dias) em comparação com o caso na qual
esse cátion não foi adicionado (32 dias). Além disso, verificou-se que os grânulos
alimentados com cálcio apresentaram melhores características de sedimentação e
maior conteúdo de polissacarídeos (JIANG et alii, 2003) .
4.5 ESTUDOS DE CASO ENVOLVENDO AFORMAÇÃO DE GRÂNULOS AERÓBIOS

Nesse item serão apresentados alguns trabalhos relacionados ao processo de
formação de lodo granular aeróbio. Vale mencionar que alguns deles, por sinal,
corresponden1 às primeiras investigações nesse campo de estudo, motivo pelo qual
a riqueza de detalhes foi maior durante a sua apresentação. Além disso, as pesqui-
sas relatadas a seguir evidenciam a influência de alguns dos fatores que afetam o
processo de granulação aeróbia, tópico discutido no item 4 .4 .
Beun et alii (1999) cultivaram grânulos de micro-organismos heterotróficos
aeróbios en1 RBS em formato de coluna, cujo volun1e era de 2,25 ou 2,5 L. O diâ-
metro interno da coluna era 5,6 cm e a altura total era de 150 cm, o que fornece
uma alta relação altura/diân1etro. Altos valores da relação altura/diâmetro tendem
a favorecer a formação de grânulos de forma regular, fato relacionado às forças
hidrodinâmicas presentes no reator. Como inóculo foi utilizado lodo de um RBS
convencional usado para a remoção de DQO. Os experimentos foram conduzidos
à temperatura ambiente 20 + 2 ºC e ar foi introduzido por meio de um difusor de

bolhas pequenas localizado na base da coluna.
O reator foi alimentado con1 efluente sintético cuja DQO era de 0,83 g/L,
nitrogênio Kjeldahl total (NKT) de 0,04 gN/L e fósforo total de O, 16 gP/L. O
tempo de ciclo foi de 3 ou 4 h . Deste total, os períodos de enchimento (com aera-
ção) e de sedimentação eram de 2 min. O período de esvaziamento era de 1 min
e o período de aeração era justamente o tempo restante, isto é, 177 1nin para o
ciclo de 3 h e 23 7 min para o ciclo de 4 h . O parâmetro principal escolhido para
selecionar a biomassa com alta velocidade de sedimentação foi o tempo de decan-
tação. A velocidade de sedimentação mínima variou de 12 a 24 m/h (BEUN et
alii, 1999).
Após a inoculação do reator com 1O mL de células em suspensão proveniente
do SBR anteriormente 1nencionado (período de partida), observações diretamente
do reator e em microscópio pennitiran1 observar que pellets de fungos filamentosos
(grânulos filamentosos) do1ninaram no reator, os quais funcionaram como un1a
matriz de imobilização na qual as bactérias puderam crescer e formar colônias. O
fato é que fungos facilmente formam filamentos de micélios que sedimentam bem
e podem ser retidos no reator. Bactérias não possue1n esta prop riedade, quando
em suspensão, sendo arrastadas do reator, motivo que explica a dominância dos
fungos filamentosos no período de start-up do reator (BEUN et alii, 1999).
Os grânulos fo rmados não eram estáveis e, em virtude da tensão de cisalha-
mento (principalmente ocasionada pela velocidade superficial do ar relativamente
elevada de 0,041 m/s), quebravam em pedaços depois de poucos dias, ocorren-
do a liberação de filamentos da supe rfície dos pellets, os quais tornaram-se mais
compactos. Os pellets cresciam até um diân1etro de 5-6 mm e posteriormente so-
frian1 lise provavelmente devido à limitação de oxigênio nas suas partes internas
(BEUN et alii, 1999).
Dessa forma, ocorreu washout de grande parte da biomassa (notadamente de
filamentos que não possuíam capacidade de sedimentar rapidamente para perma-
necer no reator), ocorrendo nova granulação . Os grânulos formados nesse segundo
estágio dificilmente continham filamentos e eram constituídos majoritariamen-
te por bactérias. Nesse estágio, colônias de bactérias puderam pern1anecer no
reator em virtude de serem grandes o suficiente para sedimentar rápido. Essas
colônias, por sua vez, cresceram posteriormente formando os grânulos (BEUN et
alii, 1999). Obviamente que esse mecanismo proposto foi baseado, de forma par-
ticular, nos experimentos com esse reator, o qual foi inoculado con1 uma pequena
quantidade de lodo em suspensão, capaz de sedünentar somente de forn1a lenta.
Caso o inóculo tivesse consistido em flocos e/ou em pequenos grânulos, o meca-
nismo seria diferente.
A morfologia dos grânulos foi analisada por meio da avaliação de alguns

parâmetros, por sinal mu ito utilizados quando se pretende caracterizar esse t ipo
de aglomeração microbiana, tais como fator de forma ( 41r · área · circunferência 2 ;
O = linha, 1 = círculo) e a razão de aspecto, isto é, quão redonda é a partícula
(mínimo diâmetro de Feret/máximo diâmetro de Feret; O = linha, 1 = círculo;
diâmetro de Feret: máxima distância entre dois pontos ao longo do limite sele-
cionado) . Os valores obtidos para esses dois parân1etros durante todos os regi-
mes operacionais foran1 em torno de 0, 45 e O, 79, respectivamente, sendo que
os mesmos foram independentes da velocidade de sedimentação, da velocidade
superficial do ar, da carga orgânica aplicada e do T RH (BEUN et alii, 1999).
O valor do pH flutuou em torno de 6 ,5 . A fonte de carbono (etanol) foi consu-
mida de forma constante e em máxima velocidade até que sua concentração fosse
nula, embora não tenha ocorrido nitrificação . Após o etanol ser integralmente
consumido, CO2 continuou sendo produzido devido à conversão dos compostos
armazenados no interior das células (BEUN et alii, 1999).
No período considerado ideal para a formação de grânulos estáveis, o reator
foi submetido a uma carga orgânica de 5 kgDQO/(m3 .d) e o tempo total de ciclo
foi de 3 h . O tempo de retenção celular aumentou nesse período de 1,8 para 3 ,4
dias, e1n grande parte devido ao au1nento do volume do leito. N essas condições,
observou-se a formação de grânulos com um diâmetro médio de 3 ,3 mm e un1a
densidade de 11, 9 gSSV/Lg,·ânutos· Em altas cargas orgânicas obteve-se, como já era
espe rado, maior crescimento de biomassa. Quando os outros parâmetros (mínima
velocidade de sedimentação, velocidade superficial do ar e TRH) fo ram ideais,
acumulou-se biomassa no sistema e a sua concentração sofreu um aumento. A
carga orgânica não apresentou um efeito direto na granulação nas condições testa-
das, embora tenha influenciado a forma final dos grânulos (BEUN et alii, 1999).
Observou-se que um pequeno TRH (6, 7 5 h) e uma alta taxa de cisalhamento
foran1 favoráveis para a granulação. Além disso, foi verificado que a mínima velo-
cidade de sedimentação equivalente a 24 m/h podia ser aplicada somente quando
a carga orgânica era baixa (2 ,5 DQO/(m3 ·d)) . Com essa carga, menos biomassa foi
acu1nulada no reator, fazendo com que a maior mínima velocidade de sedimenta-
ção pudesse ser aplicada sen1 que os grânulos exercesse1n influência uns aos outros
durante a sedimentação. Entretanto, con1 o aumento da carga orgânica para 5 kg
DQO/(m3 · d), a quantidade de grânulos aumentou, e a sedimentação ficou com-
prometida. A biomassa, nessas condições, não foi capaz de sedimentar abaixo do
nível de descarte do efluente tratado, fazendo com que parte dela fosse arrastada
do reator na etapa de esvaziamento. Nessas circunstâncias, diminuindo a velo-
cidade mínima de sedimentação, isto é, aumentando o tempo de sedimentação,
levou à melhor sedimentação e ao maior acúmulo de biomassa no reator. Segundo
os autores, outra possibilidade de evitar washout de biomassa seria justamente
contrabalançar o efeito do aumento da carga orgânica aplicando uma alta taxa
de cisalhamento, permitindo a formação de grânulos mais compactos e operação

estável (BEUN et alii, 1999).
Dangcong et alii (1 999) observaran1 o processo de granulação ae róbia em um
reator operado em bateladas sequenciais (RBS) de escala laboratorial alimentado
com meio sintético contendo acetato de sódio como substrato orgânico e cloreto de
amônio como fonte de nitrogênio amoniacal . O reator foi inoculado com lodo ativa-
do contendo bactérias filamentosas e apresentando IVL na faixa de 250-300 mL/g,
sendo mantido inicialmente sob concentrações de oxigênio de 3,5-4 mg!L. O TRH
aplicado foi de 8 h e o tempo de retenção celular foi de 20 dias. O tempo total do
ciclo fo i de 4 h (0,5 h de enchimento, O, 7 5 h de reação, 2,5 h de sedimentação e
0,25 h de retirada do sobrenadante). O reator foi mantido a 25 ºC e sob agitação
de 400 rpm para assegurar boa mistura e transferência de oxigênio.
Os autores observaram que após 20 dias, as bactérias filamentosas desapare-
ceram e o IVL do lodo diminuiu para 100-150 mL/g. E m seguida, a concentração
de oxigênio dissolvido no reator foi n1antida em valores reduzidos, situados na
faixa de 0,7-1,0 mg!L. Nessas condições, os flocos microbianos foram formados
e o IVL aumentou para 150-200 mL/g. Entretanto, o lodo floculento foi conver-
tido gradualmente para a forma de grânulos. Após um mês de operação em baixa
concentração de OD, praticamente toda biomassa estava sob a forn1a de grânulos.
Nessa etapa do processo, as eficiências de remoção de DQO, N-NH3 e nitrogênio
foram de 95, 95 e 60%, respectivamente. Bactérias filamentosas desapareceram e o
IVL foi de 80-100 ml/g, mesmo sendo a concentração de OD menor que 1,0 mg!L.
O reator permaneceu com essas mesmas características durante três meses de ope-
ração (DANGCONG et alii, 1999).
Por meio de análises microscópicas, observou-se que a morfologia dos grâ-
nulos foi esférica, diferentemente do lodo floculento. O diâmetro apresentado
pelo lodo granular variou de 0,3-0,5 mm, os quais representam valores pequenos
quando comparados com o diâmetro dos grânulos formados em reatores opera-
dos em condições anaeróbias ou anóxicas (2-3 mm) . No caso dessa pesquisa, em
particular, as tensões de cisalhamento ocasionadas pela agitação e ae ração não
permitiram a formação de grânulos com grandes diâmetros. De qualquer n1odo,
a estrutura dos grânulos, sobretudo em sua porção interior, foi muito similar à
apresentada por grânulos cultivados em condições anóxicas. Tal constatação pode
se r explicada devido ao fato de a região interna dos grânulos estar possivelmen-
te sob condições anóxicas, até mesmo em deco rrência da baixa concentração de
OD no meio líquido e levando-se em consideração que 60% do nitrogênio sob a
forma de amônio alimentado foi desnitrificado, isto é, levado a nitrogênio gasoso
(DANGCONG et alii, 1999).
Os autores ainda observaram elevada re1noção de DQO (2, 16 gDQO/(gSS · d))
e alta atividade de nitrificação (0,24 gN-NH3/(gSS · d)). A carga orgânica e ni-
trogenada foi de 1, 5 kgDQO/(m3 • d) e O, 18 kgN-NH/(m3 · d), respectivamente.
Mesmo sob operação com essa carga orgânica e concentração de OD de O, 7-1,0 m&"L,
todo amônio alimentado foi co1npletamente nitrificado. Os autores ainda ve rifica-
ram que a ren1oção de DQO ou ainda a atividade de oxidação de carbono, aumen-
tou com o aumento do fluxo de ar fornecido ao sistema, embora sendo mantida
constante a concentração de OD (menor que 1% em relação à saturação do ar) .
Esse resultado sugeriu que a atividade do lodo granular fo i fortemente influen-
ciada pelo suprimento de oxigênio, mas não pela concentração de OD no n1eio
líquido (DANGCONG et alii, 1999) .
Beun et alii (2000) cultivaram lodo granular aeróbio em um reator airlift
ope rado em bateladas sequenciais (Sequencing batch airlijt reactor - SBAR) de
3 L . O TRH aplicado foi de 5, 6 h e a carga orgânica foi de 2 ,3 kgDQO/(m 3 · d). A
duração de cada ciclo do SBAR foi de 3 h . Desse total, 3 min consistia em adição
de afluente, 1 73 min de aeração, 2 min de sedimentação e 5 min de retirada de
eflu ente tratado. O reator foi al imentado com meio sintético contendo acetato de
sódio como fonte de carbono e cloreto de amônio co1no fonte de amônio. O reator
foi inoculado com lodo proveniente de um sistema de lodos ativados, sendo que
a operação do reator foi iniciada duas vezes utilizando inóculos diferentes: uma
com duração de 41 dias (12. experimento) e outra com duração de 55 dias (22. ex-
perimento) .
No 1.0 experimento, 30 dias foram necessários para se atingir o estado estacio-
nário, enquanto no 20. experimento o tempo necessário foi de 1O dias. A diferença
da duração do período de start-up provaveln1ente esteve relacionada com o inóculo
utilizado. Vale lembrar que o 1.2 experimento foi realizado para descrever o período
de partida do reator e o desenvolvimento inicial dos grânulos.Já o 2 2 experimento
serviu para descrever a estabilidade dos grânulos sob certas condições, uma vez
que nesse último o reator foi operado durante um tempo maior (55 dias) (BEUN
et alii, 2000) .
O lodo inoculado ao reator no 1.2 experimento consistia em uma m istura
de filamentos e pequenas partículas. Após 30 dias de ope ração, o diâmetro dos
grânulos foi de aproximadamente 1,2 mm, sendo que os mesmos apresentaram
superfície lisa. Nesse período, não foi observado, visualmente, biomassa suspensa.
Do início até 30 dias de operação, a concentração de biomassa do reator mudou
de 2 para 6 g!L e o tempo de retenção celular aumentou de dois para 30 dias, di-
minuindo poste riormente para 1 7 dias. O aumento do tempo de retenção celular
foi ocasionado pela diminuição da presença de lodo filamentoso e floculento. A
seleção de grânulos foi atingida aplicando-se curto tempo de sedimentação em um
reator com alta razão altura/diâmetro. Lodos com baixas velocidades de sedimen-
tação eram arrastados do reator com o efluente tratado e somente grânulos com
boas características de sedimentabilidade (velocidades n1ínimas de sedimentação
de 16,2 m/h) eram retidos no sistema. Tal fato permitiu que a concentração de
biomassa no efluente fosse diminuída (BEUN et alii, 2000).
Durante o 22 experimento, a concentração de biomassa no reator permaneceu

estável em 4 g/L e o tempo de retenção celular foi, em média, de nove dias. O diâ-
n1etro médio dos grânulos obtido no estado estacionário foi de 1,0 mm. A densi-
dade da biomassa apresentou o valor estável de 48 g/Lgrânulos (BEUN et alii, 2000).
Por meio de análise da concentração de acetato durante u1n ciclo de operação
representativo do SBAR, verificou-se que esse substrato orgânico era consumido em
+ + -
21 min (Jeast period). Os perfis de concentração de NH4, NO3 e NO2 mostraram
que ocorreu tanto nitrificação quanto desnitrificação no reator. Durante o período
- -
feast, as concentrações de NQ3 e NO2 diminuíram, tendo em vista a ocorrência de
desnitrificação com acetato como fonte de carbono. Já no período sem disponibili-
- -
dade de acetato (período famine), as concentrações de NO3 e NO2 primeiramente
aumentaram (nitrificação mais rápida que a desnitrificação) e posteriormente de-
cresceram novamente (desnitrificação com substrato endógeno como fonte de carbo-
no) (BEUN et alii, 2000).
Vale ressaltar que Beun et alii (2000) não esperavam a ocorrência de desni-
trificação, uma vez que o reator foi totalmente operado sob condições aeróbias.
Durante o período famine, a concentração de oxigênio dissolvido no SBAR foi
de praticamente 100% en1 relação à saturação. Normalmente, em reatores airlift
aerados e continuamente alimentados, não ocorre desnitrificação (TIJHUIS et
alii, 1994b apud BEUN et alii, 2000). Esses reatores foram alimentados com o
n1esmo afluente e subn1etidos às mesmas cargas do SBAR utilizado nessa pesqui-
sa, embora exigissem a introdução de fases sem aeração para permitir a ocorrên-
cia do processo desnitrificante. Já no SBAR, a desnitrificação ocorreu de forma
significativa mes1no sob condições de processo não ideais para esse processo. Tais
observações, provavelmente, estão relacionadas ao fato de o reator ser alimentado
de forma descontínua, e não de forma contínua (BEUN et alii, 2000).
Para exemplificar o efeito da configuração do reator na formação de lodo
granular e evidenciar importantes critérios de projeto, a tabela 4.1 apresenta com-
parações entre o SBAR utilizado por Beun et alii (2000), o reator tipo "coluna
de bolhas" (bubble collumn) utilizado por Beun et alii (1999) e o reator airlift
com biofilme em suspensão (Biofilm arlift suspension reactor - BASR) operado por
Tijhuis et alii (1994) . Valores de alguns parâmetros obtidos durante o estado es-
tacionário de cada reator (submetidos à carga orgânica de 2, 5 kgDQO/(m3 • d) e à
velocidade superficial de ar de 86,4 rn/h) estão indicados na tabela 4.1.
Comparado com SBBC, grânulos muito mais densos com menor diâmetro
foram obtidos no SBAR quando foram aplicadas as mesn1as cargas de substra-
to e a mesma intensidade de aeração. No SBBC, as forças hidrodinâmicas são
distribuídas de forma mais homogênea ao longo da coluna em comparação com
o SBAR. Nesse último reator, as forças hidrodinâmicas são maiores na base do
reator onde o líquido e as partículas mudan1 a direção do fluxo. As n1aiores forças
hidrodinâmicas concentradas em determinadas regiões no SBAR provavelmente

resultam na formação de grânulos mais densos com menores diâmetros. Além
disso, no SBBC observa-se a ocorrência de uma estratificação dos grânulos. Na
parte superior do reator, menos biomassa na forma de grânulos estará presente
em comparação com a base, levando ao mais rápido crescimento dos grânulos no
topo do reator, o que, por sua vez, acarreta na formação de grânulos menos densos
com maior diâmetro e, subsequentemente, mais desprendimento e instabilidade
Da mesma forma, quando se compara os grânulos formados no SBAR com
os grânulos fo rmados no BASR continuamente alimentado, grânulos mais densos
e com maior diâmetro foram obtidos no SBAR. No caso particular do BASR, o
desenvolvimento de grânulos está relacionado aos fragmentos de biofilme oriun-
dos da quebra das partículas de biofilme. A razão para a obtenção de menores
diâ1netros obtidos nesse último sistema pode estar ligada à p resença de suportes,
os quais ocasionam maior tensão de cisalhamento e, por conseguinte, maior des-
prendimento.Já o provável motivo para a obtenção de grânulos menos densos no
BASR é que o mesmo foi continuamente alimentado, diferentemente do SBAR,
o qual foi alimentado em bateladas sequenciais (BEUN et alii, 2000) . Como já
comentado no item 4.2, a adoção de um regime feast-famine obtido por n1eio da
operação de modo descontínuo favorece o desenvolvimento de micro-organismos
cuja velocidade de crescimento é reduzida, o que, por conseguinte, propicia a
obtenção de grânulos de maior densidade. Maiores detalhes da comparação entre
os reatores será vista a seguir, quando será apresentado o trabalho realizado por
Beun et alii (2002) .
Beun et alii (2002) cultivaram lodo granular aeróbio em um reator airlift
operado en1 bateladas sequenciais (SBAR), com volun1e de 3 L, durante um pe-
ríodo de 140 dias. A razão entre a altura da coluna ascendente (riser) e o diâmetro
foi elevada (90 cm/6,25 cm = 14,4), o que é comum em reatores visando ao culti-
vo de grânulos aeróbios, tendo e1n vista a importância das forças hidrodinâmicas
relacionadas à tensão de cisalha1nento na formação de lodo granular com pro-
priedades estruturais adequadas. O n1eio sintético al in1entado ao reator possuía
uma concentração de acetato de 18 ,3 Cmmol/L, o que corresponde a uma carga
orgânica de 2,5 kg DQO/(m3 · d); o TRH foi de 5,6 h. A temperatura do reator foi
mantida e1n 20ºC e o pH foi fixado em 7 ,O + 0,2 . O ciclo de operação do reator
compreendia 2 min de enchimento, 1 70 min de aeração, 3 min de sedimentação e
5 min de esvaziamento/drenagem do sobrenadante (efluente tratado). Utilizou-se
como inóculo lodo ativado oriundo de uma planta de tratamento de águas residuá-
rias na qual ocorria remoção de nutrientes (N e P).
Observou-se que, e1n geral, todo acetato (fonte de C) foi consumido dentro de
poucos minutos (período feast) . Após o término desse substrato, a respiração en-
dógena se fazia presente (período famine) . O período de transição do período feast
para o famine foi observado por um rápido aumento da concentração de oxigênio

dissolvido (OD) no reator. Durante o períodofeast a concentração de OD no reator
foi relativa1nente baixa (7 5% de saturação do ar) devido ao consumo de oxigênio
na metabolização do acetato. Após o consumo integral desse substrato, a concen-
tração de OD passou a quase 100% de saturação do ar (BEUN et alii, 2002).
Nos primeiros 12 dias de operação, o período de sedimentação foi gradual-
mente diminuído de 5 para 4 min e posteriormente para 3 n1in, valor que per-
maneceu durante todo o restante do período operacional. No 1.2 dia de operação,
o período feast foi de aproximadamente 100 min, decrescendo para 60 min no 3.2
dia. Do 3.2 para o 4.2 dia, o período feast aumentou novamente devido ao arraste
de grande quantidade de bion1assa. As paredes do reator ficaram completamente
cobertas de biomassa nos primeiros quatro dias. No 60. dia, a biomassa fixada às
paredes foi retirada (BEUN et alii, 2002) .
Pequenos grânulos foram fo rmados no reator dentro de un1a semana após ser
inoculado com lodo ativado em suspensão proveniente de uma planta de trata-
mento de água residuária convencional . Tão logo con1eçou o processo de granula-
ção, o crescimento de biomassa nas paredes do reato r diminuiu. A concentração
de biomassa no reato r começou a aumentar sensiveln1ente, fazendo com que a
duração do período jeast din1inuísse novamente (BEUN et alii, 2002).
Vale ressaltar que, na tentativa de se explicar a formação de grânulos logo no
início da operação do reator, uma das possibilidades é que eles tenham sido oriun-
dos do crescünento de biofihne nas paredes do reator, e1nbora durante a limpeza
do reator o biofilme tenha sido integralmente removido. Tendo em vista a alta ve-
locidade de circulação de líquido, pequenos pedaços poderiam ter sido quebrados
do biofilme, os quais poderiam consistir em material inicial para a formação de
grânulos (BEUN et alii, 2002) .
A seleção son1ente de grânulos densos em un1a mistura de grânulos, fila-
mentos e flocos foi atingida devido às diferenças nas velocidades de sedimentação
entre os diferentes modos de aglomeração da biomassa: grânulos (biomassa com
alta velocidade de sedimentação) e filamentos e flocos (biomassa com baixa veloci-
dade de sedimentação). E ssa estratégia foi observada com sucesso tendo em vista
que ocorreu uma rápida t ransição de lodo na forma de flocos para lodo granular.
Inclusive outra hipótese cogitada para tentar explicar a formação de grânulos é
que flocos advindos do inóculo com alta velocidade de sedimentação poderiam
representar o início do processo de granulação (BEUN et alii, 2002) . Interessante
n1encionar que nesse trabalho não foi obse rvada a fase intern1ediária na qual há o
predomínio de fungos, como observado em trabalho anterior realizado por Beun
et alii (1999) .
Quando atingido o estado estacionário (em torno do 37Q. dia de operação),
grânulos apresentaram diâmetro médio de 2 ,5 mm, densidade de biomassa de
60 gSSV/L e velocidade de sedimentação maior que 10 rn/h. Inclusive o tempo de
sedimentação foi escolhido tal que somente partículas com velocidade de sedimen-
tação maior que 1O m/h pudessem ser retidas no reator. O resto da biomassa que
não sediinentava suficiente1nente rápido era arrastado juntamente co1n o efluente
tratado. Verificou-se igualmente que tanto a densidade dos grânulos quanto o
número de grânulos no reator aumentaram com o aumento da concentração de
biomassa (BEUN et alii, 2002).
A bion1assa consistiu tanto em micro-organismos heterotróficos quanto em
nitrificantes, sendo capaz de suportar algumas perturbações, tais como aumentos
momentâneos de pH e flutuações na concentração de OD. Após essas perturba-
ções, os grânulos geralmente rompiam parcialmente. No entanto, rapidamente
retornavam à sua forma anterior às perturbações (BEUN et alii, 2002).
Os autores ainda verificaram que, em meados do período operacional (em
to rno do 80.Q dia de operação), a concentração e a densidade de biomassa no reator
diminuíram devido à quebra (deterioração) dos grânulos provocada pelo dec rés-
cimo da concentração de OD para 50% de saturação do ar ocorrida entre o 66.Q e
o 71 2. dia de operação, fazendo com que os grânulos menores fossem arrastados
do reator. Observou-se pequena produção de lodo, fato que esteve associado à alta
idade de lodo de 50 dias (BEUN et alii, 2002) .
Beun et alii (2002) ainda realizaran1 cortes nos grânulos com auxílio de uma
lâmina cortante no intuito de visualizar sua estrutura interna por meio de micros-
copia de luz e 1nostraram a ocorrência de duas camadas no grânulo: uma camada
central, com diâmetro em torno de 1, 7 mm e uma camada externa com espessura
de aproximadamente 0,4 1nm. Essa últiina camada, por sinal, possuía uma estru-
tura mais densa em comparação com a porção central do grânulo, a qual apresen-
tou uma estrutura mais macia e gelatinosa, além de ser mais transparente. Não
foram encontrados grandes "buracos" vazios no centro do grânulo resultantes da
lise completa no interior da biomassa. A p rofundidade de penetração de oxigênio
calculada apresentou valores entre 1 7 µm (no período feast) e 20 µm (no período
famine) . Esse mesmo parâmetro calculado para o acetato apresentou valores entre
115 µm (conversão aeróbia completa) e 520 µm (conversão anóxica completa), o
que corresponde à espessura de 400 µm da cainada externa densa dos grânulos.
Dessa forma, evidenciou-se que o crescimento da biomassa ocorreu principalmen-
te na camada externa (BEUN et alii, 2002).
Os autores ainda realizaram uma comparação entre o reator airlift operado
em bateladas sequenciais (SBAR) visando à formação de grânulos e u1n sistema
turbulento continuamente alimentado, denominado reator airlift em suspensão
com biofilme (BASR), operado por Tijh uis et alii (1994). Tal comparação já havia
sido relatada em trabalho ai1terior (BEUN et alii, 2000), embora com menos ri-
queza de detalhes. No BASR, grânulos (que a princípio são biofilmes desprovidos
de material suporte) foram formados a partir de fragmentos de biofilme oriundos
do rompimento de partículas do biofilme . A diferença mais marcante entre os dois
sistemas está relacionada com a densidade de biomassa, a qual é muito maior no

SBAR em comparação com o BASR, conforme já ressaltado quando da apresenta-
ção do trabalho realizado por Beun et alii (2000) . Como mencionado, a razão para
a diferença significativa constatada é provavelmente atribuída ao modo de como
os reatores são alimentados, de forma contínua no BASR e de forma intermitente
no SBAR. Um ponto a ser considerado é que, quando há substrato presente no
SBAR (período feast), a penetração de acetato nos grânulos é 1naior do que 500 µ,m
tendo em vista que a concentração desse substrato no líquido é alta devido à ali-
mentação na forma de pulso. Em contrapartida, no BASR alimentado de fo rma
contínua, a concentração de acetato no líquido é sempre baixa ( < O, 1Cmmol/L), o
que dificulta a penetração completa de acetato no interior do biofilme (penetração
< 20 µ,m) . Dessa forma, os micro-organismos presentes nas partes mais profun-
das do biofilme ficarão desprovidos de acetato, fato que não ocorre no SBAR, nos
quais as células presentes no centro dos grânulos podem assimilar acetato e cres-
cer (utilizando tanto oxigênio quanto nitrato como aceptor de elétrons). E é justa-
mente esse crescimento no interior dos grânulos do SBAR que faz com que a sua
biomassa aumente, diferentemente do que ocorre no BASR (BEUN et alii, 2002) .
Co1no 1nencionado, o aceptor de elétrons necessário para a conversão de ace-
tato pode ser 0 2 ou NO; . E m ainbos os reatores (SBAR e BASR), o 0 2 não pene-
tra completamente no biofilme. Para o BASR, em particular, a profundidade de
penetração é e1n torno de 80 µ,m, maior que a penetração de acetato. A profun-
didade que o 0 2 penetra no SBAR no pe ríodo feast é em torno de 20 µ,m, menor
que a profundidade de penetração de acetato. Esse valo r pode ser ainda menor
caso a concentração de OD no meio líquido seja diminuída. Os micro-organismos
localizados mais internainente em relação a essa profundidade podem utilizar
NO; como aceptor de elétrons. Quando esse não está disponível, ocorre rá lise das
células na po rção central do biofilme, fazendo com que o mesmo tenha uma estru-
tura menos densa e finalmente seja rompido em pedaços (fato observado quando
foi aplicada concentração de OD de 50% em relação à saturação do ar) (BEUN et
alii, 2002).
Os autores ainda apontam para a importância da influência exercida pelas
tensões de cisalha1nento na estrutura do biofiline, a qual é detern1inada pelo ba-
lanço entre crescimento da biomassa e cisalhainento (VAN LOOSDRECHT et
alii, 1995). Considerando-se o número total de partículas no reator, o desprendi-
mento deve ser, a princípio, maio r no BASR (preenchido com basalto como ma-
terial suporte, provavelmente com alta frequência de colisão entre as partículas),
tendo em vista que o número de partículas nesse reator foi dez vezes maior que no
SBAR. Isso, a princípio, leva à formação de um biofilme menos denso no primeiro
reato r. Entretanto, como já mencionado, a velocidade específica de crescimento da
biomassa no SBAR é menor do que no BASR, o que, por sua vez, leva à formação
de um biofilme mais denso . O balanço entre esses dois fatores é obviamente mais
1 28 PROCESSOS BIOLÓGICOS AVANÇADOS
favorável no SBAR em comparação com o BASR, uma vez que a densidade de

biomassa do primeiro sistema foi muito superior em comparação com o segundo
Garrido et alii (2001) verificaram que as propriedades de sedimentação do
lodo obtido em um reator operado em bateladas sequenciais de escala industrial
(RBS.m d), tratando água residuária oriunda de um laboratório destinado à análi-
se de p rodutos de indústria leiteira e ap resentando altas eficiências de remoção
de DQO e nitrogênio, eram insatisfatórias. Tal conclusão foi obtida devido ao
fato de o índice volumétrico de lodo (IVL) em nenhum momento ser menor
que 100 mL/gSST e a velocidade de sedimentação zonal (VSZ) foi em torno
de 0,3 m/h. Levando em consideração os resultados obtidos por Garrido et alii
(2001), ARROJO et alii (2004) estudaram a possibilidade de formação de lodo
granular aeróbio em dois reatores operados em bateladas sequenciais (RBS 1 e
RBS 2), no intuito de n1elhorar as características de sedimentação da biomassa.
O RBS 1 e o RBS 2 foram alimentados con1 a mesma água residuária industrial
alimentada ao RBSind e inoculados com o lodo advindo desse último reator.
Ambos os reatores foram operados sob condições similares du rante a maior
parte do período experimental. Entretanto, somente no RBS 1 foi incluída uma
fase anóxica con1 duração de 10 a 30 n1in no início de cada ciclo, fazendo uso
de nitrogênio . A temperatura variou entre 15-20°C e a concentração de oxigênio
dissolvido ficou entre O e 8 mg/L. Sem controle automático de pH, esse parâmetro
variou entre 7 ,4 e 8 ,5. O RBS 1 foi alimentado inicialmente com meio sintético
até o 2 72 dia de operação. Em seguida, esse meio sintético foi gradualmente sendo
substituído pelo efluente industrial, mantendo a DQO razoavelmente constante.
Após o 43.0 dia de operação, esse reator foi alimentado somente com efluente in-
dustrial . A operação do RBS 2 começou 50 dias depois, sendo esse reator alimen-
tado somente com efluente industrial. A du ração do ciclo operacional era de 3 h
(3 min de enchimento, 1 71 min de reação anóxica ou aeróbia, 1 min de sedimen-
tação, 0,5-3 min de esvaziamento e um período de repouso de 2-4,5 min) para
ambos os reatores, sendo que 50% do volume do reator era retirado na etapa de
drenagem (ARROJO et alii, 2004) .
Em ambos os sistemas, a bio1nassa en1 suspensão foi quase completamente
arrastada nos sete primeiros dias, uma vez que a estratégia operacional adotada
fez uso de curto período de sedimentação e rápido período de retirada de efl uen-
te. Somente aglomerados microbianos com velocidade de sedimentação 1naior que
9 n1/h ficaran1 retidas nos reatores. Três sen1anas após a partida dos reatores, obser-
vou-se a formação de pequenos agregados com diâmetro médio de 1,05 mm. Flocos
em suspensão gradualmente desapareceram do reator e as propriedades de sedimen-
tação dos agregados obtidas foram boas, a exemplo do IVL (60 mL/gSSV) e da VSZ
(20 nl/h). Grânulos con1 morfologia sin1ilar (bastante distinta em relação ao lodo
floculento utilizado como inóculo) foram desenvolvidos em ambos os sistemas, e a
distribuição de tamanho ficou compreendida entre 0,25 e 4,0 mm. A concentra-

ção de biomassa apresentou valo res em to rno de 0,2 gSST/L no início dos expe-
rimentos e aumentou para 3 gSST/L após 50 dias de operação. Posterionnente,
tal parâmetro atingiu a concentração estável entre 5-6 gSST/L. A percentagem de
sólidos suspensos voláteis (SSV) em relação ao total de sólidos (SST) variou de
87% para 95% (ARROJO et alii, 2004).
Os resultados experimentais 1nostraran1 que o uso de água residuária indus-
trial aparentemente não apresentou efeito adverso no desenvolvimento de grânu-
los e no acúmulo de biomassa. A densidade de biomassa apresentou valores em
torno de 10-15 gSSV/Lgrânulos en1 ambos os reatores, valores similares aos reporta-
dos por Beun et alii (1999) (trabalho discutido anteriormente nesse mesmo item),
isto é, 11, 9 gSSV/Lgrânulos·
Mosquera-Corral et alii (2005), procurando encontrar as melhores condições
para a remoção de nitrogênio em um sisten1a de lodo granular aeróbio, estudaram
os efeitos a curto e longo prazos da redução da concentração de oxigênio no de-
sempenho de um reator airlift operado em bateladas sequenciais (SBAR) . O reator
foi operado em ciclos sucessivos de 3 h, sendo 3 min de enchimento, 169 min
de aeração, 3 min de sedimentação e 5 1nin de esvaziamento . O curto período de
ten1po destinado à sedimentação em conjunto com a altura do reator contribuíram
para a seleção de partículas com velocidade de sedimentação maior que 12 m/h .
Durante 150 dias, o SBAR foi operado nas mesmas condições descritas an-
teriormente no trabalho de Beun et alii (2000), sendo a única diferença relativa à
relação DQO/N, que passou de 14 para 8. A concentração de oxigênio empregada
foi de 100% em relação à saturação. Grfu1ulos apresentando diâmetro médio de
0,6 mm foram formados após 30 dias de operação. A concentração de biomassa
no reato r estabilizou em torno de 5 gSSV/L, o tempo de retenção celular atingiu
o valor estável em torno de 25 dias e a máxima densidade apresentada pelos mes-
mos foi de 53 gSST/Lgrânulo• A alta densidade combinada com a forma regular dos
grânulos resultou em baixo valor de IVL5 , o qual flutuou entre 48 e 7 5 mL/gSST.
Após 150 dias de operação, a concentração de oxigênio foi diminuída para
40% em relação à saturação no intuito de aumentar a eficiência de remoção de
nitrogênio, conforme indicado no modelo desenvolvido por Beun et alii (2001),
discutido no item 4. 7. Dez dias após a diminuição da concentração de oxigênio,
estruturas filamentosas foram obse rvadas na superfície dos grânulos. A partir do
1742 dia de operação, os grânulos começaram a se desintegrar, resultando na di-
minuição do seu tamanho e do fator de forma (menor que 0,52) . A sedimentação
do lodo granular foi consideravelmente afetada pela sua desintegração, ocorrendo
substancial arraste de biomassa do reator. A concentração de biomassa diminuiu
de 5 para 3 ,5 gSSV/L e o tempo de retenção celular diminuiu para oito dias. O
IVL5 aumentou para 100 mL/gSST, valor considerado elevado para as condições
de sedimentação aplicadas no SBAR, o que de fato resultou no washout de grande
parte da biomassa. A menor profundidade de penetração de oxigênio no grânulo

quando a concentração foi diminuída de 100% para 40% de saturação de oxigênio
pode ter acarretado a düninuição da produção de substâncias poliméricas extrace-
lulares (EPS) nas partes internas dos grânulos, enfraquecendo e rompendo a sua
estrutura e ocasionando uma queda na densidade. Diante dessas circunstâncias,
a sedimentabilidade do lodo granular ficou comprometida, levando ao seu arraste
(washout) do reator (MOSQUERA-CORRAL et alii, 2005).
Posteriormente, a operação do SBAR foi reiniciada con1 novo inóculo, sendo
aplicada a concentração de 40% de saturação de oxigênio. Os primeiros grânulos
foram formados em 10 dias de operação, os quais apresentaram pequeno tamanho
e eram instáveis, sendo frequentemente arrastados junto com o efluente. A con-
centração de biomassa neste último apresentou o valor médio de O, 144 gSST/g.
Por sua vez, o IVL5 foi de 200 mL/gSST. A impossibilidade de formar grânulos
estáveis nessas condições fez con1 que a ope ração do reato r fosse interrompida.
Os resultados obtidos por Mosquera-Corral et alii (2005) deixaram claro a
dificuldade de se obter grânulos estáveis em baixas concentrações de oxigênio,
sendo necessária elevada concentração desse elemento para atingir tal objetivo.
Entretanto, é evidente que, tanto para a economia de energia quanto para se
atingir boas eficiências de desnitrificação, é necessário que se utilize baixa con-
centração de oxigênio .
A hipótese levantada por Picioreanu et alii (1998) (discutida no item 4. 2)
vem ao encontro dos resultados obtidos por Mosquera-Corral et alii (2005), uma
vez que as baixas concentrações de oxigênio acarretam o aumento da limitação
difusiva e, consequentemente, maior gradiente de concentração no grânulo. Caso
a proposição di scutida por esses autores, na qual biofilmes estáveis são formados
quando a razão entre a taxa de crescimento da biomassa e o transporte difusivo
é baixa (pequenos gradientes de substrato e oxigênio), seja responsável por de-
terminar a estrutura de grânulos, a seleção de organismos com baixa velocidade
de crescimento levaria à formação de lodo granular estável mesmo e1n baixas
concentrações de oxigênio dissolvido. Para diminuir a velocidade de crescimento
de organismos en1 grânulos aeróbios, substratos facilmente biodegradáveis, tais
como acetato, devem ser convertidos em substratos que sejam degradados lenta-
mente, como, por exemplo, polímeros armazenados intracelularmente (poliidro-
xialcanoatos - PHA) .
Em t rabalhos descritos anteriormente nesse mesmo item, tais como o de
BEUN et alii (2002), um período de alimentação em forma de pul so foi aplicado,
no qual o substrato foi capaz de penetrar em todo o grânulo, sendo parcialmen-
te utilizado para o crescimento rápido ( 40%) e parcialmente armazenado como
polímero intracelular (30- 70%). E sse período foi seguido de uma longa fase de
aeração no qual os organismos cresceram utilizando o PHB armazenado int race-
1ularmente em baixa taxa de crescimento . Como já mencionado no item 4.2, o
CAPÍTULO 4 ◊ TECNOLOGIADEGRANULAÇÃO AERÓBIA(IODOGRANULAR AERÓBIO) 13 1
período com disponibilidade substrato para o crescimento é denominado de fase

feast . Já o período no qual os organismos utilizam o substrato internamente arma-
zenado é conhecido co1no fase famine . A diminuição da concentração de oxigênio
leva ao aumento da duração fase feast (substrato presente) e, consequentemen-
te, a um maior período com taxas de crescimento maiores. Em adição, ocasiona
um gradiente maio r de oxigênio no interior dos grânulos, o que não é desejável
quando se pretende a fonnação de grânulos estáveis, conforme n1encionado por
Picioreanu et alii (1998) . Tanto o aumento do período com maiores taxas de
crescimento como o incremento do gradient e no interior dos grânulos levam ao
crescimento de filamentos e na instabilidade do lodo granular (DE KREUK e
VAN LOOSDRECHT, 2004).
Segundo De Kreuk e Van Loosdrecht (2004), para tornar possível a obtenção
de grânulos aeróbios estáveis mesmo sob condições de baixas concentrações de
oxigênio, a taxa de crescin1ento dos n1icro-organismos deve ser dim inuída du rante
o ciclo total dos reatores en1 batelada sequencial. Esse objetivo pode ser atingido
por meio da seleção de diferentes tipos de bactérias que convertem os substratos
facilmente biodegradáveis integralmente em polímeros armazenados intracelular-
mente lentamente biodegradáveis, e não apenas 60%, como no estudo realizado
por Beun et alii (2002).
Essa conversão pretendida pode ser realizada por bactérias acumuladoras de
fosfato (PAO) e bactérias acumuladoras de glicogênio (GAO), as quais
,
são capazes
de converter todo o acetato em PHB em condições anaeróbias. E nesse contexto
que De Kreuk e Van Loosdrecht (2004), levando em consideração as pesquisas
prévias envolvendo conceitos teóricos da morfologia de biofilmes que indicaram
que a estrutura de biofilmes é dependente das forças de cisalhamento, velocidades
de crescimento de micro-organismos e difusão de substrato no biofilme (VAN
LOOSDRECH T et alii, 1995; P ICIOREANU et alii, 1998), mostraram que a
seleção de PAO e GAO em grânulos aeróbios leva à formação de lodo granular
estável, mesmo em baixas concentrações de oxigênio. Para tanto, os autores mo-
dificaram a fase de al imentação, que deixou de ser aeróbia e em forma de pulso,
passando a consistir em um período longo, em condições anaeróbias, seguido pela
fase de reação aeróbia. Dessa n1aneira, foram criadas as condições necessárias
para que as bactérias selecionadas (PAO e GAO) armazenassem todo o substrato
no interior das células, sem que ocorresse crescimento, o que, como consequência,
permitiu a for1nação de grânulos estáveis.
Fo ram operados dois reatores de 3 litros, sendo un1 deles consistindo em um
reator airlift (SBAR) e outro em um reator coluna de bolhas (SBBC). Ambos fo-
ram operados em bateladas sequenciais, sendo a única diferença a presença de riser
no primeiro. No primeiro experimento realizado, a concentração de oxigênio não
foi controlada, o que significa que apresentou valores próximos da saturação. Já
no segundo experimento, a concentração de oxigênio utilizada foi de 40 ou 20%
em relação à saturação. Ambos os reatores foram submetidos a ciclos sucessivos

de 3 h. Deste total, 60 min foi destinado ao enchimento a partir da base do reator
(regime plug-flow através do leito de grânulos e1n condições anaeróbias), 112 n1in
de aeração, 3 min de sedimentação (para manter somente partículas con1 velo-
cidades de sedimentação maiores que 12 m/h no reator) e 5 min de descarte do
efluente. O TRH e a carga orgânica aplicada foram de 5,6 h e 1,6 kgDQO/(m 2 ·d),
respectivamente. O meio de alimentação foi composto de acetato de sódio como
fonte de carbono, NH 4 Cl como fonte de nitrogênio amoniacal e KH 2 POjK2 HP0 4
como fonte de fósforo (DE KREUK e VAN LOOSDRECHT, 2004).
A tabela 4.2 sumariza as principais características dos grânulos obtidos
durante os diferentes estágios do experimento realizado por De Kreuk e Van
Loosdrecht (2004) lançando mão de um período de alimentação longo e anaeró-
bio. Além disso, para efeito comparativo, são descritas as propriedades dos grânu-
los obtidos por Mosquera-Corral et alii (2005), os quais utilizaram alimentação
na forma de pulso.
TABELA 4.2 Principais características dos grânulos obtidos durante os diferentes estágios do
experimento (DE KREUK e VAN LOOSDRECHT, 2004).
Alimentação em
Período de alimentação longo2
regime de pulso 1
Características
dos grânulos SBAR SBBC SBAR
00100% 00 400/o 0020% 0020% 0040% 00100% 0040%
Organismo
PAO PAO PAO GAO PAO Heterotróficos
dominante
Estabilidade Estável Estável Estável Estável Estável Estável Instável
Cisalhamento Sim Sim Sim Sim Não Sim Sim
local
Diâmetro médio 1,3 1,1 1,3 1,2 1,1 1,6 5,0

(mm)
Densidade 89 87 78 108 90 53 13
(gSSV/Lbiomassa)
Cone. de sólidos 8,5 12 16,5 15 13 5, 1 0,9

(gSSV/L,eato,)
IVL8 24 20 14 17 19 50 200
Retenção celular 40 67 70 71 63 8 <5
(dias)
1 Mosquera-Corral et alii (2005) ; 2 De Kreuk e Van Loosdrecht (2004).
CAPÍTULO 4 ◊ TECNOLOGIADEGRANULAÇÃO AERÓBIA(IODOGRANULAR AERÓBIO) 1 33
Como se pode observar na tabela 4.2, contrariamente aos resultados obtidos

em outros t rabalhos descritos ante riormente nos quais se empregou regime feast/
famine completamente aeróbio, De Kreuk e Van Loosdrecht (2004) obtive ram
grânulos estáveis mesmo em baixas concentrações de oxigênio (40 e 20% de sa-
turação), sendo as características desses grânulos similares àqueles formados em
100% de saturação de oxigênio. Não foram observados filamentos na superfície e
a sedimentabilidade não foi afetada, como evidencia os baixos valores de IVL8 • O
tempo de retenção celular e a concentração de sólidos aumentaram com a dimi-
nuição da concentração de oxigênio (DE KREUK e VAN LOOSDRECHT, 2004).
Devido aos períodos alternados de alimentação anaeróbia (presença de ace-
tato) e reação aeróbia e à disponibilidade de fosfato no afluente, ocorreu a seleção
de organismos acumuladores de fosfato (PAO). O acetato foi convertido integral-
mente em polímeros (PHB) armazenados intracel ularmente durante o período
de alin1entação anaeróbio e o fosfato foi liberado no 1neio líquido . Du rante o
período aeróbio, ocor reu o crescimento utilizando o PHB a rmazenado, enquanto
o fosfato no meio líquido foi convertido em polifosfato no interior das células.
Deste modo, vale mencionar que outra vantagem adicional da seleção de PAO, de
forma particular, é a possibilidade de remover fosfato da água residuária. Amônia
foi nitrificada durante o período de aeração e o nitrato produzido foi utilizado
com aceptor de elétrons nas zonas anóxicas localizadas no interior dos grânulos.
Dessa maneira, sob condições de 20% de saturação de oxigênio, obteve-se 100%
de remoção de DQO, 99% de remoção de fósforo e 90% de remoção de nitrogênio.
De Kreuk e Van Loosdrecht (2004) ainda observaram, por meio da análise
FISH, que a biomassa foi preponderantemente composta por PAO. Em contra-
partida, quando fosfato parou de ser adicionado ao meio de alimentação, a popula-
ção de PAO desapareceu e foi substituída por GAO, os quais, como já 1nencionado,
também são capazes de arn1azenar acetato em condições anaeróbias. Nesses orga-
nismos, a energia necessária para o consumo de acetato é produzida pela hidrólise
do glicogênio. Esse último é novamente formado durante a fase aeróbia, utilizan-
do-se para isso o PHB armazenado, o qual também é utilizado para crescimento e
manutenção celular. Apesar da mudança de populações dominantes ocorridas, as
características dos grânulos não apresentaram grandes alterações.
Outro ponto interessante a destacar a respeito do trabalho de De Kreuk e Van
Loosdrecht (2004) se refere ao longo período de alimentação em condições anae ró-
bias, que, alén1 de permitir a conversão integral de substrato (acetato) em políme-
ros armazenados intracelularmente (PHB), melhorar a estabilidade dos grânulos
em baixas concentrações de oxigênio, permitir remoção de fósforo e propiciar me-
lhores eficiências no processo de nitrificação/desnitrificação simultâneas (SND),
pode sin1plificar a operação dos reatores en1 batelada sequencial de lodo granular.
Caso a fase de alimentação de N reatores tenha duração que represente 1/N do
tempo do ciclo, pode ser obtido fluxo de afluente contínuo . O regime plug-flow
através do leito de grânulos permite um período de alimentação/descarte simul-

tâneos. Aproximadamente 90% do volume vazio do leito sedimentado podem ser
substituídos simultanean1ente con1 adição de afluente, fazendo con1 que a fase de
descarte de efluente se torne desnecessária. Neste modo de operação, os fluxos
de afluente e efluente se tornam contínuos, o que facilita enormemente o projeto
de instalações de pré e/ou pós-tratamento (DE KREUK e VAN LOOSDRECHT,
2004) . Além disso, resolve alguns possíveis entraves a serem enfrentados em es-
calas maiores de operação, tais como a necessidade de bombas com capacidade
excessivamente grande e de tanques de equalização.
4.6 PROCESSOS DE CONVERSÃO EM GRÂNULOS AERÓBIOS

A tecnologia de lodo granular apresenta a grande vantagem de permitir are-
moção de nutrientes (DQO, nitrogênio e fósforo) em um único reator biológico . A
operação desse último, conforme já 1nencionado no item 4.2, é realizada preferen-
cialn1ente em regime de bateladas sequenciais. Para que ocorra a remoção simul-
tânea desses poluentes, algumas condições operacionais devem ser asseguradas.
Os mecanismos para a remoção de nutrientes com grânulos aeróbios são ba-
sicamente os mesmos utilizados para o processo de lodo ativado convencional.
A principal diferença é que, na primeira tecnologia, os processos biológicos não
ocorrem em tanques diferentes, mas de forma simultânea em diferentes regiões no
interio r dos grânulos.
O p rocesso de nitrificação/desnitrificação simultâneas (SND) consiste em um
mecanismo importante que ocorre em grânulos aeróbios. A ocorrência desse pro-
cesso está ligada à presença de uma zona aeróbia externa no biofilme/grânulo para
a nitrificação e uma zona anóxica interna para a desnitrificação (POCHANA e
KELLER, 1999). A distribuição dos micro-organismos heterotróficos e autotró-
ficos nos grânulos apresenta grande influência nesse processo. Justamente pelo
fato de que a remoção de matéria orgânica e a nitrificação/desnitrificação ocorrem
de forma simultânea em sistema de grânulos aeróbios, existe uma competição por
espaço e oxigênio entre os n1icro-organismos heterotróficos e autotróficos. Os pri-
meiros, por apresentarem velocidades de crescimento elevadas, localizam-se nas
camadas externas, enquanto que os últimos, caracterizados por baixas velocidades
de cresciinento, ficam confinados em regiões um pouco mais p rofundas, nas quais
a di sponibilidade de oxigênio é limitada (VAN LOOSDRE CHT et alii, 1995). A
figura 4 .6 apresenta, de forma esquemática, a estrutura de um grânulo aeróbio
contendo a camada ae róbia e a camada anaeróbia/anóxica, bem como os diferentes
processos que nelas ocorrem.
Crescimento heterotrófico
(DQO + 0 2 -+ C02 + H2 0 )
Nitrificação
(NH4 + 0 2 -+ NOx) Desnitrificação
.... · · · ·· ·· ·· ·· · · · ·► (DQO + NOX - N2)
Remoção de fosfato e crescimento anóxico

(DQO armazenada+ NOx + PO]- - N 2 + C0 2 + H 20 + poli-P)
FIGURA 4.6 Representação esquemática das diferentes camadas dos grânulos aeróbios (adaptado
de DE KREUK, 2006).
Durante o regiinefeast, a concentração da fonte de carbono externa é elevada,

sendo que esse substrato irá difundir-se completamente no interior dos grânulos
e será armazenado anaerobicamente (por PAO), aerobicamente ou em condições
anóxicas (por outros organismos heterotróficos) na forma de polímeros intrace-
lulares (poliidrobutiratos - PHB). O oxigênio dissolvido é rapidamente consu-
mido pelos micro-organismos heterotróficos situados nas camadas externas dos
grânulos, sendo utilizado tanto para o crescimento quanto para o armazenamento
de substrato. O oxigênio dissolvido é ainda consumido pelos micro-organismos
autotróficos, que, por dependerem desse elemento para a nitrificação, situam-se
nas camadas aeróbias dos grânulos, convertendo o amônio em nitrato. Durante
o período feast, a penetração de oxigênio no interior dos grânulos é limitada. O
armazenamento de substrato (acetato) na forma de PHB e o cresciinento ocorrem
aerobican1ente na camada externa ou de forma anóxica no interior dos grânu-
los. Vale lembrar que durante a fase feast do ciclo de operação de um RB S, pode
ocorrer a desnitrificação dos compostos NOx (N02 e N0 3) remanescentes do ciclo
anterior, utilizando para tanto a fonte exte rna de carbono disponível durante esse
período. Esse processo está indicado pela linha pontilhada na figura 4.6.
Já no período sem disponibilidade de fonte externa de carbono (fase fami-
ne), somente o substrato armazenado
,
no interior das células, na forma de PHB,
está disponível nos grânulos. E justamente esse substrato que é utilizado pelos
micro-organismos para o crescimento, o qual, por sinal, apresenta velocidades
muito menores quru1do comparadas com aquele que ocorre durante o períodofeast
(BEUN et alii, 200 1) . A penetração de oxigênio durante a fase famine é maior,
devido à diminuição da taxa de respiração dos organisn1os heterotróficos nesse
período, embora ainda continue sendo lin1itada devido ao aumento da velocidade
de nitrificação (THIRD et alii, 2003). O incremento dessa velocidade está rela-

cionado com a redução da atividade das bactérias heterotróficas após o término do
período feast, isto é, com o n1enor requeriinento desse elemento por esses micro-or-
ganismos que, nessa fase, crescem utilizando o PHB intracelularmente armazena-
do, fazendo com que o oxigênio deixe de ser limitante para os micro-organismos
nitrificantes (BEUN et alii, 2001 ). O nitrato produzido na nitrificação pode ser
simultaneamente desnitrificado no interior dos grânulos, região na qual se encon-
tra o substrato armazenado (PHB) que serve como fonte de carbono (doador de
elétrons) para a desnitrificação. Boas eficiências de remoção de nitrogênio serão
atingidas quando as regiões aeróbias e anóxicas estiverem bem balanceadas ao
longo da fase aeróbia (BEUN et alii, 2001). O volume dessas regiões está relacio-
nado com a concentração de oxigênio empregada em combinação com o tamanho
do grânulo. A figura 4 . 7 apresenta os perfis teóricos de concentração de acetato
+ -
(HAc), PHB, NH4, NOx (N02 + N03) e 0 2 no interior dos grânulos durante o
períodofeast (a) efamine (b) de um reator em batelada sequencial (RBS).
(a) Profundidade de (b) Profundidade de

penetração de 0 2 penetração de 0 2
:◄ ► :◄ ..
o
l(U
o
tCU
(.), (.),
-~
~
e: o2 -~
e:
~
e: e:
o o
ü ü
Grânulo Líq uido Grânulo Líquido
FIGURA 4.7 Perfis de concentração de acetato (HAc), PHB, NH:, No: (NO2 + NO3 ) e 0 2 no interior
dos grânulos durante o período feast (a) e lamine (b) de um reator em batelada sequencial (RBS).
Os trabalhos envolvendo a formação de grânulos aeróbios, descritos no item

4 .5, apresentam diferenças quanto ao modo de operação dos reatores. Dessa for-
ma, é coerente imaginar que os processos biológicos apresentam-se de forma dis-
tinta, acarretando na formação de grânulos com diferentes propriedades. Além
disso, as condições operacionais empregadas apresentam influência nos processos
de remoção de nutrientes, seja matéria orgânica, nitrogênio ou fósforo.
Para exemplificar, caso a remoção de fósforo esteja entre os objetivos do
tratamento utilizando lodo granular, é essencial que o reator descontínuo seja
alimentado, em condições anaeróbias, durante um período relativamente lon-
go, favorecendo o desenvolvimento de PAO. A opção por um longo regime de
alimentação anaeróbio, ao mesmo tempo que cria condições para o crescimento de

PAO e ainda de GAO, resulta na formação de grânulos densos e estáveis mesmo
em baixas concentrações de oxigênio dissolvido, conforme discutido no item 4.5
quando da apresentação do trabalho realizado por De Kreuk e Van Loosdrecht
(2004) . Além disso, quando se tem em mente a aplicação da tecnologia de gra-
nulação aeróbia em larga escala, é coerente imaginar que alimentar os reatores
em batelada sequencial em regin1e de pulso, isto é, adicionando todo o afluente
de forma quase instantânea (o que corresponderia a uma vazão de alimentação
exorbitante na maioria das plantas de tratamento), é uma opção econômica e tec-
nicamente não realista.
Com o intuito de ilustrar a presença dos micro-organismos n1encionados,
a figura 4.8 mostra a presença de organismos acumuladores de fosfato (PAO)
e organismos acumuladores de glicogênio (GAO) em grânulos aeróbios cultiva-
dos em reator do t ipo coluna de bolhas, de escala laboratorial, alimentado com
acetato como fonte de carbono, NH 4 Cl como fonte de n itrogênio amoniacal e
KH 2 PO jK.2HPO 4 como fonte de fósforo. A detecção desses micro-organismos foi
realizada por meio de hibridização por fluorescência in situ (FISH), utilizando
as sondas específicas PAO 462/PAO 651 PAO 846 (representadas na figura 4.8
por PAOmix) e GAOQ431/GAOQ989 (representadas na figura 4.8 por GAOmix)
(CROCETTI et alii, 2000; CROCETTI et alii, 2002). Por meio da observação
da figura 4.8, verifica-se a predominância de PAO e GAO nos grânulos aeróbios
cultivados no reator mencionado, organismos que correspondem a praticamente
toda a população de bactérias.
FIGURA 4.8 Predominância de PAO e GAO em grânulos aeróbios cultivados em reator do tipo
coluna de bolhas. Em vermelho está representada a população de PAO (PAOmix); em verde
está representada a população de GAO (GAOmix). As cores vermelho e verde estão levemente
modificadas em virtude da sobreposição da cor azul, que representa toda a população bacteriana
(EUBmix).
A presença de GAO em sistemas de remoção biológica de fósforo (Enhanced

Biological Phosphorus R emoval - EPBR) é indesejável, uma vez que esses micro-
-organismos compete1n pelo substrato (ácidos graxos voláteis) con1 PAO em con-
dições anaeróbias, embora não contribuam para a ren1oção de fósforo . Estratégias
operacionais que favoreçam o desenvolvimento de PAO em detrimento a GAO
devem ser levadas em consideração quando se deseja aumentar a capacidade de
remoção de fósforo (OEHMEN et alii, 2006) . Caso haja interesse por parte do
leitor, a competição entre essas duas populações de micro-organismos e os fatores
que afetam a ocorrência de ambas estão discutidos, em maiores detalhes, em tra-
balhos como o de Lopez-Vazquez et alii (2008) e de Lopez-Vazquez et al,ii (2009) .
Vale mencionar que a aplicação da remoção biológica de fósforo pode ainda
simplificar o processo de nitrificação/desnitrificação simultâneas (SND). Na maio-
ria nos sistemas com biofilme consistindo em organismos heterotróficos e autotró-
ficos, os primeiros dominam as camadas mais externas, uma vez que eles são mais
bem sucedidos na competição com os nitrificantes pelo oxigênio dissolvido e pelo
espaço no biofilme. Tal distribuição não é favorável para SND em sistemas contí-
nuos, tendo em vista que a maior parte dos componentes orgânicos será consumi-
da nas regiões externas aeróbias e, dessa maneira, não poderá ser utilizada como
doador de elétrons para a desnit rificação no interior do biofilme. Além disso, esse
t ipo de sistema é mais sensível às concentrações de oxigênio, tendo em vista que
os organismos heterotróficos crescem muito mais rapidamente que os organismos
nitrificantes. Tal fato não ocorre quando se prima pela seleção de organisn1os acu-
muladores de fosfato, os quais podem coexistir com nitrificantes na mesma camada
exte rna dos grânulos em virtude de possuírem velocidades de crescimento sin1ila res
(BRDJANOVIC et alii, 1998), conforme observado por De Kreuk et alii (2005) .
A figura 4.9 apresenta, por meio da técnica FISH, a proporção de PAO/GAO
e de bactérias nitrificantes (oxidadoras de amônio - AOB + oxidadoras de nitrito
- N OB) presentes em grânulos aeróbios cultivados em um reator coluna de bolhas
de escala laboratorial, o mesmo relatado anteriormente nesse item. Nesse caso,
as sondas utilizadas foram PAO 462/PAO 651 PAO 846 (específicas para PAO),
GAOQ431/GAOQ989 (específicas para GAO), Nso1225/Nso190/Neu653 (espe-
cíficas para AOB), Ntspa662/Nit1035 (específicas para NOB) e EUB 338mix
para bactérias em geral . As referências das sondas estão descritas no capítulo 6
(Técnicas de Biologia Molecular Aplicadas ao Estudo da Diversidade Microbiana
de Sistemas de Tratamento de Efluentes).
A partir da figura 4 .9, observa-se como a população de PAO/GAO é mui-
to superior à população de nitrificantes (AOB/NOB), a qual representa parcela
ínfima da população bacteriana total. E sse resultado vai ao encontro do fato de
que, em grande parte das plantas de tratamento de águas residuárias, os micro-
-organismos autotróficos nitrificantes correspondem à pequena parcela da popu-
lação bacteriana total . A despeito dessa contribuição praticamente desprezível,
esses micro-organismos são responsáveis pelo consumo de grande parte do oxi-

gênio dissolvido, o que evidencia a alta atividade dos mesmos. Em sistemas com
n1onitoramento on-line da concentração de oxigênio dissolvido, pode-se observar
nitidamente o aumento da concentração desse gás quando o processo de n itrifica-
ção é finalizado, isto é, quando todo o amônio foi oxidado a nitrito e/ou nitrato.
FIGURA 4.9 Proporção de PAO/GAO e de micro-organismos nitrificantes (AOB/NOB) em

grânulos aeróbios cultivados em reator coluna de bolhas de escala laboratorial. Em vermelho
está representada a população de PAO + GAO (PAOmix/GAOmix); em verde está representada
a população de AOB+NOB (Nso1225/Nso190/Neu653/Ntspa662/Nit1035). As cores vermelha e
verde estão levemente modificadas em virtude da sobreposição da cor azul, que representa toda a
população bacteriana (EUB338mix).
Vale lembrar que a análise FISH foi realizada somente com o intuito de ve-
rificar a presença dos grupos microbianos anteriormente mencionados, sendo que
a posição dos micro-organismos ilustrados na figura 4.9 não corresponde à sua
localização no interior dos grânulos. Nesse caso foi adotado um procedimento no
qual os grânulos foram triturados/esmagados de modo a facilitar a hibridização
das células para posterior visualização en1 1nic roscópio de fluorescência. A obser-
vação da posição real ocupada pelos micro-organismos no lodo granular pode ser
realizada em microscópio confocal de varredura a laser, o qual possibilita realizar
cortes ópticos no n1aterial a ser analisado, os quais são posteriormente agrupados
para a construção de imagens tridimensionais do mesmo. No caso específico de
grânulos aeróbios, os sucessivos cortes ópticos permitem que seja determinada a
localização exata dos consórcios microbianos responsáveis pelos diversos processos
de conversão.
Contrariamente aos nitrificantes e à maioria dos heterotróficos, a capacidade
de PAO em utilizar nitrato como aceptor de elétrons (que neste caso são designa-
dos organismos acumuladores de fosfato desnitrificantes - DPAO) em combinação
co1n a sua capacidade de armazenar compostos orgânicos no interior das células
(PHB), possibilitam a sua existência no centro dos grânulos (mantido em condi-

ções anóxicas).
Há ainda que se considerar que, caso se pretenda obter boas eficiências no
processo de ni trificação/desni trificação simultâneas, a concentração de oxigênio
deve se r escolhida de modo a facilitar a realização de ambos os processos. Baixas
concentrações de oxigênio levam ao aumento do volume anóxico dos grânulos,
rico em micro-organismos capazes de armazenar polhneros, aumentando a capa-
cidade desnitrificante. Nessas condições, no entanto, a camada externa aeróbia na
qual os organismos autotróficos estão ativos é diminuída, ocasionando uma queda
na eficiência de nitrificação. Al ém disso, muitas vezes não se consegue manter
operação estável quando a concentração de oxigênio é diminuída para abaixo de
certo valor crítico, notadamente devido à desintegração e consequente arraste dos
grânulos do reator (MOSQUERA-CORRAL et alii, 2005) . Por sua vez, elevadas
concentrações de oxigênio levan1 à diminuição das regiões anóxicas no interior dos
grânulos em virtude da penetração co1npleta do oxigênio, diminuindo consequen-
ten1ente a capacidade desnitrificante.
Desse modo, fica claro que a razão entre o volume da camada aeróbia e o vol u-
me da camada central anóxica dos grânulos é iinportante e determina a eficiência
do processo SND. Quanto maior a concentração de oxigênio dissolvido, maior a
profundidade de penetração do mesmo sob a mesma taxa de consumo de oxigênio,
o que leva a um menor volume anóxico no interior dos grânulos. Nesse contexto, o
tamanho dos grânulos consiste em uma variável importante na operação do reator,
embora seja difícil de ser manipulada. A figura 4 .1 O representa, de forma esque-
mática, o volume aeróbio (região externa) e o volume anóxico (região inte rna) de
grânulos de diferentes diâmetros submetidos à mesn1a concentração de oxigênio .
De Kreuk et alii (2005b) verificaram que grânulos com n1enores diâmetros
levaram à diminuição da eficiência de remoção de nitrogênio, indicada pelo au-
mento da concentração de nitrato do efluente . Em contrapartida, a oxidação de
runônio não foi afetada pelos diferentes tamanhos apresentados pelos grânulos. A
maior remoção de nitrogênio foi obtida em grânulos maiores que 1,3 mm. No en-
tanto, grânulos com diâmetros superiores a 1, 7 mm começaram a se desintegrar,
formando pequenas partículas de forma irregular achatada, cuja zona anóxica
efetiva era pequena. O fato é que as condições de processo não correspondem ao
único fator que afeta decisivamente o diâmetro dos grânulos. O interior de grânu-
los grandes tende a se desestabilizar devido à respiração endógena e os grânulos
se rompem em pequenas frações que podem crescer e novan1ente fo rmar grânulos
(DE KREUK et alii, 2005b) . No item 4. 7, a influência da concentração de oxi-
gênio no processo SND será evidenciada em alguns trabalhos da literatura, tais
como os realizados por Beun et alii (200 1), Mosque ra-Corral et alii (2005) e De
Kreuk et alii (2005) .
Zona aeróbia
Ocorrência de nitrificação ; presença de organismos
autotróficos nitrificantes juntamente com organismos
heterotróficos (PAO)
Zona anaeróbia
Ocorrência de desnitrificação por
organismos heterotróficos (PAO)
FIGURA 4.10 Diminuição da zona anaeróbia ou anóxica com a redução do diâmetro do grânulo
em condições de concentração de oxigênio dissolvido constante (adaptado de DE KREUK et a/ii,
2005b).
A tabela 4 .3 apresenta as eficiências de nitrificação e de remoção de nitrogê-

nio obtidas por diversos pesquisadores, os quais emp regaram diferentes condições
de operação. Pode-se observar que os resultados obtidos estão intimamente rela-
cionados a parâmetros, como tamanho dos grânulos, concentração de oxigênio e
razão DQO/N. As baixas eficiências de remoção de nitrogênio obtidas por Qin e
Liu (2006) e Mosquera e Corral et alii (20056) e1n comparação com as obtidas
por Kim et alii (2004) estão ligadas ao fato de os prin1eiros autores abrirm mão de
maiores concentrações de oxigênio dissolvido, condição na qual a desnitrificação
é desfavorecida. Certas circunstâncias especiais, as quais dependem do diâmetro
dos grânulos, concentração de OD e razão DQO/N, podem levar à formação de
um agregado microbiano rico em substrato, o qual pode apresentar uma região
interior sem disponibilidade de oxigênio (limitação difusiva de oxigênio). Nesse
caso, são criadas condições ideais para a ocorrência do processo desnitrificante.
Os aspectos operacionais n1encionados anteriormente são apenas alguns que
influenciam decisivamente no tratamento de águas residuárias utilizando-se a
tecnologia de grânul os aeróbios. Vale lembrar que esses aspectos devem se adequar
prin1ordialmente aos objetivos que se pretende alcançar, isto é, aos processos de
conversão de interesse, sejam eles relacionados à remoção de matéria orgânica
ou de nutrientes (N e P). Obviamente que existem inúmeros outros fatores que
devem se r levados em consideração quando se deseja lançar mão de grânulos aeró-
bios para o tratamento de determinada água residuária. Con1posição de diversos
substratos e seus gradientes ao longo da estrutura dos grânulos, temperatura de
operação, configuração do reator e pH compõem o significativo grupo de fatores

que exercem influência nos coeficientes de difusão, velocidades de conversão, ta-
n1anho dos grânulos, distribuição espacial da biomassa e densidade. Esses, por
sua vez, influenciam fortemente uns aos outros, o que muitas vezes dificulta o
estudo experimental do efeito de cada um individualmente.
TABELA 4.3 Eficiências de nitrificação e de remoção de nitrogênio em sistemas de lodo granular

submetidos a diferentes condições de operação
Autor DQO/N OD (mg/ L) T (ºC) dPª"

(mm)
Kim et alii (2004) 21 >2 25 1,0-2,0
Qin e Liu (2006) 4,4-13,3 >4 25 0,8-4,6
Mosquera-Corral et alii 8,3 8 20 1,6
(2005b)
Tsuneda et alii (2003) o >2 - 0,36

Kim e Seo (2006) o >2 20-25 0,3-0,5
Carga Carga Ef. Ef. remoção

Autor orgânica nitrogenada nitrificação de N
(gDQO/(L.d)) (gN/(L.d)) (%) (º/o)
Kim et alii (2004) 2,5 21 97 97
Qin e Liu (2006) 2 4,4 13,3 > 99 24-32
Mosquera-Corral et alii 1,6 8,3 100 16
(2005b)
Tsuneda et alii (2003) o o 100 -

Kim e Seo (2006) o o 100 -
É nesse contexto que surgem os modelos computacionais, os quais podem ser

utilizados para aval iar de forma eficiente a importância relativa de parâmetros
individuais nos biofilmes/grfu1ulos e para fornecer o discernimento necessário a
respeito dos principais fatores que afetam as velocidades de remoção de nutrientes
e a distribuição das diferentes populações microbianas nos grânulos. Os modelos
a que se refere ainda podem servir como ferramenta para a melhoria do projeto
dos reatores biológicos que fazem uso dessa tecnologia. O trabalho de Beun et alii
(2001), descrito a seguir no item 4 .7, se configura como um exemplo do uso de
modelos em conjunto com dados obtidos experimentalmente para investigar o
efeito de alguns parâmetros de operação.
Cabe aqui mencionar que o cálculo das conversões que ocorrem em grânulos,
por meio de balanços de massa, pode ser um pouco complicado, especialmente
devido ao fato de serem utilizados reatores em batelada sequencial. Nesses siste-

mas descontínuos, a interpretação dos resultados e a apresentação das concentra-
ções devem ser real izadas com cuidado. O efluente que não é removido, uma vez
que está abaixo do ponto de saída do sobrenadante, dilui o afluente. Além disso, o
nitrito ou nitrato que permanece do ciclo anterior é primeiramente desnitrificado
direta111ente, utilizando o carbono orgânico proveniente da alimentação. Em um
RBS, de for111a geral, a eficiência de remoção de nitrogênio deve ser relacionada
com as concentrações presentes no afluente e com a quantidade que é removida
durante a fase de aeração. O balanço de nutrientes nesses reatores deve, de pre-
ferência, levar em consideração a composição do gás formado durante o processo.
4.7 APLICAÇÃO DE GRÂNULOS AERÓBIOS NO TRATAMENTO DE ÁGUAS RESIDUÁRIAS

A tecnologia de lodo granular pode ser aplicada na remoção de compostos
orgânicos (os mais variados) e de nutrientes, tais co1110 nitrogênio e fósforo . A
grande vantagem de se utilizar grânulos aeróbios em con1binação com a opera-
ção de reatores em batelada sequencial é justamente a possibilidade de realizar o
tratamento em um único sistema. Como mencionado no item 4.6, os processos
de remoção DQO, nitrificação e desnitrificação podem ser realizados de forma
simultânea, devido à existência, na estrutura dos grânulos, de regiões aeróbias,
anóxicas e/ou anaeróbias.
Beun et alii (2001) investigaram o efeito da concentração de oxigênio dissol-
vido (OD) no desempenho de um reator airlift operado em bateladas sequenciais
(SBAR) contendo lodo granular, particularmente no que se refere à remoção de
nitrogênio. Para tanto, utilizou-se tanto dados experimentais quanto resultados
obtidos pelo modelo desenvolvido. Esse último, alé111 de ser utilizado para descre-
ver o efeito de baixas concentrações de OD na remoção de nitrogênio, foi utilizado
para predizer o efeito de diversas condições de processo no desempenho de remo-
ção desse nutriente .
O reator foi operado durante 142 dias. No 42ll. dia, pequena quantidade de
lodo nitrificante foi adicionada para acelerar o acún1ulo de n1icro-organisn1os ni-
trificantes no reator. A alimentação consistiu em acetato de sódio como fonte de
carbono (18,3 Cmmol/L) e cloreto de amônia como fonte de nitrogênio amoniacal
(40 n1gN-NH; /L). O desempenho do SBAR foi descrito por meio de um modelo
ünplementado em Aquasim (REICHERT et alii, 1994 apud BEUN et alii, 2001),
o qual foi utilizado para simular os processos que ocorrem no reator sob as mesmas
condições aplicadas nos experimentos em laboratório e para ter uma ideia da loca-
lização da biomassa autotrófica e heterotrófica nos grânulos (BEUN et alii, 2001 ).
Observou-se que a nitrificação, desnitrificação e remoção de DQO podem
ocorrer de forma simultânea em um reator de lodo granular operado em bateladas
sequenciais. Durante a fase feast (período com disponibilidade de acetato) a con-

centração de NH; decresceu lentamente, e a quantidade de NO" (NO2 +NO3)
remanescente do ciclo anterior foi desnitrificada com acetato . Após o acetato ser
+
totalmente consumido (início do período famine), a concentração de NH 4 ime-
diatamente começou a diminuir mais rapidamente em comparação com o re-
gime feast, devido à ocorrência do p rocesso de nitrificação . A concentração de
NO" sofreu um aumento durante esse período. Por meio da realização do balanço
de massa para o nitrogênio, evidenciou-se a ocorrência de desnitrificação duran-
te o período famine. Quando todo NH; foi convertido, a concentração de NO"
não diminuiu, permitindo inferir que posteriormente não ocorreu desnitrificação.
Segundo os autores, a desnitrificação não continuou devido à penetração completa
de oxigênio nos grânulos após a n it rificação te r sido con1pletada. Na condição de
100% de OD em relação à saturação do ar, verificou-se, por meio do balanço de
nitrogênio, que 8 7% do NH; removido foi nitrificado e o resto foi utilizado para
o crescin1ento da biomassa. Cerca de 70% do NO" formado durante a nitrificação
foi desnitrificado (BEUN et alii, 2001 ).
No intuito de aun1entar a eficiência de desnitrificação, do ÓÓº ao 71º dia de
operação do reator, a concentração de OD foi diminuída, particular1nente após
40 min do início de cada ciclo até o final do mesmo, para 50% em relação à
saturação do ar. Tal concentração foi atingida misturando-se ar e gás nitrogênio.
Entretanto, con1 este procedimento, não foi observado um aumento na desnitri-
ficação, en1bora an1ônio tenha sido detectado no efluente, ou seja, a n itrificação
foi limitada pela diminuição de OD (BEUN et alii, 2001) .
Nos dias 79, 100 e 142 de operação do reator, a concentração de OD foi di-
minuída a parti r de 40 min do início de determinado ciclo até o final do mesmo,
para um valor constante de 20% de saturação . A concentração de NH; no efluente
aumentou e a concentração de NO" no efluente diminuiu . Nestas condições, 83%
do NH; foi convertido pela nitrificação e 100% do NOX formado pelo p rocesso
nitrificante foi desnitrificado . Ficou claramente demonstrado que, diminuindo
a concentração de OD para 20% em relação à saturação do ar, a velocidade de
nitrificação foi diminuída e a desnitrificação sofreu um incremento substancial
Tendo em vista que o modelo descreveu ben1 os dados experin1entais obtidos a
100 e 20% de OD em relação à saturação do ar, o mesmo foi utilizado para avaliar
quantitativamente o efeito do OD na nit rificação e na desnitrificação, variando
a concentração desse parâmetro dentro dessa faixa (20 - 100%). O balanço de
nitrogênio durante um ciclo foi utilizado para o cálculo da eficiência de remoção
de nitrogênio do reator. Os autores observaram claramente que o aumento da
concentração de OD contribuiu para aumentar a eficiência de nitrificação, dimi-
nuindo a concentração de NH; do efluente, embora tenha acarretado o decréscimo
da eficiência de desnitrificação, aumentando a concentração de NO; do efluente.

A máxima remoção de nitrogênio foi obtida a 40% de OD (BEUN et alii, 2001 ).
Em outra simulação realizada, estudou-se em maior detalhe o desempenho
do SBAR a 40% de OD, uma vez que nessa condição o percentual de remoção de
nitrogênio foi máximo. O período feast foi maior do que o dobro quando compara-
do com a operação a 100% de OD e a penetração de oxigênio durante esse período
foi pequena. Já a penetração de acetato foi completa nos grânulos, independen-
temente da concentração de OD. Uma vez que o oxigênio não estava presente
no centro do grânulo durante o período feast, combinado com a disponibilidade
de NO; proveniente do ciclo anterior, o acetato pôde ser armazenado na região
central dos grânulos, em condições anóxicas, na forma de PHB (BEUN et alii,
200 1). Embora a concentração de PHB fosse pequena no centro dos grânulos em
comparação com as camadas externas, a presença de NO; no período famine e a
baixa concentração de 0 2 propiciara1n a ocorrência de desnitrificação na região
central dos grânulos, utilizando-se os polímeros arn1azenados intracelularmente
como fonte de carbono (BEUN et alii, 2001) .
Na condição de 40% de OD, NH; não foi con1pletamente ren1ovido durante
o ciclo, a concentração de No ; no efluente foi menor que du rante a operação do
SBAR a 100% de OD e a eficiência de remoção de nitrogênio foi de 80%. Nessa
concentração de OD, a profundidade de penetração de oxigênio foi pequena e o
oxigênio p ropiciou a ocorrência de nitrificação somente nas camadas externas dos
grânulos, enquanto uma zona anóxica interna foi criada no centro dos grânulos,
favorecendo a desnitrificação. Os autores deixaram claro que a concentração de
OD apresenta um efeito pronunciado na remoção de nitrogênio. Com o aumento
da concentração de OD, a nitrificação foi favorecida. Por outro lado, esse mesmo
aumento de OD prejudicou o desempenho em tern1os de desnitrificação. Dessa
forma, torna-se apropriado estabelecer um balanço ideal entre nitrificação e des-
nitrificação, conseguido por meio do controle da concentração de OD no reator,
garantindo dessa forma máxima remoção de nitrogênio (BEUN et alii, 200 1).
Em outra simulação realizada na qual a nitrificação foi considerada inativa
durante um ciclo operacional, verificou-se o efeito do processo n itrificante na pro-
fundidade de penetração do oxigênio . Na simulação sem a ocorrência de nitrifica-
ção, a quantidade de nitrato remanescente do ciclo precedente foi desnitrificada
durante o período feast . Amônio não foi completamente consumido durante o
ciclo, pois foi utilizado somente para o crescimento microbiano . Observou-se tam-
bém que, 1nesmo durru1te o períodofeast da condição-padrão (100% de OD), are-
moção de NH; foi decorrente principalmente do crescimento da biomassa, tendo
em vista que a taxa de remoção desse substrato durante o períodofeast foi a mesma
do ciclo no qual a ocorrência da nitrificação foi negligenciada pela simulação. Tal
constatação está ligada ao fato de que, durante a fase feast, os micro-organismos
heterotróficos responsáveis pela degradação do acetato e que possuem alta veloci-

dade de crescimento, dominam a competição com os nitrificantes pelo oxigênio.Já
a partir do início da fasefamine da condição de 100% de OD, a taxa de remoção
de NH; aumenta devido ao processo de nitrificação (BEUN et alii, 2001).
Durante o período jeast, a profundidade de penetração foi bastante pequena
tanto para a simulação com nitrificação quanto para simulação sem nitrificação.
Assim que o acetato foi integralmente consumido na simulação com nitrificação,
a profundidade de penetração de oxigênio foi de 350 ,um enquanto NH; esteve
presente no meio líquido. Nessas circunstâncias, o oxigênio foi utilizado para a ni-
trificação . Quando esse substrato n it rogenado foi integralmente consumido, o oxi-
gênio penetrou completamente no interior dos grânulos. Já na simulação na qual
se desconsiderou a ocorrência de nitrificação, após o térn1ino da disponibilidade
de acetato (final do período feast), o oxigênio foi capaz de penetrar integralmente
tendo em vista que o mesmo não foi utilizado para a nit rificação. Esses resultados
obtidos por meio do n1odelo permitiram inferir que a atividade das bactérias nitri-
ficantes é responsável pelo fato de o oxigênio não alcançar o centro dos grânulos, o
que certamente favorece a realização da desnitrificação nessa região, em particular
Os autores ainda investigaram o efeito do armazenamento e da degradação de
PHB na desnitrificação, realizando uma simulação na qual o acúmulo e a degra-
dação desse composto foram considerados inativos durante um ciclo operacional
do SBAR. Na sünulação-padrão (com PHB), ocorreu crescimento dos grânulos
durante todo o ciclo. Durante o períodofeast, a biomassa cresceu devido ao acetato
degradado, enquanto no períodofamine o crescimento se deu devido à degradação
de PHB (BE UN et alii, 2001) . O períodofeast na siinulação sem PHB foi quase o
dobro comparado con1 a simulação-padrão com PHB . O crescimento dos grânulos
ocorreu somente durante a fasefeast, embora a quantidade de biomassa produzida
tenha sido muito maior nesse período do que durante todo o ciclo da simulação-
-padrão. A remoção de NH; foi maior na condição sem PHB em comparação com
o período feast da condição co1n PHB devido à 1naior velocidade de crescimento
da bion1assa, absorvendo de fo rma mais intensa esse substrato nitrogenado, em-
bora não tenha ocorrido nitrificação nesse período. Após todo o acetato ter sido
consumido (início do período famine), a remoção de NH; foi atribuída somente à
nitrificação e, a partir desse período, não ocorreu mais crescimento da biomassa,
a qual passou a enfrentar um período sem disponibil idade de substrato orgânico
A respeito do papel do PHB na desnitrificação durante o período famine da
simulação sem esse polímero intracelular, observou-se que todo o NH; removido
foi convertido em NO;, ou seja, não ocorreu desnitrificação. Já no período famine
da simulação com PHB, 50% do NH; foi nitrificado em NO;, indicando que
ocorreu o processo desnitrificante. Nesse último caso, o PHB armazenado no

centro do grânulo pode ser usado com fonte de carbono para a desnitrificação
quando não há 1nais disponibilidade de fonte externa de carbono (acetato), desde
que esteja presente NO; (proveniente da nitrificação) como aceptor de elétrons e
não oxigênio (BEUN et alii, 2001) .
Beun et alii (2001) ainda enfatizaran1 o fato de que, em sistemas operados de
forma contínua, não ocorre armazenamento e degradação de substrato orgânico,
tendo em vista que a sua concentração no reator é sempre baixa, não permitin-
do a existência de períodos feast e famine . Segundo os autores, nesses sistemas a
profundidade de penetração de acetato é sempre muito menor que a respectiva
profundidade do oxigênio, fazendo com que seja necessária a introdução de condi-
ções anóxicas para propiciar a desnitrificação, o que, por sua vez, requer o ajuste
do modo de operação do reator. Alén1 disso, a fonte externa de carbono deve ser
utilizada diretamente para o processo desnitrificante nesses reatores alimentados
continuamente (BEUN et alii, 2001).
Em relação à distribuição da população de micro-organismos na estrutura
dos grânulos, os autores ainda ponderam que, em um sistema alimentado de for-
ma descontínua, a exemplo do SBAR, o substrato orgânico (nesse caso acetato)
penetra completamente no biofilme ou grânulo devido à alta concentração no
meio líquido, especialmente no início do período feast. Uma vez que o oxigênio
está presente somente nas camadas externas dos biofilmes, é esperado que as
bactérias nitrificantes estejam localizadas nessas regiões onde há disponibilidade
de oxigênio, e que o acetato seja armazenado na for1na de PHB pela população
heterotrófica, em condições anóxicas, na porção interna dos biofilmes/grânulos
A estratificação da estrutura dos grânulos também foi prevista pelas si-
mulações realizadas por Beun et alii (2001 ). A bio1nassa autotrófica se situou
principalmente na porção externa dos grânulos. Já a localização da população
heterotrófica foi menos definida, estando presentes tanto na região central dos
grânulos (crescendo com acetato durante o período feast e utilizando NO; como
aceptor de elétrons) quanto nas camadas externas dos grânulos (utilizando o oxi-
gênio disponível como aceptor de elétrons).
A simulação em condições constantes de 40% de oxigênio dissolvido en1 re-
lação à saturação do ar mostrou que, em longo prazo, o OD influenciou a distri-
buição microbiana na estrutura do lodo granular. Nessas condições de OD (40%),
a biomassa autotrófica se situou em maior quantidade na região externa aeróbia
dos grânulos em comparação com a condição de 100% de OD. Essa situação é
explicada claramente levando-se em consideração a necessidade de oxigênio por
parte da biomassa autotrófica para a conversão de NH; pela nitrificação. Já a po-
pulação heterotrófica é capaz de utilizar tanto oxigênio quanto No; como aceptor
de elétrons, podendo dessa forma também estar presente no centro dos grânulos.
Verificou-se que a exata localização da biomassa autotrófica influencia a remoção
de nitrogênio, e a distribuição dessa biomassa é influenciada pela concentração de
oxigênio dissolvido no reator (BEUN et alii, 2001 ).
Utilizando-se os conhecimentos adquiridos em pesquisa prévia (DE KREUK
e VAN LOOSDRECHT, 2004), discutida a11terio rmente no item 4 .5, na qual
se verificou que a seleção de organismos acumuladores de fosfato e organisn1os
acumuladores de glicogênio, por meio da adoção de um regime de alimentação
anaeróbio, propiciou a melhoria da estabilidade dos grânulos aeróbios em baixas
concentrações de oxigênio, D e Kreuk et alii (2005) estudaram os fatores impor-
tantes para se obter remoção simultânea de nitrogênio e fó sforo en1 reatores de
lodo granular.
As condições operacionais utilizadas por De Kreuk et alii (2005) for8111 as
n1esmas do trabalho anterior (DE KREUK e VAN LOOSDRE CHT, 2004), des-
crito no item 4.5. Procurando observar os p rincipais processos de conversão que
estavam ocorrendo em diferentes concentrações de oxigênio dissolvido, os autores
verificaram que após 52 dias de operação em condição de satu ração de oxigênio,
ocorreu consumo integral de acetato durante o período anaeróbio. Após 65 dias,
atingiu-se 95% de remoção de fosfato, cuja concentração inicial foi de 20 mg!L.
Do 650. ao 2330. dia de operação, a concentração média de fosfato liberada no meio
líquido du rante a fase de alimentação anaeróbia foi de 86 mgP/L, enquanto a con-
centração do efluente foi de apenas 0,4 mgP/L. A razão entre o fosfato liberado
e o acetato consumido foi de 0,44 P-mol/C-mol, comparável com a razão de 0,5
obtida em pH 7 para uma cultura altamente enriquecida em PAO (SMOLDERS
et alii, 1994 apud De Kreuk et alii, 2005b).
Durante os prin1eiros dois dias após o start-up do reator, os organismos oxi-
dadores de amônio foram inibidos com aliltioureia (ATU) no intuito de evitar a
nitrificação. Como consequência, evitou-se a presença de nitrato durante o perío-
do de alimentação anaeróbio, o qual poderia impedir o desenvolvimento de PAO.
Observou-se oxidação completa de amônio 39 dias após a dosagem de ATU ter
sido interrompida, embora se tenha levado em torno de 100 dias para que todo
o nitrito fosse oxidado. Após o 154Q dia de operação, amônia e nitrito não foram
mais detectados no efluente . Devido à operação em saturação de oxigênio, ocorreu
desnitrificação incompleta, obtendo-se 34% de remoção total de nitrogênio, sendo
27% ocasionado pelo crescimento da biomassa (DE KREUK et alii, 2005b) .
A concentração de oxigênio foi diminuída para 40% no intuito de melhorar a
eficiência de desnitrificação, diminuindo a profundidade de penetração de oxigênio
e, por conseguinte, o volume aeróbio dos grânulos. Essa mudança não apresentou
influência na remoção de fosfato, a qual foi mantida em torno de 97%. O acetato
continuou sendo totalmente consumido durante o período anaeróbio, enquanto a
razão média entre o fosfato liberado e o consumo de acetato não apresentou va-
riação (0,45 P-mol/C-mol). A eficiência de desnitrificação aumentou lentamente
durante esse período, sendo que concentrações abaixo de 5 mgN-NO3/L foram
medidas no efluente após 64 dias de operação sob 40% de saturação de oxigênio.
Amônio e nitrito foram totalmente oxidados e a remoção média de nitrogênio foi
de 98% (DE KREUK et alii, 2005b).
Posteriorn1ente, os autores observaran1 que ocorreu uma mudança na mor-
fologia dos grânulos, os quais passaram de partículas esféricas para partículas de
forma irregular, apresentando fissuras em direção ao centro dos mesmos. Uma das
consequências foi justamente a din1inuição da eficiência de remoção de nitrogênio,
a qual despencou para valores entre 50 e 70%. Com o objetivo de melhorar esse
índice, a concentração de 0 2 foi diminuída novamente, passando de 40 para 20%
de saturação. A remoção de fosfato se manteve elevada (94% em média) durante
os primeiros 90 dias de operação nestas condições. Entretanto, posteriormente a
concentração de P-PO!- no efluente começou a aumentar, provavelmente devido
ao baixo rendimento da biomassa, relacionado ao alto tempo de retenção celular
aplicado (71 dias) (DE KREUK et alii, 2005b). Para atingir remoção completa
de fosfato, é necessário que a idade do lodo seja mantida em valores relativamen-
te baixos. Caso tal condição não seja respeitada, a remoção de P-POi- não será
eficiente, uma vez que a biomassa, carregando esse nutriente, não é removida do
sistema em proporções adequadas.
+ - -
As concentrações dos compostos nitrogenados (N-NH4, N-NO2 e N-NÜ3)
não apresentaram 1nodificações imediatas após o decréscimo da concentração de
oxigênio de 40 para 20%. Após 30 dias de operação nesta condição, observou-se
uma queda na eficiência de nitrificação, ocasionada pela diminuição da cama-
da externa aeróbia na qual os nitrificantes estão presentes, embora a capacidade
desses micro-organismos tenha sido restabelecida ao longo do tempo. Durante a
operação em estado estacionário sob condições de 20% de saturação de oxigênio,
na qual os grânulos apresentaram tamanhos maiores que 1,3 mm, o volume anó-
xico contendo organismos acumuladores de fosfato clesnitrificantes (DPAO) no
interior dos grânulos foi grande o suficiente para possibilitar a desnitrificação,
sendo obtida a maior eficiência de remoção de nitrogênio (94%) (DE KREUK et
alii, 2005b) .
De Kreuk et alii (2005) ainda avaliaram o efeito a curto prazo tanto do au-
mento quanto da diminuição da concentração de oxigênio dissolvido. Os experi-
mentos foram realizados durante a operação em estado estacionário sob condições
de 40% de saturação de oxigênio, sendo sua concentração modificada durante
um ciclo para 100, 40 e 10%. A taxa de consumo de fosfato foi diminuída com
a redução da concentração de oxigênio, devido à diminuição da profundidade de
penetração do mesmo, fazendo com que o volume anóxico e aeróbio aumentasse e
diminuísse, respectivamente. Observou-se ainda que, na ausência de nitrato (ob-

t ida pela inibição da nit rificação por aliltioureia), a taxa de consumo de fosfato foi
diminuída em torno de 45% em relação ao valor máximo obtido durante operação
em 100% de saturação de oxigênio com nitrificação/desnitrificação. A maior efi-
ciência de remoção de nitrogênio obtida nesse experimento foi obtida em 40% de
saturação de oxigênio, a qual corresponde ao nível de saturação a longo prazo no
qual os grânulos fo ram cultivados.
Os mesmos autores ainda evidenciam o fato de que, com as altas concentra-
ções de fosfato do afluente (19,6 mgP-PO!-/I.,; DQO/P=20,2) e co1n o baixo fator
de conversão de substrato em células (0,25 gSSV/gDQO), o valor calculado para o
conteúdo de P nos grânulos seria de 0 ,20 gP/gSSV. Os valores para esse parâmetro
encontrados na literatura são menores, variando de 0,02 a O, 14 (FALKENTOFT,
2000) . Dessa maneira, deve ser considerado que parte da remoção de fosfato foi
ocasionada pela precipitação química que ocorreu no interior dos grânulos. Tal
possibilidade pode ser comprovada pelo aumento do teor de sólidos fixos dos grâ-
nulos enriquecidos em PAO (representando 30-41 % do total de sólidos) quando
utilizou-se al imentação sob condições anaeróbias em con1paração com os grânulos
obtidos du rante a alimentação do reator e1n forma de pulso e e1n condições aeró-
bias (representando 6% do total de sólidos). Além disso, a cor da maioria dos grâ-
nulos era branca, embora alguns grânulos apresentassem coloração marrom-clara.
Esses últimos apresentaram teor de sólidos fixos de 1 7 ,2%, enquanto nos grâ-
nulos brancos essa proporção foi de 50,4%, sugerindo a presença de precipitados
nesses últ imos (DE KREUK et alii, 2005b) . Vale mencionar que a precipitação
no interior dos grânulos, de certa forn1a, pode ser vantajosa uma vez que, alé1n de
favorecer a remoção de fosfato, torna os grânulos mais pesados, aumentando a sua
velocidade de sedimentação.
Mosquera-Corral et alii (2005), conforme discutido no ite1n 4.5, avaliaram
quais seriam as melhores condições de operação para a remoção de nitrogênio em
um sistema de grânulos aeróbios. Para tanto, verificaram os efeitos a curto e longo
prazos da redução da concentração de oxigênio no desempenho de um reator airlift
operado em bateladas sequenciais (SBAR). Os autores obtiveram remoção integral
de a1nônia após 120 dias de operação em saturação de oxigênio de 100%. Nestas
condições, a eficiência média de remoção de N é equivalente a 16% em relação ao
total desse elemento alimentado ao reator (MOSQUERA-CORRAL et alii, 2005) .
Quando a menor concentração de oxigênio foi apl icada (40%), verificou-se
um aumento da eficiência de desnitrificação e os compostos NOx (NO2 e NO3)
foram quase completamente convertidos a nitrogênio gasoso durante os primei-
ros dias de operação nessas condições. E sses resultados estão relacionados com o
aumento do volume anóxico dos grânulos com a diminuição da concentração de
oxigênio, aun1entando a capacidade desnitrificante. De forma oposta, a eficiência
de nitrificação foi diminuída, fazendo com que amônia estivesse presente no

efluente. Tal decréscimo pode estar relacionado com a competição, pelo oxigê-
nio, entre os micro-organismos oxidadores de amônio e os micro-organismos
heterotróficos na camada externa dos grânulos. Um fato interessante observado
por Mosquera-Corral et alii (2005) foi que o volume de biomassa em condições
aeróbias na camada externa dos grânulos diminuiu menos que a taxa de oxidação
de amônio . Para exemplificar, quando a concentração de oxigênio foi diminuída
de 100% para 50% de saturação, o volume aeróbio diminuiu 27%, enquanto a
taxa de oxidação de amônia sofreu uma queda de 4 7%. Esses dados indicam uma
estrutura composta de diversas camadas nas zonas aeróbias, com os organismos
heterotróficos crescendo mais externamente que os organismos responsáveis pela
oxidação de amônio. Segundo Van Loosdrecht et alii (1995), essa estratificação
é principalmente causada pelas diferenças no crescimento entre essas duas po-
pulações de micro-organismos em conjunto com a competição pelo oxigênio. A
diminuição da ta,'{a de nitrificação não levou ao decréscimo na remoção global de
nitrogênio. A remoção média de nitrogênio foi de 63% en1 concentração de oxigê-
nio de 40%, evidenciando que grande parte do nitrito e nitrato foi desnitrificada
nessas condições.
Mosquera-Corral et alii (2005), conforme també1n evidenciado no iten1 4.5,
reiniciaram a operação do sistema com novo inóculo e aplicaran1 concentração de
oxigênio de 40% em relação à saturação. Nessas condições, a taxa volumétrica de
consumo de acetato foi bastante pequena, tendo e1n vista o longo período feast
de 160 min. Não foi observada nitrificação, uma vez que os micro-organismos
nitrificantes não conseguiram se desenvolver e1n tal sistema instável. A impossi-
bilidade de formar grânulos estáveis nessas condições fez com que a operação do
reator fosse interrompida.
No que se refere aos experimentos visando estudar o efeito a curto prazo
da diminuição da concentração de oxigênio dissolvido na remoção de nitrogênio,
Mosquera-Corral et alii (2005) verificaram que a sua redução de 100 para 50, 40,
20 ou 10% em relação à saturação do ar não influenciou a taxa de consumo de ace-
tato, tendo em vista que a duração da fase feast foi similar em todas as concentra-
ções testadas. A oxidação de amônio diminuiu e a produção de nitrato au1nentou
com a din1inuição da concentração de 0 2 • Em concentrações de oxigênio menores
que 20% de saturação, a concentração de amônio no efluente aumentou, indican-
do que nitrificação completa não foi atingida. Co1npostos NOx foram desnitrifica-
dos durante a fasefeast utilizando acetato como fonte de carbono. Durante a fase
famine dos ciclos com alta concentração de oxigênio (40 - 100% de saturação),
não ocorreu desnitrificação. Em contrapartida, em baixas concentrações de 0 2 ,
esse processo ocorreu durante a fasefamine, utilizando-se para tanto o PHB arma-
zenado intracelularmente. Os percentuais de remoção de nitrogênio aumentaram
com a diminuição da concentração de oxigênio, atingindo o valor máximo de

34,5% quando se en1pregou 10% de satu ração de oxigênio.
Na literatura também foram reportados trabalhos que primam pela operação
de reatores de lodo granular, sem se p reocupar com o armazenamento de políme-
ros intracelulares. Um exemplo é a pesquisa desenvolvida por Qin e Liu (2006),
na qual foram cultivados grânulos microbianos com excelente sedimentabilidade,
subn1etidos a dife rentes cargas de nitrogênio amoniacal, em quatro reatores (RBS 1
- RBS 4) operados em bateladas sequenciais operados sob condições aeróbias-anae-
róbias alternadas. O tempo do ciclo foi de 6 h (5 min de enchimento, 230 min de
reação em condições aeróbias, 11 9 min de reação em condições anaeróbias, 2 min
de sedimentação e 4 min de descarte de efluente) e o TRH foi de 12 h. A concen-
tração de oxigênio dissolvido (OD) foi maior que 50% en1 relação à saturação do
ar durante a fase aeróbia. Já na fase anaeróbia, utilizou-se gás nitrogênio. O tempo
de retenção celular foi de aproximadamente 20 dias após a formação dos grânulos.
Os reatores foram inoculados com lodo ativado proveniente de uma planta
de tratamento de água residuária municipal e foram alimentados, através de suas
bases, com meio sintético contendo etanol como única fonte de carbono, cloreto
de amônio, bicarbonato de sódio e outros nutrientes necessários. A DQO do meio
de aliinentação foi mantida constante em SOO mg/L, enquanto a concentração
de N -NH; para os quatro reatores foi aumentada, de forma gradual, de 3 7 ,5 a
11 2,5 mgN/L. E sses valores acarretaram o aumento gradual da carga orgânica
nitrogenada de O, 15 (no RBS 1) a 0,45 kgl(m 3 • d) (no RBS 4) (QIN e LIU, 2006).
Grânulos foram observados nos reatores após 40 dias de operação sob con-
dições aeróbias-anaeróbias alternadas. Esses apresentaram forma externa esférica
com estrutura compacta. A concentração de biomassa nos reatores foi significativa,
variando de 3,0 no RBS 1 a 5,5 gSSV/L no RBS 4 , evidenciando o fato de que a
granulação propiciou melhor retenção de biomassa nos reatores. O IVL diminuiu
de 230 ml)g (lodo ativado inoculado ao reator) para 30-12 ml)g (lodo granular
submetido a cargas nitrogenadas crescentes no RBS 1 ao RBS 4) . Esses valores de
IVL são ainda menores que os obtidos durante a operação de reatores de lodo gra-
nular em condições exclusivan1ente aeróbias, os quais apresentam valores típicos de
IVL variando na faixa de 50 - 100 mL (DANGCONG et alii, 1999; TAY et alii,
200 1b) . A velocidade de sedimentação dos grânulos cultivados nos quatro reato res
atingiu valores maiores que 60 m/h, valor muito superior ao apresentado pelo lodo
ativado convencional (2 - 5 m/h) (CAMPOS et alii, 1999 apud QIN e LIU, 2006) .
Em um experimento sem adição de fonte externa de carbono durante a fase
anaeróbia, Qin e Li u (2006) verificaram que 95% da DQO afluente foram remo-
vidos durante a primeira hora da fase aeróbia. Durante esse período, a concen-
tração de amônia foi diminuída lentamente. Após a DQO ter sido integralmente
removida, a concentração de amônia começou a decrescer rapidamente devido à
nitrificação . Durante essa fase sob condições aeróbias, amônia foi inteiramente
convertida em nitrito e nitrato. Na fase anaeróbia subsequente, a desnitrifica-
ção foi observada em níveis bastante reduzidos (desnitrificação parcial), sendo
que aproximadamente 13-27 mg/L N-NOx (N-NO 2 e N-NO3 ) foi desnitrificado
quando a fonte externa de carbono não esteve disponível, valores que representam
menos de 10% do N-NO X formado pela nitrificação.
Tendo en1 vista os resultados obtidos se1n adição de fonte externa de carbono
e no intuito de se atingir completa desnitrificação, passou-se a adicionar etanol
como fonte externa de carbono em uma razão mássica etanol/N-NOX de 2:1 no
início da fase anaeróbia. Deste modo, observou-se que quase todo o n itrito e o ni-
trato produzidos na fase aeróbia pela nitrificação foram convertidos rapidamente
a nitrogênio gasoso (N2) na fase anaeróbia pelo processo desnitrificante. Sendo
assim, ficou comprovado que grânulos 1nicrobianos cultivados sob condições aeró-
bias-anóxicas alternadas poden1, de forma eficiente, remover carbono orgânico e
converter nitrogênio na forma de amônia para nitrito e nitrato e posteriormente
a nitrogênio gasoso (N2). Em outras palavras, observou-se a coexistência de po-
pulações de micro-organismos heterotróficos, nitrificantes e desnitrificantes na
estrutura do lodo granular cultivado em condições aeróbias-anaeróbias alternadas
(QIN e LIU, 2006).
Cabe aqui evidenciar que, diferente dos trabalhos descritos anteriormente,
nos quais os diferentes processos ocorriam em diversas regiões (aeróbia e anóxica/
anaeróbia) no interior dos grânulos em virtude da presença de um gradiente de
concentração de oxigênio e da di sponibilidade de polímeros intracelulares como
fonte de carbono para a desnitrificação, o trabalho de Qin e Liu (2006) se asse-
melha ao que normalmente é realizado na maioria das estações de tratamento de
águas residuárias. Obviamente que, nesse caso, não foram utilizadas as vantagens
de tecnologia de lodo granular, como a economia de material orgânico para a des-
nitrificação, especialmente quando o desenvolvin1ento de micro-organismos capa-
zes de armanezar substrato orgânico na forma de polímeros intracelulares (PAO
por exemplo) é favorecido (QIN e LIU, 2006).
A atividade respiro1nétrica das bactérias oxidadoras de amônia e oxidadoras
de nitrito foram descritas, respectivamente, pela taxa específica de utilização de
oxigênio para oxidação de amônia (SOURNH4 ) e nitrito (SOU RN02 ). A atividade das
bactérias heterotróficas foi determinada por meio da taxa específica de utilização
para oxidação de carbono (SOURH). Observa-se que, tanto na condição com au-
sência quanto na condição com presença de fonte externa de carbono na fase anae-
róbia, a atividade das bactérias oxidadoras de amônia aumentou com o aumento
da carga nitrogenada aplicada, enquanto a atividade das bactérias oxidadoras de
nitrito não apresentou variação significativa nessas condições. Na ausência de
fonte externa de carbono, verificou-se ainda que a atividade da população hetero-
trófica diminuiu com o enriquecimento do consórcio microbiano em nitrificantes,
tornando-se menos dominante. Já o suprimento de carbono externo aumentou a

atividade da população de heterotróficos e desnit rificantes (os quais compreen-
dem, e1n sua maioria, bactérias heterotróficas facultativas), especialmente quando
foram aplicadas altas cargas orgânicas (QIN e LIU, 2006).
A atividade das bactérias desnitrificantes foi determinada pela taxa específica
de redução de N-NOx. Esse parâmetro variou de 12 ,0-25,3 mgN/gSSV.h na condi-
ção na qual os reato res fo ram alimentados com fonte externa de carbono no início
da fase anaeróbia. Esses valores são de uma ordem de magnitude maiores que os
obtidos durante a operação dos reatores sem adição de fonte externa de C, os quais
variaram de 1, 9-3 ,5 mgN/gSSV.h . Os resultados evidenciaran1 que a atividade das
bactérias desnitrificantes foi essencialmente determinada pela disponibil idade de
fonte externa de carbono na fase anaeróbia (QIN e LIU, 2006) .
Em virtude de sua alta superficial, porosidade e boa capacidade de sedi-
mentação, os grânulos aeróbios apresentam importante função no tratamento de
compostos químicos tóxicos e metais pesados. Gai et alii (2008) estudaram os
mecanismos de adsorção de Cu 2 + por meio de lodo granular. Esses autores ob-
servaram que 70% do cobre foi adsorvido através do mecanismo de troca iônica
com Na+, Ca2 + e Mg2 +, os quais foram liberados pelos grânulos. Xu e Liu (2008)
propusera1n que troca iônica, li gação com EPS e p recipitação química são os me-
canismos principais envolvidos na biossorção de Cd 2 +, Cu2 + e Ni 2 + por grânulos
aeróbios. Tais autores ainda verificaram que grupos alcoólicos, carboxilatos e
éteres participam ativamente na captura dos metais. Nancharaiah et alii (2008)
cultivaram grânulos aeróbios em água residuária contendo ácido nitrilotriacéti-
co . O agente quelante acelerou significativa1nente o processo de granulação, en-
quanto os grânulos formados removeram esse agente quase completamente. Zhu
et alii (2008) cultivaram grânulos para a degradação de 4-cloroanilina em um
RBS cuja razão altura/diâmetro era elevada. Grânulos maduros foram obtidos
em 90 dias, sendo que a taxa específica de degradação de 4-clo roanilina variou de
0, 14-0,27 gl(gSSV.d).
Na maioria das pesquisas realizadas com grânulos aeróbios, os reatores em-
pregados foram alimentados com água residuária sintética. Conforme abordado
previamente nesse n1esmo item, os trabalhos focaram principalmente questões
relativas às eficiências de remoção de nutrientes (DQO, N e P), em diferentes con-
dições de operação. Existem poucos trabalhos de pesquisa nos quais a granulação
aeróbia foi aplicada no tratamento de água residuária industrial.
Como mencionado no iten1 4.5, Arrojo et alii (2004) avaliaram a formação
de grânulos aeróbios em dois reatores operados em bateladas sequenciais (RBS 1 e
RBS 2) alimentados com água residuária industrial oriunda de um laboratório des-
t inado à análise de produtos de indústria leiteira. No RBS 1 foi inserida uma fase
anóxica no início de cada ciclo, embora o RBS2 tenha sido sub1netido somente a
condições aeróbias. Os mesn1os autores ainda avaliaran1 o processo de remoção
de nitrogênio. No início do experimento do RBS 1 (carga orgânica e nitrogenada

aplicadas equivalentes a 1 gDQO/(L · d) e O, 1 gN-NH; /(L ·d), respectivamen-
te), a ren1oção de nitrogênio foi relacionada à assim il ação desse nutriente para
o crescimento da bion1assa, sendo que a nitrificação não ocorreu nesse período.
Esse último processo somente foi verificado após um mês de operação, no qual
se observou conversão de an1ônia a nitrato. Quando a concentração de amônia
foi dobrada devido a mudanças na composição da água residuária (após o 150.u
dia de operação), começou a ocorrer desnitrificação em ambos os sistemas. Dessa
forma, a nitrificação e a desnitrificação eram os principais mecanismos de re-
moção de nitrogênio após esse período . A eficiência de remoção de nitrogênio
alcançou 80% no l 88 2 de operação em ambos os reatores. A carga orgânica e a
carga nitrogenada aplicadas em ambos os sistemas situaram-se, respectivamente,
entre 1 e 7 DQO/(L ·d) e entre 0,1 e 0,7 gN/(L·d). Esses valores são superiores
aos reportados por Dangcong et alii (1999), os quais alimentara1n RBS de lodo
aeróbio granular utilizando meio sintético contendo 0,15-0,18 N-NH;/(L·d) e
1,5-2 ,O gDQO/(L · d) .
A eficiência de remoção de nitrogênio foi de 70% em ambas as unidades
mesmo considerando que o RBS2 foi operado sempre sob condições aeróbias. A
DQO do afluente apresentou valores entre 0,5 e 1,8 mg/L e a concentração de
a1nônia variou de 30 a 180 mgN-NH;/L durante todo o período operacional. As
eficiências de remoção de DQO se situaram entre 85% e 95%. A concentração de
amônia no efluente variou de O a 20 mgN-NH; /L e a concentração de nitrato de
O a 40 mgN-NO3 /L, valores esses similares aos obtidos por Garrido et alii (2001),
tratando a mesma água residuária industrial em um RBS de 28 m 3 contendo bio-
massa em forma de flocos. Entretanto, deve se levar em consideração que as cargas
orgânica e nitrogenada aplicadas foram maiores no RBS con1 lodo granular (em
torno de cinco vezes maior considerando os valores máximos aplicados) e mesmo
assim as características do efluente, em termos de concentração de nitrogênio e
DQO, foram semelhantes, o que evidencia as vantagens da tecnologia de granu-
lação aeróbia quando comparada com a tecnologia de lodo ativado convencional
(ARROJO et alii, 2004).
Medições das concentrações dos compostos envolvidos foram realizadas du-
rante os ciclos operacionais (particularmente no 260.2 dia de operação no qual a
carga orgânica e a carga n itrogenada fora1n de 5 gDQO/(L · d) e 0,4 gN-NH; /(L · d),
respectivamente) e permitiram observar que quase toda a matéria orgânica biode-
gradável e o nitrato (remanescente do ciclo anterior) foram completamente remo-
vidos em ambos os sistemas durante os priineiros 1O minutos de ciclo. Nitrato
foi consumido via desnitrificação enquanto compostos orgânicos biodegradáveis
foram parcialmente oxidados aerobicamente, parcialmente usados como doador de
elétrons para a desnitrificação e parcialmente acumulados na forma de biomassa.

Amônia foi oxidada para nitrato durante o período aeróbio (após o período anó-
xico no RBS, e durante todo o ciclo no RBS 2 desprovido de fase anóxica), ime-
diatamente após o desaparecimento de toda a DQO biodegradável da fase líquida.
Mesmo quando foram aplicadas cargas orgânicas de 5-7 gDQO/(L·d), observou-se
a ocorrência de nitrificação (ARROJO et alii, 2004).
A atividade específica de desnitrificação foi de 0,28 e 0,30 gN/(gSSV·d) no
RBS, e no RBS 2 , respectivamente . Já a atividade específica nitrificante foi de
aproximadamente 0 ,033 gN/(gSSV·d) no RBS 2 e 0,023 gN/(gSSV·d) no RBS 1 •
No caso do RBS 2 , o fato dos grânulos apresentarem atividades desnitrificantes
mesmo sob condições aeróbias pode ser explicado devido ao fato de, durante os
minutos iniciais do ciclo, uma grande quantidade de material orgânico biodegra-
dável ser alimentada ao sistema. Desse modo, durante esse período, o t ranspo rte
por difusão dessa fração de n1atéria orgânica para o interior dos grânulos foi maior
em comparação com o transporte de oxigênio. Além disso, o oxigênio dissolvido
presente durante o período de enchimento do RBS 2 , em concentração equivalente
a 3 mg/L, foi provavelmente consumido pela camada externa dos grânulos. Dessa
forma, as camadas internas, mantidas e1n condições anóxicas, receberam fonte
de carbono e nitrato suficiente para permitir a realização do processo de desni-
trificação (ARROJO et alii, 2004). Tais constatações também foram descritas no
t rabalho de Beun et alii (200 1), mencionado anteriorn1ente nesse mesmo item.
Um importante parâmetro levado em consideração nesse estudo foi justamen-
te a concentração de SST na água residuária industrial alimentada aos reatores
(RBS 1 e RBS 2), a qual variou de 200 a 900 mg/L, contendo alta fração de SSV
(na faixa de 75-97%). A concentração de sólidos suspensos no afluente foi parcial-
mente removida em an1bos os RBS. A concentração de SST no efluente foi menor
que no afluente quando os reatores foram alimentados com a água residuária in-
dustrial, apresentando valores dentro da faixa compreendida entre 50 e 800 mg/L
(ARROJO et alii, 2004).
Verificou-se que a presença de sólidos suspensos totais (SST) no efluente dos
RBSs (cuja origem está relacionada à presença de SST no afluente, ao despen-
dimento de pequenos pedaços dos grânulos e ao crescimento de pequenos flocos
que foram arrastados do reator) foi fo rtemente influenciada tanto pela du ração do
período de esvazian1ento quanto pela relação entre DQO particulada e bion1assa
(DQOp/SSV) dos sistemas. A concentração de SST no efluente aumentou quando
a relação DQOp/SSV foi n1aior que O, 12 gDQO/gSSV. No intuito de din1inuir o
conteúdo de sólidos no efluente, utilizou-se uma estratégia na qual a duração do
período de esvaziamento foi diminuída. Ocorreu uma redução significativa na
concentração de SST no efluente de 450 para 200 mgSST/L e posteriormente
para 150 mgSST/L quando o período de esvaziamento diminuiu gradativamente
de 3 para 1 mine posteriormente para 0,5 n1in, respectivamente. Esse fato esteve
relacionado ao maior arraste (washout) de pequenos agregados de biomassa sus-

pensa que ocorreram quando a duração dessa fase foi diminuída, reduzindo dessa
n1aneira a proliferação de pequenos flocos nos reatores. Dessa forma, a estratégia
utilizada pelos autores mostrou ter um efeito positivo na qualidade do efluente no
que se refere à concentração de sólidos (ARROJO et alii, 2004).
A partir do 2 96º dia de operação, ambos os reatores começaram a se r ali-
mentados com a mes1na água residuária sintética desprovida de sólidos, a qual
foi utilizada durante o período de partida do RBS 1 • A concentração de SST no
efluente foi em torno de 200 mgSST/L, valor esse menor do que o medido quando
os reatores foram alimentados com água residuária industrial e quando a d uração
do tempo de esvaziamento foi de 3 n1in, isto é, 450 mgSST/L. Essas observações
permitem inferir que os sólidos presentes no efluente não dependem unicamente
do arraste de biomassa do reator, mas também do conteúdo de sólidos advindo do
afluente do processo (ARROJ O et alii, 2004) .
Os resultados obtidos por esses autores certamente devem ser levados em con-
sideração quando da aplicação da tecnologia de lodo granular. O washout de biomas-
sa, que porventura é capaz de ocorrer, pode ser consequente da alta concentração de
sólidos do afluente do processo. Arrojo et alii (2004) ainda apontam que a presença
de sólidos suspensos totais (SST) no efluente pode se r um dos principais entraves
no desenvolvimento de RBS com grânulos de escala industrial. A eficiência de re-
moção de SST é um aspecto crucial que deve ser levado em consideração quando da
aplicação da tecnologia de lodo granular, uma vez que muitas vezes os poluentes se
encontram na forma de coloides ou partículas. Schwarzenbeck et alii (2004), uti-
lizando grânulos aeróbios para o tratamento de água residuária contendo malte e
com alto conteúdo de matéria orgânica particulada (0, 9 gSST/L), observaram que
partículas com diâmetros médios menores que 25-50 µm foram removidas com efi-
ciência de 80%. J á a eficiência de ren1oção das partículas maiores que 50 µm foi de
apenas 40%. Os autores verificaram que a capacidade do lodo granular em remover
material orgânico particulado foi devido à incorporação pela matriz do biofilme e
à atividade metabólica da população de protozoários que cobriam a superfície dos
grânulos. Entretanto, Inizan et alii (2005) observaram que grânulos aeróbios não
foran1 capazes de remover os sólidos em suspensão presentes em água residuária
proveniente de indústria farmacêutica.
Diante desse contexto, muitas vezes as vantagens dos RBS contendo lodo
granular, tais como alta capacidade de conversão e boas propriedades de sedi-
mentabilidade dos grânulos, podem ser neutral izadas pela presença de sólidos em
suspensão no efluente. Esse fato pode consistir en1 um paradoxo uma vez que os
RBS contendo lodo granular são usualmente descritos na literatura como siste-
mas que podem melhorar o desempenho de biorreatores no que diz respeito à re-
tenção de sólidos. En1 algumas situações, pode-se pensar na adição de u1n processo
de pós-tratamento (unidades de filt ração po r membranas, filtros de superfície,
decantadores secundários, entre outros) para remover o conteúdo de SST no in-

tuito de se adequar à legislação ambiental, embora tal procedimento diminuísse a
atratividade econômica da tecnologia de granulação aeróbia.
Cassidy e Belia (2005) operaram um reator de lodo granular alimentado
com água residuária de matadouro, a qual continha DQO total equivalente a
7 685 n1g/L, DQO solúvel de 5 163 mg/L, nitrogênio Kjeldahl total de 1 05 7 mg/L
e sólidos suspensos voláteis (SSV) de 1 520 mg/L. Os autores obtiveram eficiên-
cia de remoção de DQO e fósforo de 98%, enquanto os percentuais de remoção
de nitrogênio e de sólidos suspensos voláteis (SSV) foram de 97%. Para atingir
esses percentuais de remoção apreciáveis, Cassidy e Belia (2005) submeteram o
reator a saturação de oxigênio de 40%, condição considerada ideal para a remoção
de nitrogênio, segundo Beun et alii (2001 ). Além disso, para conseguir manter a
estabilidade dos grânulos quando houvesse limitação de concentração de oxigênio
dissolvido, os autores seguiram a recomendação de De Kreuk et alii (2005b) e
lançaram mão de um período de alimentação anaeróbio . Tsuneda et alii (2006)
observaram uma taxa de remoção de nitrogênio de 1,0 kgN/(m3 • d) e eficiência de
remoção de N de 95% em um sistema contendo grânulos autotróficos, aplicados
no tratamento de água residuária proveniente de refinaria de metais contando
1 ,0-1 ,5 gN-NH; /L e até 2 2 glL de sulfato de sódio.
Recentemente, Bassin et alii (2011) observaram uma propriedade importan-
te do lodo granular aeróbio, a qual se refere à elevada capacidade de adsorção de
amônio. Essa, por sinal, é muito maior do que aquela apresentada por lodo ativa-
do e grânulos anammox. Por meio da realização de testes de adsorção em batelada,
esses autores observaram uma adsorção de 1, 7 mgN-NH;/gSSV quando a concen-
t ração de amônio no equilíbrio era de 30 mgN-NH;/L. Bassin et alii (2011) ainda
ressaltam que o fenômeno de adsorção de amônio deve ser incorporado a modelos
de nitrificação/desnitrificação, especialmente quando lodo granular aeróbio esti-
ver envolvido.
A tecnologia de granulação aeróbia já foi aplicada em escala que vai além do
laboratório. A figura 4.11 a apresenta uma planta p il oto de lodo granular (Ede,
Holanda). Um sistema de escala industrial está mostrado na figura 4.11 b (Epe,
Holanda) . Um projeto de pesquisa, em escala piloto, foi iniciado na Holanda
no intuito de demonstrar a aplicabilidade da tecnologia de grânulos aeróbios no
tratamento de água residuária municipal . A capacidade hidráulica da planta é
representada por 5 m 3/h, sendo a instalação principal compreendendo dois rea-
tores biológicos paralelos - Granular Sludge Sequencing B atch R eactors (GSBR 1
e GSBR2), os quais apresentam diâmetro e altura de 6 me 0,6 m, respectiva-
mente. O pré-tratamento da planta-piloto consiste em um tanque de decanta-
ção primário, opcionalmente seguido por um filtro de areia p ressurizado (DE
BRUIN et alii, 2005).
(a) (b)
FIGURA 4.11 Sistemas de lodo granular de escala piloto (a) e industrial (b). Cortesia: DHV©,
Holanda.
O afluente apresenta, em média, DQO de 560 mg/L, sólidos suspensos de

225 mg/L, nitrogênio Kjeldahl de 58,4 mg/L e fósforo total de 10 mg/L. O GSBR 1
sempre foi operado con10 coluna de bolhas, enquanto o GSBR2 foi inicialmente
operado como um reator airlift, sendo transformado posteriormente também em
um reator coluna de bolhas. O tempo do ciclo dos reatores varia de 2 ,5 a 4 horas.
O período de alimentação, em condições anaeróbias, é de 50-60 1nin e o período
de sedimentação corresponde a 20-30 min. O restante do ciclo refere-se à fase de
aeração (DE BRUIN et alii, 2005) .
A planta-piloto foi inoculada com lodo ativado proveniente de u1na planta
de trata1nento convencional. Inicial1nente, o processo de granulação teve um p ro-
gresso apreciável, o que resultou em grânulos com boas propriedades de sedimen-
tação. Ent retanto, a granulação não prosseguiu devido às baixas temperaturas de
operação (em torno de 5ºC) e ao inadequado controle da aeração, o que levou à
obtenção de elevadas concentrações de nitrato no efluente e às baixas eficiências
de remoção de fosfato . Deste modo, o controle da aeração foi implementado, bem
como as paredes dos reato res foram isoladas e o fluxo afluente pré-aquecido na
tentativa de controlar a temperatura do processo (DE BRUI N et alii, 2005) .
Con1 o start-up da unidade contando co1n as novas modificações, o objetivo
era se obter altas eficiências de remoção de fosfato e de nitrificação. A remoção de
Po!- era em média de 65% e a nitrificação não era completa. Uma vez que as con-
centrações de amônio no efluente eram altas e as características de sedimentação
do lodo estavam se deteriorando, a carga orgânica, em termos de DQO, foi di-

minuída em 50%. Tal mudança resultou na obtenção de nitrificação completa e
n1aiores concentrações de nitrato no efluente. Ao mes1no tempo a remoção bioló-
gica de fosfato diminuiu drasticamente e o processo de granulação não melhorou
(DE BRUIN et alii, 2005) .
Os resultados obtidos fizeram com que novamente algumas condições de ope-
ração fosse1n n1odificadas. Ficou comprovado que, du rante o período de partida
dos reatores, não foi possível manter completa remoção de fosfato e nitrificação
ao mesmo tempo. Tendo em vista que a seleção de organismos com baixa veloci-
dade de crescimento (organismos acumuladores de fosfato - PAO, nesse caso) era
considerada como un1 requisito para a granulação, a carga de DQO fo i novamente
aumentada, sendo verificado o começo da granulação aeróbia. Em aproximada-
mente três meses, em torno de 30% do lodo do GSBR 1 consistiam em grânulos.
Entretanto, devido à falha operacional, 7 5% do lodo fo i perdido em ambos os
reatores (DE BRUIN et alii, 2005).
Os reatores foram novamente inoculados com o mesmo lodo ativado ante-
riormente utilizado, sendo dessa vez observada uma granulação rápida. O salto
no processo de granulação foi ocasionado pela mudança do 1nétodo de coleta de
amostra. Com o método prévio de coleta da mesma, grande parte dos grânulos
era esmagada/rompida. Em um mês após o start-up, a granulação no GSBR 1 foi
completa, Tendo o IVL30 apresentado o valor de 55 mL/g. A granul ação no GSBR 2
procedeu-se de forma mais lenta, representando 50% depois de um mês após a
partida do reator. Nessas circunstâncias, o IVL30 do lodo desse reator foi en1 torno
'
de 70 mUg. A medida que o processo de granulação avançava, o arraste de lodo
diminuiu, o que, por conseguinte, resultou no acúmulo de biomassa nos reatores
(DE BRUIN et alii, 2005).
Tay et alii (2005) estudaram o desenvolvimento de grânulos aeróbios em
um reator em batelada sequencial de escala piloto, inoculado com lodo granular
pré-cultivado em um pequeno reato r em for1nato de coluna. Os auto res observa-
ram que os grânulos inoculados se desintegraran1 nos primeiros dias de operação,
embora tenham formado novos grânulos posteriormente. Em contrapartida, os
grânulos que foram mantidos no reator de escala laboratorial não apresentaram
desintegração. Os resultados obtidos fora1n relacionados com as diferentes con-
dições h idrodinâmicas encontradas nos reatores en1 escala-piloto e em escala de
laboratório. Fatores como diâmetro do reator e efeito de parede, bem como ta-
manho e localização dos difusores de a r, poderiam ter influenciado as condições
hidrodinâmicas nos reatores, as quais, por sua vez, determinaram as propriedades
dos grânulos (TAY et alii, 2005).
Em ge ral, os resultados obtidos evidenciaram a possibilidade de aplicação
dos grânulos em escalas maiores, u1na vez que foi demonstrado ser possível for-
mar grânulos com água residuária n1unicipal, os quais propiciaram apreciáveis
remoções de nutrientes (DE BRUIN et alii, 2005) . Além disso, a pesquisa em

escala piloto evidencia como a dificuldade de se obter boa granulação aumenta
quando se passa de escala laboratorial para escalas 1naiores. Fica claro que 1naio-
res cuidados e maior controle das condições operacionais são imprescindíveis para
que o processo de formação de grânulos aeróbios seja realizado de maneira satisfa-
tó ria, o que ce rtamente pode rep resentar boas eficiências de remoção de poluentes.
Un1 estudo de aplicabilidade mostrou que a tecnologia de lodo granular é
bastante promissora do ponto de vista econôn1ico (DE BRUIN et alii, 2004).
Baseando-se em custos totais anuais, reatores de lodo granular operados em ba-
teladas sequenciais (GSBR) com p ré-tratamento e pós-tratamento provaram ser
mais atrativos que o processo de lodo ativado convencional, sendo a economia
situando-se dentro da faixa de 6-16%. Uma análise de sensibilidade mostrou que
os GSBR são menos sensíveis ao preço do terreno e mais sensíveis ao fluxo de
água advindo da chuva. Devido à possibilidade de serem aplicadas altas cargas
volumétricas, a área ocupada pelos sistemas GSBR representa apenas 25% da área
utilizada pelos sistemas convencionais. Entretanto, os sistemas de lodo granular
contendo apenas tratamento primário podem não conseguir atingir os padrões
de descarte de efluente estabelecidos, o que se deve principalmente à presença
de sólidos no efluente ocasionada pelo arraste de biomassa cujas propriedades de
sedimentação não são satisfatórias. Com a imposição de padrões de lançamento
de efluentes mais rigorosos, as plantas de lodo ativado deverão incorporar uma
etapa de pós-tratamento, tal como filtração com areia, ou serem transformadas
em biorreatores com membranas. Nesse caso, sistemas GSBR com tratamento
primário e pós-tratamento pode consisti r em alternativas atrativas (DE BRUIN
et alii, 2004).
4.8 CONSIDERAÇÕES FINAIS EPERSPECTIVAS FUTURAS

A tecnologia de granulação aeróbia, quando comparada com os processos con-
vencionais que fazem uso de biomassa dispersa, apresenta inúmeras vantagens sob
o ponto de vista técnico-operacional. As características de sedimentação do lodo
granular são muito melhores que as apresentadas pelo lodo ativado convencional,
o que repercute em menor tempo necessário para a decantação das partículas,
menores valores de IVL e n1aior concentração de biomassa no reator. Essa última
característica certamente favorece a estabilidade do siste1na biológico, tornando-o
menos vulnerável a choques de carga orgânica ou de compostos tóxicos, bem como
propicia o aumento da capacidade de tratamento da unidade .
O cult ivo de lodo granular é majoritariamente realizado em reatores ope ra-
dos em bateladas sequenciais (RBS). O modo de operação desses reatores, quando
combinado com o uso de biomassa na forma de grânulos, torna-se facilitado, pois
permite que as fases de enchimento e descarga do efluente tratado sejam reali-

zadas de forma simultânea, sobretudo quando é adotado o regime plug-flow, em
fluxo ascendente através do leito de lodo . Tendo em vista que a sedimentação dos
grânulos é rápida, um período de tempo maior pode ser destinado à fase de reação,
isto é, ao tratamento biológico propriamente dito . Outra característica positiva do
uso da tecnologia de grânulos aeróbios em RBS se refere justamente à redução da
área necessária para a iinplantação do sistema de tratamento biológico, uma vez
que, na maioria das vezes, a presença de um decantador secundário é dispensá-
vel. A maior retenção de biomassa no sistema, por permitir o aumento das taxas
volumétricas de conversão, também contribui para a diminuição do volume dos
reatores de lodo granular, reduzindo ainda mais o requerimento de espaço.
Por meio do uso de grânulos aeróbios, a remoção de compostos orgânicos e
nutrientes (nitrogênio e fósforo) pode ser realizada de forma simultânea. A pre-
sença de dife rentes regiões no interior dos grânulos, tanto aeróbias, quanto anóxi-
cas/anaeróbias, permite que en1 sua estrutura coexista1n populações heterotróficas
e autotróficas nitrificantes, o que repercute em elevada diversidade microbiana. A
estratificação da estrutura dos grânulos faz com que micro-organismos heterotró-
ficos aeróbios e autotróficos estejam presentes na camada externa, a qual é seguida
por uma camada cujo nível de oxigênio é reduzido, na qual se situam bactérias
anaeróbias facultativas. Finalmente, na região central dos grânulos predominam
micro-organismos anaeróbios ob rigatórios devido à ausência de oxigênio . Na ver-
dade, a distribuição das regiões aeróbias e anaeróbias é influenciada decisivamente
pelo diâmetro dos grânulos. No entanto, como controlar esse parâmetro ainda
permanece uma incógnita.
Entre os micro-organismos heterotróficos, além dos responsáveis pela de-
gradação do material orgânico, podem estar presentes organisn1os acumuladores
de fosfato (PAO), os quais são protagonistas da remoção de fósforo . Tais micro-
-organismos ainda apresentam função impo rtante no processo de desnitrificação
(nesse caso são denominados DPAO) que ocorre na região central dos grânulos,
mantida em condições anóxicas. Para tanto, utilizam compostos armazenados
intracelularmente (poliidroxibutiratos - PHB) como fonte de carbono. Algumas
condições de operação dos RBS devem ser asseguradas para a seleção de PAO,
tais como a aplicação de um período de alimentação em condições anaeróbias.
Tal procedimento ainda induz à formação de grânulos estáveis (fundamental para
que não ocorra o arraste dos mesmos do reator) mesmo em baixas concentrações
de oxigênio dissolvido, uma vez que favorece o desenvolvimento de bactérias cuja
velocidade de crescin1ento é reduzida, sem contar que reduz os custos de investi-
mento e de operação e facilita a operação em escalas maiores.
Estudos lançando mão de sistemas de lodo granula r para o tratamento de
águas residuárias industriais indicarain que essa tecnologia é adequada para a
obtenção de apreciáveis eficiências de remoção de matéria orgânica e nu trientes
(N e P) desses efluentes. Entretanto, algumas vezes é recomendado o uso de pré

ou pós-t ratamento para adequação da água residuária aos limites de descarte im-
postos pelos órgãos an1bientais competentes, sobretudo quando se leva em consi-
deração a possibilidade de ocorrer elevadas concentrações de sólidos em suspensão
no efluente.
O principal ônus do processo de granulação aeróbia se refere ao período de
partida do reator, especialmente no que tange à formação dos grânulos. Quando
se utiliza como inóculo alguns grânulos provenientes de outros sistemas e1n ope-
ração, o tempo necessário para que ocorra a granulação aeróbia pode ser minimi-
zado. Outro entrave da tecnologia de granulação aeróbia se refere à incerteza em
critérios como estabilidade e robustez dos grânulos, características que muitas ve-
zes podem ser afetadas devido à operação e1n determinadas condições específicas.
Embora muitas pesquisas a respeito da tecnologia de grânulos aeróbios já
tenham sido realizadas, ainda existem assuntos que não foram completamente ex-
plorados nessa área de estudo. A melhor compreensão dos mecanismos envolvidos
na formação dos grânulos é um ponto a ser considerado. Atenção redob rada deve
ser dada aos gradientes de concentração de oxigênio existente no lodo granular,
os quais são determinados pela distribuição e pelo desempenho de diferentes po-
pulações de micro-organismos no interior dos grânulos e influenciam de fo rma
direta os processos de conversão que ocorre1n nos grânulos. Devido aos perfis de
concentração de 0 2 obtidos serem resultado de diferentes fatores que influenciam
uns aos outros, t ais como coeficientes de difusão , taxas de conversão, tamanho dos
grânulos, distribuição de tamanho de poros, penneabilidade e densidade, estudos
procurando investigar o efeito de cada fator, de forma individual, se tornam difí-
ceis de serem determinados experimentalmente. Nesse sentido, o desenvolvimen-
to de novos modelos matemáticos certamente consistirá em ferramenta valiosa
para fo rnecer o discernimento necessário a respeito dos fatores importantes que
afetam as taxas de remoção de nutrientes e a distribuição das populações 1nicro-
bianas responsáveis pelos processos de biodegradação, sem contar que os modelos
também são úteis para a otimização do processo e para o aumento de escala, pro-
jeto e controle de reatores em escala piloto/industrial .
Por falar nisso, pode-se ainda mencionar a necessidade de estudos adicionais
em escala piloto/industrial. O aumento de escala de sistemas de lodo granular
leva à modificação das condições hidrodinâmicas, as quais apresentam importan-
te função na formação e estabilidade de grânulos aeróbios. Dessa forma, novos
estudos são requeridos nesse tópico, em particular. Outro assunto promissor a ser
investigado se refere à pesquisa detalhada a nível microbiológico a fim de se eluci-
dar as relações entre deter1ninados 1nicro-organismos e a estabilidade do lodo gra-
nular. Questões relativas à influência da estrutura dos grânulos nos p rocessos de
conversão e ao transporte de massa que está envolvido nesses processos devem ser
estudadas de forma mais profunda. Por fim, outras pesquisas visando à aplicação
de grânulos aeróbios no tratamento tanto de águas residuárias municipais quanto

industriais devem ser colocadas em prática no intuito de expandir a aplicabilidade
da tecnologia. Desse modo, a mesma poderá ser explorada de maneira ainda mais
intensa no futuro próximo.
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Capítulo '5
Novos Processos de Remoção

Biológica de Nitrogênio
5.1 INTRODUÇÃO
abordagem dada ao tratamento biológico de resíduos líquidos tem

sofrido inúmeras alterações ao longo do tempo. Particularmente
nas décadas de 1960 e 1970, a grande preocupação estava vol-
tada para a remoção do n1aterial orgânico de águas residuárias,
obviamente levando-se en1 consideração a sua aguçada capacidade poluidora do
meio ambiente. Diante desse panorama, foram desenvolvidos inúmeros sistemas,
tanto aeróbios quanto anaeróbios, voltados à degradação de matrizes orgânicas.
A partir da década de 1980 verificou-se que mesn10 na ausência de quantida-
des apreciáveis de material orgânico nas águas residuárias, o efeito poluidor sobre
o meio ambiente ainda se pronunciava de fonna intensa, notadamente na forma
de substâncias nitrogenadas. O aumento da população mundial e o consequente
aumento da quantidade de dejetos humanos, bem como o uso de fertilizantes sin-
téticos nitrogenados produzidos a partir de N 2 atmosférico pelo processo Haber-
Bosch, intensificado nos últimos 40 anos, são dois fatores que contribuíram de
forma significativa para o aumento da poluição por compostos nitrogenados.
São diversos os fatores que agregam importância à remoção de nitrogênio.
O principal deles se refere ao processo de eutrofização, o qual é primordialmente
causado pelo acréscimo na disponibilidade desses nutrientes em corpos d'água,
levando à elevação da produção primária, exemplificada pelo crescimento exces-
sivo de espécies fitoplanctônicas (algal bloom) . Em tais condições, a população
microbiana responsável pela degradação da matéria orgânica das plantas e algas
aumenta exponencialmente e, por conseguinte, a demanda de oxigênio necessária
para essa degradação sofre un1 substancial incremento. Mortandade de peixes e
de outros organismos aquáticos por asfixia, aumento no custo de tratamento das

águas eutrofizadas ou ainda a inadequação destas águas para diversos usos são
algumas das consequências da eutrofização.
Nesse contexto, ficou claro que a aplicação de processos destinados à remo-
ção de nitrogênio e fósforo era algo indispensável para preservar a qualidade dos
corpos hídricos receptores. Sendo assim, os processos convencionais de remoção
biológica de n it rogênio (envolvendo as etapas de nitrificação e desnitrificação)
passaram a ser utilizados extensivamente.
Na década seguint e (década de 1990), o aumento dos custos de implantação
das tecnologias de t ratamento de águas residuárias t radicionais, a imposição de
limites mais rigorosos para o descarte de efluentes (fazendo com que as plantas de
tratamento necessitassem de significativas modificações para adequação às nor-
mas ambientais), a limitação dos processos convencionais no que tange ao trata-
n1ento de efluentes com alta concentração de nit rogênio e o su rgimento de ideias
inovadoras iinpulsionaram ainda n1ais o desenvolvimento de novas tecnologias
para a remoção biológica de nitrogênio.
N esse período, novas bactérias relacionadas aos processos de remoção de com-
postos nitrogenados foran1 identificadas e isoladas a partir de diversos ambientes
(naturais ou concebidos pela engenharia), o que culminou no surgimento de novos
processos de remoção de nitrogênio. Na realidade, esses novos processos possuem
aplicação ainda bastante incipiente quando comparados aos processos convencio-
nais, sobretudo em escalas de operação maiores. Entretanto, conforme será dis-
cutido no ite1n 2, a maioria deles apresenta enorme potencial de utilização, uma
vez que surgem justan1ente para tentar superar as limitações que o processo de
nitrificação/desnitrificação convencional apresenta em determinadas condições.
Quando comparados com p rocessos de natureza físico-química, tais como
stripping de amônio e precipitação co1n fosfato de magnésio (processo MAP), os
novos processos biológicos destinados à remoção de nitrogênio são muito mais
vantajosos economicamente. Os processos físico-químicos requerem quantidades
significativas de produtos químicos, o que, por conseguinte, leva à produção de
maior quantidade de lodo químico. Apesar do a rgu1nento de que os processos
físico-químicos podem pe rmitir a recuperação de amônio, somente uma quantida-
de pequena de amônio é recuperada em comparação com o seu uso geral, tal como
fertilizante . Além disso, essas técnicas, em geral , requerem maior energia do que
a requerida pelos processos biológicos de nitrificação/desnitrificação. Em virtude
de todos esses fatores, o tratamento biológico de nitrogênio é a opção mais reco-
mendada e mais utilizada (VAN LOOSDRECHT, 2008).
A seguir, serão apresentados os novos processos de remoção de nitrogênio,
tópico p rincipal desse capítulo, que prima por apresentar os novos aspectos das
t ransformações microbianas de nitrogênio no contexto do tratamento de águas
residuárias. Para melhor entendimento do assunto, o leitor é convidado a ler
CAPÍTULO 5 ◊ NOVOS PROCESSOS DE REMOÇÃO BIOLÓGICA DE NITROGÊNIO 173
o capítulo 3 do livro Processos e Técnicas para o Controle Ambiental de Efluentes

Líquidos, intitulado "Tratamento primário, secundário e terciário de efluentes".
Informações detalhadas a respeito dos processos tradicionais de nitrificação/des-
nitrificação podem ser encontradas no capítulo mencionado e em outras fontes.
5.2 NOVOS PROCESSOS DE REMOÇÃO BIOLÓGICA DE NITROGÊNIO
5.2.1 INTRODUÇÃO
Existem complexas inter-relações entre diferentes espécies nitrogenadas

(tais como amônio, nitrito, n itrato e outras) e diferentes mecanismos de trans-
formação. Nitrogênio orgânico é representado por diversos compostos incluindo
a1ninoácidos, ureia, ácido úrico e bases nitrogenadas. Por meio de hidrólise e mi-
neralização, nitrogênio orgânico é convertido a nitrogênio amoniacal. Amônio é
um dos mais importantes compostos nitrogenados em águas de superfície e outros
ecossistemas por diversas razões: 1) consiste no nutriente preferido por diversas
espécies de plantas e bactérias autotróficas; 2) é quiinicamente reduzido e pode,
dessa n1aneira, ser facilmente oxidado em ambientes aquáticos naturais, resul-
tando no consun10 de oxigênio dissolvido; 3) amônia não ionizada é tóxica para
diversas formas de vida aquática mesmo em baixas concentrações (> 0,2 mg/L)
(KADLEC e KNIGHT, 1996) .
Sob condições aeróbias, amônio é oxidado a nitrato, tendo nitrito como pro-
duto intermediário. Esse processo é denominado de nitrificação . Dois grupos
principais de bactérias participam da nitrificação: bactérias oxidado ras de amônio
e bactérias oxidadoras de nitrito. A nitrificação (equação 5 .1 ) é a primeira etapa
do processo convencional de remoção de nitrogênio. A etapa complementar é a
desnitrificação, na qual ocorre a redução de nitrato a nitrogênio gasoso (equação
5 .2) . A equação 5.3 representa o processo combinado envolvendo as duas etapas
anterio res. O processo de nitrificação/desnitrificação convencional é o 1nais uti-
lizado para remoção de nitrogênio nas modernas plantas de tratamento de águas
residuárias. É bastante eficiente e, caso operado de forma adequada, é bastante
estável e confiável. O custo de operação é moderado e o controle do processo é
relativamente fácil (METCALF e EDDY, 2003) .
(5 .1)
(5 .2)
(5 .3)
Apesar de sua extensiva aplicação, o processo convencional de remoção de ni-

t rogênio ocorre muito lentamente, característica essa associada à baixa atividade
n1icrobiana e ao reduzido rendin1ento desse processo. É utilizado para o tratamen-
to de águas residuárias contendo baixas concentrações de nitrogênio amoniacal,
geralmente menores que 100 mgN/L. Em se tratando de efluentes com altas
concentrações, tais como efluentes de digestores anae róbios, dejetos suínos, lixi-
viados e determinados efluentes industriais, o tratamento convencional se torna
limitado, sobretudo no que se refere a questões de dimensionamento e de opera-
ção. A limitação de espaço e a restrição econômica são alguns dos problemas que
não permitem que a maioria das plantas de tratan1ento existentes apresentem
o desempenho almejado, sobretudo quando a carga nitrogenada a ser tratada é
elevada. A tabela 5.1 apresenta exemplos de águas residuárias contendo altas con-
centrações de nitrogênio amoniacal .
A água oriunda do desaguamento do lodo digerido é nor1nalmente reto rnada
ao início do tratamento junto ao afluente da estação de tratamento. Ao realizar o
balanço de massa para o nitrogênio na planta de tratamento de águas residuárias
de Dokhaven (Rotterdam, Holanda), verificou-se que a água de rejeito contribuía
muito pouco para a vazão total, embora correspondesse a 15% da carga nitroge-
nada (VAN DONGEN et alii, 2001a; MULDER et alii, 2001). Um tratamento
separado (side-stream) dessa corrente rica em nitrogênio amoniacal, conforme in-
dicado na figura 5 .1 , poderia reduzir a carga nitrogenada oriunda dos digestores
de lodo e poderia contribuir significativan1ente para a redução da concentração de
nitrogênio no efluente da planta de tratamento e permitiria atingir os limites de
descarte.
Desse modo, a apl icação de processos side-stream é especialmente importante
quando a planta de tratamento necessita de um upgrade devido aos padrões mais
rigorosos de descarte de efluentes ou devido ao aumento da carga n itrogenada.
Como a adição de um volume de reator relativamente pequeno, a concentração de
nitrogênio do efluente pode ser diminuída. Uma vantagem adicional é a possibili-
dade de se construir um reator independente do processo principal de tratamen-
to, o que é obviamente muito mais simples do que modificar e expandir plantas
de tratamento já existentes. Além disso, caso o amônia não seja totalmente con-
vertido no processo de tratamento principal, cada kg de a1nônio removido no
processo side-stream resultará em 1 kg a menos de amônia no efluente da planta
de tratamento.
TABELA 5.1 Águas residuárias contendo altas concentrações de nitrogênio amoniacal.
Água DQO' BQD5b Nitrogênio total

Referência
residuária (mg/L) (mg/L) (mg/L)
'
Agua de 232-12 587 81-750 260-958 G il e Choi (2004)
rejeiçãoc n.m. 943-1 513 Jenicek et alii (2004)
390-2 720
610 140 910 Wyffels et alií (2003)
Fração fina de n.m. 2 912 707 Chen et alíí (2004)

dejetos suínos 3 969 1 730 1 700 Obaja et alíí (2003)
9 000-13 000 n.m. 3 100-4 300 Poo et alíí (2004)
6 456 n.m. 695 Tilche et alíí (1999)
Lixiviado 2 000-5 000 1500-4000 500-1 000 Chung et alii (2003)

n.m. 45 310 llies e Mavinic (2001)
1 300-1 600 n.m. 160-270 Jokela et alíí (2002)
9 660-20 560 n.m. 780-1 080 Kalyuzhnyi e
Gladchenko (2004)
Curtume 300-1 400 n.m. 50-200 Abeliovich (1992)

1 940-2 700 n.m. 123-185 Murat et alíí (2003)
Abatedouro 1 400-2 400 n.m. 170-200 Keller et alíí (1997)d
Produção de 3 000 990 1 060 Kalyuzhnyi e

amido G ladchenko (2004) 0
5 000-10 000 2 000-5 000 800-1 100 Abeling e Seyfried
(1993) 0
Produção de 15 000-22 000 n.m. 1 280-2 990 Austermann-Haun et alíí

pectina (1999)
8100 n.m. 1 600 Deng Petersen et alíí
(2003)
n.m: não mencionado.

ª Demanda química de oxigênio.
b Demanda bioquímica de oxigênio em cinco dias.
e Água proveniente do desaguamento dos lodos digeridos em estações de tratamento de esgotos.
d Após tratamento em lagoa anaeróbia.
e Após tratamento em digestor anaeróbio.
Efluente
Planta principal de tratamento
Afluente
Retorno de lodo
Excesso de lodo
Tratamento separado da
corrente rica em n'itrogênio Digestor de lodo
(processo side-sfream)
FIGURA 5.1 Representação esquemática da aplicação de um tratamento separado (processo

side-stream) da corrente rica em nitrogênio amoniacal oriunda do digestor de lodo.
Lixiviados são altamente poluidores e devem ser capturados e tratados.

Geralmente o lixiviado é retornado à camada superior do aterro, o que p ropicia a
diminuição da concentração de matéria orgânica, en1bora acarrete o aumento da
concentração de nitrogênio, uma vez que o aterro funciona como um biorreator
anaeróbio (CLABAUGH, 2001 ). De forma similar à água de rejeito oriunda do
desaguamento de lodo, alguns lixiviados de ate rros sanitários são caracterizados
por alta concentração de amônio e baixo teor de orgânicos (ILIES et alii, 2001).
No que se refere aos dejetos suínos, esses podem se r separados em duas fra-
ções: grossa e fina. A fração grossa pode ser utilizada como adubo para solos en-
quanto a fração fina é tratada. A composição da fração fina pode variar e depende
do método de separação e da composição da alimentação dos animais. Muitas
vezes altas concentrações de matéria orgânica, nitrogênio e fósforo podem estar
presentes, o que obviamente não é favo rável para os processos de remoção auto-
trófica de nitrogênio.
Em relação aos processos industriais, esses podem gerar efluentes com altas
concentrações de nitrogênio, especialmente quando tratados primeiramente em
digesto res anaeróbios. Como exen1plo pode-se mencionar os efluentes de indús-
trias farmacêuticas (CARRERA et alii, 2003), de curtun1es (MURAT et alii,
2003), de abatedouros (KELLER et alii, 1997), de processamento de bat ata,
álcool e amido (ABELING e SEYFRIED, 1993) e de produção de formaldeído
(CAMPOS et alii, 2003).
Nos últimos anos, o paradigma de que o único modo para converter biolo-
gicamente amônio para nitrogênio gasoso era a completa oxidação de amônio a
nitrato (nitrificação) seguida da redução de nitrato a nitrogênio gasoso (desnitri-
ficação), tornou-se obsoleto. Com o descobrimento de novas rotas metabólicas,
novos processos de remoção de nitrogênio mais sustentáveis foram desenvolvidos
e vêm sendo aprimorados continuamente à medida que as pesquisas nesse as-
sunto avançam. Con10 exemplo dos novos processos envolvidos na re1noção de
nitrogênio pode-se mencionar: nitrificação parcial, nitritação parcial (SHARON -
Single Reactor HighActivity Ammonia Removal Over Nitrite), Anammox (Anaerobic
ammonium oxidation), desamonificação aeróbia/anóxica, OLAND (Oxygen Limited
Autotrophic Nitrification and Denitrification), CANON (Completely Autotrophic
Nitrogen Removal Over Nitrite) e sistemas wetlands (banhados artificiais).
De forma geral, a aplicação específica das alternativas disponíveis para a
remoção de nitrogênio precisa ser avaliada em relação a aspectos envolvendo cus-
tos, requerimentos químicos e energéticos, experiência de operação, confiabilidade
do processo e impacto ambiental. Entretanto, a seleção da melhor alternativa é
usualmente baseada em critérios de custo. Os novos processos vão ao encontro dos
objetivos de redução de custo operacional. A grande maioria dos novos processos
busca realizar a remoção de nitrogênio via nitrito (aceptor de elétrons) e não via
nitrato como ocorre no processo convencional .
O processo de nitritação-desnitritação via nitrito (equações 5 .4 e 5 .5) é um
exemplo de processo alternativo para remoção de nitrogênio. Apresenta menor
consumo de oxigênio na nitrificação (nitrificação parcial até nitrito) e menor re-
querimento de carbono orgânico para a desnitrificação (nitrito e não nitrato deve
ser reduzido a nitrogênio gasoso) (SCHMIDT et alii, 2003) . Outra vantagem é a
menor produção de lodo. A aplicação do processo con1binado de nitritação parcial/
Anammox (detalhado posteriormente no texto) traz ainda mais vantagens, como
mostra a tabela 5 .2 . Nesse último processo não há necessidade de matéria orgâ-
nica, uma vez que a remoção de nitrogênio é realizada por bactérias autotróficas.
Esse processo é especialmente indicado para o tratamento de águas residuárias
cuja razão C/N é baixa (RUIZ et alii, 2003) e que contêm altas concentrações de
amônio (entre 100 e 5 000 n1gN/L) (MULDER, 2003) . Nessa faixa, o processo
de remoção autotrófica de nitrogênio é mais vantajoso em relação ao processo con-
vencional de nitrificação e desnitrificação, requerendo menos energia e produtos
químicos.
(5.4)
(5.5)
TABELA 5.2 Comparação dos diversos processos de remoção de nitrogênio (adaptado de AHN,
2006 e PLAZA et alii, 2003)
Matéria orgânica Matéria orgânica
Oxigênio
(DQO) necessária (DQO) necessária
Processo necessário
sem assimilação com assimilação
(gO/ gN)
(gDQO/gN) (gDQO/gN)
Nitrificação-desnitrificação 4,57 2,86 4,0

Nitritação-desnitritação 3,43 1,72 2,4
Nitritação parcial-Anammox 1,72 - -
OLAND 1,94 - -
Comparado ao tradicional processo de remoção de nitrogênio, o consumo de

oxigênio nos processos de nitritação-desnit ritação e nit ritação parcial-Anammox é
25% e 60% menor, respectivamente. Se após nitritação for aplicado o processo de
desnitritação, uma economia de 40% de carbono orgânico poderá ser obtida. Com
a aplicação do processo Anammox a jusante do processo de nitritação a economia é
ainda maior, uma vez que esse processo dispensa fonte de carbono orgânico (AHN ,
2006) . Hao et alii (2001) e Nielsen et alii (2005 ) ressaltam que para o tratamento
de correntes al tamente concentradas, o custo relativamente elevado de implanta-
ção do processo combinado de nitritação parcial/Anammox é compensado pelos
menores custos de operação e pelo bom desempenho de remoção de nitrogênio.
Os três processos (convencional, nitritação-desnitritação e nitritação parcial-
-Anammox), apesar de serem bastante distintos em termos de requerimento de oxigê-
nio e matéria orgânica, requerem níveis de alcalinidade similares, tendo em vista que
1 n1ol H+ é produzido por mol de nitrogênio convertido. Sendo assim, esses processos
não acarretam em custos elevados para o controle do pH caso a água residuária a ser
t ratada tenha boa capacidade tamponante (1 mol H CO; por molde NH 4 ) .
A principal desvantagem dos processos de remoção autotrófica de nitrogênio
consiste justamente nas reduzidas velocidades de crescimento das bacté rias oxida-
do ras de amônia e dos 1n icro-o rganismos Anammox. O desempenho dos reatores nos
quais predon1inam bactérias, cujo crescin1ento é lento, pode ser melhorado pela
aplicação de altos tempos de retenção celular. Uma das alternativas é a utilização
de mate riais supo rtes para o desenvolvimento de biofilmes ou ainda propiciar
condições
,
para a autoagregação das células na fo nna de grânulos (VÁZQUEZ-
PADIN et alii, 2009). As figuras 5 .2a e 5 .2b apresentam, de forma ilustrativa
e simplificada, duas ilustrações em diferentes perspectivas do ciclo do nitrogênio
atualizado com a remoção autrotrófica de nitrogênio. Como se pode obse rvar, a
detecção de novos micro-organismos (tais como as bactérias Anammox) au1nentou
substancialmente a complexidade do ciclo do nitrogênio. O processo Anammox
será abordado no item seguinte.
CAPÍTULO5 ◊ NOVOS PROCESSOS DE REMOÇÃO BIOLÓGICA DE NITROGÊNIO 179
~ Fixação de nitrogênio
~ Remoção tradicional de nitrogênio
... Remoção autotrófica de nitrogênio
(a)
Nitrificação
Oxidaçã.o de
Oxidação de amônio
nitrito
N2
óxico Assim/ação ~xação de N
Assimilação
N0
3 _ _., N o rg. NH+
4
anóxico
Red. dis. de
N03 aNHt :' Fixação de N
Anammox
N2
NO
Desnitrificação
(b)
FIGURA 5.2 Representação esquemática do ciclo do nitrogênio: (a) comparação simplificada
entre o processo convencional de remoção de nitrogênio e o Processo Anammox ; (b) principais
reações óxicas e anóxicas envolvidas no ciclo do nitrogênio. As diversas reações que ocorrem em
condições anóxicas estão indicadas em diferentes tonalidades de cor: cinza-claro (desnitrificação) ,
cinza-escuro (redução dissimilatória de nitrato a amônia) e preto (Anammox). A linha tracejada indica
a formação de N2O por bactérias oxidadoras de amônia (adaptado de MADIGAN et alii, 2000).
5.2.2 PROCESSO ANAMMOX
5.2.2.1 Breve histórico
Em 19 77 , Engelbert Eroda previu, baseado em teorias termodinâmicas e

evolucionárias, que a oxidação de amônio em condições anóxicas com nitrato ou
nitrito como aceptor de elétrons era algo possível de existir (BRODA, 1977). A
oxidação de amônio utilizando aceptor de elétrons que não o oxigênio já havia
sido prevista por pesquisadores de ambientes marinhos com base em estudos de
balanço de massa (RICHARDS, 1965) e posteriormente em combinação com jus-
t ificativas termodinâmicas (CLI NE e RI CHARDS, 1972). Essas predições foram
de certa forma levadas em consideração, embora em uma época em que poucos
acreditavam na existência da oxidação biológica de an1ônio em condições anóxicas.
Em 1985, a remoção de amônia foi de fato observada pela primeira vez sob
condições anóxicas em um reato r desnitrificante de escala-piloto e1n uma fáb ri-
ca de fermento em pó denominada Gist-Brocades, atualmente parte da en1presa
DSM, localizada em Delft, Holanda (HEIJNEN, 1988; MULDER, 1989; VAN
DE GRAAF et alii, 1990; MULDER et alii, 1995). Nesse reator, nitrato foi
adicionado no intuito de se obter o processo con1binado de oxidação de sulfeto
e redução de nitrato. De forma su rpreendente, amônio (tido con10 não reativo
sob condições anóxicas) foi também removido (MULDER et alii, 1995). O novo
processo biológico passou a ser chamado Processo Anammox, abreviatura para
oxidação anóxica de amônio (MULDER, 1989; VAN DE GRAAF et alii, 1990)
ou oxidação anaeróbia de amônio (MULDER, 1989; VAN DE GRAAF et alii,
1995), nome pelo qual esse processo é mais conhecido. Um reator de escala labo-
ratorial baseado no reato r de desnitrificação de escala-piloto foi montado e o en-
riquecimento do organis1no responsável do processo Anammox se tornou possível
somente após o nitrito (e não o nitrato) ter sido identificado como o verdadeiro
aceptor de elétrons (VAN DE GRAAF et alii, 1996).
Dez anos após as primeiras observações da reação de oxidação de a1nônio em
condições anóxicas em Delft (Holanda), na Alen1anha (HIPPEN et alii, 1996;
HIPPEN et alii, 1997) e na Suíça (BINSWANGER et alii, 1997; SIEGRIST et
alii, 1998) foi repo rtada a produção de gás nitrogênio ao invés de n itrato (perda
de nitrogênio) em contactores biológicos rotativos (Rotating biological contactors
- RBC) tratando águas residuárias ricas em amônio proveniente de lixiviado de
aterro sanitário. Uma vez que o único doador de elétrons presente em quantidades
significativas nessas águas residuárias era o amônio, se esperava que todo o nitro-
gênio sob a forma de amônio fosse convertido em nitrato, ao invés de ser perdido
para a atmosfera na forma de gás N 2 • A conversão nesses reatores foi inicialmente
relacionada à desnitrificação realizada por organismos n itrificantes, descrita pre-
viamente por Poth e Focht (1985), embora tambén1 eventual1nente atribuída à
combinação entre organismos nitrificantes e bactérias responsáveis pelo processo

Anammox.
As bactérias Anammox foram encontradas não somente em plantas de tra-
tamento de águas residuárias, mas também em ambientes naturais, tais como
em diversos mares (Mar Negro, por exemplo) e rios (KUYPERS et alii, 2003),
influenciando de forma significativa o ciclo de nitrogênio. Dependendo da carga
orgfu1ica, até 70% da produção de N 2 em sedimentos marinhos pode1n ser atribuí-
dos ao processo Anammox (DALSGAARD e THAMDRUP, 2002).
Culturas enriquecidas (50-90% puras) obtidas por alguns pesquisadores
(SCHMID et alii, 2000; EGLI et alii, 2001; STROUS et alii, 2006; TSUSHIMA
et alii, 2007a; LÓPEZ et alii, 2008) eram as únicas fontes de informação do
processo Anammox, uma vez que muitas tentativas de isolamento do organismo
responsável por esse processo falharam (STROUS et alii, 1999a). Para provar
que os organismos enriquecidos eram realmente os responsáveis pelo processo
Anammox, células foram fisica1nente purificadas até 99,6% por meio de centri-
fugação por gradiente de densidade (método Percoll, STROUS et alii, 1999a). O
fato de que as células purificadas foram capazes de realizar a conversão Anammox
característica (conversão de amônio e nitrito) e1n alta taxa, comprovou que o mi-
cro-organismo enriquecido era realmente o responsável pela oxidação de amônio
em condições anóxicas. A solução celular concentrada permitiu o sequenciamento
do gene 16S rRNA, o qual forneceu evidência de que o organismo em questão per-
tencia ao Filo dos Planctomicetos (STROUS et alii, 1999a), sendo denominado
Candidatus "Brocadia Anammoxidans".
5.2.2.2 Conversões envolvidas noprocesso Anammoxecaracterísticas dos organi smos responsáveispor esse
processo
Os principais substratos do processo Anan1mox consistem em amônio, nitrito

e bicarbonato (VAN DE GRAAF et alii, 1996). O acoplamento do átomo de nitro-
gênio do amônio (doador de elétrons) e do átomo de nitrogênio do nitrito (aceptor
de elétrons) para a formação de gás nitrogênio compreende a reação catabólica
(equação 5.6).
(5 .6)
Por ser um processo biológico autotrófico, HCO; é a fonte de carbono para a

produção de biomassa nas reações anabólicas (equação 5. 7). A oxidação de nitrito
a nitrato gera os elétrons requeridos para o processo de redução de HCO; (VAN
DE GRAAF et alii, 1996). A reação catabólica é realizada 15 vezes para a fixação
de uma molécula de CO2 com nitrito funcionando como doador de elétrons, levan-
do à produção anaeróbia de nitrato no anabolismo. Em p rocessos autotróficos, a
geração anóxica de n itrato pode servir como un1a medida do crescimento da bio-
massa Anammox e consiste em um bom indicativo da atividade Anammox (VAN
LOOSDRECHT, 2008).
Hco; + 2,1No; + o,2NH: + o,8H+ ➔ CH 1•8O0,sN 0.2 +

(5 .7)
+ 2,lNO; + 0,4H 2O
A combinação das reações catabólica (equação 5 .6) e anabólica (equação 5 . 7)

utilizando o rendimento de carbonato a amônio determinado experimentalmente
(0,066 mol C/mol NH;, STROUS et alii, 1998) resulta na seguinte reação global
(equação 5.8).
NH: + 1,13N O; + 0,066HCO; + 0,053H+ ➔ 0,99N2 +

(5 .8)
+ 0,066CHl ,8º 0,SN0,2 + O, 14NO; + 2H2O
A estequiometria da equação (5 .8) é bastante próxiina da estequio1netria ob-

t ida experimentalmente (STROUS et alii, 1998), representada na equação (5 . 9).
Como se pode observar, amônio e nitrito são consumidos praticamente em pro-
porções equimolares (1: 1,3) . O excesso de nitrito (0,3 mol de nitrito por mol de
a1nônia) é oxidado anaerobicamente a n it rato. Os elétrons derivados dessa oxi-
dação são provaveln1ente utilizados para a fixação de CO2 (VAN DE GRAAF et
alii, 1996). O produto principal do processo Anammox é o N 2, embora pequena
parcela do nitrogênio alimentado seja convertida em nitrato. O nitrato produzido
requer carbono orgânico para a desnitrificação, o que não constitui u1n problema
devido ao fato de a maioria das águas residuárias reais conter pelo menos uma pe-
quena quantidade de matéria orgânica biodegradável que pode ser utilizada para
desnitrificar o n itrato p roduzido .
NH: + 1,32N O; + 0,066HCO; + 0,13H+ ➔ 1,02N2 +

(5 .9)
+ o,066CH 1•8O0.sN 0.2 + o,26No; + 2,03H2O
Os organismos responsáveis pelo processo Anammox crescem muito lenta-

mente, conforme a própria estequiometria evidencia. O tempo de duplicação é de
vários dias sob condições de operação consideradas ideais (STROUS et alii, 1998;
T SUSHIMA et alii, 2007b) . De acordo com Schrnid et alii (2003), o tempo de
duplicação é de 11 dias. Outros autores, tais corno Van Der Star et alii (2008),
reportaram tempos de duplicação entre 5 ,5 e 7 ,5 dias, valores calculados tendo
corno base a máxima capacidade de conversão. Esses mesmos autores indicam a
possibilidade de se obte r tempos de duplicação ainda menores, em torno de três
dias. Outras pesquisas recentes apontaram a possibilidade de se obter ten1pos de
duplicação de apenas 1 ,8 dias em condições operacionais ideais (ISAKA et alii,
2006) . Urna possível explicação para que os resultados sejam divergentes é o
método usado para a determinação da taxa de crescimento. I saka et alii (2006)
determinaram a taxa de crescimento baseados na contagem direta de bactéria
Anarnrnox, enquanto os outros estudos basearam-se no rendimento da biomassa e
na taxa de remoção de nitrogênio.
O crescimento autotrófico é um processo substancialn1ente custoso en1 ter-
mos energéticos e, portanto, sempre leva a baixas taxas de crescimento quando
comparadas ao crescimento heterotrófico. Corno consequência, o período de par-
tida (start-up) do processo Anarnrnox é bastante longo e a obtenção de velocida-
des de processo mais adequadas é dificultada. O uso de reatores com sistemas
eficientes de retenção de biomassa é fundrunental para se conseguir o enrique-
cimento da cul tura CTETTEN et alii, 200 1). A baixa taxa de crescimento das
bactérias Anarnrnox e a dificuldade de se obter culturas enriquecidas desses micro-
-organismos certamente dificultam as pesquisas envolvendo o processo Anarnrnox
(ST ROUS et alii, 1998). No entanto, a baixa taxa de crescimento não significa
limitação da capacidade de remoção de nitrogênio, a qual pode atingir valores
entre 5-1 O rngN/rn3 .d devido ao fato dos micro-organismos Anarnrnox formarem
biofilrnes compactos ou grânulos, o que permite a obtenção de elevadas concentra-
ções de biomassa no reator.
Vale mencionar que o crescimento extremamente lento das bactérias Anarnrnox
não pode ser apenas explicado sin1plesn1ente por autotrofia. A energia obtida por
meio do catabolisrno (calculada por rnol de elétrons) é comparável com a do pro-
cesso autotrófico de nitrificação, embora a taxa de crescimento seja muito menor.
Outras explicações plausíveis para o crescimento lento podem estar relacionadas
ao fato de as bactérias Ana1nrnox possuíren1 baixa taxa de conversão intrínseca
(de arnônio e nitrito) ou, então, de o enriquecimento da cultura ser realizado em
condições de crescimento não ideais nos sistemas de cultivo.
Muitas incertezas existem em relação aos intermediários do catabolisrno das
bactérias Anarnrnox. Há, entretanto, um consenso geral de que a h id razina (N2 H 4)
é un1 intermediário. A produção de hidrazina a partir de hidroxilarnina pode ser
utilizada corno um método para detectar biomassa Anarnrnox ativa. A oxidação
desse composto a N 2 consiste na etapa geradora de energia. N it rito não é converti-
do diretamente à h idrazina, e sim via hidroxilarnina e/ou óxido nítrico (VAN DE
GRAAF et alii, 199 7; STROUS et alii, 2006) . Uma representação esquemática

de t rês possíveis metabolismos está ilustrada na figura 5.3 . E nzimas importan-
tes do p rocesso envolvem a hidroxilamina oxido rredutase (H AO, purificada por
SCHALK et alii, 2000), hidrazina oxidase (HZO, purificada por SHIMAMURA
et alii, 2007) e nitrito redutase ccNir (parcialmente pu rificada por SCHALK,
2000) e cdl Nir (encontrada no geno111a de "Kuenenia", ST ROUS et alii, 2006).
U111a vez que todas essas enzimas são capazes de realizar diversas reações envol-
vendo a conversão de nitrogênio, até o presente momento não está totalmente
elucidado qual enzima é responsável po r determinada reação.
(a) N02 (b) N02 (e) N02

....
i ! NO
NH+
4 NH 2 0H NH; NO NH4+ NHtOH
\.. ,I \.. ,I \.. ,I
y y y
N2H4 N2H4 N2H4
.i i i
N2 N2 N2
FIGURA 5.3 Reações catabólicas do processo Anammox com hidrazina funcionando como
intermediário principal. Outros potenciais intermediários são hidroxilamina (A), óxido nítrico (B), ou
hidroxilamina e óxido nítrico (C) (adaptado de VAN DER STAR, 2008).
De acordo com Van Dongen et alii (200 1a), a enzima h idrazinase conve rte
hidroxilamina em hidrazina. A hidrazina fo rmada é oxidada pela hid roxilamina-
-oxido rredutase (HAO) para gás nitrogênio, etapa na qual são liberados quatro
prótons e quat ro elétrons. Quando nitrito está presente no sistema, os quatro
elétrons liberados, juntamente com o nit rito, são convertidos em hid roxilamina
pela enzima nit ritorredutase. Quando nit rito não está presente no sistema e o
processo Anan1mox é operado sob condições de limit ação de nitrito, os elétrons
deixam o sistema de outra manei ra. Esse p rocesso geralmente ocorre por reação
de despropo rcionamento de hid razina para a111ônio e gás n it rogênio de acordo com
a reação 5 .10 .
(5. 10)
A desintegração de hidrazina ocorre mais lentamente do que a formação de

hidroxilamina. Como consequência, ocorre um acúmulo de hidrazina no sistema.
Devido ao fato de ocorrer a desintegração de hidrazina em amônia e gás nitrogê-

nio, um acúmulo de amônia é esperado.
Vale ressaltar que enquanto as bactérias desnitrificantes usuais têm N 2 O
como composto intermediário, as bactérias Anammox não o possuem em sua fi-
siologia. Isso significa que esse poderoso gás-estufa não é produzido pelos orga-
nismos Anam111ox.
O principal compartimento das bactérias Anammox é o Anammoxosomo. O
Anammoxosomo é cercado pelo riboplasma (onde estão localizados os ribossomos
e o cromossomo), o qual por sua vez é circundado pelo parifoplasma (LINDSAY et
alii, 2001; VAN NIFTRIK et alii, 2008), conforme mostra a figura 5.4. Tendo
em vista que não há um consenso em relação às características da membrana
entre o parifoplasma e o riboplasma, a classificação do parifoplasma (seja como
compartimento interno verdadeiro ou como região que é similar ao periplasma em
bactérias gram-negativas) está ainda em discussão.
Observações microscópicas sugeren1 que as bactérias Anan1mox, como to-
dos os outros Planctomicetos, não possuem peptidoglicanos, embora apresentem
uma membrana celular de natureza proteica. Os lipídios das bactérias Anammox
contêm uma combinação de ácidos graxos ligados a ésteres (característica típica
de bactérias e eucariotos) e éteres (característica típica de arqueias). Membranas
lipídicas são essenciais para permitir a existência de gradientes de íons e meta-
bólitos. As bactérias Anammox contêm uma variedade de lipídios de membrana,
não convencionais, única na natureza (SINNINGHE DAMSTÉ et alii, 2002;
SINNINGHE DAMSTÉ et alii, 2005; KUYPERS et alii, 2003) . As células
Anammox possuem a forma esférica (cocos) e apresentam diâmetro menor que
1 µ m. A biomassa Anammox apresenta uma cor marrom-avermelhada (figura
5 .5), o que provavelmente se deve ao alto conteúdo de citocromos CTETTEN et
alii, 1999).
Anamrnoxosomo
Riboplasma
Parifoplasma
FIGURA 5.4 Representação esquemática dos diferentes compartimentos das bactérias Anammox
(adaptado de LINDSAY et alii, 2001 e FUERST, 2005). O citoplasma é dividido em parifoplasma
(compartimento exterior), riboplasma (onde se encontram os ribossomos e o cromossomo) e
Anammoxosomo (onde a maioria ou todos os citocromos c estão presentes e onde se acredita
ocorrer o catabolismo).
(a) (b)
FIGURA 5.5 Biomassa Anammox na forma de grânulos (a) e em suspensão - células livres (b).
O Anammoxosomo é tido como o local do catabolismo, tendo como função

a geração de energia, de forma análoga à função das mitocôndrias em eucariotos
(LINDSAY et alii, 2001; VAN NIFTRIK et alii, 2004). Essa hipótese implica
que a força próton motora é ge rada através da membrana do Anammoxosomo para
o acoplamento da geração de energia e anabolismo. A presença de enzimas impor-
tantes (hidrazina/hidroxilamina oxidorredutase) no Anammoxosomo indica que o
catabolismo Anammox ocorre nesse co1npartimento.
Um n1odelo bioquímico (figura 5 .6) foi proposto no qual a oxidação anaeróbia
de amónio é catalisada por diversos citocromos e e proteínas (STROUS et alii,
2006) . Nesse modelo, nitrito é primeiramente reduzido a oxido nítrico por um
citocromo e e citocromo dl contendo a enzima nitritorredutase (NirS). Assume-se
que óxido nítrico e amónio sejam combinados, formando hidrazina pela ação da
hidrazina hidrolase e esse composto é finalmente oxidado a nitrogênio gasoso por
uma proteína do citocron10 e, denominada hidrazina/hidroxilamina oxidorredu-
tase (SCHALK et alii, 2000; SHIMAMURA et alii, 2007). Os quatro elétrons
derivados dessa oxidação são transfe ridos para os carreadores de elétrons do cito-
cron10 e (CIRPUS et alii, 2005; HUSTON et alii, 2007), ubiquinona, con1plexo
do citocromo bel, carreadores de elétrons do citocromo e e finalmente para nitri-
torredutase e hidrazina hidrolase.
Nesse modelo, a reação Anammox estabelece u1n gradiente de prótons pela
translocação de prótons do riboplasma para o Anammoxosomo, o que resulta em
um gradiente eletroquímico de prótons diretamente do Anammoxosomo para o
riboplasma. Esse gradiente contém en ergia potencial química (gradiente químico
de prótons na forma de uma diferença de pH na qual o riboplasma é mais alcalino
comparado ao Anammoxosomo) e energia potencial (gradiente elétrico de prótons
na forma de uma diferença de carga tendo em vista que o riboplasma é carregado
negativamente em relação ao Anammoxosomo). Ambas diferenças de pH e de car-

ga propiciam o deslocamento dos prótons de fora para dentro do Anammoxosomo,
isto é, fornecem a força próton-motora. Esse mecanismo pode ser usado para a
síntese de ATP catalisada por adenosina trifosfatases (ATPases) localizadas na
membrana do Anammoxosomo, conforme indicado na figura 5.6. Os prótons se
movimentam passivamente de volta ao riboplasma (devido ao gradiente eletroquí-
mico de prótons) por 1neio dos poros for1nados pelas ATPases. O do1nínio globular
e hidrofóbico sintetizador de ATP das ATPases ficará localizado no riboplasma e
o seu domínio hidrofóbico translocador de prótons ficará localizado na membrana
do Anammoxosomo. O ATP sintetizado será liberado no riboplasma.
NO-+-
FIGURA 5.6 Modelo bioqu ímico representando a oxidação anaeróbia de amônia acoplada à
membrana do Anammoxosomo em bactérias Anammox , resultando na força próton-motora e
subsequente síntese de ATP por meio dasATPases ligadas à membrana. bc1: complexo do citocromo
bc1; cit: citocromo; hao: hidrazina/hidroxilamina oxidorredutase; O: coenzima Q; a: compartimento
do Anammoxosomo; r: compartimento do riboplasma (adaptado de STROUS et alii, 2006).
As bactérias Anammox dependem do gradiente eletroquímico de íons através

da membrana para a síntese de ATP. Em vi rtude de o catabolismo Anammox ser
lento, somente alguns poucos p rótons são t ranslocados por unidade de tempo, en-
quanto a dissipação do gradiente eletroquímico resultante da difusão passiva é in-
dependente da taxa de crescimento e procede em velocidade normal . Dessa forma,
a difusão passiva de prótons através da membrana é relativamente importante e
leva a um 1naior gasto de energia no caso das bactérias Anamn1ox. Para se ter uma
ideia, o gasto devido à difusão passiva de prótons em mitocôndrias corresponde a
10% (HAINES, 2001 ). Sendo assim, fica claro que a presença de uma membrana
especial, menos pern1eável, é essencial para as células Anammox. Além disso, os
intermediários da reação Anammox, tais como hidrazina, facilmente se difundem
através da membrana.
Em uma perspectiva bioenergética, a perda de energia associada com a perda
de uma molécula de hidrazina da célula Anammox é equival ente a 1S ciclos cata-
bólicos. A explicação é a seguinte: quando u1na molécula de hidrazina é pe rdida,
a reserva de hidrazina deve ser reestabelecida. Presumidamente, a hidrazina é
formada por meio da redução de nitrito a óxido nítrico e subsequente junção de
óxido nítrico com amônia. Os equivalentes necessários (quatro elétrons) devem
vir da oxidação de material de reserva, como glicogênio, sendo esse composto de-
rivado do COr Tendo em vista que somente uma molécula de C02 é fixada para
cada 1S moles de amônia oxidado (1 S ciclos catabólicos), uma perda de 10% de
hidrazina já irá causar completa perda de viabilidade da célula. Po r essa razão, a
limitação da difusão tanto de prótons quanto de intermediários Anammox é ex-
t reman1ente importante para as bactérias Anammox. Uma vez que se assun1e que
o catabolismo Anammox ocorre no Anammoxosomo, a n1embrana lipídica desse
compartimento (ressaltada anteriormente) apresenta estrutura rígida, justamente
para limitar a difusão de intermediários importantes do processo para fora do
Anammoxosomo, característica que representa uma adaptação específica para o
n1etabolismo não usual das bactérias Anammox.
Devido à estrutura densa da membrana do Anammoxosomo, são necessários
t ransportadores específicos para regular o transporte de amônia e nitrito. O ge-
noma de "Candidatus Kuenenia stuttgartiensis" (uma das espécies de bactérias
Anammox, conforn1e será visto em seguida) codifica para quatro transportadores
de amônia (Amt), quatro transportadores de formato/nitrito (FocA) e dois trans-
portadores de nitrato/nitrito (Na rK) cuja localização é desconhecida (STROUS et
alii, 2006).
Embora a membrana do Anammoxosomo deva ser rígida, a membrana cito-
plasmática deve se r flexível e permeável para a manutenção da homeostasia, con-
t rolando as concentrações de íons intracelulares e processos de transporte. Dessa
forma, possuindo u1na 1nen1brana do Anammoxoson10 rígida e uma me1nbrana
citoplasmática flexível, a célula pode superar o problema que a presença de uma
só membrana traria, uma vez que essa deveria ser impermeável e permeável ao
mesmo tempo . Adicionalmente, o uso de um compartimento intracitoplasmático
(Anammoxosomo) para a síntese de ATP por meio da força próton-motora resulta
em um controle total dessa força, permitindo uma eficiente transdução de energia.
Até o presente momento, quatro gêneros de bactérias Anammox foram descri-
tos, sendo a similaridade das sequências do gene 16S rRNA das espécies variando
entre 8 7 e 99% (SCHMID et alii, 2007). Apesar dessa distância filogenética re-
lativamente grande, todos os organismos Anammox pertencem à mesma família,
denominadaAnammoxcueae GETTEN et alii, 2008), formando um grupo mono-
filético pertencendo ao filo dos Planctomicetos (Strous et alii, 1999a). Uma carac-
terística dos Planctomicetos se refere ao seu não usual alto nível de organização
celular, sendo que cada célula consiste em um ou mais compartimentos internos
envoltos por membranas com funções variáveis e desconhecidas (LINSAY et alii,
200 1; FUERST, 2005).
Entre as diferentes bactérias Anammox, pode-se n1encionar as enrique-
cidas a partir do processo de lodos ativados, tais con10 "Candidatus Kuenenia
stuttgartiensis" (Schmid et alii, 2000), "Candidatus Brocadia Anammoxidans"
(STROUS et alii, 1999a), "Candidatus Brocadia fulgida" (KARTAL et alii, 2004)
e "Candidatus Anamn1oxoglobus propionicus" (KARTAL et alii, 2007) e as detec-
tadas em ambientes marinhos, especialmente em sedimentos e zonas com mínima
concentração de oxigênio, tais como "Scalindua brodae", "Scalindua wageneri" e
"Scalindua sorokinii" (SCHMID et alii, 2003).
Uma vez que nenhuma bactéria Anammox foi obtida em cultura pura, to-
das as espécies levam o nome Candidatus. "Brocadia" e "Kuenenia" foram geral-
mente enriquecidas em experimentos de laboratório util izando-se meio similar
ao usado por VAN DE GRAAF et alii (1996) independentemente do inóculo
usado (SCHMID et alii, 2000; VAN DONGEN et alii, 2001 b; CHAMCHOI e
NITIROSAVUT, 2007) . A adição de ácidos graxos levou ao enriquecimento de
"Anammoxoglobus" (KARTAL et alii, 2007) e "Brocadia fulgida" (KARTAL et
alii, 2004; KARTAL et alii, 2008). Apesar da considerável diversidade em dife-
rentes sistemas de enriquecimento, "Scalindua sorokinii" é a espécie dominante
em ambientes n1arinhos.
Alguns estudos apontaram que, além da conversão de amônio e nitrito, bac-
térias Anammox pertencentes aos gêneros "Brocadia", "Anammoxoglobus" e
"Kuenenia" são também capazes de metabolizar ácidos graxos, tais como pro-
pionato, acetato e formiato (GÜVEN et alii, 2005; KARTAL et alii, 2008). A
oxidação desses ácidos graxos a C02 é acoplada à redução de nitrato (via n itrito)
a amônio. Dessa maneira, as bactérias Anammox são capazes de produzir seu
próprio substrato (amônio e nitrito) para executar seu catabolismo (figura 5 . 7).
Acetato Acetato
Propionato Propionato
Formato C0 Formato C0
_v. _V+
2 2
N03
____ N02
\..._
y
NH1
/
FIGURA 5.7 Versatilidade metabólica das bactérias Anammox. Além da conversão de amônia e
nitrito (linhas sólidas), bactérias Anammox utilizam ácidos graxos de cadeia curta como doador de
elétrons para amonificação (linhas tracejadas) (adaptado de VAN DER STAR, 2008).
Até o presente momento não se sabe se a conversão de nitrato a amônio cons-

titui uma reação catabólica adicional, o que certamente consistiria em uma fonte
de energia. De forma su rp reendente, estudos indicam que os ácidos graxos não são
inco rporados à biomassa, sendo convertidos inteiramente em CO2 (KARTAL et
alii, 2008) . Tendo em vista que as bactérias Anammox também executam a fixa-
ção de CO2 via acetato (reação inversa à oxidação de acetato descrita previamente),
essa é uma característica de certa forma su rpreendent e, embora já consolidada das
bactérias Anammox.
Além da conversão de ácidos graxos, "Kuenenia stut tgartiensis" mostrou ser
capaz de oxidar Fe2 + a Fe3 + utilizando nitrato como aceptor de elétrons, bem
como a redução de Fe 3 + a Fe2 + e Mn 4 + a Mn2 + utilizando formiato como doador
de elétrons (STROUS et alii, 2006) . Da mesma fo rn1a que a conve rsão de ácidos
graxos, o metabolismo e a possibilidade de crescimento utilizando esses subst ratos
são desconhecidos.
5.2.2.3 Fat ores queinfluenciam a atividade dasbactériasAnamm ox
Substratos e produt os
A concentração de nitrito é um importante parâmetro a se r controlado no

processo Anammox. Por um lado, é fundamental que se tenha determinada con-
centração de nitrit o durante o processo de partida do sistema Anammox. Caso a
concentração de nit rito seja muito baixa, pode-se te r limitação de substrato oca-
sionando baixo crescünento . Por outro lado, concentrações muito elevadas podem
ocasionar inibição. A literatura descreve diversas faixas de concentração de nitrito
capazes de ocasionar inibição, de forma que não há consenso entre os diversos
estudos realizados.
Strous et alii (1999b) verificaram que o processo Anammox (utilizando

Candidatus B rocadia Anammoxidans) foi completamente inibido quando a concen-
t ração de nitrito foi superior a 100 mgN/L. Dapena-Mora et alii (2007), po r n1eio
da realização de testes de atividade, observaram que 350 mgNO 2-N/L correspon-
deram à concentração capaz de causar inibição de 50% do processo Anammox.
Fux (2003), ao manter a concentração de nitrito em torno de 40 mgN/L por
diversos dias, observou a inativação irreve rsível das bactérias Anammox. Uma
maneira para tentar restaurar a atividade Anammox devido à inibição por nitrito
consiste na adição de quantidades traço de intermediários do processo Anammox,
tais como hidroxilan1ina e hidrazina, mesmo após longo tempo de exposição a
altas concentrações de nitrito (STROUS et alii, 1999b).
Pesquisas demonstraram que a tolerância ao nitrito é diferente para os di-
ferentes gêneros de bactérias Anammox. Egli et alii (2001 ), realizando expe-
rimentos com Candidatus I(uenenia stuttgartiensis, observaram que o p rocesso
Anammox foi somente inibido quando submetido a concentrações de nit rito su-
periores a 182 mgN/L. Os experimentos realizados por Strous et alii (1999b)
mostraram que com o aumento da concentração de nitrito, a estequiometria do
processo sofreu alteração. A estequio1netria do consumo de amônio e nitrito pas-
sou de 1,3 g de nitrito por gran1a de amônia (quando a concentração de nitrito
era de O, 14 gN/L) para quase 4 g de nitrito por grama de amônia (quando a con-
centração de nitrito era de 0,7 gN/L) .
A mudança significativa da estequiometria en1 altas concentrações de nitrito
permite inferir que os micro-organismos, quando submetidos a essas condições,
não usam apenas amônio como doador de elétrons, mas também devem gerar um
doado r de elétrons interno para reduzir o nitrito. E ssa mudança na estequiome-
tria também foi observada em altas ten1peraturas. Dosta et alii (2008) obse rvaram
que a razão de consumo nitrito:amônio era de 1,3 8 :1 a 30ºC e de 1,05: 1 a 18º C.
Strous et alii (1999b) reportaram que o processo Anammox não é inibido por
runônio ou por nitrato em concentrações abaixo de 1 gN/L. Entretanto, Dapena-
Mora et alii (2007) observaram uma queda de 50% da atividade en1 altas concen-
trações de amônio e nitrato (770 e 630 mgN/L, respectivamente). Tendo em vista
que os organismos quimiolitoautotróficos utilizam basicamente carbono inorgâ-
nico como fonte de carbono, a concentração afluente de bicarbonato é um impor-
tante fator que pode afetar o enriquecimento da cultura Anammox.
Dexiang et alii (2007) observaram baixa atividade Anammox em baixas ra-
zões de bicarbonato:amônio (2 ,3 :1 ). Nessas condições, a atividade é diminuída
possivelmente devido à limitação de CO2 • Em contrapartida, alta concentração de
bicarbonato (razão bicarbonato:amônio de 4, 7: 1) tambén1 pode levar à inibição.
Nesse caso, a inibição está relacionada à formação de quantidades significativas de
a1nônia livre devido ao aumento do pH para valores acima de 8.
Oxigênio
As bactérias Anammox são estritamente anaeróbias e são inibidas pelo oxigê-

nio dissolvido no n1eio. A inibição causada por baixas concentrações de oxigênio
foi descrita em diversos trabalhos na literatura como sendo reversível. A partir
de experimentos nos quais oxigênio foi fornecido de forma intermitente, Strous et
alii (1997) concluíran1 que o processo Anamn1ox foi reversivelmente inibido por
oxigênio, fazendo com que fosse possível obter a nitritação parcial e Anammox
em um único reator. Egli et alii (2001) afir1naram que o metabolismo Anammox
é reversivelmente inibido em baixos níveis de oxigênio (0,25 - 2% em relação à
saturação do ar), embora seja provavelmente irreversível em altos níveis (> 18%
em relação à saturação do ar) .
Carbonoorgânico
O tratamento de lixiviados e efluentes de digestores de lodo, os quais contêm

alta concentração de nitrogênio, pode ser realizado por 1neio dos novos processos
de remoção de nitrogênio, tais como nitritação parcial + Anan1mox. Entretanto,
esses resíduos podem conter igualmente alta concentração de matéria orgânica.
Apesar disso, eles ainda são considerados potenciais correntes afluentes de um
reator Anammox. Durante a digestão anaeróbia, a n1atéria orgânica facilmente
biodegradável é convertida em biogás. Desse modo, son1ente a porção cuja biode-
gradabilidade é baixa permanece no efluente do digestor.
Ruscalleda et alii (2008) observaram que as bactérias Anammox e organis-
mos desnitrificantes pode1n coexistir e ser fundamentais para o tratamento com
altas concentrações de material orgânico lentamente biodegradável, a exemplo de
efluente de digestores e lixiviados. Nessas águas residuárias, em particular, o cres-
cimento de organismos heterotróficos desnitrificantes é li1nitado pela baixa dis-
ponibilidade de carbono orgânico facilmente biodegradável. Como consequência,
esses micro-organismos não conseguem se tornar dominantes e não prejudicam o
crescimento dos organisn1os Anammox.
Entretanto, há na literatura diversos estudos que reportam um efeito negativo
da presença de matéria orgânica no crescimento das bactérias Anan1n1ox (TETTEN
et alii, 1999; MOLINUEVO et alii, 2009; TANG et alii, 2010) . Na presença de
determinadas quantidades de material orgânico, as bactérias Anammox não são
mais capazes de competir por n itrito com os organismos desnitrificantes, os quais
apresentam velocidades de crescimento muito superiores quando comparados aos
micro-organismos Anammox. Além disso, a reação de desnitrificação é termodi-
namicamente mais favorável que a oxidação anaeróbia de amônia, uma vez que a
energia livre de Gibbs das bactérias Anan1mox e das bactérias desnitrificantes está
na ordem de -355 kJ/mol GETTEN et alii, 1999) e -427 kJ/mol (RITTMANN

e MCCARTY, 200 1), respectivamente . Dessa maneira, os desnitrificantes hete-
rotróficos irão crescer muito n1ais rapidamente quando carbono orgânico estiver
presente em combinação com amônia e nitrito, não permitindo o desenvolvimento
dos micro-organismos Anammox.
Da mesma forma que para o nitrito, não existe um consenso na literatura a
respeito da concentração de orgânicos a partir da qual os micro-organismos desni-
trificantes não permitem o crescimento das bactérias Anammox. Chamchoi et alii
(2008) reportaram que concentrações de material orgânico acima de 300 mgDQO/L
ou razões DQO/N acima de 2, causaram a inativação dos organismos Anammox
em um reator UASB al imentado com leite com alto teor de gorduras como fon-
te de carbono orgânico. Tang et alii (201 O) relataram que os micro-organismos
desnitrificantes passaram a dominar o sistema quando foi aplicada a alta razão
DQO/NO2-N de 2,9: 1. Molinuevo et alii (2008) observaram inibição con1pleta do
processo Anammox quando a DQO foi de 292 mg/L.
Uma vez que o processo Anammox remove apenas 90% do nitrogênio sob a
forma de amônia/nit rito e 10% do nitrogênio permanece no efluente sob a fo rma
de nitrato, a coexistência de organismos Anammox e desnitrificantes se torna
favorável. Em condições anóxicas, o nitrato pode ser reduzido a nit rito pelos des-
nitrificantes, e o nitrito pode então ser utilizado pelas bactérias Anammox para a
oxidação de amônio (KUMAR e LIN, 2010) .
Deve ficar claro que não são todos os tipos de n1aterial orgânico que podem ser
utilizados no processo no qual bactérias Anammox e desnitrificantes coexistem.
Conforme reportado por Güven et alii (2005), a atividade Anammox é completa
e irreversivelmente inibida por metanol e etanol. Esse aspecto deve ser levado em
consideração, especialmente e1n virtude de o 1netanol ser comumente utilizado
para ren1over nitrato, particularmente em sistemas de pós-desnit rificação. A ini-
bição por metanol é possivelmente ocasionada pela formação de formaldeído pela
enzima hidroxilamina oxidorredutase (PAREDES et alii, 2007) .
Em contrapartida, algumas fontes de carbono não apresentam efeito inibitó-
rio à atividade Anammox. Pelo contrário, elas podem ser utilizadas pelas bactérias
Anammox. Como mencionado no item 2.1.2 durante a apresentação dos diferen-
tes tipos de metabolismos Anammox, alguns gêneros de bactérias Anammox são
capazes de oxidar acetato e propionato .
Estudos envolvendo a adaptação das bactérias Anammox a águas residuá-
rias contendo componentes tóxicos também estão descritos na literatura. Toh
e Ashbolt (2002) e Toh et alii (2002) observaram aclimatação dos organismos
Anammox à água residuária sintética de forno de coque, a qual continha não ape-
nas alta concentração de orgânicos (2 000-2 SOO mgDQO/L), n1as também alguns
compostos químicos como fenol (300-800 mg/L), cianetos (10-90 mg/L) e tiocia-
netos (300-500 mg/L) . A tentativa inicial de enriquecer as bactérias Anammox
falhou, embora a adição gradativa de fenol de 50 a SOO mg/L permitisse a aclima-

tação desses organismos.
Temperatura e pH
A faixa de pH considerada ideal se situa entre 6, 7 e 8 ,3, com valor ótimo de

8,0 (STROUS et alii, 1999b). A temperatura ideal para as bactérias Anammox
se encontra na faixa de 30-40ºC (STROUS et alii, 1999b; EGLI et alii, 2001 ).
Experimentos realizados por DOSTA et alii (2008) para avaliar o efeito de curto
prazo da temperatura na atividade Anammox mostraram que a máxima ativida-
de da biomassa Anammox não adaptada foi obtida entre 35 e 40ºC, enquanto a
ten1peratura de 4Sº C causou um decréscin10 irreversível na atividade Anammox
devido à lise das células. Pequenas diferenças na temperatura ótima foram encon-
tradas para J(. stuttgartiensis (40ºC) e B. Anammoxidans (3 7ºC) (STROUS et alii,
1999b; EGLI et alii, 2001 ).
Apesar de as temperaturas ótimas para o processo Anammox serem relati-
vamente elevadas, Cerna et alii (2007) e Isak.a et alii (2006) conseguiram ope-
rar o processo Anammox em um contactar biológico rotativo e em um biofiltro
anaeróbio, respectiva1nente, sob te1nperaturas de 20ºC. A adaptação gradual da
bion1assa parece ser o fator-chave para se conseguir operar o processo Anammox
em temperaturas menores que as consideradas ideais para o processo, sendo que
mudanças drásticas nas condições operacionais podem levar à desestabilização do
sistema biológico (SZATKOWSKA e PLAZA, 2006).
Para a partida de um sistema Anammox em baixas temperaturas, uma es-
tratégia é p roduzir a quantidade de biomassa desejada em um reator separado,
o qual deve ser operado em temperaturas próximas àquelas consideradas ideais.
Posteriormente, a biomassa pode ser gradualmente adaptada a baixas tempera-
turas no mesmo reator e finalmente a biomassa adaptada pode ser inoculada ao
reator mantido sob baixas tempe raturas (DOSTA et alii, 2008).
Algu1nas pesquisas realizadas com amostras de bacté rias Anammox prove-
nientes de sedimentos reportaram atividade Anammox en1 baixas temperaturas,
sugerindo que os fatores ambientais locais influenciam as características dessas
bactérias. Rysgaard et alii (2004) encontraram atividade Anan1mox em sedimen-
tos árticos entre -1 ,3 e 30ºC, sendo a tempe ratura ótima equivalente a 12ºC.
Resultados semelhantes foram obtidos por Dalsgaard e Thamdrup (2002), os
quais observaram a temperatura ótima de 1SºC para sedimentos marinhos do
Mar Báltico.
Vale mencionar que, ao contrário das bactérias Anan11nox em siste1nas de
tratamento de águas residuárias, os micro-organismos Anammox de ambientes
marinhos dependem de outro processo para a obtenção do nitrito requerido. Em
a1nbientes marinhos, nitrato é muito mais abundante que nitrito, fazendo com
que o processo Anammox necessite de uma etapa adicional para a redução do ni-
t rato a nitrito. Devido ao fato de a concentração de oxigênio dissolvido diminuir
progressiva1nente ao longo do sedimento, nas camadas n1ais p rofundas redutores
de nitrato podem ocasionar o acúmulo de nitrito, permitindo a ocorrência do pro-
cesso Anammox (DALSGAARD et alii, 2005).
Embora as propriedades físicas do lodo e as populações bacterianas possam
permanece r invariáveis du rante a operação do reator em tempe raturas mais baixas,
a taxa de conversão de nitrogênio é substancialmente din1inuída. Esse problema
pode ser minimizado de acordo com a estratégia descrita por Isaka et alii (2006),
os quais conseguiram atingir alta taxa de conve rsão de nitrogênio (8, 1 kgN/m3 • d)
por meio da redução do tempo de retenção hidráulica (TRH) e por meio da adição
de concentrações apropriadas e não inibitórias de nitrito no afluente .
Concentração de biomassa
A atividade Anammox é altamente influenciada pela concentração de bio-

massa. De acordo com Strous et alii (19996), as bactérias Anammox são ativas
somente quando as concentrações de células são maiores que 10 1º-10 11 células/mL,
mesmo quando em culturas altamente enriquecidas. Talvez a presença de células
containinantes, 1 em 200-500, é necessária para sustentar o crescimento, uma
vez que essas células poden1 garantir o suprimento de vitaininas e a remoção de
componentes tóxicos (KUENEN e JETTEN, 2001) .
Pynaert et alii (2004) descreveram a hipótese de que a presença de bactérias
oxidadoras de amônia é necessária para a reativação dos organismos Anainmox
após o sistema biológico ter sofrido algumas perturbações. Pela produção ou acú-
mulo de hidroxilamina ou hidrazina pelas bactérias responsáveis pela oxidação
de amônia, as bactérias Anammox podem reativar seu metabolismo. Assim que o
processo é reestabelecido, a tendência é de que as bactérias oxidadoras de amônio
não participem do processo Anammox. Essa suposição tan1bém foi descrita por
Strous (2000) devido ao fato de a adição dos intermediários hidroxilainina ou
hidrazina ter sido necessária para reiniciar o processo Anainmox após inibição.
Sólidos em suspensão
Produtos floculantes são geral mente utilizados para remover substâncias

coloidais orgânicas e inorgânicas de águas residuárias previamente ao processo
Anainmox. O efeito desses floculantes no processo Anammox foi alvo de estudo
realizado por Dapena-Mo ra et alii (2007). Concentrações de até 1 g/L de um
co1nposto polimérico positivan1ente carregado usado como floculai1te não ap resen-
tarain efeito negativo na atividade Anammox.
No estudo realizado por Yamamoto et alii (2008), uma grande quantidade de

sólidos em suspensão afluente p resente no líquido digerido parcialmente nitrifica-
do se juntou com o material que cobria a biomassa Ana1n1nox, a qual crescia em
um n1aterial-suporte . Como consequência, a atividade Anammox foi diminuída
e o desempenho do processo foi altamente prejudicado. O uso de um floculante
melhorou a sedimentabilidade dos sólidos em suspensão do afluente e reduziu o
seu acúmulo no interior do reator. Em contrapartida, o floculante por sua vez
também ficou retido na superfície do material-suporte, ocasionando a redução da
atividade Anammox.
A precipitação de sais também pode levar a uma operação instável de reato res
Anammox. Trigo et alii (2006) operaram um reator Anammox com membranas,
as quais funcionavam como uma barreira para reter os sais inorgânicos que se pre-
cipitavam e acumulavam na biomassa. Para se ter uma ideia, a precipitação desses
sais na superfície da bio1nassa ocasionou a diminuição da remoção de nitrogênio
de 100 para 1O mg/(L · dia).
Luz evelocidade de agitação
E studo realizado po r Van de Graaf et alii (1996) indicou que as bactérias

Anammox são sensíveis à luz visível. Esses autores observaram un1 decréscimo
na atividade Anammox de 30 - 50%. Os resultados influenciaram as condições
operacionais, fazendo com que os reatores fossem cobertos para evitar o efeito da
luz. O efeito da tensão de cisalhamento no processo Anammox foi avaliado por
Arrojo et alii (2006) . Nessa pesquisa constatou-se que velocidades de agitação até
180 rpm não ocasionaram efeito negativo no desempenho do processo Anammox.
Entretanto, quando a velocidade de agitação foi aun1entada para 250 rpm, a
atividade Anammox e o diâmetro médio foram reduzidos para 40 e 45%, respec-
tivamente. Adicionalmente, acúmulo de nitrito foi observado nessas condições.
5.2.2. 4 Apl icação do pr acesso Anam mox
O processo Anamn1ox oferece diversas vantagens para a remoção de amônio

de águas residuárias. De forma convencional, amônio é removido por meio do
processo de nitrificação (oxidado a nitrato), seguido por desnitrificação. O proces-
so Anammox sempre deve se r co1nbinado com u1n processo de nitritação parcial
(processo SHARON, por exemplo), no qual metade do amônio é oxidado a nitrito
(e não a nitrato) . O nitrito produzido reage com o amônio remanescente para for-
mar gás nitrogênio. As principais vantagens do processo autotrófico combinado
de nitritação parcial + Anammox que certa1nente au1nenta1n a sustentabilidade
do tratamento são:
CAPÍTULO 5 ◊ NOVOS PROCESSOS DE REMOÇÃO BIOLÓGICA DE NITROGÊNIO 19 7
• Menor requerimento energético tendo em vista os menores custos de

aeraçao.
• Não necessidade de fonte de carbono orgânico (oxidante externo), o que
acarreta menor produção de lodo com consequente redução dos custos de
disposição do lodo.
• Ausência de emissão de CO2 devido à natu reza autotrófica dos processos
de nit ritação e Anamn1ox (CO2 é consumido e não p roduzido).
O processo Anammox é especialmente apropriado para o tratamento de águas

residuárias contendo altas concentrações de amônio, embora con1 baixo teo r de
orgânicos. Tendo em vista que as bactérias Anammox são caracterizadas pela sua
interação com outras bactérias, uma vez que necessitan1 de nitrito gerado por ou-
t ro grupo microbiano, duas principais configurações de reatores são possíveis para
a remoção de amônio por meio do processo Anammox:
1) Sistema contendo dois reatores (figura 5 .8a) nos quais parte do amônio
é primeiramente oxidada a nitrito (nitritação parcial) no reator manti-
do sob aeração, sendo a mistura amônio/nitrito direcionada ao processo
Anam1nox que ocorre em u1n segundo reator mantido em condições anóxi-
cas (VAN DONGEN et alii, 2001b). O processo de nitritação parcial pode
ser conseguido em um sistema SHARON (Single R eactor High Activity
Ammonia R emoval Over Nitrite), o qual será detalhado em seguida.
2) Configuração contendo apenas um reator (figura 5 .8b) no qual a nit rita-
ção parcial e o processo Anammox ocorrem no mesmo reator, mantido sob
aeração. Nessa configuração, em particular, a nitrificação ocorre na região
aeróbia do floco ou grânulo, enquanto a reação Anan1n1ox ocorre na zona
mais profunda do biofilme, mantida em condições anóxicas (HIPPEN et
alii, 1997; KUAI e VERSTRAETE, 1998). A alternância de períodos
aeróbios (aeração ligada) e anóxicos (aeração desligada) é outro método
para se atingir as reações de nitritação e Anammox e1n u1n único reator.
Presentemente, o processo Anammox é empregado em ambas as configura-

ções para a remoção de amônio de efluentes de digesto res de lodo, lixiviados e
diversas águas residuárias industriais. Além da aplicação do processo Anammox
para a remoção de an1ônio, a ren1oção combinada de amônio e nitrato tambén1 já
foi empregada em escala laboratorial (KALYUZHNYI et alii, 2006; PATHAK et
alii, 2007). Nesse processo, desnitrificação parcial (redução de nitrato a nitrito)
é acoplada ao processo Anammox. Caso os doadores de elétrons para a desnitrifi-
cação consistam em ácidos graxos, as bactérias Anammox são capazes de realizar
essa redução (GÜVEN et alii, 2005) . A seguir serão detalhados os dois sistemas
(dois reato res ou reator único) destinados à desnitritação parcial e Anam1nox, com
ênfase para os diversos tipos de reatores utilizados e para a implementação prática

desses sistemas.
Nitritação
0,45 NH;
- - 0 , 1 N03
O, 55 NO-2
Anóxico
(a) Processo de nitritação parcial+ Anammox em reatores separados (dois estágios);
Nitrição + Anammox
(b) Processo de nitritação parcial + Anammox no mesmo reator (um estágio).
FIGURA 5.8 Remoção de amônio por meio do processo Anammox realizada em duas configurações
de reatores: (a) configuração de dois reatores, nitritação ocorre no primeiro reator (aerado) e o
processo Anammox ocorre no segundo reator (anóxico); (b) ambos processos ocorrem no mesmo
reator aerado (adaptado de VAN DONGEN et alii, 2001 b).
Nitritaçãoparcial eAnammox emdois reatores separados (dois estágios)
O processo combinado de nitritação parcial e Anam1nox em dois reatores

separados utiliza as vantagens do primeiro processo de realizar a conversão de
metade do amônio somente até nitrito (e não até nitrato), fornecendo ao processo
Anammox os substratos necessários (amônio e nitrito) em proporções adequadas
para a geração de nitrogênio gasoso.
O desafio durante a operação do primeiro reator é justamente a obtenção de
um efluente, cuja razão amônio/nitrito seja similar à razão estequiométrica de
1 :1,32, proposta por Strous et alii (1998) para representar a reação Anammox.
Na prática, entretanto, essa razão deve ser próxiina de 1: 1 para prevenir inibição
por nitrito e fornecer excesso de amônio. Simplesmente pelo fato de não necessi-
tar composto orgânico e de dispensar períodos anóxicos, um reator de nitritação
parcial pode fornecer a mistura amônio/nitrito desejada, sem a necessidade de
controle de realimentação. Uma das razões que torna essa conversão possível é
que, depois de 50% do amônio ser oxidado, o decréscimo no pH impede a oxidação
do runônio residual.
Por meio da limitação do fornecimento de oxigênio em reator nitrificante
com retenção de lodo, o mesmo resultado pode ser obtido, embora o controle de
realimentação possa ser necessário (STROUS et alii, 1997). É importante que o
afluente do reator Anammox tenha uma composição constante, tendo e1n vista
a toxicidade do nitrito, independentemente da estratégia utilizada para obter as
proporções adequadas de amônia e nitrito no primeiro reator (nitritação parcial) .
A aplicação da configuração com dois reato res é especialmente apropriada
quando compostos orgânicos biodegradáveis e compostos tóxicos estejam presen-
tes, uma vez que esses são degradados na etapa prévia de nitritação parcial, im-
pedindo a sua entrada no reator Anrunmox (VÁZQUEZ-PADÍN et alii, 2009;
LACKNER et alii, 2008).
Conforme já 1nencionado, a remoção de nitrogênio baseada na nitritação par-
cial com o processo Anammox apresenta muitas vantagens. Além de não necessi-
tar da adição externa de carbono, gera pouca quantidade de lodo e requer menos
oxigênio que o processo convencional (40% menos), o que implica em economia
de energia (AHN, 2006). Além disso, a operação de um sistema contendo dois
reatores separados (um para nitritação parcial e outro para o processo Anammox)
é mais flexível em comparação com a configuração na qual ambos os processos
ocorrem em um único reator. Adicionalmente, pelo fato dos dois processos ocorre-
rem em diferentes unidades, o desempenho do processo é mais estável (WYFFELS
et alii, 2004).
Nitritaçãoparcial
Nesse item são apresentados primeiramente os fatores que afetam o processo

de nitrificação, sendo que alguns deles ou a sua combinação consistem na base
para o desenvolvimento de tecnologias de nitritação parcial. E1n seguida, diversas
pesquisas sobre esse assunto serão mencionadas.
Na prática, todos os fatores utilizados para se conseguir a nitritação parcial
estão relacionados à inibição ou limitação da segunda etapa da nitrificação (nitra-
tação ou formação de nitrato). O ponto crucial para controlar a nitrificação parcial
é obter um reator nitrificru1te com acúmulo estável de nitrito. Para forçar os pro-
cessos biológicos a seguir a rota do nitrito, diversas estratégias foram utilizadas
(BERNET et alii, 2005), as quais incluem: controle de temperatura, tempo de
retenção hidráulica, pH, oxigênio dissolvido e presença de amônia livre. A tabe-
la 5.3 apresenta como esses fatores influenciam o crescimento e a atividade dos
micro-organismos responsáveis pela nitrificação.
TABELA 5.3 Efeito de alguns fatores (temperatura, pH, amônia livre, ácido nitroso) no
crescimento e na atividade das bactérias nitrificantes
Fator Efeito Referência
Temperatura
T > 15ºC Bactérias oxidadoras de amônio crescem van Dongen et atii (2001a),
mais rapidamente que bactérias oxidadoras Brouwer et alii ( 1996)
de nitrito
T = 25ºC Bactérias oxidadoras de amônio se tornam van Dongen et alii (2001),

dominantes Brouwer et alii ( 1996)
pH
7,0-8,0 Faixa ótima para a nitrificação Antoniou et atii ( 1990);
Painter e Loveless (1983)
7,9-8,2 Faixa ótima para os oxidadores de amônio Alleman (1984)

7,2-7,6 Faixa ótima para os oxidadores de nitrito Alleman (1984)
Amônia livre
150 mg/L Inibição das bactérias oxidadoras de amônio Anthonisen et alii (1976) ;
e oxidadoras de nitrito
1-7 mg/L Inibição das bactérias oxidadoras de amônio Anthonisen et alii (1976),
e acúmulo de nitrito Abeling e Seyfried (1992);
Kim et alii (2003)
Ácido nitroso Inibição das bactérias oxidadoras de amônio Anthonisen et alii (1976)
> 2,8 mg/L e oxidadoras de nitrito
Uma das possíveis maneiras de se atingir a nitrificação parcial é justamente

baseada na diferença da energia de ativação apresentada pela oxidação de amônia
(68 kJ/mol) e de nitrito (44 kJ/n1ol). A alta energia de ativação apresentada pela
reação de oxidação da amônia torna a velocidade desse processo mais dependente
da temperatura em comparação com a reação de oxidação do nitrito. Somente em
temperaturas acima de 25°C é possível que as bactérias oxidadoras de amônia
se torne1n dominantes em detriinento das bactérias oxidadoras de nitrito (VAN
DONGEN et alii, 2001a; BROUWER et alii, 1996). Caso essa condição seja
combinada com baixo tempo de retenção hidráulica e baixo t empo de retenção
celular, as bactérias que oxidam nitrito podem ser seletivamente arrastadas do
sistema (HELLINGA et alii, 1998).
O pH apresenta grande influência no sistema devido ao fato de, em baixos
valores desse parâmetro, as bactérias oxidadoras de nitrito crescerem mais rapida-
n1ente que as bactérias oxidadoras de amônio. Sendo assin1, os tempos de retenção
hidráulica (ou taxa de diluição) requeridos para manter as oxidadoras de amônio e

arrastar as oxidadoras de nitrito são mais flexíveis em valores de pH mais elevados
(HELLINGA et ai,ii, 1998).
Em relação às faixas de pH consideradas ideais para a nitrificação, alguns efei-
tos principais desse parâmetro sobre as bactérias nitrificantes foram identificados:
ativação/desativação das bactérias nitrificantes; efeitos nutricionais associados com
a alcalinidade e espécies de carbono inorgânico e inibição por amônio e ácido nitroso
(VILLAVERDE et alii, 1997). A ativação/desativação das bactérias nitrificantes
está relacionada à ligação de íons H+ ou OH- a grupos de enzima, bloqueando os sí-
t ios ativos de modo reversível (QUINLAN, 1984). Efeitos nutricionais estão prin-
cipalmente associados com a disponibilidade de carbono inorgânico, essencial aos
micro-organismos autotróficos nitrificru1tes. Em baixos valores de pH, predominam
as espécies de CO2 que podem se r facilmente removidas da água por meio de strip-
ping. Por outro lado, em valores elevados de pH, carbono inorgânico está presente
majoritariamente sob a forma carbonato, o qual é raramente assimilado.
A presença de amônia livre e ácido nitroso está intrinsecamente ligada ao
valor do pH do meio. O pH afeta a concentração de substrato em ambas as etapas
da nitrificação, face à modificação do equilíbrio ácido-base. Elevando-se o pH, por
exemplo, maiores concentrações de amônia livre estarão presentes no meio, o que
pode acarretar em efeito inibitório tanto para as bactérias oxidadoras de amônia
quanto para as bactérias oxidadoras de nitrito. A diminuição do pH, no entanto,
favorece a presença de ácido nitroso. Tanto a an1ônia livre quanto o ácido nitroso
podem exercer inibição aos micro-organismos oxidadores de amônio e oxidadores
de nitrito, embora esses últimos sejam mais sensíveis que os primeiros, especial-
mente à presença de amônia livre.
Outra estratégia para tentar evitar o desenvolvimento das bactérias oxida-
doras de nitrito e propiciar o acúmulo de nitrito é din1inuir a concentração de
oxigênio dissolvido do meio. Esse procedimento é baseado no fato de as bactérias
oxidadoras de nitrito serem mais sensíveis a baixas concentrações de oxigênio
dissolvido no meio em comparação com as bactérias que oxidam amônio, apresen-
tando menor afinidade pelo oxigênio. A oxidação de amônio e a oxidação de nitrito
apresentam coeficientes de saturação de oxigênio (cinética de Monod) de 0,3 e
1, 1 mg/L, respectivamente (WEISMANN, 1994).
Um possível mecanismo para a inibição da oxidação de nitrito por baixas
concentrações de oxigênio é baseado no acúmulo de hidroxilamina, produto in-
termediário da oxidação de amônio. Em geral, as bactérias oxidadoras de amônio
obtêm energia por meio da oxidação de amônio a nitrito em uma reação de duas
etapas, tendo a hidroxilamina (NH 2 OH) como intermediário. A primeira etapa é
a oxidação de an1ônio, catalisada pela enzima amônia mono-oxigenase, enquanto
a segunda etapa é a oxidação de hidroxilamina, catalisada pela enzin1a hidroxila-
mina oxidorredutase. Em baixas concentrações de oxigênio e altas concentrações
de amônio, pode ocorrer o acúmulo de hidroxilamina, a qual pode inibir os micro-

-organismos oxidadores de nitrito a partir de concentrações de 250 µM . Quando
em concentrações acüna de 2 000 µ M, podem també1n causar inibição às bacté-
rias oxidadoras de amônio. As equações S .11 - S .13 representam o acúmulo de
hidroxilamina em condições nas quais há limitação de oxigênio (YANG, 1990).
Dessas equações observa-se que os quatro elétrons ge rados a partir da oxida-
ção da hidroxilamina podem ser transferidos para a oxidação de amônia quando
a redução de oxigênio terminal for interrompida, devido à deficiência de oxigênio
no intuito de balancear o número de elétrons dessa reação redox (YANG, 1990).
No estudo desenvolvido por HU (1990), a hidroxilamina causou severa inibição
a Nitrobacter, sugerindo a possibilidade de acúmulo de nitrito em sistemas n itri-
ficantes. No entanto, a hidroxilamina é praticamente ignorada em processos de
nitrificação, visto que sua concentração é considerada insignificante.
Yang e Allen1an (1992) estudaram a possibilidade de acú1nulo de hidroxila-
mina e a sua relação com acúmulo de nitrito e1n um sistema em batelada contendo
uma cultura enriquecida em nitrificantes. Os resultados obtidos por esses autores
indicaram que a quantidade de nitrito acumulada aumentou com a elevação do
pH, e, dessa forma, aumentou em relação di reta à concentração de hidroxilamina
não ionizada. A hidroxilamina foi considerada a principal causa de acúmulo de
nitrito no sistema nitrificante mantido sob baixas concentrações de oxigênio dis-
solvido e pH elevado.
(5 .11)
(5 .1 2)
equação global :
2NH3 + 202 ~ HNO2 + H 2 O (5 .1 3)
Diversos estudos visando obter a nitrificação por meio do controle do oxigê-

nio dissolvido foram realizados, tanto em sistemas com biomassa em suspensão
quanto em sistemas em biofilme (tabela S .4). No caso dos sistemas com bio1nassa
em suspensão operados sob condições de limitação de oxigênio, conversão comple-
ta e estável de amônio em nitrito foi obtida, independentemente da idade do lodo.
Entretanto, a idade do lodo se tornou um parâmetro crítico para a obtenção da
nitrificação parcial quando a operação não foi realizada en1 limitação de oxigênio.
Yang e Allemann (1992) concluíram que a combinação de parâmetros, tais como
concentração de amônia livre, oxigênio dissolvido e hidroxilamina, consistiam nos
principais fatores para o acúmulo de nitrito em um sistema batelada contendo
uma cultu ra en riquecida e1n nitrificantes.
Como apontado na tabela 5 .4, os resultados obtidos em sistemas com biofil-

me são semelhantes aos obtidos em reatores com biomassa suspensa. Em geral,
baixas concentrações de oxigênio levam ao acúmulo de nitrito. Entretanto, em
sistemas com biofilme as bactérias oxidadoras de nitrito poden1 ser ainda mais
prejudicadas devido à própria estratificação do biofilme. Em geral, as bactérias
oxidadoras de amônia se localizam em regiões mais externas do biofilme, enquanto
as bactérias que oxidam nitrito se encontram em uma ca1nada mais interna (KIM
et alii, 2003) . Tal distribuição espacial faz com que os organismos oxidadores de
nitrito fiquem mais expostos a condições de limitação de oxigênio em comparação
com os oxidadores de amônia.
Os principais reatores utilizados até o presente momento para a obtenção de
nitritação parcial são os reatores contínuos perfeitamente agitados (CSTR), bior-
reatores com membranas (MBR) e reatores e1n batelada sequencial (RBS). Nos
MBR e SBR pode1n ser obtidos elevados tempos de retenção celular (50 - 75 dias)
(ST ROUS et alii, 1997). Nos siste1nas MBR e en1 outros sistemas con1 biofilme,
o tempo de retenção celular é difícil de ser manipulado, ao contrário dos reatores
no qual a biomassa cresce em suspensão. Dessa forma, torna-se difícil provocar o
arraste das bactérias oxidadoras de nitrito mesmo sob condições de limitação de
oxigênio (XUE et alii, 2009) e a produção de nitrito sem acúmulo de nitrato pode
não ser atingida (FUX et alii, 2004).
Algumas vezes, mesmo aplicando-se critérios de seleção das bactérias oxi-
dadoras de amônia em detrin1ento das bactérias oxidadoras de nitrito, tais con10
alta concentração de amônia livre, baixa concentração de oxigênio e alta carga de
amônia, a supressão dessas últimas bactérias fica dificultada. Desta maneira, fica
claro que configurações de reatores, tais como CSRT e RBS com biomassa em
suspensão são recomendados, especialn1ente quando se trata de escalas reais. Nos
reatores operados de forma contínua (CSRT, por exemplo), geralmente o critério
de seleção das bactérias que oxidam amônia é o tempo de retenção hidráulica. Já
nos reatores operados em bateladas (RBS, por exemplo), a idade do lodo é fator
que controla quais as populações microbianas que serão dominantes.
A possibilidade de se obter um e.fluente do processo de nitritação parcial ide-
al para o subsequente reator Anammox foi inicialmente testada por Van Dongen
et alii (2001a), processo conhecido por SHARON (Single R eactor High Activity
Ammonia Removal Over Nitrite).
TABELA 5.4 Efeito da concentração de oxigênio dissolvido no processo de nitrificação

Oxigênio
Sistema dissolvido Efeito Referência
(mg/L)
Lodos ativados < 0,5 Acúmulo de amônio e nitrito Ciudad et alii
0,7 (2005)
Acúmulo de nitrito em torno de
67% do amônio alimentado
1,0 80% oxidação de amônio, sendo
80% acumulados como nitrito
Lodos ativados < 0,5 Acúmulo de amônio e nitrito Ruiz et a/ii (2003)
1,7 Nitrificação completa
Crescimento em 0,5 Acúmulo de nitrito Hanaki et alii

suspensão 6 Nitrificação completa (1990)
Reator air-lift 1,0 Operação estável com 100% de Kim et alii (2003)
acúmulo de nitri to
Pequena conversão de amônio

Reator air-lift < 1,0 Garrido et alii
e pequeno acúmulo de nitrito e
(1997)
nitrato
1,5 Conversão de 50% do amônio em
nitrito
> 2,5 Nitrificação completa, oxidação
de amônio dependendo da carga
aplicada
Reator com biofilme 0,5 Acúmulo estável de nitrito (90%) e Bernet et alii
100% de remoção de amônio (2001)
> 0,5 Acúmulo de nitrato no efluente;
diminuição da 0D propicia
novamente acúmulo de nitrito
Filtro biológico 2,0 - 5,0 Acúmulo de nitrito de até 60% da Joo et alii (2000)
aerado conversão de amônio
Reator de leito 3,0 Conversão de 50% do amônio em Fux et alii (2004)

móvel com biofilme nitrito. Nitrificação completa após
11 meses de operação
Embora não seja adequado para o tratamento de todos os tipos de águas resi-
duárias, devido à alta dependência com a temperatura, este processo é ideal para
a ren1oção de nitrogênio de efluentes con1 alta concentração an1oniacal (efluente
de digestores de lodo, lixiviados de aterros sanitários, água residuária de processos
de compostagem e condensados do processo de secagem do lodo), os quais iriam
consumir quantidades enormes de oxigênio dissolvido para realizar o processo
convencional de nitrificação (AHN, 2006).
Muitas vezes, o processo SHARON pode funcionar como um pré-tratamento,
aplicado para reduzir substancialmente a concentração de amónio, possibilitando
com isso a introdução de um sistema convencional posterior para o polimento
final da água residuária em questão (HELLINGA et alii, 1998; MULDER e
KEMPEN, 1997). Nesse caso, a aplicação do sistema SHARON, como um pro-
cesso side-stream, isto é, separado do processo principal, pode ser avaliado em
termos de carga removida e não em tern1os de qualidade de efluente, uma vez que
o efluente do reator SHARON será descartado posteriormente na planta principal
de tratamento (VAN LOOSDRECHT, 2008).
O processo SHARON faz uso das diferentes velocidades de crescimento das
bactérias oxidadoras de amônia e das oxidadoras de nitrito e1n temperaturas sufi-
cientemente altas (maiores que 26ºC). Sendo assim, está ligado à seleção de bac-
térias oxidadoras de amónio (a partir de um inóculo proveniente de um sistema
no qual ocorre a nitrificação) em reato r contínuo operado com altas vazões espe-
cíficas de alimentação. Essas condições de processo são desfavoráveis às bactérias
responsáveis pela oxidação do nitrito, podendo provocar o seu arraste (SCHMIDT
et alii, 2003; MULDER e KEMPEN, 1997).
Na proposta original, imaginou-se operar o sistema utilizando aeração inter-
mitente, intercalando períodos nos quais o reator é aerado, provocando a redução
do pH com a geração de nitrito (nitritação), e períodos sem aeração, propiciando
condições anóxicas com adição de fonte externa de carbono e levando o nitrito a
N 2 (desnitritação), com consequente aumento do pH e produção de alcalinidade,
compensando o efeito acidificante da nitrificação. Desse modo, os períodos aera-
dos e anóxicos eram definidos em função dos valores limites de pH estipulados a
priori. As reações envolvidas poderiam se r representadas segundo as equações 5 .4
e 5 .5.
A alcalinidade é um importante fator no processo SHARON, uma vez que,
dependendo do valor desse parâmetro, um reator SHARON pode converter uma
fração ou ainda toda carga de amónio em nitrito. Caso o objetivo seja a aplicação
de um processo Anammox subsequente para a remoção de nitrogênio, uma razão
molar amônio:nitrito de 1 :1 deve ser atingida. Essa razão pode ser atingida por
meio do controle da alcalinidade da água residuária. Em virtude da oxidação de
1 mol de amônia a nitrito consumir 2 moles de bicarbonato e, tendo em vista de
que esse processo praticamente é interro1npido e1n valores de pH abaixo de 6,5,
uma razão molar amônio:bicarbonato de 1 :1 converte aproximadamente 50% do

amônio em nitrito, sendo que o restante permanece sob a forma de amônio . Essa
estratégia não se aplica no caso de ser aplicado o p rocesso de desnitritação ao invés
do processo Anammox.
Nessa situação, em particular, se faz necessária a completa oxidação de ni-
trito ou ainda uma etapa anaeróbia intermitente com suspensão da aeração e for-
necin1ento de carbono orgânico para a redução de n itrito a nitrogênio gasoso no
próprio reator SHARON. Em outras palavras, a alcal inidade é crucial para o caso
da aplicação de um reator SHARON seguido de um reator Anammox, embora não
tenha muita importância no caso em que o sistema SHARON é combinado com o
processo de desnitrificação via nitrito (desnitritação), no qual alcalinidade é pro-
duzida (VAN DONGEN et alii, 2001a; HELLINGA et alii , 1998).
O processo SHARON é operado com velocidades espaciais (1/HRT) maiores
que a velocidade de cresciinento dos oxidadores de nitrito, embo ra 1nenores que a
dos oxidadores de amônio. Geralmente, a nitritação é realizada sem retenção de
lodo, en1 tempo de retenção hidráulica (TRH) de 1 dia, temperatura que varia na
faixa de 30 a 40°C e valores de pH entre 6 ,6 e 7. Sob essas condições, o processo
de nitrificação é estável, tendo o nitrito co1no produto final (AHN , 2006) .
Em virtude de este processo ser conduzido, principaln1ente em sistemas con-
tínuos e por consequência ser desprovido de retenção de lodo (tempo de retenção
hidráulico = tempo de retenção celular), a taxa de diluição (vazão específica de
al imentação) deve ser determinada de forma que os micro-organismos oxidadores
de amônio sejam capazes de crescer suficientemente para permanecer no reator,
enquanto as bactérias que oxidam nitrito são arrastadas do mesmo.
O processo SHARON também pode ser operado com retenção de lodo. Nesse
caso, o tempo de aeração será o fator limitante para o projeto do reator devido à
maior quantidade de oxigênio necessária. O balanço econômico, levando em consi-
deração o volume do reator e os equipamentos para a retenção de lodo, é que deter-
mina a escolha apropriada para a aplicação do sistema SHARON com retenção de
lodo. Na prática, quando as concentrações de nitrogênio são acima de 0,4-0,5 gN/1,
um sistema sem retenção de biomassa é mais barato. Além disso, um sistema
desprovido de retenção de lodo requer menos manutenção. O lodo p roduzido no
reator SHARON sairá junto ao efluente, o que não constitui um problema uma
vez que o efluente desse processo será direcionado ao afluente da planta principal
de tratamento.
Como brevemente ressaltado, o processo SHARON não é adequado para to-
dos os tipos de águas residuá rias justamente por depender de temperaturas eleva-
das. Para o t ratamento de efluentes de digestores de lodo, o p rocesso SHARON
é ideal, uma vez que esses efluentes apresentam temperaturas que variain entre
20 e 35ºC, permitindo a operação do reator com reduzidos tempos de retenção
de lodo. A ausência de retenção de lodo e o tempo de residência hidráulico fixo,
características usuais do processo SHARON, fazem com que as cargas volumétri-

cas de amônio aplicadas dependam da concentração de amônio afluente . Sendo as-
sim, o custo do p rocesso tambén1 depende da concentração de an1ônio sub1netida
ao sistema, com aumento dos custos diretamente proporcional à diminuição desta
concentração. A composição do efluente do processo SHARON também depende
da taxa de crescimento das bactérias envolvidas, a qual, por sua vez, é dependente
da concentração afluente (VAN DONGE N et alii, 2001a).
A aeração é necessária não somente para o fornecimento de oxigênio, mas
também para o stripping do CO2 do reator e controle do pH. O nitrito pode ser
reduzido a nitrogênio gasoso po r meio da desnit ritação, utilizando compostos
orgânicos (metanol, por exemplo) como doadores de elétrons, adicionados perio-
dicamente enquanto a aeração está desligada (SCHMIDT et alii, 2003), ou então
por meio da aplicação do processo Anammox.
Van H ulle et alii (2005) descrevera1n a partida de u1n reator SHARON de
escala labo ratorial, operado a 3Sº C e desprovido de controle de pH. O efluente do
reator SHARON se mostrou adequado para ser alimentado ao processo Anammox
quando o afluente do processo consistia em água residuária sintética contendo
carga de a1nônio de 1,5 kgN/1n 3 .dia. Edert et alii (2003) descrevera1n um reator
SHARON con1 bom desempenho, alimentado com urina. O efluente do CSTR
operado por esses autores apresentou razão amônio/nitrito de 1 :1 quando o tempo
de retenção hidráulica foi de 4 ,8 dias.
A tecnologia SHAR ON é atualmente utilizada com sucesso em escala real
para tratar efluentes de digestores de lodo . Reatores SH ARON em funcionamento
em larga escala podem ser encontrados em plantas de tratamento de águas resi-
duárias de Rotterdam e Utrecht (Holanda) (MULDER et alii, 2001) . No total,
seis plantas foram implantadas e estão em operação na Holanda e outra está em
construção e1n Nova Iorque (EUA) . A carga nitrogenada aplicada a essas plantas
varia entre 400 e 2 SOO kgN/d (VAN LOOSDRECHT e SALE M, 2005) . FUX
et alii (2002) operaram um reator CSRT de 2, 1 m 3 em Zurique, o qual foi sub-
metido a um TRH de 1, 1 dias, na temperatura de 30º C, sem controle de pH. O
reator foi alimentado com efluente de digestor de lodo de duas diferentes plantas
de tratamento, e foi possível a obtenção de razões amônio/nitrito de 1 :1 ,3 2 em
valores de pH entre 6,6 e 7,2 .
Embora aplicado com sucesso em escala real, há algumas desvantagens do
processo SHARON. O TRH dos digestores de lodo é elevado, o que garante com-
posição estável de seus efluentes para serem alimentados, posteriormente, ao
subsequente processo SHARON. O efluente dos digestores é caracterizado por
apresentar alta concentração de nitrogênio e por conter compostos orgânicos pou-
co biodegradáveis. Quando o TRH dos digestores for menor que o usual ou quando
águas residuárias industriais estão envolvidas, é provável que ocor ram flutuações
na composição de seus efluentes, que aliinenta1n o processo SH ARON. Dessa
maneira, alguns parâmetros de processo, tais como, oxigênio dissolvido e pH, de-
vem ser controlados no processo SHARON com o intuito de se obter a razão ideal
a1nônio/nitrito para o processo Ana1n1nox subsequente (VOLCKE et alii, 2006) .
Outra desvantagem do processo SHARON é o fato de a máxima capacidade
volumétrica ser limitada, uma vez que a biomassa é constantemente removida
do sistema. No intuito de assegurar condições estáveis, o TRH mínimo de um
quimiostato é limitado a 1 - 1,2 dias. Nos MBR, RBS e outros sistemas com
biofilme, a biomassa é retida mais facilmente, permitindo que o TRH seja inde-
pendente do tempo de retenção celular. Nesses sistemas, em particular, é possível
a apl icação de TRH n1enores que 1 dia, o que resulta em maiores capacidades
volumétricas (WYFFELS et alii, 2004) .
Como mencionado anteriormente, a temperatura é um parâmetro crucial
para o bom desempenho de um reator SHARON. Geralmente esse processo é
operado em temperaturas relativamente elevadas (acima de 26ºC), condições nas
quais as bactérias oxidadoras de amônia levam vantagem em relação às oxidado-
ras de nitrito. No entanto, quando o afluente do processo SHARON (geralmente
efluente de digestores de lodo) apresenta temperaturas abaixo de 24ºC, a taxa
máxima de crescimento dos organismos que oxidan1 amônia se torna menor do
que a dos que oxidam nitrito; em decorrência, o nitrito formado é convertido em
nitrato (FUX et alii, 2002) .
Levando-se em consideração que o uso da temperatura, como critério de se-
leção das populações 1nicrobianas do1ninantes, não é muito favorável e1n termos
econômicos e, tendo em vista a dificuldade de n1odificar e controlar esse parâ-
metro em reatores de escala industrial, outras estratégias são necessárias para
se atingir a nitritação parcial em temperaturas menores que 24º C. Entre elas se
pode mencionar a inibição das bactérias oxidadoras de nitrito por amônia livre
ou ácido nitroso, ou ainda, a manutenção do reator sob condições de limitação de
ox1gen10.
• A •
An1ônia livre e ácido nitroso consistem em dois potenciais inibidores do p ro-

cesso nitrificante, sendo as bactérias oxidadoras de nitrito mais atingidas, uma
vez que concentrações relativamente baixas são suficientes para ocasionar a sua
inibição. Abeling e Seyfried (1992) relataram que concentrações de 1-5 mef.L de
amônia livre são capazes de inibir a nitratação sem que ocorram danos à nitrita-
ção. A máxima velocidade específica de geração de nitrito e mínima geração de
nitrato foram obtidas para concentração de amônia livre de 5 mg/L, em condições
de pH e te1nperatura de 8,5 e 20 ºC, respectivamente.
Mauret et alii (1996) relataram que a inibição das bactérias oxidadoras de
nitrito pode ser atingida com concentrações de amônia livre compreendidas na
faixa de 6 ,6 a 8, 9 mgN/L. Balmelle et alii (1 992) afirmam que mesmo concen-
t rações de apenas 1 mgN/L de amônia livre são capazes de ocasionar inibição
da etapa de nitratação. GANI GUÉ et alii (2007) mostraran1 a possibilidade de
conseguir afluentes estáveis para o processo Anammox durante o tratamento de

lixiviado em um reator em batelada sequencial . Em baixos valores de pH, a ativi-
dade microbiana din1inuiu devido ao efeito inibitório ocasionado por ácido nitro-
so, em decorrência da falta de alcalinidade (bicarbonato). Valores elevados de pH
indicaram decréscimo da taxa de consumo de oxigênio em virtude da inibição por
amônia livre . Os autores concluíram que o pH é um importante fator a ser levado
em consideração para controle do processo de nitritação parcial .
Aplicando a nitritação parcial seguida do processo Anammox para o trata-
mento de efluente de digestor anaeróbio, Yamamoto et alii (2008) observaram
conversão estável de an1ônio a nitrito equivalente a 58%. Os autores atribuíram
este resultado à inibição ocasionada por amônia livre e ácido nitroso. Vale men-
cionar que a estratégia de controlar a ação das bactérias apenas pelo pH e pela
presença de amônia livre pode não atingir o sucesso almejado (RUIZ et alii, 2003;
SCHMIDELL e REGINATTO, 2005), uma vez que a concentração lin1ite de
a1nônia livre capaz de ocasionar inibição da etapa de oxidação de nitrito pode au-
mentar ao longo do tempo.
Há autores que afirmam a possibilidade de ocorrer adaptação das bactérias
oxidadoras de nitrito mesmo em altas concentrações de an1ônia livre. ~Tong-Chong
e Loehr (1978) observaram que culturas puras de Nitrobacter aclimatadas à amônia
livre foram capazes de tolerar até 40 mgNH3 -N/L, enquanto culturas não aclima-
tadas foram inibidas a partir de concentrações equivalentes a 3 ,5 1ngNH 3-N/L.
Outros estudos em sistemas com biofilmes ou com biomassa em suspensão mos-
traram que os organismos oxidadores de nitrito podem se adaptar a altas concen-
trações de amônia livre, verificando-se que, em determinado período (de seis a 12
meses), o acún1ulo de nitrito diminui e a concentração de nitrato aumenta (FUX
et alii, 2004; VILLAVERDE et alii, 2000).
No intuito de investigar o acúmulo de nitrito utilizando como estratégia a
manutenção de baixos níveis de oxigênio, Wyffels et alii (2003), operando um rea-
tor contínuo utilizando 1nembranas para o reciclo total de células, atingiran1 50%
de conversão de amônio em nitrito quando o sistema foi submetido à concentração
de oxigênio dissolvido de 0,1 mg'L, temperatura de 35ºC e pH 7,9.
Observou-se conversão integral de amônia a nitrito quando a concentração de
oxigênio foi de aproximadamente 0,25 mg/L, situação em que se atingiu em torno
de 800 n1gNO2 -N/L. Turk e Mavinic (198 7) verificaram que células aclimatadas
sob condições anóxicas foram capazes de propiciar longos períodos de acúmulo de
nitrito (até algumas horas), n1es1no quando colocadas em condições de aeração.
Os resultados obtidos por esses autores enfatizam a possibilidade de se intercalar
períodos de aeração com períodos sem aeração, obtendo-se o acúmulo de nitrito
desejado, sem que sejam geradas quantidades consideráveis de nitrato. Essa estra-
tégia, por sinal, dota-se de maior simplicidade em comparação com a utilização de
controles refinados da concentração de oxigênio visando à manutenção desta em
valores muito baixos. Além disso, o uso de aeração alternada para limitar a oxi-
dação de amônio somente até o nitrito tem favorecido principalmente a aplicação
de processos de remoção simultânea de amônio e nitrito, a exemplo do processo
Anammox e OLAND (MULDER et alii, 1995; KUAI e VERSTRAETE, 1998).
Ruiz et alii (2003) determinaram as melhores condições para a nitrificação
parcial, com acúmulo de nitrito, em uma água residuária sintética com alta con-
centração de amônia, objetivando a diminuição da quantidade total de oxigênio
requerida na etapa de nitrificação . Operando um reator de lodo ativado em escala
laboratorial, elegeram o pH e o OD como parâmetros operacionais para avaliar
a possibilidade de acúmulo de nitrito, sen1 afetar a remoção global de an1ônia.
Segundo os autores, o pH não foi um parâmetro ideal para propiciar o acúmulo de
nitrito, tendo em vista que, enquanto este parâmetro apresentou valores na faixa
de 6,45 a 8,95, nitrificação completa até nitrato ocorreu no sistema e, em valores
de pH abaixo de 6,45 e acima de 8,85, ocorreu con1pleta inibição do p rocesso
de nit rificação. De maneira diametral1nente oposta, mantendo-se a concentração
de OD no reator em 0,7 mg/L, foi possível acumular mais de 65% do nitrogênio
amoniacal na forma de nitrito com conversão de amônia de 98%. Já em concen-
trações de OD abaixo de 0,5 mg/L, houve acúmulo de amônia e, e1n concentrações
acima de 1, 7 mg/L, completa nitrificação até nitrato foi atingida (RUIZ et alii
2003) .
Wyffels et alii (2004) utilizaram um biorreator com membranas como pri-
meira etapa do processo de remoção autotrófica de nitrogênio, o qual foi sub-
metido a concentrações de oxigênio dissolvido inferiores a O, 1 1ng/L. O pH foi
mantido em 7, 9 e a temperatura em 35ºC. A diminuição da temperatura não
ocasionou efeito significativo na razão amônio/nitrito obtida. Adicionalmente, a
redução da concentração de NH3 (o que provavelmente deve ter contribuído para
diminuir o seu efeito inibitó rio aos oxidadores de nitrito), também não acarretou
a modificação da razão amônio/nitrito obtida. Esses resultados permitiram inferir
que a limitação de oxigênio é o principal fator operacional que determina a razão
amônio/ni trito.
De forma geral, as diferentes estratégias utilizadas nos trabalhos descritos an-
teriormente para conseguir obter a nitritação parcial desejada e produzir o afluen-
te ideal para o processo Anammox podem ser sumarizadas da seguinte maneira:
• Operação do reator em baixas concentrações de oxigênio dissolvido (me-
no r que 0,5 mg/L).
• Operação do reator e1n altos valores de pH (7,5-8,5), fazendo com que a
concentração de amônia livre aumente e a concentração de ácido nitroso
diminua.
• Operação do reator em alta temperatura (maior que 25ºC);
• Te1npo de nitrificação limitado, fazendo com que a oxidação de amônio
pare antes de sua conversão integral.
Anammox
A aplicação do processo Anan11nox ainda se encontra lin1itada, o que se deve

primordialmente aos longos tempos de partida do processo (de até um ano), tendo
em vista as baixíssimas velocidades de crescimento e o baixo rendimento celular
dos organismos Anammox. A perda frequente de bio1nassa junto ao efluente corro-
bora para aumentar os períodos de start-up dos reatores Anamn1ox. Por conseguin-
te, o uso de reatores com boa capacidade de retenção de biomassa é fundamental
para o sucesso elo processo. O cultivo de bactérias de crescimento lento é baseado
na habilidade da biomassa em formar biofilmes ou agregados, tais como flocos ou
grânulos (VAN DER STAR, 2008).
Até o presente momento, diversas configurações de reatores foram utilizadas
para o enriquecimento das bactérias Anammox. Entre elas encontram-se as de
reatores de leito fixo, reatores de leito fluidizado, reatores UASB, reatores em
batelada sequencial (RBS) e reatores air-lift (WYFFELS et alii, 2004; STROUS
et alii, 2002). Dentre esses, os RBS foram preferencialmente escolhidos por sua
simplicidade operacional, e por apresentarem eficiente retenção de biomassa, mis-
tura homogênea no interior do reator, estabilidade e confiabilidade para operações
durante longos períodos, estabilidade sob condições de limitação de substrato e
altas conversões de nitrogênio CTETTEN et alii, 1999; STROUS et alii, 1998).
Strous et alii (1997) iniciaram a operação do processo Anan1n1ox em um
reator de leito fixo e em un1 reator de leito fluidizado con1 partículas de vidro e de
areia funcionando como material-suporte. Os autores não conseguiram impedir a
perda de biomassa devido à flotação do lodo causada por bolhas de gás. A mesma
situação foi verificada por Dapena-Mora et alii (2004), e1n u1n reator air-lift.
Esses autores afirmaram que a agitação (mecânica em um RBS) pode ser mais
efetiva para eliminar o gás que penetra nos grânulos quando comparada com a do
reator air-lift.
No intuito de se obter retenção integral de biomassa em sistemas Anammox,
pode-se lançar mão de biorreatores com membranas (MBR). Ao contrário dos
reatores com biomassa granular, o MBR permite o cultivo de bactérias de cres-
cimento lento con1 ótima retenção de bio1nassa e não requer biomassa com boas
características de sedin1entação. Desse modo, consiste em boa opção para a obten-
ção de células de Anammox em suspensão. A figura 5.9 apresenta um reator com
membranas utilizado para o cultivo de células Anammox em suspensão (células
livre).
\i\Tang et alii (2009) utilizaram um agitador em un1 MBR no intuito de pro-
piciar a formação de células livres de Anammox, obtendo com isso distribuição de
substrato e bio1nassa mais homogênea. No entanto, para aplicações em escala real,
reatores com biofilme ou reatores de lodo granular são preferidos em detrimento
dos MBR uma vez que as bactérias Anammox facilmente formam grânulos ou
biofilmes, obtendo-se com isso alta concentração de biomassa, de modo simples

e econômico. Além disso, o entupimento (fouling) da membrana é uma das des-
vantagens dos siste1nas MBR. Os custos operacionais de limpeza da me1nbrana
(retrolavagem ou adição de produtos químicos) encarecem o processo (TRIGO et
alii, 2006). Outro ponto importante é o fato de as águas residuárias geralmente
conterem certa quantidade de sólidos, os quais também serão retidos na membra-
na. O acúmulo desse n1aterial também pode propiciar a diminuição da atividade
dos organismos Anammox em sistemas MBR (YAMAMOTO et alii, 2008).
FIGURA 5.9 Reator com membranas para o cultivo de bactérias Anammox em suspensão (células
livres).
Como mencionado, o período de partida dos sistemas Anammox é uma das

desvantagens do processo. Garantir condições nas quais o oxigênio está ausente é
essencial durante o período de start-up. Geral1nente esse período é caracterizado
por un1 aumento gradual da concentração de nitrito. Embora a razão ideal amô-
nia/nitrito seja a próxima de 1 :1, geralmente um excesso de amônia é utilizado,
acarretando menor eficiência global de remoção de nitrogênio, embora garantindo
maior estabilidade do processo.
Para diminuir o tempo de partida do sistema Anammox é conveniente que
o mesmo seja inoculado com biomassa proveniente de outro reator Anammox. O
período de partida de un1 reato r RBS operado por Slieke rs et alii (2003) foi de
apenas 1 dia, en1 função do reator ter sido inoculado con1 biomassa Anammox al-
tamente ativa. A adição contínua de biomassa Anammox pré-enriquecida foi uti-
lizada na Holanda para o start-up de um reator em escala real de 70 m3 • O período
de partida do reator durou en1 torno de 3 ,S anos e atualmente o reator apresenta
operação estável, apresentando taxa de remoção de nitrogênio de 9,5 kgN/m 3 .dia
(VAN DER STAR, 2007).
Uma variação do processo Anammox foi recentemente testada em escala de
laboratório, sendo denominada de DEAMOX (Denitrifying Ammonium Oxidation).
Esse processo é baseado na combinação da reação Anamn1ox en1 condições de
desnitrificação autotrófica utilizando sulfeto como doador de elétrons para a pro-
dução de nitrito a partir do nitrato em um biofilme anaeróbio (KALYUZHNYI et
alii, 2006).
A tabela S .S mostra diversos estudos descritos na literatura envolvendo a re-
moção autotrófica de nitrogênio em dois sistemas, incluindo o processo Anammox.
Como pode ser observado, diversas configurações de reatores foram empregadas
em sistemas distintos, como já n1encionado anteriormente. A remoção de nitrogê-
nio varia em diferentes sistemas, fato que também está relacionado às diferentes
cargas nitrogenadas aplicadas. Os sistemas mencionados propiciam eficiente re-
tenção de biomassa no intuito de contrabalançar o baixo rendiinento celular das
bactérias Anammox. A maior taxa de remoção de nitrogênio (8, 9 kgN/m 3 .d) foi
reportada por Sliekers et alii (2002), em um reator air-lift de escala laboratorial
contendo lodo granular.
TABELA 5.5 Diferentes configurações de reatores e taxas de remoção de nitrogênio em

processos de remoção autotrófica de nitrogênio em dois estágios
Carga de Remoção de
Reator Água residuária nitrogênio nitrogênio Referência
(kgN/m 3 -d) (kgN/m 3 •d)
Reator em Efluente de 1,0 0,75 Van Dongen et alii

batelada digestor (2001 b)
sequencial
Reator em Efluente de 2,6 2,4 Fux et alii (2002)

batelada digestor
sequencial
Reator em Sintética 1,4 1, 1 Dapena-Mora et

batelada alii (2004)
sequencial
Reator de leito Sintética 0,07-0 ,55 0,35-0,38 Fux et alii (2004)

fixo
Efluente de n.d. 3,5
digestor
Reator de leito Sintética 1,3 1,1 Strous et alii

fixo (1997)
Sintética 0,2-2,0 1,8
Efluente de 2,5 1,5
digestor
Reator de leito Efluente de 0,48-2,63 2,5 Jetten et alii

fluidizado digestor (1997)
Reator air-lift Sintética 2,3 2,0 Dapena-Mora et

alii (2004)
Reator air-lift Sintética 10,7 8,9 Sliekers et alii
(2003)
Reator UASB Sintética 0,52 0,51 Schmidt et alii

(2004)
Reator UASB Resíduo de 0,84-1 ,02 0,59-0,66 Ahn et atii (2004)

suínos
n.d.: não disponível.
Nitritação parcial eAnammox emum úni co reator (um est ágio)

Em teoria, a combinação da oxidação de amônio e a desnitrificação pode ser
feita em sistemas com biofilme submetidos a baixas concentrações de oxigênio.
Entretanto, para o processo de desnitrificação convencional, a fonte de carbono
orgânico pode se tornar um fator limitante devido ao fato de o doador de elétrons
para a desnitrificação ser mais rapidamente oxidado que o amônio.
Caso o amônio funcione como o doador de elétrons (como no caso do processo

Anammox), esse problema não ocorre (VAN LOOSDRECHT et alii, 2004) . A
co1nbinação da nitritação parcial e reação Anammox (equações 5 .4 e 5 .8) em um
único reator implica que os micro-organismos autotróficos aeróbios responsáveis
pela nitritação parcial (bactérias oxidadoras de amônia) e os micro-organismos
Anammox atuem em cooperação durante todo o processo, possibilitando a ocor-
rência de reações sequenciais de forma simultânea (AHN, 2006) . Nesse sistema,
em particular, a concentração de oxigênio é um parâmetro crucial que deve ser
controlado.
Os micro-organismos nitrificantes se encarregam da oxidação da amônia a
nitrito, consumindo boa parte do oxigênio e criando condições anóxicas funda-
mentais para a ocorrência do processo Anammox, no qual ocorre a conversão de
amônia e nitrito (gerado na nitritação parcial) em nitrogênio gasoso.
A concentração de oxigênio geralmente deve ser baixa por duas principais
razões: 1) evitar a inibição das bactérias Anamn1ox, as quais são reversivelmente
inibidas pelo oxigênio; 2) obter condições de operação nas quais seja possível rea-
lizar a nitritação parcial (STROUS et alii, 1997), impedindo o crescimento das
bactérias oxidadoras de nitrito. E ssas bactérias tên1 menor afinidade pelo oxigênio
do que as bactérias oxidadoras de amônia e também n1enor afinidade pelo nitrito
do que as bactérias Anammox (HANAKI et alii, 1990).
Condições específicas de operação buscando a nitritação parcial fo ram apre-
sentadas anteriormente. A estratégia de realizar o arraste (washout) das bactérias
oxidadoras de nitrito por meio da aplicação de vazões específicas de alimentação
não pode ser aplicado nos sistemas de nitrificação parcial e Anammox em um úni-
co reator. A representação da remoção autotrófica de nitrogênio em sistemas com
biofiln1e está ilustrada na figura 5.10.
Vale mencionar que a concentração de oxigênio dissolvido, parâmetro-chave
dos processos conjugados de nitritação parcial e Anammox em um único reator,
está relacionada com a espessura do biofilme. Para deter1ninada carga superficial
de amônio e sob condições de baixa temperatura, um biofilme espesso é requerido.
Por conseguinte, maior concentração de oxigênio dissolvido é necessária. Em con-
t rapartida, um biofilme fino requer menos oxigênio dissolvido e, nesse caso, altas
concentrações de oxigênio irão causar nitrificação completa e menor ren1oção de
nitrogênio (HAO et alii, 2002; KOCH et alii, 2000).
Quanto menor a carga nitrogenada aplicada, menor será a concentração de
oxigênio dissolvido requerida para se obter a nitrificação parcial . Nesse contex-
to, fica claro que considerar apenas a concentração de oxigênio dissolvido como
forma de obter acúmulo de nitrito não é suficiente, uma vez que outros fatores
estão envolvidos, como a espessura do biofilme e a carga nitrogenada aplicada.
A figura 5.11 apresenta a dinâmica de formação de nitrito/nitrato em diferentes
concent rações de oxigênio dissolvido em um sistema com biofilme, experimen-

talmente observada por Garrido et alii (199 7) e teoricamente explicada por
Picioreanu et alii (199 7).
1
Líq uido
N0-3
I
Oxidadores Oxidador
de amôn io de nitrito
Biofilme
Substrato
FIGURA 5.1O Esquema da remoção autotrófica de nitrogênio em processos com biofilme (adaptado
de VAN LOOSDRECHT, 2008).
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Oxigênio (mg/L)
FIGURA 5.11 Efeito da concentração de oxigênio dissolv ido no acúmulo de nitrito em um sistema
com biofil me (adaptado de VAN LOOSDRECHT, 2008).
CAPÍTULO 5 ◊ NOVOS PROCESSOS DE REMOÇÃO BIOLÓGICA DE NITROGÊNIO 2 17
Duas estratégias principais podem ser utilizadas para a partida de um siste-

ma de remoção autotrófica de nitrogênio em um único reator. A primeira consiste
em inocular biomassa nitrificante em un1 reator Anammox que esteja operando
de maneira satisfatória e suprir aeração ao reator de forma a manter condições
microaeróbias. A segunda consiste em operar um reator de nitritação parcial sob
condições de limitação de oxigênio para a obtenção de uma razão amônio/nitrito
de 1: 1, inoculando posteriormente biomassa Anamn1ox (PYNAERT et alii, 2004;
GONG et alii, 2007).
A alta atividade nitrificante pode proteger as bactérias Anammox do oxigê-
nio, além de fo rnece r o nitrito. Al ém disso, ao se inocular biomassa enriquecida
em bactérias Anan1mox em um reator de nitritação parcial, a partida do processo
de remoção autotrófica de nitrogênio em um único reator é acelerada e permite ob-
ter consideráveis remoções de nitrogênio após um ou dois meses. Caso não corra a
inoculação da bion1assa Anammox, podem ser n ecessários vários meses ou mesmo
anos para se atingir resultados significativos de remoção de nitrogênio.
A segunda estratégia de partida de um reator único para a remoção autotró-
fica de nitrogênio parece ser mais apropriada em virtude da considerável redução
da atividade Anammox quando a prüneira estratégia é aplicada (SLIEKERS et
alii, 2003; SLIEKERS et alii, 2002; LIU et alii, 2008). Em adição, somente
uma pequena quantidade de biomassa Anammox é necessária para o start-up do
processo CANON.
O processo de único estágio ge ralmente apresenta maior taxa volumétrica de
remoção de nitrogênio e n1enor custo de investimento quando comparado com a
configuração de dois estágios, uma vez que não há necessidade de um reator adi-
cional destinado à nitritação parcial (WYFFELS et alii, 2004) . Não obstante, a
dificuldade de regular a concentração de oxigênio dissolvido e a remoção incom-
pleta de nitrogênio durante o trata1nento de águas residuárias altamente concen-
t radas, são alguns dos p roblen1as enfrentados quando se utiliza a configuração
co1n u1n único reator (HAO et alii, 2001; NIELSEN et alii, 2005).
Alguns modelos matemáticos foram desenvolvidos para entender e predizer
o comportamento do sistema em diferentes condições operacionais e o efeito da
carga superficial de amônio. Os principais resultados mostram que a carga de
amônio está associada com a espessura do biofilme, sendo que um biofilme fino
possui capacidade limitada para a atividade do processo Anammox e a formação
estável de nitrito é o fator limitante. Por outro lado, o processo Anammox pode
ocorrer em sistemas com biofilme, embora o tempo e não a carga nitrogenada seja
o fator chave para o processo. Nesses sistemas, foi previsto que entre cinco e 1O
anos são requeridos para a obtenção de uma população Anammox que permita a
obtenção de 1náJcimas taxas de conversão (VAN LOOSDRECHT et alii, 2004).
D iversos t ipos de reatores fo ram e1npregados para o processo combinado de
nitritação parcial e Anammox em um único reato r. Entre eles pode-se mencionar
reatores em batelada sequencial, contactares biológicos rotativos, reatores de leito

móvel com biofilme e reatores air-lijt. A tabela 5.6 apresenta resultados de algu-
.
n1as pesquisas.
TABELA 5.6 Diferentes configurações de reatores e taxas de remoção de nitrogênio em

processos de remoção autotrófica de nitrogênio em um único reator (nitritação parcial + Anammox)
Carga de Remoção de
Reator Água residuária nitrogênio nitrogênio Referência
(kgN/m 2•d) (kgN/m 2 •d)
Contactar Lixiviado 1,4-3,2 0,4-1,2 Siegrist et alii

biológico rotativo (1998)
Contactar Lixiviado 1,5 0,9 Hippen et alii

Contactar Sintética 2,3 1,55 Pynaert et alii

Reator de leito Efluente de 4,8 2,4 Hippen et alii

móvel com digestor (2001)
biofilme
Reator de leito Efluente de 4-8 2,0 Seyfried et alii

móvel com digestor (2001)
biofilme
À primeira vista, parece óbvio que a 1nelhor configuração que permite a ob-
tenção de eficiente retenção de biomassa autotrófica de crescimento lento consiste
nos reatores operados em batelada sequencial, os quais permitem a manutenção
da biomassa no reator por meio da alternância das fases de reação/decantação.
Entretanto, altas taxas de ren1oção de nitrogênio também foram obtidas em ou-
tros tipos de reatores mencionados anteriormente, tais como os contactares bio-
lógicos rotativos (PYNAERT et alii, 2003; PYNAERT et alii, 2004) e reatores
air-lift (SLIEKERS et alii, 2003).
Em reatores con1 biofilme ou reatores com lodo granular, os micro-organis-
mos que oxidam amônia estão ativos nas regiões externas do biofilme (ou grânu-
lo), produzindo a quantidade apropriada de nitrito para os organismos Anammox,
os quais se encontran1 nas camadas mais internas. Dessa n1aneira, as bactérias
Anammox ficam protegidas do oxigênio, o qual é consumido nas camadas mais
externas do biofilme (grânulo) (WYFFELS et alii, 2004). A figura 5.12 apresenta
um reator de lodo granular no qual ocorre simultaneamente a nitritação parcial e
reação Anammox (processo CANON).
FIGURA 5.12 Foto ilustrativa de um reator CANON de escala laboratorial no qual ocorre
simultaneamente a nitrificação parcial e a reação Anammox.
Uma variação dos reatores convencionais com biofiln1e é o reator com mem-
branas (GONG et alii, 2007), nos quais membranas hidrofóbicas e permeáveis
a gases são utilizadas para a transferência de oxigênio. Na região próxima às
membranas, oxigênio dissolvido está presente e é onde as bactérias oxidadoras de
amônio convertem amônio a nitrito. As bactérias Anammox, por sua vez, se en-
contram ativas na região rica em amônio, próxima à fase líquida.
Quando os sistemas com biofilme ou sistemas granulares são utilizados no

processo de nitritação parcial/Anammox, a resistência à transferência de massa
é geralmente a etapa limitante. Enquanto a concentração de a1nônio na região
externa ao biofilme for muito maior do que a concentração de oxigênio ou nitrito,
a difusão de amônio para o interior do biofilme não irá limitar a velocidade do
processo. Caso o nitrito produzido na região externa seja principalmente consu-
mido na região interna, o oxigênio se torna o principal fator limitante do processo
global.
Szatkowska et alii (2007) reportaram que a transferência de oxigênio foi o
fator limitante do processo em um reator de leito móvel de escala piloto. Ames-
ma constatação foi feita por Sliekers et alii (2 003) em um reator air-lift de escala
laboratorial. A limitação de oxigênio pode ser atribuída à sua difusão lenta no in-
terior do biofilme/grânulo ou à transferência ineficiente na interface gás-líquido .
Conforme 1nencionado no item 5 .2 .2 .3, o nitrito é um potencial inibidor
do processo Anammox. Caso seja consumido na mesma proporção em que é pro-
duzido, o seu efeito inibitório não é significativo. Entretanto é possível que em
algumas situações, nas quais a concentração de nitrito seja alta, nenhum efeito
negativo sobre as bactérias Anan1n1ox seja registrado. Esse fato foi constatado por
Vázquez-Padín et alii (2009), os quais registraran1 concentrações de nitrito da
ordem de 25 mgN/L. A presença de gradiente de concentração no interior dos grâ-
nulos, onde estão localizadas as bactérias Anammox, provavelmente resultou em
menores concentrações de nitrito nessas regiões, impedindo o seu efeito inibitório.
Diversas denon1inações foram utilizadas para os sistemas de nitritação par-
cial/Anammox em apenas um reator: processo CANON (Completely Autotrophic
Nitrogen Removal over Nitrite) (THIRD et alii, 2001), processo OLAND (Oxygen
Limited Autotrophic Nitrij'ication and Denitrification) (KUAI e VERSTRAETE,
1998), desamonificação aeróbia/anóxica ou processo DEMON (HIPPEN et
alii, 1997; ,~TETT, 2007) e processo SNAP (Single-stage Nitrogen removal using
Anammox and Partial nitritation) (FURUKAWA et alii, 2006).
O motivo pelo qual o mesmo processo foi denominado de diversas formas se
deve ao fato de que diferentes grupos de pesquisa atribuíram a oxidação anaeróbia
de amônio a diferentes micro-organismos. Nos processos OLAND e desamonifica-
ção aeróbia/anóxica, os organismos tidos como responsáveis pela oxidação anaeró-
bia de amônia en1 condições n1icroaeróbias são bactérias nitrificantes (KUAI e
VERSTRAETE, 1998; HELMER et alii, 1999). Já no processo CANON, as
bactérias Anammox foram assumidas como sendo as responsáveis por esse proces-
so. Estudos com a técnica de hibridização fluorescente in situ (FISH) confirma-
ram que a oxidação anaeróbia do amônio, em todos os reatores, era realizada por
organismos Anammox (PYNAERT et alii, 2003; HELMER-MADHOK et alii,
2002), embora Pynaert et alii (2003) não excluísse1n uma função específica para
os micro-organismos oxidadores de amônio.
Processo CANON
O processo CANON está representado por meio da equação 5 .14 (SLIEKERS

et alii, 2003). Os trabalhos com o processo CANON reportados na literatura fo-
ram, em sua maioria, operados em temperaturas na faixa de 30-35°C, com má-
xima taxa de remoção de nitrogênio situada na faixa entre 0,075-1,5 kgN/m3 .d
(SLIEKERS et alii, 2003; SLIEKERS et alii, 2002) . Nessa faixa de ten1peratu-
ra, as bactérias que oxidam amônio crescem mais rapidamente do que as bactérias
responsáveis pela oxidação de nitrito. Além disso, o crescimento dos micro-orga-
nismos Anammox é estimulado nessas condições de temperatura, que por sinal
coincide com os valores de temperatura considerados ideais para essas bactérias.
Há, entretanto, trabalhos na literatura que obtiveram significativa remoção de
nitrogênio (0,5 kgN/m3 .d) em temperaturas de 20-24ºC, tal qual o realizado por
Vázquez-Padín et al,ii (2009) e1n um reator em batelada sequencial. A diferença é
que nesse sistema, em particular, uma pequena atividade das bactérias oxidadoras
de nitrito foi observada. A possibilidade de se obter um rápido tempo de partida
e alta taxa de remoção de nitrogênio em sistemas de remoção autotrófica de ni-
trogênio em temperaturas en1 torno de 20º C já foi reportada por Pynaert et alii
(2004) em sistemas de um único estágio e por Dosta et alii (2008) e Isalca et
alii (2006) em sistemas de dois estágios.
O modelo desenvolvido por HAO et alii (2001) para descrever o processo
CANON indicou que a taxa máxima de remoção de nitrogênio será atingida so-
mente quando a concentração de oxigênio dissolvido for proporcional à carga su-
perficial de amônio. Para cargas de amônio variáveis, o oxigênio dissolvido deve
ser regulado por meio de um controle de realiinentação. O modelo desenvolvido
pelos mesmos autores mostrou que a concentração ideal de oxigênio dissolvido
para um reator CANON se situa em torno de 1 mg/L, embora esse valor ideal
dependa da espessura e da densidade do biofilme, da concentração de 1natéria
orgânica do afluente e da temperatura.
(5 .14)
Processo OLAND
O termo OLAND foi inicialmente introduzido por Kuai e Verstraete (1998) . A

estequiometria do processo OLAND envolve a remoção de amônio em duas etapas:
na primeira, amônio é parcialmente oxidado a nitrito e, na segunda, ocorre a reação
entre amônio e nitrito para a forn1ação de gás nitrogênio. Essa estequiometria é por
sinal bastante similar àquela envolvida no processo CANON. O processo OLAND
pode ser representado pela equação 5.15 (VERSTRAETE e PHILIPS, 1998).
A chave para este processo é o fornecimento de oxigênio, fazendo-se com que

a nitrificação ocorra apenas até o nitrito . Posteriormente, devido às baixas con-
centrações de oxigênio dissolvido (aceptor final de elétrons), o nitrito é consumido
para a oxidação de amónio. Na pesquisa que introduziu o conceito do processo
OLAND, a remoção de amónio obtida em um reator em batelada sequencial ali-
mentado com água residuária sintética foi de apenas 0,050 kgN/m 3 .dia (KUAI e
VERSTRAETE, 1998) .
O reator foi operado com reciclo total de células por sedimentação, sendo a ali-
mentação realizada em duas etapas, cujas cargas eram de O, 125 e O,2 50 kgN/In3 .d.
Durante a operação do reator, a limitação de oxigênio foi mantida em função do
valor de pH, isto é, quando este parâmetro apresentava valores acima de 7,2,
acionava-se o sistema de agitação (300 a SOO rpm). Quando o valor do pH era
menor que 7, a agitação era interrompida com o objetivo de possibilitar o consu-
mo do N 2 0 e do NO; gerados, etapa que durava até que o valor do pH aun1entasse
novamente, dando início a um novo ciclo .
Os resultados obtidos não fo ram muito satisfatórios, tendo em vista que a
máxima ren1oção de nitrogênio atingida foi de 40%. A estratégia de limitação
de oxigênio adotada parece não ter conseguido promover a inibição da ação das
bactérias oxidado ras de nitrito, já que se detectou nit rato durante o período ope-
racional. O fraco desempenho, em termos de eliminação de nitrogênio, também
pode ter sido ocasionado pelas altas concentrações de nitrito.
Sliekers et alii (2002) lançaran1 mão de un1a estratégia específica para a
partida de reatores CANON. Esses autores utilizaram como inóculo biomassa
enriquecida em bactérias Ana1n1nox (80% da população bacteriana), sendo essa
etapa seguida pelo suprimento de oxigênio para desenvolver n1icro-organismos
nitrificantes. A temperatura de operação foi de 30ºC, pH 7 ,8 , agitação a 100 rpm
e uma vazão específica de ar de 0,04 vvn1. O reator foi alimentado con1 n1eio
sintético contendo NH; e NH2, sendo a carga nitrogenada total de 45 7 mg/L.
Utilizou-se gás hélio na etapa anaeróbia. Foram realizados testes de atividade de
oxidação de amónio sob condições aeróbias durante as duas primeiras semanas
de operação, não sendo detectada nenhu1na atividade p resente. O resultado da
análise FISH apresentou grande quantidade de bactérias Anammox, embora não
tenha sido detectada a presença de bactérias oxidadoras de amônia, tampouco de
oxidadoras de nitrito.
Após cinco semanas de operação, ocorreu a substituição de gás hélio por ar
atmosférico e a carga nitrogenada foi reduzida para 13 1 mgN/L.d, sendo o ni-
trogênio adicionado somente sob a forma de amônia. Por meio da técnica FISH,
observou-se um aumento substancial das bactérias oxidadoras de amônia aeróbias,
para 45%, enquanto ocorreu decréscimo das bactérias Anammox de 80 para 40%.
O reator apresentou baixa taxa de remoção de nitrogênio, tanto na etapa anóxica
(Anammox), quanto na etapa com limitação de oxigênio (Canon), as quais apre-

sentaram valores de 0,315 e 0,06 4 kgN/m3 .d, respectivamente.
Os 1nesmos autores ainda ressaltam que sob condições nas quais o oxigênio
é limitado, as bactérias Anammox consomem nitrito, enquanto as bactérias oxi-
dadoras de nitrito não estiverem ativas. Este fato sugere que estes últimos micro-
-organismos estejam presentes somente quando não há limitação de oxigênio. Na
deficiência de oxigênio, estas bactérias, que são inibidas pela amônia livre (pre-
sente em concentração considerável nesse estudo), tiveram que competir por esse
elemento com as bactérias oxidadoras de amônia, como também competiram pelo
nitrito com as bactérias Anammox.
Em pesquisa recente realizada por De Clippeleir et alii (2009) e Vázquez-
Padín et alii (2009), observou-se altas taxas de remoção de nitrogênio em reatores
contendo lodo granular. A ope ração desses reatores é bastante similar aos reatores
com biofilme e as conversões são semelhantes: na região aeróbia exte rna, amônio
é convertido em nitrito, enquanto que o processo Anammox ocorre na região cen-
tral do grânulo (região anóxica). Operando um sistema OLAND, Pynaert et alii
(2003) obtiveram remoção de nitrogênio de 1,8 kgN/m3 .dia, 100 dias após terem
inoculado o reator (contactor biológico rotativo) com lodo granular anaeróbio . Em
um reator air-lift, Sliekers et alii (2003) observaram conversão de nitrogênio de
1 ,5 kgN/m3 .dia.
(5 .15)
Desamonificaçãoaeróbia/anóxica ouDEMON
O termo desamonificação aeróbia/anóxica ou DEMON foi utilizado primeira-

mente para descrever a perda significativa da concentração de nitrogênio inorgâni-
co (até 90%) na etapa de nitrificação de um contactor biológico rotativo destinado
ao tratamento de lixiviado, operado com altas concentrações de amônio e subme-
tido a baixas concentrações de oxigênio (HIPPEN et alii, 1997).
Na verdade, a desa1nonificação aeróbia é baseada no p rincípio do p rocesso
CANON, no qual ocorre cooperação entre as bactérias nitrificantes e bactérias
Anammox sob condições de limitação de oxigênio .
Muitas vezes a desamonificação., ae róbia se desenvolve em reatores nos quais
ocorre a nitrificação convencional. E o caso de pesquisas real izadas por HIPPEN
et alii (1997), Siegrist et alii (1998) e Hippen et alii (2001), todas reportando
perdas consideráveis de nitrogênio em contactores biológicos rotativos. Nenhum
desses reatores foi projetado para a desamonificação, embora a eliminação de ni-
t rogênio tenha sido estabelecida ao longo do tempo .
Siegrist et alii (1998) observaram que cerca de SO% da população bacteriana

do biofilme consistia em bactérias Anammox. Próximo aos contacto res biológicos
rotativos, reatores de leito móvel foram ope rados en1 regime contínuo. A remoção
de amônia mais significativa foi atingida em concentrações de oxigênio dissolvido
em torno de O, 7 mg/L.
Cornelius e Rosenwinkel (2002) apresentaram os resultados da operação de
reatores de leito móvel com biofilme, utilizando suportes Kaldnes®, em uma plan-
ta de tratamento de Hattingen, Alemanha. Os reatores foram projetados visando
à desamonificação, sendo a concentração de oxigênio mantida abaixo de 1 mg/L.
Plantas, en1 escala real destinadas à desamonificação estão em operação
em Strass (Austria) e Zurique (Suíça). A planta de Strass possui um reator em
batelada sequencial de SOO m 3 para desamonificação do efluente de digestores
(INNEREBNER et alii, 2007) . Em Zurique o reator possui 1 400 m 3 , trata e
SOO gN/n13 .dia, com conversões acima de 90% (JOSS et alii, 2009) .
5.2.3 PROCESSOS NOx
O controle e o estímulo da atividade desnitrificante de micro-organisn1os do

gênero Nitrosomonas por meio de óxidos de nitrogênio propiciaram novas possi-
bilidades no tratamento de águas residuárias. Na presença de N Ox, estes micro-
-organismos autotróficos são capazes de realizar a nitrificação e a desnitrificação
simultaneamente, mesn10 sob condições completan1ente aeróbias, tendo N 2 con10
principal produto.
Nesse p rocesso, somente cerca de 40% da carga de amônia é convertida a
nitrito . Al ém da demanda de oxigênio se r SO% menor na etapa de nitrificação, já
que o nitrito é usado co1no aceptor terminal de elétrons, a etapa de desnitrificação
subsequente consome n1enos n1atéria orgânica (DQO) (SCHMIDT et alii, 2003).
Os compostos NOx (NO/NO 2) consistem no sinal regulatório que induz a
atividade desnitrificante das bactérias oxidadoras de an1ônia, sendo somente adi-
cionados em quantidades traço (relação NH; /NO 2 variando de 1 000/1 a 500/1)
(SCHMIDT et alii, 2001) . Como consequência, em torno de 50% dos equiva-
lentes de redução [H] são transferidos para o nitrito como aceptor terminal de
elétrons ao invés do oxigênio. Dessa forma, o consumo de 0 2 nesse processo é
reduzido.
5.2.4 BANHADOS ARTIFICIAIS (WETLANDS)
Alguns banhados artificiais (wetlands) também foram recentemente utilizados

como sistemas para a remoção autotrófica de nitrogênio, resultando em 50-60%
de remoção (SUN e AUSTIN , 2007; DONG e SUN, 2007). Os tipos de wetlands
empregados no tratamento de águas residuárias variam dependendo da vegetação

e da vazão. Além dos construídos artificialmente, wetlands naturais e mangues
també1n são utilizados para o controle do polimento de efluentes (CLOUGH et
alii, 1983).
Wétlands cujo fluxo líquido é realizado subsuperficialmente podem funcionar
como reatores com biofilme. Nesses sistemas, o biofilme cresce nas partículas
de solo e nas raízes das plantas, as quais fornecem alta área superficial, fazendo
com que se torne possível a combinação de processos aeróbios e anaeróbios e a
obtenção de altas taxas de remoção de compostos orgânicos, patógenos e alguns
materiais de baixa biodegradabilidade. Nesse contexto, diferentes aspectos vêm
sendo investigados nos últimos anos, incluindo os efeitos da composição do solo,
fluxo hidráulico, produção de oxigênio pelas plantas para a rizosfera, entre outros
(STOTTMEI STER et alii, 2003).
Em sistemas wetlands subsuperficiais, os valores de remoção de nitrogênio po-
dem variar significativamente. Alguns autores reportam baixas taxas de remoção
(0, 1 gN/m2 .d) enquanto outros reportam altas taxas (0, 76 gN/m2 .d) (KADLEC
e KNIGHT, 1996; BRIX, 1994; GELLER, 1997; KUSCHK et alii, 2003;
MAEHLUM et alii, 1999).
Kuschk et alii (2003) observaram uma variação significativa na taxa de
remoção de nitrogênio, em função da estação do ano, em um sistema wetland
de fluxo horizontal subsuperficial . A maior taxa de remoção foi obtida no verão
(O, 70 gN/m2 .d) e a n1enor foi obtida no inverno (O, 15 gN/m2 .d). Os autores suge-
riram que aspectos relacionados com a baixa temperatura e a inibição dos proces-
sos de nitrificação e desnitrificação são as principais causas da baixa remoção de
nitrogênio obtida no período de inverno.
Existem diversos mecanis1nos que procuram explicar a remoção de nitrogênio
em sisten1as wetland: absorção pela planta, nitrificação-desnitrificação n1icrobia-
nas, adsorção pelo solo e volatilização. A figura 5 .13 apresenta de forma sünplifi-
cada os processos envolvidos no ciclo do nitrogênio e os fluxos do nitrogênio sob a
forma de diferentes compostos em um sistema wetland.
A remoção de nitrogênio é principalmente atribuída aos micro-organismos
presentes e não às plantas. Thable (1984) estimou que entre 5 e 10% da carga
nitrogenada de um esgoto doméstico foram incorporados à biomassa da planta.
De forn1a similar, a transformação de nitrogênio en1 material do solo (material hú-
mico ou adsorção para minerais argilosos) não é significativa, contribuindo para
menos de 10% da carga de nitrogênio removida (OSMAN, 1981). A volatilização
de amônia também pode ser considerada irrelevante uma vez que os valores de pH
e de temperatura em sistemas wetland estão usualmente fora da faixa que propicia
a formação de amônia livre. Conforme descrito por Lance (1986), os processos
de nitrificação e desnitrificação estão entre os principais processos de re1noção de
nitrogênio em sistemas de infiltração subsuperficiais.
Em sistemas wetland construídos existem regiões aeróbias e anaeróbias, fa-

zendo com que a nitrificação e a desnit rificação possam ocorrer. As plantas liberam
oxigênio através das raízes e as bacté rias oxidadoras de amônia podem utilizá-lo
para oxidar amônio a nitrato. Nas regiões anaeróbias, o nitrato produzido é redu-
zido a gás nitrogênio pelos organismos desnitrificantes, utilizando alguns com-
postos orgânicos liberados pelas plantas (exsudatos, matéria e111 deco111posição)
como fonte de carbono.
Desse modo, existem dois principais fatores que limitam os processos de
nitrificação-desnitrificação em sistemas wetland: a disponibilidade de oxigênio
dissolvido reque rida para a nitrificação e a acessibilidade de fonte de carbono
orgânica necessária para a desnitrificação. A presença de material orgânico, essen-
cial para a desnitrificação, pode limitar a nitrificação.
Acredita-se que o oxigênio dissolvido no interior dos sistemas wetland é p ri-
meiramente utilizado por micro-organismos heterotróficos para a remoção de ma-
téria orgânica, fazendo com que as bactérias oxidadoras de amônia se encontrem
em condições de limitação de oxigênio (STOTTMEISTER et alii, 2003; SUN
et alii, 1998). Por outro lado, a desnitrificação também é sensível à presença de
oxigênio (CHRISTENSEN et alii, 1990), e111bora atividade desnitrificante tenha
sido encontrada em sistemas wetland com baixas concentrações de oxigênio dis-
solvido .
Alguns estudos apresentaram a hipótese de que a desnitrificação ocorre na
zona anóxica microscópica de filmes microbianos (KADLEC e KNIGHT, 1996),
embora tal hipótese não tenha sido provada. Por meio de balanço de massa para o
nitrogênio em um sistema wetland, SUN et alii (2005) concluíram que além dos
processos de nitrificação e desnitrificação, a assimilação de biomassa bacteriana
deve ser levada em consideração quando alguma fonte de carbono orgânico estiver
presente.
Como nos sistemas com biofilme, dependendo das concentrações de oxigênio
e de carbono orgânico, p rocessos como nitrificação parcial e oxidação anaeróbia de
amônia podem ser importantes para a ren1oção de nitrogênio e a sua estimulação
pode propiciar o aumento das taxas de remoção de nitrogênio em sistemas wetland
(STOTTMEIST ER et alii, 2003) . A presença de bactérias Ana111mox foi repo rta-
da em sistemas wetland, embora o seu papel nos processos de remoção de nitrogê-
nio ainda não tenha sido completamente elucidado (SHIPIN et alii, 2005).
A figura 5.14a-f apresenta diagramas de fluxo ilustrativos dos principais
processos empregados para a remoção autotrófica de nitrogênio, anteriormente
descritos. É neles que ocorrem, a luz dos conhecimentos atuais, as 111ais impor-
tantes conversões do ciclo do nitrogênio. O tradicional processo de ren1oção de
nitrogênio está igualmente representando para efeito de comparação com as novas
tecnologias.
CAPÍTULO5 ◊ NOVOS PROCESSOS DE REMOÇÃO BIOLÓGICA DE NITROGÊNIO 22 7
Fixação de nitrogênio
Ar
Volatilização de amônia
Desnitrificação
monifica - Nitrificação anóxica)
Assimilaç
Assimilação
Sedimentação Difusão
Água
Nitrificação Sedimento
(óxica)
Assimilação
FIGURA 5.13 Il ustração simplificada dos processos integrantes do ciclo do nitrogênio e os fluxos
dos diferentes compostos nitrogenados em um sistema wetland. N0 rg : nitrogênio orgânico (adaptado
de BASTVIKEN , 2006).
NH4+ No - NO- N2
. 2 . 3
Nitrificação Nitratação Desnitrificação
(100) (100) (100) (1 00)
a) Nitrificação - desnitrificação (processo convencional)
NH4+ Nitrificação NO-2 N2

parcial Desn itritação
(100) (100) (100)
b) Nitrificação parcial - Desnitritação
FIGURA 5.14 Diagramas de fluxo representando os processos de: (a) nitrificação/desnitrificação

convencionais ; (b) nitrificação parcial - desnitritação; (c) nitrificação parcial - Anam mox ; (d) processos
CANON/OLAND ; (e) processo DEAMOX; e (f) processos NO,. Os números entre parênteses
representam a quantidade de nitrogênio em % , sendo os valores idealizados, podendo variar
dependendo do processo; NO2 (g): NO2 gasoso ;ª Na presença de oxigênio o NO2 age como um sinal
regulatório, e não como um substrato, induzindo a atividade desnitrificante de bactérias oxidadoras
de amônia aeróbias (adaptado de SCHM IDT et alii, 2003 e KALYUZHNYI et alii, 2006).
continua
continuação
NH+
4 Nitrificação NH+/NO
4 -
2 N2/NO3
parcial Anammox
(100) (50/50) (90/10)
c) Nitrificação parcial - Anammox
N2/NO3
CANON/OLAND
(100) .___ _ _ _ _ (90/10)
d) CANON / OLAND
NO 3 (NO2")
Nitrificação
'
A fluente Reator NH+

4 ) Hs- N2/NO 3
Deamox
(100) anaeróbio (100)
(90/10)
e) DEAMOX
NH;/NO 2 (g) Processo NH1/NO; N2

Desnitrificação
(100/1ª) NOX
(60/40) (100)
(f) Processos NO,
FIGURA 5.14 Diagramas de fluxo representando os processos de: (a) nitrificação/desnitrificação

convencionais ; (b) nitrificação parcial - desnitritação; (c) nitrificação parcial - Anammox; (d) processos
CANON/OLAND ; (e) processo DEAMOX e (f) processos NO, . Os números entre parênteses
representam a quantidade de nitrogênio em %, sendo os valores idealizados, podendo variar
dependendo do processo ; NO2 (g): NO2 gasoso; ª Na presença de oxigênio o NO2 age como um sinal
regulatório, e não como um substrato, induzindo a atividade desnitrificante de bactérias oxidadoras
de amônia aeróbias (adaptado de SCHM IDT et alii, 2003 e KALYUZHNYI et alii, 2006).

Os novos processos de remoção de nitrogênio (processos autotróficos) consis-
ten1 em alternativa aos processos convencionais, especialmente para o tratamento
de águas residuárias contendo altas concentrações de nitrogênio e con1 razões C/N
desfavoráveis para a aplicação do processo de nitrificação/desnitrificação conven-
cional .
As novas t ecnologias baseadas em nitrificação parcial acopladas com a redu-

ção do nitrito formado, via adição de fonte de carbono ou, até mesmo, via redução
co1n amônio (oxidação anaeróbia de amônio - Anammox) são 1nais favoráveis em
termos de requerimento nutricional e acarretam menores custos de operação.
Conforme mencionado ao longo desse capítulo, os processos de remoção au-
totrófica foram e estão sendo estudados extensivamente por diversos grupos de
pesquisa. Não somente testes e1n escala de laboratório, n1as també1n estudos em
escala-piloto e industrial estão descritos na literatura.
É bem verdade que, à primeira vista, os processos de remoção autotrófica e
de remoção de nitrogênio parecem ser de difícil ope ração em virtude da necessi-
dade de rigoroso controle do processo em relação a concentrações de substratos,
pH, temperatura e oxigênio dissolvido. Esses, por sua vez, são alguns dos fatores
decisivos que irão determinar o sucesso do t ratamento, uma vez que influenciam
a presença ou ausência de co1npostos inibidores, que 1nuitas vezes são utilizados
para selecionar populações bacterianas específicas.
Embora a aplicação de sistema nos quais a nitrificação parcial e a reação
Anammox ocorrem no mesmo reator tenha sido feita com sucesso em diversos
casos, a estabilidade desse processo a longo prazo é ainda difícil de ser atingida e
permanece como um desafio para pesquisas futuras.
As pesquisas em escala de laboratório visando ao entendimento cada vez mais
detalhado de processos como o Anammox certamente devem continuar, o que
ce rtamente pode resultar em um número crescente de sistemas de tratamento em
escala real no futuro .
Para melhorar o desenvolvimento e intensificar a aplicação dos processos de
remoção autotrófica de nitrogênio, pesquisas devem ser direcionadas com objetivo
de encontrar estratégias para minimizar os elevados tempos de partida dos reato-
res, os quais consistem em um dos principais entraves para a aplicação da tecno-
logia. Além disso, estudos direcionados ao melhor entendimento do n1etabolisn10
de bactérias Anammox devem ser incentivados, sen1pre buscando melhores formas
de controlar o processo.
Outro ponto a ser destacado se refere às pesquisas que procuram explorar a
possibilidade de to rnar os reatores destinados à remoção autotrófica de nitrogênio
parte do processo principal de tratamento, e não somente processos side-stream,
que funcionam apenas como uma opção para o tratamento de correntes específicas
altamente concentradas. Para tanto, os reatores destinados à remoção autotrófica
de n it rogênio (reatores Anammox, por exemplo) estão sendo adaptados para ope-
rar em condições de temperatu ra nas quais a planta de trata1nento em questão
está operando, temperatura essa bastante inferior àquelas consideradas ótimas
para os micro-organismos envolvidos.
Não importando qual o foco principal da pesquisa, deve-se ter em mente que
as rotas metabólicas dos processos de transformação de nitrogênio são complexas.
O entendimento de como os diversos fatores ambientais afetam esses processos é

uma meta a ser buscada. O conhecimento dos processos microbianos básicos en-
volvidos nesses novos sistemas é fundamental para permitir incrementar as taxas
de remoção de nitrogênio, obter resultados satisfatórios em escalas reais de trata-
mento e expandir a aplicação de estratégias de tratamento confiáveis.
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Capítulo 6
Técnicas de Biologia Molecular Aplicadas

ao Estudo da Diversidade Microbiana de
Sistemas de Tratamento de Efluentes
João Paulo Ba55in
Márcia Dezotti
Alexandre Ro5ado
6.1 INTRODUÇÃO
6.1.1 DIVERSIDADE MICROBIANA
ara a microbiologia, a época atual é extraordinária devido ao rá-

pido desenvolvimento do conhecimento científico e à existência
de enorme biodiversidade, a qual se está apenas começando a
caracterizar. Os micro-organismos vêm evoluindo desde aproxi-
madan1ente quatro bilhões de anos e, há dois bilhões de anos, eram as únicas for-
mas de vida na terra. Eles são capazes de explorar um amplo espectro de fontes de
energia e viver em p raticamente todos os hábitats. Ao longo de sua história, toda a
bioquímica básica para a vida evoluiu e todas as outras formas vivas se desenvolve-
ram a partir dos micro-organismos ancestrais. Eles representam o repertório mais
rico em diversidade química e molecular na natureza. Além disso, constituem a
base de processos ambientais básicos, tais como os ciclos biogeoquín1icos e as ca-
deias alimentares, bem como mantêm relações vitais e co1nplexas entre si e com os
organismos superiores (ROSADO e DUARTE, 2002).
Dive rsidade é um assunto crítico que envolve todos os níveis de organização
biológica, desde o molecular até o global. De um modo geral, os progran1as de
diversidade biológica têm enfatizado os estudos com plantas e animais e pouca
atenção tem sido dada aos micro-organismos. A diversidade de micro-organis-

mos é tão vasta quanto desconhecida (ROSADO e DUARTE, 2002) . O estudo
da diversidade microbiana é também importante para o avanço da biotecnolo-
gia. As novas tecnologias desenvolvidas, principalmente de análise de ácidos
nucleicos, bioinformática, química analítica, amostragem e caracterização de
ecossistemas, têm conferido à diversidade microbiana uma posição prioritária
no universo científico.
A detecção e a identificação de bactérias eram feitas, de forn1a tradicional,
levando-se em conta os principais meios de obtenção de carbono e energia, suas
exigências nutricionais e meio de cultivo para o seu crescimento, além da observa-
ção direta por microscopia (KENNEDY, 1999; HERBERT, 1990).
Os métodos tradicionais de descrever os micro-organismos normalmente não
são aplicáveis diretamente às comunidades microbianas; os micro-organismos são
geralmente descritos e classificados pelo seu fenótipo . Fenótipo é um te rmo bas-
tante amplo, que compreende características obse rváveis da célula, tais como mor-
fologia, atividades fisiológicas, estrutura de componentes celulares e, em alguns
casos, o nicho ecológico que a célula ocupa. Infelizmente, essas características for-
necem pouca informação sobre os parentescos evolutivos dos micro-organismos,
o que, teoricamente, deveria servir de base para qualquer sistema de classificação
(HUGENHOLTZ e PACE, 1996). No caso da sistemática microbiana baseada
no fenótipo, muitos ensaios de características fenotípicas requerem função celular
ou crescimento . Nesse contexto, torna-se necessário o plaqueamento e o cultivo
em meios de cultura, para obtenção de culturas puras do micro-organismo ou a
observação direta ao microscópio para estabelecer seu fenótipo (H UGENHOLTZ
e PACE, 1996).
As técnicas microbiológicas convencionais, baseadas no isolamento de cultu-
ras puras e em ensaios morfológicos, metabólicos, bioquímicos e genéticos, embora
tenham fornecido informação extensiva a respeito da diversidade de comunidades
n1icrobianas tanto em sistemas naturais quanto en1 sistemas modificados pela
engenharia, apresentam lin1itação de informação, havendo desta maneira a neces-
sidade de um refinamento maior (ZAK et alii, 1994). Na maioria das vezes, não
se dispõe de informações a respeito das necessidades fisiológicas (nutricionais e
físico-químicas) dos micro-organismos e1n estudo, e a complexidade das relações
sintróficas e sin1bióticas, abundantes na natureza, corrobora para aumentar a di-
ficuldade de se obter culturas puras da maioria dos micro-organismos que vivem
nos mais diversos ambientes (SANZ e KOCHLING, 2007).
As limitações das técnicas tradicionais de detecção e de identificação de
m icro-organismos são ainda n1aiores quando se almeja estudar a diversidade
de micro-organismos associada a um dado an1biente. A diversidade das bacté-
rias é maior que a de qualquer outro grupo de organismos, sendo que qualquer
meio de cultivo é, em maior ou menor extensão, seletivo a determinados grupos
CAPÍTULO 6 ◊ TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS AO ESTUDO DA DIVERSIDADE MICROBIANA... 247
microbianos, fazendo com que seja favorecido o crescimento de alguns desses gru-
pos, enquanto outros, também presentes na amostra original, ficam impossibili-
tados de se desenvolver. Até mesmo quando se pretende utilizar um meio seletivo
para determinado organismo-alvo, algumas estirpes em estado não cultivável no
ambiente seriam excluídas das análises (COUTINHO et alii, 1999). Deste modo,
muitas vezes os micro-organismos provenientes do isolamento por métodos con-
vencionais que utilizam meio de cultura podem não representar os que estão real-
mente presentes em maior número.
Segundo Pace (1996), somente uma porção mínima equivalente a 1 % dos
micro-organismos presentes no meio ambiente podem ser cultivados por meio
de técnicas-padrão de cultivo e de plaqueamento, o que evidencia a limitação das
metodologias convencionais. Além disso, as contagens de células por microscopia
refletem apenas uma avaliação quantitativa da população microbiana, sendo pou-
co informativas sobre a diversidade dos organismos e1n uma amostra (PICKUP,
1991). Além do mais, vale len1brar que o conhecimento acerca dos organismos
procarióticos é limitado. Seu pequeno tamanho e muitas vezes a ausência de ca-
racterísticas fenotípicas distinguíveis somam-se ao fato de que a maioria desses
organismos não pode ser cultivada (PACE, 1997).
De forma alternativa aos métodos tradicionais e buscando-se superar a es-
cassez de informações fornecidas por essas metodologias, foram desenvolvidas
diversas técnicas, dentre as quais ganham destaque aquelas baseadas nos ácidos
nucleicos. Desta forma, surge a biologia molecular como alternativa para con-
tornar a limitação intrínseca às técnicas convencionais de estudo da diversidade
de micro-organismos. As limitações dos métodos tradicionais, aliadas ao avanço
tecnológico na área da biologia molecular, tornam as técnicas moleculares muito
utilizadas para o estudo da diversidade microbiana (VAN ELSAS et alii, 1998).
Assin1, a aventura da descoberta do mundo microbiano em diversos sistemas bio-
lógicos fica ainda mais interessante.
6.1.2 CONCEITOS BÃSICOS DE GENrTICA
Antes de se iniciar a descrição dos princípios e conceitos das principais téc-

nicas de biologia molecular empregadas no estudo da diversidade microbiana, é
interessante partir dos primórdios dessas ferramentas. Dessa forma, far-se-á uma
abordagem resumida referente aos conceitos fundan1entais de genética, engloban-
do informações a respeito dos ácidos nucleicos (DNA e RNA), de sua composição
e das importantes etapas de duplicação/replicação, transcrição e tradução envol-
vendo essas bio1noléculas portadoras da infor1nação genética.
Todas as células dos organismos, desde bactérias até seres humanos, con-
têm um ou mais conjuntos de uma coleção de DNA (ácido desoxirribonucleico)
característica da espécie. Essa bateria fundamental de DNA é denominada geno-

ma dos seres vivos, onde estão contidas todas as informações genéticas fundamen-
tais para sua existência. A partir do DNA, essas informações se expressam nas
células e se perpetuam na progênie. Dessa forn1a, pode-se dizer que o DNA tem
função de armazenar e transmitir a informação genética (código genético) .
O genoma pode ser subdividido em cromossomos, contendo cada um uma
só molécula contínua e muito longa de DNA. O cromosson10, por sua vez, é
composto por milhares de regiões chamadas genes (segmento de DNA que codi-
fica a informação requerida para a produção de determinado polipeptídeo ou de
um segmento de RNA), que são distribuídas para cada célula-filha no momento
da divisão celular. Portanto, a célula precisa fazer uma cópia de seus genes para
dividi-los igualmente entre suas células-filhas. A posição dos genes no cromosso-
mo é denominada lócus.
O DN A é um polhnero longo, não ra1nificado, composto de subunidades
denominadas desoxi rribonucleotídeos, agrupadas em quatro tipos. Cada tipo sub-
divide-se em moléculas menores, entre as quais se encontram bases nitrogenadas
(dNTPs) do tipo purinas (adenina-A e guanina-G) ou pirimidinas (timina-T e
citosina-C), açúcar do tipo pentose (desoxirribose) e grupo fosfato . As bases A e T
e G e C são complementares entre si e estão ligadas à pentose por uma ligação no
carbono 1' dessa última, e, o fosfato, associa-se ao carbono 5' da mesma pentose e
ao carbono 3' da pentose do nucleotídeo adjacente . E ssa última ligação é chamada
de fosfodiéster e constitui a cadeia de nucleotídeos. Esse tipo de ligação confere
polaridade à molécula de DNA que possui função na replicação e transcrição, cha-
mada de sentido 5' ~ 3', conforme mostrado na figura 6 .1. A direção das ligações
3' e S' diéster-fosfato de uma cadeia é inversa em relação à da outra cadeia. Dessa
forma, essas cadeias são comumente denominadas antiparalelas. Em função disso,
em cada extremidade da molécula, uma das cadeias polinucleotídicas tern1ina em
3' e a outra em S' .
O DNA é constituído por duas cadeias de nucleotídeos, sendo que a asso-
ciação entre elas é realizada por parean1ento de bases nitrogenadas. Con10 já res-
saltado, a adenina se associa à t imina e a citosina à guanina. Tal configuração se
deve a ligações do t ipo ponte de Hidrogênio (H), conforme ap resentado na figura
6 .2, as quais são as principais responsáveis pela estabilidade da hélice. Existem
duas possibilidades de pontes entre adenina e timina (envolvendo o nitrogênio
de uma base e o oxigênio da base complementar) e três entre citosina e guanina
(envolvendo dois Nitrogênio com Oxigênio e um Nitrogênio com Nitrogênio) . Tal
constituição é universal nos se res vivos, de modo que a estruturação do DNA é a
mesma para bactérias, fungos, vegetais e animais. Na verdade, a diferenciação está
na sequência em que os nucleotídeos se associam.
1
O P- O
1
GUANINA
93'
- o - P -0
1
Q CITOSINA
Ligação 5·
Fosfodiéster
J'
CITOSINA
l"
-o-1ó = OH
ADENINA
5' t:H, ~-...._
FIGURA 6.1 Representação esquemática da ligação fosfodiéster entre dois nucleotídeos (adaptado
de LEHN INGER, 1985).
A desnaturação pelo rompin1ento das pontes de hidrogênio pode ser completa

ou parcial, e ocorre n1ais cedo nas ligações A=T, as quais possuem duas pontes de
hidrogênio, ao contrário das ligações C = G, mais resistentes, uma vez que pos-
suem três pontes de hidrogênio. A desnaturação parcial permite a identificação
das zonas ricas em AT e das zonas ricas em CG.
Análises bioquímicas de preparações de DNA de diferentes espécies n1ostra-
ram que, apesar da composição de nucleotídeos ser muito variada, existe uma regra
geral quantitativa na qual o número de bases adenina é igual ao de timina (A= T)
e o de guanina é igual ao de citosina (G = C). O n1odelo construído revelou que os
números de pontes de hidrogênio efetivas que poderiam ser formadas entre G e C
ou entre A e T eram maiores do que entre qualquer outra combinação. O modelo
de dupla-hélice para DNA, proposto por \iVatson & Crick na década de 1950, ex-
plica perfeitamente a bioquín1ica quantitativa.
TIMINA Pontes de Hidrogênio
()_
/
ADENINA
lc1ros1NA I
FIGURA 6.2 Ligações por pontes de hidrogênio entre adenina e timina ou citosina e guanina
(adaptado de LEHN INGER, 1985).
Co1n a descoberta da estrutura dupla-hél ice do DNA, a transferência de in-

formações genéticas entre as células pôde ser explicada. Uma vez que cada fita de
D NA cont ém uma sequência de nucleotídeos, que são exatamente complementa-
res à sequência de nucleotídeos da outra fita, ambas as fitas carregam a mesma
informação genética. Então, se fo re1n designadas duas fitas A e A:., a fita A pode
servir de molde para fazer uma nova fita A:. e vice-versa. Assim, a informação
genética pode ser copiada por um processo no qual a fita A se separa da fita A:.,
e cada uma serve como molde para a produção de uma nova fita complementar.
E ste processo é denominado de replicação semiconservativa, o qual possibilita a
perpetuação da n1olécula de DNA por meio da divisão celular (n1itose ou meiose).
A partir deste entendimen to, os cientistas pude ram concluir que com o meca-
nismo de pareamento de bases, torna-se evidente que o DNA carrega info rmações
por meio da sequência linear de seus nucleotídeos. Cada nucleotídeo pode ser con-
siderado uma letra num alfabeto de quatro letras, utilizado para "escrever" men-
sagens biológicas. Os organi smos diferem um dos outros, pois suas respectivas
CAPÍTULO 6 ◊ TÉCNICAS DE BIOLOGIAMOLECULARAPLICADAS AO ESTUDO DA DIVERSIDADEMICROBIANA... 251
moléculas de DNA carregam diferentes sequências de nucleotídeos (ALBERTS et

alii, 1994).
A enzima que catalisa a formação da ligação fosfodiéste r 5 ' ➔ 3' entre o
novo nucleotídeo e a cadeia em formação é denominada DNA-polimerase. Após a
formação dessa ligação, a DNA-polimerase avança um resíduo de nucleotídeo na
cadeia-molde, posicionando-se novamente para promover a ligação de um novo
dNTP à cadeia em crescin1ento. É válido ressaltar que a DNA poli1nerase, respon-
sável pela polimerização da n1olécula de DNA, só consegue catalisar o crescimento
de uma cadeia polinucleotídica no sentido 5' ➔ 3', tendo em vista que a mesma só
é capaz de adicionar nucleotídeos na extremidade 3'-0H livre de uma cadeia em
crescimento. Esse mecanismo garante que a energia necessária para a incorpora-
ção de um novo nucleotídeo seja fornecida por ele mesmo, isto é, pela quebra das
ligações entre os fosfatos ligados ao carbono 5' do trifosfato do nucleotídeo a ser
incorporado, e não pela extre1nidade da cadeia em crescünento.
A adição de um nucleotídeo à cadeia por meio da DNA-poliine rase somente
ocorre caso esse estiver corretamente emparelhado ao nucleotídeo corresponden-
te da cadeia molde. Caso contrário, a DNA-polimerase remove o nucleotídeo da
extremidade 3' -OH livre emparelhado de fo rma incorreta, propriedade conhe-
cida como atividade exonucleotídica 3' ➔ S', inversa ao sentido de crescimento
da cadeia. Essa propriedade é na verdade um mecanismo corretor que possibili-
ta à DNA-polimerase conferir o último nucleotídeo incorporado, corrigindo seus
próprios erros de incorporação à medida que se desloca ao longo da molécula de
D NA-molde. A capacidade de autocorreção da DNA-polime rase é fundamental
para garantir a alta fidelidade de replicação do DNA, o que, por sua vez, propicia
a estabilidade genética no decorrer das gerações.
Caso esses erros que ocorrem durante o processo de replicação do DNA não
sejam corrigidos pela enzima DNA-polimerase, eles se perpetuam na forma de
mutações. Além disso, o DNA sofre continuamente danos causados por agentes
externos físicos e quín1icos e embora as células possua1n u1n mecanisn10 sofistica-
do para repará-los, alguns permanecem e se expressam também na forma de mu-
tações. Baixas taxas de mutações são, no entanto, fundamentais para a evolução,
tendo em vista que novos alelos (formas alternativas do gene que ocupam o mesmo
lugar em cromossomos homólogos) se formam a partir delas.
A outra molécula de ácido nucleico conhecida é o RNA (ácido ribonucleico),
formado a part ir da transcrição do DNA (reprodução de uma fita de DN A em uma
sequência de RNA complementar). O processo de t ranscrição é catalisado pela en-
zima RNA polin1erase e inicia-se em determinadas regiões do DNA denominadas
de promotores, sendo que é nesse sítio onde a RNA-polimerase se liga (etapa de ini-
ciação). A RNA-polimerase desen rola o DNA, dando início à síntese de RNA, que,
a exemplo da síntese de DNA, ocorre na direção S' ➔ 3' (etapa de elongação) . Por
fi1n, ocorre a etapa de terminação das cadeias polinucleotídicas de RNA sintetizado .
Ao contrário do D NA, o RNA é constituído somente por uma cadeia de nu-

cleotídeos que se associam por meio dos fosfatos (sentido 5' ~ 3 '), além de con-
sistir em uma molécula bem menor e menos estável em con1paração com o DNA.
As bases que constituem o RNA são adenina, uracila, citosina, guanina. O RNA
pode ser observado no núcleo e no citoplasma da célula.
Do ponto de vista funcional e estrutural, distinguem-se três variedades prin-
cipais de ácido nucleico: RNA de transferência ou transportador (tRNA), RNA
mensageiro (mRNA) e RNA ribossômico (rRNA). A função primordial dos dife-
rentes tipos de RNA é a síntese de proteínas (processo denominado tradução), que
são os compostos finais da expressão de um caráter genético estocado no DNA. As
proteínas desempenham funções estruturais e catalíticas.
O RNA mensageiro é o carreador da informação genética diretamente do
DNA, presente no núcleo, conduzindo a mesma até os sítios ribossômicos. A
partir dele, é possível se realizar a transcrição do código genético. A n1olécula de
mRNA é bem maior do que a proteína por ele formada, tendo em vista que são ne-
cessários três nucleotídeos para codificar um aminoácido. Nas células procarion-
tes, de forma particular, as moléculas de mRNA podem ser ainda maiores, uma
vez que nas bactérias uma longa molécula de mRNA pode ser traduzida a partir
de locais diferentes, originando mais de un1a proteína, conforme o local onde a
tradução teve início.
O RNA ribossomal consiste no lócus da síntese de proteínas no citoplasma.
Encontra-se livre no citoplasn1a ou associado ao retículo endoplasmático rugoso.
Quando combinado com proteínas, forma partículas facilmente visíveis ao micros-
cópio eletrônico denominadas ribossomos. Quando presos a filamentos de RNA
mensageiro, os ribossomas formam os polirribossomas, onde ocorre a síntese de
proteínas. ORNA ribossômico é muito mais abundante do que os outros dois tipos
de RNA, constituindo 80% do RNA celular. Os ribossomas são formados por duas
subunidades, uma maior e outra menor, com características funcionais e estrutu-
rais diferentes. As subunidades se prendem de modo reversível no início da síntese
da molécula proteica, separando-se quando a proteína está terminada. A subuni-
dade maior dos ribossomas das células eucariontes contém três tipos de RNA, com
coeficiente de sedimentação 28 S, 5 ,8S e 5 S. Já a subunidade maior dos ribossomas
das células procariontes possui dois tipos de RNA, um cujo coeficiente de sedimen-
tação é 23S e outro 5 S. A subunidade menor apresenta apenas um tipo de RNA:
18S nas células eucariontes e 16S nas células procariontes. Como será visto no
item 6.2 .1, essa subunidade é a mais utilizada em estudos que empregam técnicas
de biologia molecular para identificação e quantificação de micro-organismos.
Apresentando as menores moléculas entre os três tipos de ácidos ribonucleicos
e possuindo estrutura em forma de trevo, o tRNA tem a função de ligar e transfe-
rir os aminoácidos específicos requeridos na síntese de proteínas para as posições
corretas nas cadeias polipeptídicas em formação nos complexos de ribossomas e
RNA mensageiro (polirribossomas) . Para tanto, o tRNA possui a propriedade de

se combinar com aminoácidos e é capaz de reconhecer determinados locais da mo-
lécula do mRNA constituídos por u1na sequência de t rês bases. Estas sequências,
típicas para cada aminoácido, são denominadas códon. A correspondência entre
uma trinca de nucleotídeos e um aminoácido é denominada de código genético . A
sequência de três bases na molécula do tRNA e que reconhece o códon é chamada
anticódon. Para cada an1inoácido existe pelo n1enos un1 tRNA. É válido ressaltar
que o tRNA pode reconhecer mais de um códon, fazendo com que o código seja
conhecido como "degenerado". Tal característica é importante em atividades de
engenharia genética, a exemplo da amplificação de sequências gênicas a partir de
iniciadores degenerados, que tem como base a sequência de proteínas.
6.2 PRINCÍPIOS E CONCEITOS DE TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS AO ESTUDO

DA DIVERSIDADE MICROBIANA
6.2.1 INTROOUÇÃO AS TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
A melhor forma de classificação biológica é baseada nas relações filogenéticas

ou evolutivas. A informação genotípica, ou seja, as sequências das moléculas se-
mânticas (genes ou transc ritos, DNA, RNA e proteínas), constitui o histórico da
evolução e a dete rminação da sequência de DNA possibilitaria não só a medida
das relações evolutivas entre as moléculas sequenciadas, mas também forneceria
uma visão da evolução dos organisn1os a partir dos quais aquelas sequências foram
geradas.
A comparação de organisn1os a fin1 de dete rminar suas relações evolutivas
poderia ser conseguida por meio da comparação das sequências nucleotídicas de
seus genomas. Entretanto, essa informação é difícil de obter e inte rpretar e ge-
ralmente é pouco prática. Apesar disso, genótipos têm sido comparados de uma
maneira limitada, usando-se a hibridização DNA-DNA para determinar o grau de
parentesco entre micro-organismos cultivados (STACKEBRANDT et alii, 1993).
E studos de reassociação de DNA também têm sido usados para estimar a comple-
xidade das comunidades 1nicrobianas. Nessas análises, o DNA extraído de un1a
comunidade do ambiente é desnaturado e depois reassociado. A taxa de reassocia-
ção é uma medida da magnitude do número de genótipos individuais na amostra
ambiental (T ORSVIK et alii, 1990) . A conclusão desses estudos é que os ecossis-
temas microbianos naturais são in1ensamente con1plexos; u1na pequena a1nostra
de solo, por exemplo, pode conter milhares de genótipos diferentes.
Relações evolutivas também podem ser inferidas por meio de análise com-
parativa das sequências de genes individuais do genoma (ZUCKERKAND L e
PAULING, 1965). A avaliação do tipo filogenético (phylotype) de um organismo

fornece considerável perspectiva sobre as suas características. Algumas proprieda-
des do organismo podem ser previstas e baseadas nas propriedades dos organisn1os
relacionados a ele. Espera-se que todos os representantes de um certo grupo filoge-
nético tenham as propriedades que ocorrem frequentemente no grupo .
Devido à dificuldade de se utilizar a estrutura primária inteira do DNA para
faze r essas comparações, optou-se por co1nparar sequências gênicas codificadoras
de proteínas, sequências de aminoácidos e de genes que possuam suficiente grau
de conservação entre as espécies anal isadas, tais como os genes representativos do
RNA ribossomal (H ILLIS et alii, 1996) .
Nesse contexto, as técnicas de biologia molecular são frequentemente baseadas
nos ácidos ribonucleicos (RNAs) de pequenas subunidades ribossomais (16S rRNA
para procariontes) ou seus genes correspondentes (rDN As), considerados os bio-
polín1eros mais adequados para estudos de biodiversidade. E1n outras palavras, as
sequências que codificam para o RNA ribossômico 16S têm sido usadas mais ex-
tensamente para classificar de forma filogenética a diversidade da vida (\i\TOESE,
1987; vVOESE et alii, 1990).
A escolha desta n1olécula, em particular, se deve à sua universalidade e à
sua abundância e1n todos os seres vivos (10 3 a 10 5 ribossomos por célula), além
de derivar de un1 ancestral comun1, ser geneticamente estável e apresentar um
tamanho compatível com as an1plificações por PCR (descrita no item 6.2 .2).
Além dessas características, as moléculas dos rRNA apresentam regiões extre-
mamente conservadas entre todos os organismos que compartilham aquela es-
pécie de rRNA, já que em virtude de sua rigidez estrutural, necessária para a
manutenção de sua função, a taxa de mutações ao longo do processo evolutivo é
extremamente baixa, se comparada à de outros genes (ROSADO et alii, 1997).
Ao mesmo tempo, apresenta regiões altamente variáveis, sendo que o grau de
variação nessas regiões pode variar de um táxon a outro. A presença dessas regiões
variáveis oferece grandes possibilidades para o desenho de sondas reino-espe-
cíficas, gêne ro-específicas e até espécie ou estirpe-específicas (\i\TOESE, 198 7;
ROSADO et alii, 1996).
Em outras palavras, essas características peculiares da molécula de rRNA
permitem que se efetue comparações de organismos dentro de um único domínio,
como também possibilita1n diferenciar estirpes de mesmas espécies e classificar
de fonna filogenética a diversidade microbiana. Além disso, a sequência de genes
é suficientemente longa para gerar dados relevantes estatistican1ente e pode ser
faciln1ente sequenciada com a tecnologia atual . Nesse contexto, as diferenças nas
sequências dos ácidos nucleicos ribossomais vêm propiciando uma expansão do
conhecimento acerca da filogenia (construção de árvores filogenéticas) e represen-
tações esquemáticas quantitativas da diversidade evolutiva (HILLIS et alii, 1996;
WOESE, 1987; OLSEN, 1994). A construção de árvores filogenéticas, por sua
vez, consiste no modo mais incisivo para inferir relações filogenéticas de dados de
sequenciamento molecular.
Contando co1n as informações trazidas pelo uso de técnicas baseadas na molé-
cula de RNA, pela primeira vez foi possível avaliar a biodiversidade de um hábitat
natural de um modo completo e relativamente simples (SANZ e KOCHLING,
2007) . Uma grande vantagem de se utilizar as informações sobre as sequências
do rRNA é a sua disponibilização em base de dados (RDP, Gen-Bank, EMBL),
as quais, na maioria das vezes, poden1 ser acessadas gratuitamente, permitindo
assim a comparação das novas sequências obtidas com as sequências existentes
nesses bancos de dados (COUTINHO et alii, 1999) .
Estudos de diversidade molecular de micro-organismos devem enfocar gru-
pos funcionais definidos. Análises de sequências ribossômicas obtidas diretamen-
te de amostras ambientais são capazes de revelar novas espécies, quebrar antigos
paradigmas ou até n1es1no reestruturar a taxonomia de grupos funcionais. Para
citar um exemplo, o sequenciamento de fragmentos de rDNA 16S do grupo das
bactérias oxidadoras de amônio amplificados de amostras de solo e sedimentos
revelou que a vasta maioria das sequências era nova, significando que os três gê-
neros cultiváveis deste grupo (Nitrosomonas, Nitrosospira e Nitrosococcus) não eram
dominantes em nenhun1a das amostras analisadas (STEPHEN et alii, 1996). As
descobertas deste trabalho redefiniram este grupo funcional, previamente conside-
rado como de baixa diversidade e ressaltou a importância da abordagem molecular
para estudos de avaliação e monitoran1ento dos micro-organismos no ambiente
(ROSADO e DUARTE, 2002).
O aperfeiçoamento das técnicas de biologia molecular juntamente com o de-
senvolvimento crescente da área de bioinformática levou a uma especialização tão
grande na microbiologia ambiental que surgiu a denominada E cologia Microbiana
Molecular (ROSADO et alii, 1997).
Especifica1nente no que se refere à biotecnologia ambiental, especialmente
aos biorreatores destinados ao tratamento de águas residuárias, estes vêm sendo
aplicados há mais de um século no intuito de minimizar o impacto causado pela
ação antropogênica sobre o meio ambiente. Dessa forma, o projeto desses biorrea-
tores foi gradualmente aperfeiçoado de modo a melho rar o seu desen1penho em
termos de eficiência de re1noção de poluentes (principalmente matéria orgânica e
nutrientes), tornando sua operação mais estável.
Apesar de sua extensiva utilização por n1ais de un1 século e de todas as ino-
vações pertinentes a esses sistemas biológicos, muitas plantas de tratamento ain-
da enfrentam diversos problemas, tais como intumescimento do lodo (bulking),
excesso de espuma e problemas relacionados à nitrificação e à remoção de fosfato
(MARTINS et alii, 2004; SE VI OUR et alii, 2000) . As razões para esses proble-
mas operacionais poden1 ser diversas, podendo ser atribuídas a un1 projeto imp ró-
prio, operação inadequada, excesso de afluente ou choques de carga (compostos
orgânicos, matrizes contendo substâncias tóxicas, alta salinidade, entre outros).

Entretanto, deve-se atentar ao fato de que a maioria dos problemas de desempe-
nho está relacionada a mudanças na estrutura das co1nunidades microbianas. Para
exemplificar, o processo de lodos ativados, considerado o "coração" da maioria dos
sistemas de tratamento de águas residuárias, geralmente contém diversos tipos
de micro-organismos, tais como bactérias, protozoários, fungos, micrometazoá-
rios e algas. De toda essa população microbiana, 95% corresponde a bactérias
GENKINS et alii, 1993), as quais apresentam papel fundamental no processo de
degradação de poluentes.
A despeito da importância dos p rocessos biológicos de tratamento de águas
residuárias, informações a respeito da ecologia microbiana desses sistemas têm
sido bastante escassas. Por muito tempo estes foram (ou ainda vêm sendo, em al-
guns casos) considerados uma verdadei ra "caixa preta", desprovidos de elucidação
completa dos fenôn1enos microbiológicos que neles acontecem. Na grande 1naioria
das vezes, o interesse está centrado unicamente na eficiência de remoção de di-
versos poluentes, com o objetivo primordial de adequar a água residuária tratada
aos requisitos impostos pela legislação ambiental em vigor. Em geral, utilizam-se
as vantagens do incrível potencial metabólico das co1nunidades microbianas sem
conhecimento detalhado dos organismos envolvidos.
Dessa forma, a pesquisa sobre a microbiologia dos processos biológicos de tra-
tamento sofreu severas limitações metodológicas até uma década atrás. Métodos
dependentes de cultivo como contagem e1n placas ou número mais provável (NMP)
eran1 preferencialmente utilizados para detecção e quantificação de bactérias re-
levantes em tais sistemas de tratamento. Na verdade, esses métodos tradicionais,
apesar de sua limitação, já mencionada anteriormente, são ainda utilizados em al-
guns casos para controle da qualidade de efluentes, particularmente com respeito
a patógenos e a vários organismos indicadores.
A partir da última década, a introdução de dife rentes técnicas moleculares
e os novos discernimentos em microbiologia (notadamente relacionada ao trata-
mento de águas residuárias) têm auxiliado na melhoria do projeto e desempenho
de novas gerações desses biorreatores, auxiliando na identificação dos verdadeiros
protagonistas dos processos biológicos, isto é, os micro-organismos (especialmente
os procariontes), contribuindo igualmente para desvendar o que se passa no seio
desses processos. Desse n1odo, é possivel se determinar de for1na precisa a compo-
sição e a dinâmica das con1unidades microbianas tanto de sistemas de lodos ativa-
dos quanto de sistemas que fazem uso de biofilmes, que, conforme já comentado,
representam papel crucial no tratamento biológico de efluentes.
Nesse contexto, deve ficar claro que a ecologia microbiana e a biotecnologia
estão intrinseca1nente relacionadas, sendo que a prin1eira gera fundamentação
teórica para a realização das práticas biotecnológicas. Em última análise, a bio-
tecnologia ambiental aplica os conceitos e ferramentas da ecologia microbiana
para melhor gerenciar seus processos. Caso gerenciados de forma apropriada, uma
ampla gama de benefícios pode ser obtida.
Ao se pensar na possibilidade de se identificar os 1nicro-organis1nos presentes
em um dado sisten1a de tratamento, pode surgir um questionamento: por que é
importante determinar quais tipos de bactérias estão presentes em cada grupo
funcional de uma determinada planta de tratamento de águas residuárias? A res-
posta para esse questionamento, en1bora passível de subjetividade, pode ser dada
levando-se em consideração que a identificação dos micro-organimos-chave que
estão envolvidos em cada processo degradativo que ocorre nos reatores biológi-
cos de tratamento, seja de matéria orgânica, nutrientes (nitrogênio e fósforo) ou
ainda de micropoluentes e patógenos, é de grande valia uma vez que esses são,
em sua grande maioria, responsáveis pela utilização máxima de um determinado
substrato . Tal fato está diretamente relacionado à obtenção de maiores eficiências
de remoção de poluentes, o que ven1 ao encontro dos objetivos primordiais de
qualquer estação de tratamento de águas residuárias. Além disso, as ferran1entas
moleculares podem ajudar a identificar bactérias até então não cultivadas, al-
gumas importantes na formação da estrutura do floco e outras responsáveis por
ocasionar problemas durante a operação de sistemas de tratrunento, tais como
intun1escimento do lodo ou bulking (relacionado a bactérias filamentosas) e forma-
ção excessiva de espuma (WAGNER e LOY, 2002) . Dessa forma, fica claro que a
identificação e a análise, tanto de mic ro-organismos benéficos quanto maléficos
ao sistema, devem ser asseguradas, uma vez que a eficiência e a robustez de un1a
planta de tratamento de águas residuárias dependem da composição e da atividade
de toda sua comunidade microbiana.
Em suma, a possibilidade de se relacionar a composição da comunidade n1i-
crobiana presente em sistemas de tratamento e as funções de cada população
bacteriana, de forn1a individual, está se tornando uma realidade cada vez mais
próxima. Como tais informações podem ser utilizadas para melhor controlar os
processos biológicos é u1na resposta que no futuro próximo será respondida.
Diversos grupos funcionais de bactérias envolvidas nos processos mais co-
muns de tratamento já estão claramente identificados e descritos. Esses grupos
são representados, primordial mente, por bactérias envolvidas na nitrificação e em
alguma extensão por bactérias envolvidas na desnitrificação, por diversas bacté-
rias envolvidas no processo de remoção biológica de fósforo (Enhanced Biological
Phosphorous Removal - EBPR) e pela maioria das bactérias causadoras de pro-
blen1as relacionados à sedimentação do lodo (bulking) e à forn1ação de espumas
e escumas. Em cada grupo funcional, por exemplo dos nitrificantes, um número
limitado de linhagens filo genéticas ( < 1O) é encontrado em plantas nitrificantes,
em geral, sendo que poucas populações dominantes (3 -5) estão presentes em uma
única planta, en1 particular (NIELSEN et alii, 2009).
Além da importância da identificação dos micro-organismos-chave na de-

gradação de diversos poluentes em sistema de tratamento de águas residuárias,
deve-se atentar ao fato do surgimento de novas e interessantes soluções susten-
táveis. Entre essas, incluem-se a recuperação de nutrientes (p. ex. P) de águas
residuárias, ou conversão de componentes de resíduos orgânicos em compostos
utilizáveis como bioplásticos (poliidroxialcanoatos - PHA). A conversão de resíduos
orgânicos en1 energia pela p rodução de 1netano por meio da digestão anaeróbia
tem sido utilizada por décadas e esses processos começam a ser desenvolvidos
juntamente com outros processos geradores de energia, a exemplo das células a
combustível microbianas (NIELSEN et alii, 2009). No intuito de se atingir esses
objetivos, é evidente que para gerenciar esses sisten1as microbianos complexos é
fundamentalmente necessário ter um conhecimento a respeito das populações mi-
crobianas envolvidas e os fatores que afetam a sua atividade. E esse conhecimento
não se refere apenas à identificação, que por sinal deve se r bastante confiável e
precisa, mas também à ecofisiologia, ecologia e dinâmica populacional das comu-
nidades microbianas envolvidas.
Deve-se enfatizar que a composição da comunidade microbiana em uma de-
terminada planta de t ratamento depende intimamente da co1nposição da água
residuária, do projeto do processo e do n1odo de operação da planta. Obviamente
que certos grupos funcionais são dominantes somente se processos específicos são
incluídos no projeto da planta de tratamento (p. ex. remoção de nitrogênio ou
EBPR). Entretanto, pouco se sabe a respeito dos fatores controlado res determi-
nantes da composição da comunidade 1nicrobiana. Dessa forma, estudos a respeito
da n1icrobiologia da planta de tratamento de águas residuárias são importantes
para observar e registrar os fatores potenciais que podem ser decisivos para apre-
sença de diferentes espécies.
Caso um siste1na de lodos ativados esteja visando so1nente à remoção de C,
há a necessidade de apenas tanques ae róbios (além de sedimentado r). Já quando as
etapas de desnitrificação/EBPR também estão incluídas, tanques anóxico~anae-
róbios também precisam estar presentes em adição aos aeróbios. A pressão seletiva
devido à existência de tanques anóxicos/anaeróbios modifica de forma substancial
a estrutura da população de micro-organismos. A idade do lodo é outro parâmetro
determinante das comunidades de bactérias dominantes. Baixos valores desse pa-
râmetro (menores que 5-1 O dias) podem não permitir a ocorrência de nitrificação
devido às baixas velocidades de crescimento dos micro-organismos nitrificantes.
Em contrapartida, alta idade do lodo (maiores que 20-30 dias) é crucial para
obtenção de remoção integral de N e P em climas temperados. Plantas operadas
a altas temperaturas (maiores que 40ºC) geralmente selecionam comunidades mi-
crobianas 1nenos comuns (NIELSEN et alii, 2009) .
Como comentado anteriormente, a composição da água residuária afluente
é outro fator decisivo no crescimento bacteriano e apresenta influência marcante
,
na determinação das populações dominantes em um determinado sistema. Aguas
residuárias industriais diferem enormemente de águas residuárias domésticas. O
prin1eiro tipo pode conter inúmeras substfu1cias nocivas ao desenvolvimento mi-
crobiano nos processos biológicos de tratamento (substâncias orgânicas/inorgâni-
cas causadoras de efeito inibitó rio aos micro-organismos), podendo ser desprovidas
de importantes nutrientes, co1110 P e N, e outros micronutrientes. Dependendo
de sua procedência, águas residuárias industriais podem conter elevadas concen-
trações salinas, afetando igualmente o ecossistema microbiano. Por sua vez, o
segundo t ipo apresenta uma relação mais balanceada de orgânicos e nutrientes,
além de conter maior número de micro-organismos. E sses micro-organismos ad-
vindos juntan1ente con1 a água residuária também podem afetar a composição da
população microbiana no interior dos reatores biológicos.
Outra questão importante a ser levada em consideração, também pobremente
explorada e entendida, se refere à importância da platafonna tecnológica aplicada
para realizar um processo específico, tal como a nitrificação. Investigar se diferen-
tes configurações de reatores, operados de forma contínua ou batelada, e receben-
do a mesma água residuária levam à colonização de diferentes micro-organismos,
é um tópico de estudo a ser destacado. A tabela 6 .1 sumariza alguns potenciais
fatores determinantes da população microbiana em sistemas de tratamento de
águas residuárias.
Poucos estudos descrevendo a composição completa da comunidade de micro-
-organismos de estações de tratamento foran1 publicados. Entre eles pode-se men-
cionar o trabalho de JURETSCHKO et alii (2002), que estudaram o processo de
lodos ativados para o tratamento de efluente industrial, no intuito de remover C e
N, e o trabalho de KONG et alii (2007), vinculado ao estudo de remoção bioló-
gica de N e P de uma mistura de água residuária doméstica e industrial. De un1a
maneira diametralmente oposta, diversos estudos de populações específicas têm
sido realizados em diversos sistemas de tratamento (escala laboratorial ou real),
referindo-se so111ente a micro-organismos nitrificantes e/ou desnitrificantes, or-
ganismos acumuladores de fosfato, bactérias filamentosas, entre outros. No item
6 .3 .2 serão descritos inúmeros desses estudos, cada qual visando aos micro-orga-
nismos específicos em diferentes configurações de reatores. A tabela 6 .2 apresenta
uma relação das espécies e gêneros mais comumente encontrados em estações de
tratamento.
TABELA 6.1 Visão geral de importantes fatores determinantes da estrutura de comunidades

microbianas em estações de tratamento de águas residuárias (adaptado de NIELSEN et alii, 2009)
Fatores Descrição dos fatores
Desempenho do processo □ Remoção de C, remoção de C e nitrificação

o Remoção de C e N (nitri/desnitrificação)
o Remoção de C e N e EBPR
□ Precipitação química de P
O Idade do lodo
Operação da planta □ Concentração de oxigênio

D Tempo de retenção celular
D Adição de agentes químicos (sais de Fe/AI, polímeros)
o Adição de C externo (metanol)
D Concentração de biomassa
Tipo da planta de tratamento D Lodo ativado (regime contínuo ou batelada)

□ Biofiltros (filtros de perco lação)
O Biorreatores a membranas
D Reatores de leito móvel com biofilme
Composição da água residuária D Industrial/doméstica

D Frações solúveis/particuladas (C, N e P)
o Compostos orgânicos específicos
o Micronutrientes
D Substâncias tóxicas
D Salinidade
D Alcalinidade
D pH
Para se t er uma ideia da importância da abordagem molecular e1n estudos

relacionados ao processo biológico de remoção de nitrogênio, por décadas os prin-
cipais micro-organismos responsáveis por esse processo eram representados por
Nitrosomonas e Nitrobacter, que são cultiváveis. Lançando mão de técnicas mole-
culares, ficou evidenciado que outros n1icro-organismos também são in1portantes.
O mesmo ocorre para os micro-organismos relacionados à remoção de fósforo, os
quais são capazes de acumular polifosfato . Acinetobacter spp. estão entre os mais
conhecidos atuantes nesse último processo, justamente por terem sido cultivados.
Entretanto, outros vários candidatos não cultiváveis estão sendo evidenciados
com a utilização das ferramentas de ecologia molecular microbiana.
TABELA 6.2 Micro-organismos comumente observados em sistemas de tratamento de águas

residuárias (adaptado de NIELSEN et alii, 2009)
Grupo funcional Populações comumente reportadas
N ltrificantes
Oxidadores de amônia (AOB) Gênero Nitrosomonas (N. europaea, N. eutropha, N. mobilis e

N. o/igotropha (classe f>-Proteobacteria)
Gênero Nitrosospira (classe f>-Proteobacteria)
Oxidadores de nitrito (NOB) Gênero Nitrospira (sublinhagem 1 e 2) (filo Nitrospirae)

Gênero Nitrobacter (classe a-Proteobacteria)
Bactérias Anammox Linhagens Brocadia, Kuenenia, Scalindua e Anammoxoglobus

(filo Planctomicetos)
Desn itrificantes Gênero Candidatus Accumulibacter (classe f>-Proteobacteria)

Gênero Azoarcus (classe f>-Proteobacteria)
Gênero Curvibacter ( classe f>-Proteobacteria)
Gênero Thauera (classe f>-Proteobacteria)
Gênero Zoogloea (classe f>-Proteobacteria)
Organismos acumuladores Gênero Candidatus Accumulibacter (classe f>-Proteobacteria)

de fosfato (PAO) Gênero Tetrasphaera (filo Actinobacteria)
Organismos acumuladores Gênero Candidatus Competibacter (classe y-Proteobacteria)

de glicogênio (GAO) Gênero Defluviicoccus ( classe a-Proteobacteria)
Bactérias filamentosas Espécies da classe a-Proteobacteria

Gênero Sphaerotilus (classe f>-Proteobacteria)
Gênero Thiothrix ( Theiothrix spp e tipo 021N)
(classe y -Proteobacteria)
Candidatus Microthrix parvicella (filo Actinobacteria)
Gênero Skermania (filo Actinobacteria)
Gênero Gordonia (filo Actinobacteria)
Gênero Rhodococcus (filo Actinobacteria)
Gênero Dietzia (filo Actinobacteria)
Espécies do filo e c lasse Chloroflexi
Gênero Haliscomenobacter (filo Bacteroidetes)
Outro exemplo referente às informações fornecidas pelas ferramentas mo-

leculares está ligado a inúmeros estudos a respeito de bactérias oxidadoras de
an1ônia (AOB) em sistemas de tratamento de águas residuárias, os quais têm su-
gerido que diferentes plantas apresentam diferentes populações e diferentes níveis
de riqueza de espécies. Por exemplo, Okabe et alii ( 1999) verificaram que um
reator com biofilme de escala laborato rial para o tratamento de água residuária
doméstica era dominado por AOB da espécie N . europaea. Já Schramm et alii
( 1998) e Juretschko et alii ( 1998) verificaram que as populações de AOB em

plantas de escala laboratorial e real eram dominadas por Nitrosospira e N . mobilis,
respectivamente. Entretanto, baseando-se no gene amoA, é notável que espécies de
Nitrosospira não são importantes AOB em sistemas de tratamento de escala real
analisados até o presente momento (WAGNER e LOY, 2002) .
É importante ressaltar que o conhecimento e a info rmação adquiridos com
o uso dessas técnicas moleculares podem, algumas vezes, ser escassos e a sua
utilidade para engenheiros e técnicos que lidam com o projeto e a operação dos
biorreatores não está bem definida. Sendo assim, deve-se ter em mente como o
conhecimento adquirido pelas técnicas moleculares pode vir a ser utilizado para
melhorar o desempenho de sistemas de tratamento. E é justamente sobre essa
questão que recaem as maiores incertezas. Perguntas como o quanto importante é
ter o conhecimento da composição exata da comunidade microbiana para o desem-
penho do processo devem ser respondidas no intuito de to rnar a imensa gama de
informações adquiridas pelas ferramentas moleculares mais úteis e aproveitáveis.
Até o presente momento, está muito pouco documentado a relação existente entre
uma determinada comunidade microbiana, a operação e a estabilidade de sistemas
biológicos de trata1nento. A perspectiva é que, no futu ro, baseando-se em identi-
ficações confiáveis das populações n1icrobianas por meio de técnicas moleculares,
tais questões possam ser respondidas.
Obviamente que não se faz necessário um conhecimento específico da posição
filogenética ou da classificação taxonômica de cada micro-organismo atuante em
um dado sistema biológico para o projeto de uma planta de tratamento de águas
residuárias. Entretanto, os conhecimentos advindos das técnicas moleculares aju-
dam a compreender melhor os processos biológicos e a quebrar certos paradigmas
consolidados há tempos (SANZ e KOCHLING, 2007) . A utilização de n1etodolo-
gia convencional combinada com metodologia molecular, primando, dessa forma,
por uma abordagem com vários enfoques (polifásica), também deve ser incentiva-
da, uma vez que já foi provado que ambas as metodologias deixam lacunas quan-
do trabalhadas isoladamente, n1as que podem ser preenchidas quando utilizadas
concomitantemente. Além disso, lançando mão de uma abordagem polifásica é
possível se chegar o n1ais p róximo possível do quad ro real de um sistema biológico
(MUYZER e SMALLA, 1998).
Na figura 6 .3 estão representadas, de forma esquemática, algumas técnicas
moleculares usadas no estudo da diversidade genética de micro-organismos a par-
tir de amostras ambientais. Em geral, a estratégia usada para coletar as amostras
e o n1étodo de extração do DNNRNA da mesma são, p rimordialmente, os fatores
que irão ditar o sucesso do experimento.
Amostra
Hibridização
ín situ l Extração
PGR
in situ
Cinética de Eletroforese
reassociação ◄ DNA RNA ► LMW-RNA
de DNA
/
PCR
\ RT-PCR ► Exp ressão
A •
genica
Análise por
Hibridização
1
l
Clonagem de produtos de PCR
DGGEfTGGE/
ARDRA, etc.
Dot/Colony
Southern Blot i
Sequenciamento
i Hibridização
Análise das sequências
(Banco de Dados)
i
Análise Filogenética
i
Desenho de sondas
moleculares
FIGURA 6.3 Representação esquemática de diversas técnicas moleculares utilizadas na

caracterização de micro-organismos em amostras ambientais (adaptado de ROSADO e
DUARTE, 2002).
Seja em ambientes naturais ou em ambientes concebidos pela engenharia

(reatores biológicos, por exemplo), uma grande diversidade de micro-organisn1os
com diferentes densidades se faz presente. Esta grande diversidade representa a
variedade das diversas populações que se organizam em diferentes comunidades.
Geralmente, estas se estruturam de uma maneira similar, sendo compostas por
muitas populações representadas com poucos indivíduos e poucas populações com
muitos indivíduos, ou seja, don1inantes.
Ao tentar realizar um levantamento de uma determinada comunidade mi-
crobiana, determinando as espécies componentes e o número de indivíduos pre-
sente em cada espécie, dificilmente será possível amostrar todas as populações
existentes, principalmente as mais raras. Por isto, a fim de tornar os dados obti-
dos os mais próximos da realidade, algumas etapas devem ser respeitadas antes da
coleta proprian1ente dita. O prin1eiro passo antes de se iniciar qualque r trabalho é
formular uma hipótese a ser provada. Feito isto, traçan1-se os objetivos para pro-
var esta hipótese. Uma vez traçados os objetivos define-se a metodologia. Esta eta-
pa é de grande importância, pois aqui se definem não somente as análises a serem
feitas, mas toda a an1ostragem a ser real izada. Questões con10 quantas amostras
e qual a frequência de obtenção destas devem ser pensadas com cuidado, uma vez
que consistem no suporte estatístico para o trabalho . Se o trabalho consiste em
conhecer a comunidade, as amostras deven1 ser retiradas aleatoriamente do meio
estudado (reatores biológicos quando se refere ao tratan1ento de águas residuárias)
uma vez que as diferentes populações podem se encontrar distribuídas de forma
agregada (no caso de biofilmes), uniforme ou mesmo aleatórias.
Uma vez definida a amostragem, parte-se para a coleta. O máximo de cui-
dado para se evitar contaminação nesta etapa faz-se necessário, de modo que a
amostra obtida represente fidedignamente o número ou a atividade das popula-
ções em questão. Equipamentos específicos podem ser utilizados dependendo do
substrato a ser amostrado. A preservação das amostras até o p rocessamento destas
também é de suma importância . Recomenda-se guardar a amostra e1n banho de
água e gelo com ten1peratura entre O e 4°C ao abrigo da luz. O congelan1ento em
alguns casos é prejudicial . Entretanto, para análises moleculares, é recomendado
o congelamento da amostra a - 20ºC logo após a coleta. O tempo de preservação
també1n deve ser observado . Vários trabalhos já demonstraram que quanto antes
a an1ostra for processada, mais p róximo da realidade estarão os resultados. Dessa
forma, o ideal é iniciar o processamento da amostra imediatan1ente após a mesma
ter sido coletada.
O processamento, assim como a análise, vai depender do tipo de substrato e
do grupo microbiano a ser trabalhado. Porém, qualquer que sejam estes, a homo-
geneização das amostras deve ser realizada anteriorn1ente . Diluir ou concentrar a
amostra irá depender do an1biente amostrado. Análises qualitativas e quantitati-
vas devem ser realizadas.
Com o desenvolvimento da ecologia microbiana molecular, tornou-se funda-
mental o investimento em métodos de extração de DNA dos diferentes tipos de
organismos a partir de diferentes amostras, sendo essa uma etapa essencial em
t rabalhos que utilizam técnicas moleculares (ROSADO et alii, 1996) . A escolha do
melhor método para isolamento de DNA ou RNA a partir de diferentes a1nbientes
sejam, naturais ou concebidos pela engenharia, a exemplo dos reatores biológicos
empregados no tratamento de águas residuárias, vai depender do tipo de ácido nu-
cleico a ser isolado e do tipo de ambiente de onde este será extraído. Existem diver-
sos métodos destinados à extração de ácidos nucleicos de a1nostras provenientes de
diferentes locais, sendo que cada caso deve ser estudado de forma individual.
Diversos protocolos já foram descritos para a extração de ácidos nucleicos

do ambiente, mesmo tendo-se em vista as dificuldades gerais que estas técnicas
ap resentam e1n relação à aplicação e ao desenvolvin1ento (OGRAM et alii, 198 7;
SMALLAet alii, 1993; VAN ELSAS et alii, 199 7). A extração tem sido realizada
por meio de duas abordagens: lise direta in situ (OGRAM et alii, 1987) ou extra-
ção celular seguida de lise celular (HOLBEN et alii, 1988) . Estes 1nétodos são
provenientes de dois estudos p ioneiros que servira1n de ponto de partida para o
desenvolvimento e o aperfeiçoamento de outros protocolos n1ais sin1ples e rápidos
(TREVORS e VAN ELSAS, 1995).
A maior parte das técnicas de extração de ácidos nucleicos do ambiente utili-
zadas atualmente envolve a extração direta de DN A e/ou RNA. Esta metodologia
possibilita maior ganho total de DNA (OGRAM, 2000). É importante lembrar
que o método mais eficaz, para o estudo da diversidade de bactérias, deve levar
em consideração a extração de ácidos nucleicos de t ipos celulares bastante dife-
renciados, con10 esporos bacterianos e células vegetativas Gram-posit ivas e Gram-
negativas (NIEMI et alii, 2001). Estes métodos, em geral, envolvem o emprego
da desagregação mecânica das células. Neste caso, o maior problema é a fragmen-
tação excessiva do material nucleico obtido. A fragmentação impossibilita estudos
de hibridização de DN A total da comunidade e pode levar à obtenção de artefatos
na reação de PCR (NIEMI et alii, 2001 ).
Para extração de DNA das amostras de água existem basicamente quatro
estratégias diferentes. A primeira destas utiliza lise das células microbianas por
métodos quünicos, como SDS e Fenol (OEMÜLLER et alii, 1990). A segunda
utiliza a lise n1ecânica das células (FERRIS et alii, 1996). Nos demais métodos
se extrai o DNA das amostras utilizando o calor gerado no próprio termociclador
durante a reação de PCR. Kirchman et alii (200 1) propõem que se coloque um
pequeno fragmento da n1embrana utilizada nas filtrações das a1nostras no tubo
de amplificação para servir como molde na reação. 0vreãs et alii (1997) utilizam
como n1olde uma suspensão de células concentradas não lisadas. Segundo os auto-
res, apenas 3% das células são perdidas nessa metodologia.
Diante desse contexto, a escolha de um protocolo de extração vai depender do
material a ser usado, bem como da aplicação do ácido nucleico, o qual vai requerer
diferentes graus de pureza (MELO e VALADARES, 1998). Diversos kits comer-
ciais para extração de DNA estão disponíveis no mercado, os quais apresentam
diferentes protocolos. Deve ficar claro que para cada amostra específica deve ser
escolhido o melhor método disponível, de acordo con1 a sua procedência.
A etapa de extração do 1naterial genético, conforme rep resentado na figura
6 .3, pode ser real izada visando atender vários objetivos, dentre os quais se pode
mencionar estudos de biodiversidade (cinética de reassociação) e amplificação por
PCR para detectar e determinar a dive rsidade microbiana. Nesse caso, o proce-
dimento de amostragem escolhido é crucial e consiste e1n um fator limitante na
detecção de micro-organismos específicos em virtude de seu caráter não represen-

tativo (ROSADO e DUARTE, 2002).
O produto PCR pode ser analisado por métodos de fingerprinting molecular,
tais como DGGE e TGGE (item 6.2 .3), ARDRA, T-RFLP, AFLP, RISA, RAPD e
SSCP (item 6 .2 .6), ou ainda ser clonado e sequenciado (item 6 .2 .4), sendo dessa
forma realizada a análise das sequências obtidas. Essas sequências, por sua vez,
se rão muito úteis no desenho de sondas oligonucleotídicas para hibridização in
situ por fluorescência - FISH (item 6 .2.5), técnica que não necessita de extração
de DNA.
Complementando as informações contidas na figura 6.3, a figura 6 .4 apre-
senta, de forma ilustrativa, um resumo dos principais procedimentos utilizados
em ecologia microbiana molecular, particularmente os envolvidos na análise da
comunidade microbiana de um reator biológico destinado ao tratamento de deter-
n1inada água residuária.
Realçando o que foi descrito anteriormente, a representação esquemática da
figura 6.4 evidencia a importância de se combinar as técnicas convencionais de
cultivo e isolamento com as metodologias moleculares, especialmente quando se
deseja um n1elhor entendimento das comunidades n1icrobianas presentes em um
detern1inado an1biente. Vale mencionar que os esquemas representativos de cada
técnica mostrados serão melhor compreendidos pelo leitor ao longo da leitura do
capítulo .
A seguir, será feita uma abordagem das principais técnicas de biologia mole-
cular utilizadas tanto na identificação e na quantificação de micro-organismos em
diversos sistemas biológicos quanto no estudo das modificações dos perfis apre-
sentados por essas populações mic robianas em diferentes condições ambientais.
Serão igual1nente descritas outras técnicas adicionais aplicadas menos frequente-
mente, embora também possuindo grande potencial de utilização.
e,
;e,.
En riquecimento e isolamento -o
=.·
e
r-
0
Ligação dos produtos

=
o
Extração dos ácidos
Ampl ifiação dos genes de PCR com vetor de ......
m-
Reator nucléicos clonagem ~
biológico de
tratamento 4~,~(f"
rRNApor PCR
o
~ -oOo
o Transformação
e,
~
e:,
m
=
vv ( ' 00 ~ em E. coli ô
r-
_____
0
~xx, G)
;e,.
s:::
) or-
m
e,
Fixação Uso de sequências clonadas
e
s;
de células Análise ;;o
eletroforética como padrões ;e,.
e> tft ~
Análise padrão
T
Fingerprinting (DGGE) Seq uenciamento 1

-o
e
ge:,
~
caracterização do- ~
clones E,
m
C/)
......
o e
e:,
o
Sondas com ~ Desenvolvimento de ~
e:,
ligonucleotídeos sondas específicas a parti r <
m
r---......:.·_...;e:::.:;specíficos . das seq uências clonadas Determinação de
~
ou das sequências dos sequência de rR e:,
;e,.
tfP ~ 1
organismos cultivados
e:,
m
,/ ,0 º
- • - _ - _
1 1 s:::
e,
~
•
~-IT'[1I1IIT
Isolados cultivados
~
=
;e,.
:z
;,:,,
Hibridização in situ Enriquecimento e isolamento

(FISH)
FIGURA 6.4 Ilustração das técnicas utilizadas em ecologia microbiana molecular (adaptado de HEAD et alii, 1998). N
a,
....,
6.2.2 PCR
As primeiras técnicas 1noleculares en1pregadas após a extração total dos ácidos

nucleicos das comunidades microbianas de amostras ambientais foram a hibridi-
zação de DNA, a determinação da porcentagem do conteúdo de GC nas comunida-
des, os estudos de reassociação de DNA e RFLP. A maior limitação destas técnicas
é a necessidade de grande quantidade de DNA relativamente puro (FRANKLIN
et alii, 1999). Atualmente, as técnicas moleculares empregadas no estudo da eco-
logia microbiana têm como princípio básico amplificar uma sequência-alvo por
meio da reação em cadeia de pol ünerase, mais conhecida simplesn1ente pela sigla
PCR - Polimerase Chain Reaction, apropriando-se de tal técnica ou de suas varia-
ções para o estudo da diversidade de micro-organismos nos mais diversos siste-
mas biológicos. Descrita po r Mullis e Faloona (1987), a PCR consiste em uma
poderosa ferramenta que vem revolucionando a p rática da Biologia Molecular,
permitindo o desenvolvimento de protocolos altamente sensíveis e específicos para
a detecção e/ou quantificação de micro-organismos, plasmídios, transposons ou
genes (ROSADO et alii, 1996).
A reação en1 cadeia de polimerase pôde ser desenvolvida a partir do enten-
dimento do mecanismo de duplicação do DNA, e é baseada em diversos fatores
desse mecanismo, como, entre outros, o fato de o DNA servir de molde para sua
própria duplicação, e que un1a enzima denominada DNA-polimerase catalisa a
formação de uma nova fita de DNA. Através da PCR, é possível se amplificar in
vitro, de forma seletiva, uma única molécula de DNA ou RNA milhões de vezes
em apenas algumas horas, utilizando para tanto os elementos básicos do proces-
so de replicação natural do DNA. Dessa fonna, torna-se possível a detecção e a
análise de sequências de genes específicos de uma amostra, sem a clonagem e não
necessitando de h ibridizações (OSTE, 1988; VAN DER ZEE e RUIS, 1997).
Uma desvantagem dessa técnica é a necessidade prévia de informação a respeito
das sequências-alvo de DNA que se deseja copiar e a infidelidade na replicação do
DNA (STRACHAN e READ, 2002).
Em linhas gerais, o método baseia-se na capacidade que iniciadores específicos
(primers) para determinada região do DNA de u1n organismo têm de anelar somente
con1 a sequência desejada por meio da complen1entaridade das bases, sendo capazes
de localizar um sítio único em um genoma de alta complexidade. Esses primers, que
são oligonucleotídeos curtos possuindo geralmente de 1O a 20 pares de bases, propi-
ciam uma hibridização perfeita com os filamentos opostos da sequência-alvo (pares
de base da fita do DNA estudado) e desencadeiam a síntese da sequência de DNA
complementar com auxílio da enzima DNA-polimerase. Esta última é responsável
pela extensão do DNA-alvo, reconhecendo o complexo formado pelo iniciador e a
fita do DNA molde, o que resulta na cópia simultânea de ambos os sentidos do seg-
mento de DNA flanqueado pelos dois primers anelados (OSTE, 1988).
Para que a PCR reproduza, em laboratório, o processo de replicação natural

de DNA, a DNA-polimerase deve suportar os ciclos térmicos utilizados durante
o seu procedimento. Para tanto, esta enzin1a é comumente extraída de T hermus
aquaticus, uma espécie de bactéria que sobrevive em altas temperaturas (SAIKI
et alii, 1988). Quando extraída de tal micro-organismo, a enzima é denominada
Taq DNA-polimerase.
D iante do exposto, partes de um gene, geral1nente os éxons do DN A, podem
ser amplificados rapidamente pelo uso de primers específicos conhecidos. O proce-
dimento reacional da PCR compreende uma sucessão de três etapas, que consti-
tuem um ciclo, e que são determinadas po r diferentes temperaturas:
♦ Desnaturação térmica da dupla fita de DNA da amostra que servirá como
molde, gerando duas fitas únicas. Esta etapa compreende uma incubação
rápida (de 30 segundos a 1 minuto), sob tempe ratura de 90 a 95°C.
♦ Hibridização dos oligonucleotídeos iniciado res (primers) ou anelamento
específico por con1plementaridade com a sequência-alvo do DNA pelo res-
friamento, ocorrendo então a demarcação das extremidades do DNA de
interesse nas duas fitas resultantes da etapa anterior (desnaturação) . O
anelamento se dá na posição 5' de cada fita simples do D NA n1olde . As
temperaturas ideais para esta etapa varian1 entre 45 e 60ºC, com tempo
de aproximadamente um minuto. A escolha da temperatura está atrelada
ao tamanho e à composição de bases dos oligonucleotídeos iniciadores.
♦ Amplificação ou alongamento dos oligonucleotídeos con1 auxílio da enzi-
ma Taq DNA-polimerase, realizados a uma temperatura de 70 a 72°C,
durante um período de 1 a 3 minutos. Em outras palavras, esta etapa
é caracterizada pela extensão ou polimerização propriamente dita, e é
iniciada quando o primer já se encontra ligado aos segmentos comple-
mentares da fita molde. A DNA-polimerase liga os nucleotídeos entre si,
completando a fita simples e transformando-a em fita dupla, p romovendo
a sua extensão e produzindo uma cópia exata da sequência-alvo.
Nos ciclos seguintes, de forma subsequente, ocorre uma reação em cadeia, na

qual as fi tas de DNA recém-sintetizadas são separadas das fitas originais na etapa
de desnaturação, e cada fita serve novamente como n1olde nas etapas de anela-
mento e extensão para a montagem de novas fitas, o que garante o seu aumento
exponencial . A figura 6 .5 apresenta esquematicamente o princípio da reação em
cadeia de polimerase.
Primeiro Ciclo
..""'1~11"""9"1""'1-1""'1~11"""9"1""'1- 1
1
Desnaturação
w
DNA +
DNA polimerase Anelamento dos
Desoxirribonucleotídeos iniciadores
Primers [Tl 2
MgCl2
Tampão
1
• 1
11 1 ii 1 1 1 1 "' 2
Anelamento + Extensão
Segundo Ciclo
1 1
w ◄'
[TJ
Reação
w -------,►
1 1
_rn
_______ 2
--------► 2
FIGURA 6.5 Principio da PCR, no qual pequenas sequências especificas de DNA (primers) são
usadas para se ligarem às fitas do DNA-alvo desnaturado por aquecimento, sendo a extensão da
molécula para formação da fita complementar realizada a partir dos iniciadores, mediante a enzima
termoestável Taq DNA-polimerase (adaptado de KREUSER e MASSEY, 2002).
Os processos de desnaturação, anelamento e extensão ocorrem de forma cícli-

ca graças à termoestabilidade da enziina Taq DNA-polimerase, até que a sequên-
cia-alvo se encontre em quantidades detectáveis. Estes processos são usualmente
repetidos em 30 a 40 ciclos. Uma vez que todos os componentes estão presentes
na amostra desde o início da reação, o procedimento para a realização da PCR
pode se r automatizado e conduzido em um aparelho denominado termociclador,
programado para ajuste de tempos, temperatura e número de ciclos específicos,
o qual depende primordialmente do objetivo que se pretende alcançar (OSTE,

1988; VAN DER ZEE e HUIS, 1997).
Antes do início do primeiro ciclo no tern1ociclador, são misturados em u1n tubo
o DNA molde, os oligonucleotídeos iniciadores (primers), a Taq DNA-polimerase,
os desoxirribonucleotídeos fosfatados (dNTPS - dATP, dTTP, dCTP, dGTP), clo-
reto de magnésio (MgC12) e um tampão apropriado. O volume de reação geralmen-
te varia de 25 a 100 µ,L, e as concentrações mais comuns estão descritas na tabela
6.3. Estas condições pern1item a an1plificação da maioria das amostras, mas po-
dem ser modificadas a cada nova reação de PCR conforme seja conveniente. A
temperatura de cada etapa, a duração de cada ciclo e o número de ciclos devem ser
igualmente ajustados no intuito de aumentar o rendimento da reação. A variação
da temperatura de anelamento determina o grau de especificidade da reação, sen-
do que temperaturas mais altas elevam a especificidade primer/DNA molde.
TABELA 6.3 Alguns componentes da reação PCR e suas concentrações mais usuais (adaptado
de GUIMARÃES e GROSSI DE SÁ, 2002)
Componente Concentração
DNAmolde 10-100 ng
Tampão KCl(500mM), Tris-HCl(1 00mM), 1/1O do volume da reação (tampão 10X)

MgCl2 (15mM), Triton X-100(0,01 g/ml)
MgCl2 0,5-5 mM
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 20-200 µM
Primers 0,1-0,5 µM cada

Enzima (Taq DNA-polimerase) 0,5-2,5 unidades
Água Até completar o volume final
Teoricamente, tendo em vista que a sequência demarcada pelos primers dupli-

ca a cada ciclo (figura 6 .6), após 3 O ciclos pode ser atingido um fator teórico de
um bilhão de cópias da sequência-alvo .
A quantidade de DNA amplificada durante a reação em cadeia de polimerase
(PCR) pode ser analisada por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida,
técnica essa utilizada na separação e na caracterização dos fragmentos de DNA
obtidos. Assim, pode-se confirmar se ocorreu ou não a amplificação. A eletrofore-
se, por sinal, é um procedimento básico em todas as análises com ácidos nucleicos.
A metodologia empregada nessa técnica baseia-se no fato de que essas moléculas
apresentam carga elétrica negativa quando em solução aquosa. Essa carga é oriun-
da da ionização dos grupamentos de fosfato presentes nas moléculas dos ácidos
nucleicos. Essas podem n1igrar em um suporte sólido (agarose ou poliacrilamina,
como já ressaltado) submetido a um campo elétrico. Dessa forma, os ácidos nu-

cleicos migram em direção ao polo positivo e se separam dependendo do seu peso
n1olecular. Moléculas pequenas tende1n a migra r con1 velocidades maiores em re-
lação às moléculas grandes.
4 2 ciclo
< Amplificação
exponencial
~ ºciclo
~
I
2° ciclo
/
~
<.
Sequência-
alvo "- /
~
1º ciclo --····--····► 30º ciclo
I 2 30 = 1 bilhão
quatri:ópi~ === /
23 ~
oito cópias
24
16 cópias 25
32 cópias
FIGURA 6.6 Esquema ilustrativo da duplicação da sequência demarcada pelos oligonucleotídeos

iniciadores (primers ).
O gel de acrilamida, em particular, é bastante utilizado quando os frag1nentos

obtidos são menores que 1 kb. O gel pode ser posteriormente corado com brometo
de etídeo e visualizado diretamente ou pela luz (BIRATA e BIRATA, 1997). A

figu ra 6 .7 apresenta um gel de agarose, visualizado por coloração com brometo
de etídeo sob luz ultravioleta, e as bandas resultantes do produto de PCR. Nesse
caso, os primers utilizados foram Bac341f (5'- CCTACGGGAGGCAGCAG- 3')
e Bac907r (5'- CCC CGT CAA TTC CTT TGA GTT - 3') (MUYZER et alii,
1993).
FIGURA 6.7 Eletroforese em gel de agarose dos produtos de PGR.
Os primers ligados à região do DNA molde escolhida a priori são fundamen-

tais para que a enzima DNA polimerase desempenhe sua função de polimerização,
uma vez que só haverá amplificação de DNA se houver hibridização do primer com
um segmento de DNA da amostra, o que confere alta especificidade à reação. A
eficiência e a especificidade da amplificação devem ser levadas en1 consideração
quando for realizado o desenho do primer. Adicionalmente, é fundamental que não
haja complementaridade entre as extre1nidades 3' dos primers, justamente para
evitar que ocorra a forn1ação de dímeros que reduziriam a formação da sequência-
-alvo (GUIMARÃES e GROSSI DE SÁ, 2002) .
O desenho dos primers geralmente consiste no parâmetro mais crítico no de-
senvolvimento de protocolos de PCR , tendo e1n vista que o mesmo frequentemen-
te determina o sucesso da amplificação por esta técnica. Não existe uma regra
que garante a amplificação do segmento desejado, embora possam ser utilizadas
algumas estratégias nos desenhos de pares de primers. E ntre alguns exemplos
dessas estratégias pode-se citar que o comprimento dos primers deve ser em torno
de 15-30 pares de bases, e o conteúdo de resíduos GC deve ser em torno de 50%,
sendo que estes nucleotídeos devem estar randomicamente distribuídos dentro do
primer. O desenho dos primers, quando realizado de forma cuidadosa, pode levar
à economia de te1npo e de custos, tendo em vista que os mesmos constitue1n os
componentes mais caros na técnica de PCR.
Uma falha observada na PCR é a amplificação preferencial de sequências

causada pelo pareamento inespecífico em algumas regiões da molécula de DNA,
o que atrapalha a ligação dos iniciadores do PCR co1n a região-alvo, gerando p ro-
dutos inespecíficos. Outro fator, que deve ser levado em consideração na pesquisa
de amostras complexas pela técnica de PCR, é a amplificação preferencial causada
pela existência de diversos tamanhos e concentrações de genes presentes na amos-
t ra. Uma das formas de p revenir a amplificação seletiva nestas amostras consiste
na criação de condições facilitadoras da desnaturação das fitas de DNA, como adi-
ção de álcalis, cossolventes ou acetamida à reação (REYSENBACH et alii, 1992).
A escolha da região do DNA localizada entre dois primers que é amplificada es-
pecífica e seletivamente de maneira exponencial influencia decisivamente o grau de
especificidade da reação PCR, e depende do propósito para o qual o teste está sendo
aplicado. A especificidade depende do grau de homologia entre a sequência-alvo e o
D NA de diferentes gêne ros e espécies.
Como breven1ente descrito anteriormente, usualmente são utilizadas regiões
altamente conservadas de um gene universal como alvo ideal para o desenvol-
vimento de um teste de PCR para a identificação de micro-organismos. E sta
estratégia fundamenta-se no uso de sequências universais como alvos para am-
plificação, a exemplo da sequência do RNA ribossomal (rRNA) (GUIMARAES e
GROSSI DE SÁ, 2002) .
Os genes do rRNA são bastante conservados tanto funcionalmente como
em sua sequência, além de estar associados com regiões de moderada variação
(~TOESE, 198 7), tornando a comparação de sequências de rRNA uma ferramenta
bastante útil não somente no que tange à identificação, mas ,
também à dedução
de relações filogenéticas e evolutivas de organisn1os (RODICIO e MENDOZA,
2004). Na verdade, as primeiras aplicações de técnicas baseadas em ácidos nuclei-
cos no estudo de ecologia microbiana se referem a relações filogenéticas entre mi-
cro-organismos determinadas pela análise da sequência do 16S rRNA (MACRAE,
2000) . Al ém disso, outras técnicas foram desenvolvidas com base no uso des-
ses marcadores, tai s con10 ARDRA e a hibridização in situ (KOZDROJ e VAN
ELSAS, 2000), as quais estão descritas nos itens 2 .6 e 2 .5 , respectivamente.
A subunidade menor do rRNA, isto é, a 16S, é uma molécula amplamente
utilizada para análises filogenéticas em procariontes, e constitui um polirribo-
nucleotídeo de aproximadamente 1 SOO nucleotídeos, codificado pelo gene rrs
(rDNA) . O rRNA 16S, como qualquer sequência de cadeia simples, se dobra em
uma estrutura secundária que intercala cadeias simples e cadeias duplas, confor-
me mostrado na figura 6 .8 (RODÍCI O e MENDOZA, 2004) .
,,
~ 1
1 1
V7 1
1
P41 -1
1 1
1 1
1 1
1 1
40 41 : ~ P41-2
'-~-----'-.:..rv"'--~ --------- ,
39
1 ,
.---------.,
1 1
V6 38 42
1 1
1 1
36 1 1
1 1
23 P35-2 1 1
1
1 P41-3
P35-1 ------... ' 1
-. I
44
V5 27
25
V4
V8
21
-- _,... ....'
,---
46 1 -
) 1 P45-2
18 - - - - -
47 "
-
1
V9
P17-1
V3
6
V1
12
11 ----..J9
V2
10
FIGURA 6.8 Representação da estrutura secundária do 16S rRNA. As regiões conservadas estão
representadas pelas li nhas em negrito e as regiões variáveis (V1 -V9) pelas linhas finas (adaptado
de RODÍZIO e MENDOZA, 2004).
O 23S RNA também tem ganhado destaque por possuir maior número de
regiões variáveis, possibilitando análises filogenéticas a nível de espécie e subes-
pécie, podendo, portanto, ser utilizado de forma complementar ao 16S rRNA
(CHRISTENSEN et alii, 1998). Apesar de o 23 S rRNA conter aproxiinadamente
3 000 nucleotídeos, apresentando dessa forma duas vezes mais informação e maior
acurácia nas inferências filogenéticas em comparação com o 16S rRNA, que, como
já dito, apresenta em torno de 1 SOO nucleotídeos, este últ imo tornou-se referência
justamente por apresentar maior facilidade de sequenciamento. Esse fato, entre-
tanto, não diminui a importância do uso do 23S rRNA como suplemento para os
dados gerados do 16S rRNA em estudos de organismos intimamente relacionados
(STAHL, 1997).
A região espaçadora entre os genes ribossomais 16S e 23S do rRNA não
somente vem sendo aplicada para a identificação de espécies como também vem
sendo alvo de muitos estudos que buscam caracterizar e desenvolver marcadores
moleculares em procariotos e eucariotos CTENSEN et alii, 1993). O espaço situa-
do entre os genes 16S e 23 S do rDNA é denominado de ITS (Internal Transcribed
Spacer), e contém maior grau de variabilidade em comparação com as regiões 16S
e 23 S. E stas variações têm sido usadas para diferenciar espécies de bactérias e
análises filogenéticas (LEBLOND-BOURGET et alii, 1996).
Em suma, o interesse pela região conservada do rRNA é oriundo de dois
fatores. O primeiro consiste no princípio de que os três genes que codificam para
as subunidades ribossomais estão contidos en1 um único loco, o qual ocorre várias
vezes em um genoma. Já o segundo fator se refere à existência de regiões variáveis
flanqueadas pelas regiões codificantes, conhecidas como região intergênica (I GS)
e região espaçadora transcrita (ICS), ambas muito úteis na diferenciação entre es-
pécies e gêneros (EDEL, 1998). Em geral, o uso de regiões bastante conservadas
possibilita a identificação de um conjunto de micro-organismos afins, e não um
gênero ou uma espécie individualn1ente. Já o uso de regiões altamente variáveis
propicia maior especificidade, o que permite a identificação de um gênero ou es-
pécie em particular. Quanto mais variável for a região, mais discriminatória será
a PCR (MITCHELL et alii, 1993).
A técnica PCR encontra-se evolutiva1nente em desenvolvin1ento, sendo fre-
quentes as inovações a ela incorporadas. Alguns problemas operacionais são fac-
tíveis de ocorrer, como, por exemplo, a extrema sensibilidade e a ocorrência de
contaminação, o que acarreta em resultados falso-positivos e amostras contendo
substâncias que inibem a amplificação, ocasionando falso-negativos.
Em virtude de a reação de PCR ser capaz de amplificar D NA a partir de
um pequeno número de moléculas, a contaminação de qualquer componente da
mistura com um DNA exógeno pode levar à amplificação simultânea de mais de
uma espécie de DNA. Além disso, a presença do produto de PCR e de primers
de a1nplificações anteriores também podem servir como fontes de contaminação.
A inclusão de um controle negativo em cada experimento realizado é uma das
formas para detectar contan1inação na reação. Este controle deve conter os mes-
mos ingredientes utilizados nas demais amostras, exceto a molécula de DNA-alvo
(GUIMARÃES e GROSSI DE SÁ, 2002).
Outro ponto a ser destacado é a importância de se adicionar também um

controle positivo, que permitirá determinar a ocorrência de falsos-negativos, os
quais podem advir de proble1nas com o termociclador, com algum reagente utili-
- ,
zado ou com a enzima Taq DNA polimerase (GUIMARAES e GROSSI DE SA,
2002) . Os falsos-negativos também podem advir da escolha de primers com grande
concentração dos pares de nucleotídeos guanina-citosina (GC maior que 50%),
uma vez que essa ligação se dá por ponte tripla de hidrogênio, caracterizando uma
ligação mais forte e, portanto, n1ais difícil de sofrer o processo de desnaturação,
demandando maior tempo para se atingir uma temperatura mais alta e que con-
siga romper esta ligação. Tais fatos podem levar a uma desnaturação incon1pleta,
reduzindo a possibilidade de hibridização e consequentemente levando a um de-
créscimo do rendimento do produto da PCR (BIRATA e BIRATA, 1997).
Em relação ao controle dos falso-positivos, os reagentes utilizados devem ser
cuidadosan1ente selecionados e dosados, de forma a manter sua qualidade e pure-
za, juntamente com concentrações padronizadas e pH balanceado, parâ1netros que
devem permanecer constantes de uma reação a outra. Desequilíbrio no sistema
reacional da PCR pode ocasionar o aparecimento de dímeros geradores de confusões
diagnósticas, os quais podem ser evitados com a manutenção de um ritual padro-
nizado na realização de todas as etapas manuais, assim como técnicas especiais
de anelamento inicial no programa do termociclador. Os resultados falso-positivos
ainda podem ser oriundos da contaminação por amplicons, a qual pode ser evitada
seguindo alguns procedimentos específicos para adequada manipulação das amos-
tras (DEGRAVE et alii, 1994; GUIMARÃES e GROSSI DE SÁ, 2002).
Outras modificações da técnica de PCR visando 1nelhorar suas sensibilidade
e especificidade têm sido propostas. Em uma delas, conhecida como nested PCR,
as amplificações iniciais são realizadas com um par de primers sem grande especi-
ficidade, a exemplo dos primers universais. Em seguida, o produto amplificado da
PCR é submetido a uma segunda rodada de amplificação com outro conjunto de
iniciadores localizados mais internrunente em relação ao prin1eiro par, aun1entan-
do a sensibilidade e a especificidade do método (DIEFFENBACB et alii, 1993
apud GUIMARÃES e GROSSI DE SÁ, 2002) .
Outra variação, a quantitative PCR, possibilita se estimar a quantidade de
moléculas do DNA-alvo inicial, por meio de um padrão interno de co1nparação
(CROSS, 1995). Já a técnica RT-PCR propicia a amplificação de RNA viral ou
mRNA por meio da transcrição reversa, ocorrendo a formação de uma fita de
cDNA a partir de RNA, etapa essa mediada pela enzima transcriptase reversa
(KAWASAKI, 1990 apud GUIMARÃES e GROSSI DE SÁ, 2002) . Há também
a PCR in situ, a qual co1nbina as altas sensibilidade e especificidade da reação de
PCR com a capacidade de hibridização in situ de detectar pequenas quantidades
de ácidos nucleicos no interior das células, o que permite localizar sequências
raras de RNA e DNA.
Finalmente, a variante de maior expressão é a PCR em tempo real (PCR Real

Time), técnica que permite a amplificação e a detecção simultâneas, num sistema
fechado, requerendo u1n termociclador que possua sistema de monitoramento de
emissão de fluorescência. A PCR em tempo real possui a vantagem de ser quanti-
tativa, uma vez que possibilita avaliar o número de moléculas produzidas a cada
ciclo, permitindo o acompanhamento da reação e a apresentação dos resultados
de fonna mais precisa e rápida quando comparada com a PCR convencional, que
gera somente resultados qualitativos.
Entre as características mais relevantes apresentadas pela PCR em tempo real
estão rapidez, especificidade, sensibilidade e quantificação. O método envolve basi-
camente três fases: a linha basal, na qual não há produtos de PCR suficientes para
detectar fluorescência; a fase log, na qual a quantidade de produtos PCR dobra a
cada ciclo; e finalmente a fase platô, atingida quando o número de p rodutos não
aumenta mais. Características, como precisão e grande reprodutibilidade na quan-
t ificação dos ácidos nucleicos, apresentadas pela PCR em tempo real, se devem ao
fato de que os valores são determinados durante a fase exponencial da reação.
A PCR em tempo real requer uma plataforma de instrumentação que contém
um termociclador, dotado de sistema óptico para a excitação da fluorescência e na
coleção da en1issão, assim como um computador provido com software para aqui-
sição de dados e análise final da reação.
O ponto que detecta o ciclo no qual a reação atinge o limiar da fase exponen-
cial é chamado de Cycle Threshold (CT), conforme mostrado na figura 6. 9 . O ponto
CT possibilita a quantificação exata e reprodutível na fluorescência. A emissão dos
compostos fluorescentes gera um sinal que aun1enta na proporção direta da quan-
tidade de produto da PCR, sendo que os valores de fluorescência são gravados
durante cada ciclo e refletem a quantidade de produto amplificado.
São duas as principais abo rdagens para a quantificação na PCR em tempo
real : sendo un1a delas a detecção não específica e a outra a detecção específica.
O Syber Green é o exemplo mais utilizado de detecção não específica, no qual
fluoróforos (moléculas que absorvem e emitem luz em um comprimento de onda
específico) se ligam à fita dupla de DNA, e com a excitação da luz emitida pelo
sistema óptico do termociclador, emite uma fluorescência verde (figura 6 .1 0a).
No início da amplificação, a mistura da reação contém o DNA desnaturado,
os primers e o Syber Green. As moléculas não ligadas do Syber Green apresentam
fluorescência fraca, produzindo um sinal mínimo que é subtraído durante a aná-
lise de computador. Após serem reconhecidos os iniciadores e durante o p rocesso
de polimerização catalisado pela enzima Taq DNA polimerase, as moléculas do
Syber Green se ligam ao DNA fita dupla recentemente sintetizado, realçando
a fluorescência. Assim, a reação é monitorada de forma contínua, e o aumento
da fluorescência é observado em tempo real. No ciclo subsequente, p recisamente
na etapa de desnaturação do DNA, as 1noléculas do Syber Green são liberadas e
ocorre uma queda no sinal da fluorescência. A fluorescência detectada no fim da

etapa de extensão de cada ciclo da PCR possibilita o monitoramento da quanti-
dade crescente de DNA amplificado (VIT ZTHUM et alii, 1999). Dessa forma,
pode-se relacionar o primeiro aumento significativo na quantidade de produto
de PCR com a quantidade inicial de DNA-alvo. Quanto mais DNA-alvo estiver
presente no início da reação PCR, menor o número de ciclos necessários para se
atingir o ponto no qual o sinal fluorescente é inicialmente detectado .
0,90
.................
0,80 .. ...........
0,70
....·..
('Q
Amostra ..•···
-E 0,60
"O
.. .•
..
. ..
Q)
('Q 0,50
·c3 .
e: 0,40 .
•Q)
(.)
Limiar
..
.. .
(/)
.... 0,30
Q) ..........
111 111••···· ···· ··'· ····•• 1.. ... ...... . ~····· .. ........ ... .......... ...... .... ...... ... .
o::,
u:: 0,20 Região da hnha de base Amostra controle sem DNA
0,10
0,00
o 5 10 15 20 25 30 35 40
CT = Cycle Threshold
Número de ciclos da PCR
FIGURA 6.9 Curva de amplificação do PCR em Tempo Rea l, mostrando três fases distintas: linha
basal, fa se log e fase platô (adaptado de NOVAIS e PIRES-ALVES, 2004).
O Syber Green apresenta vantagens, como baixo custo, facilidade no uso e

sensibilidade . A desvantagem é que a ligação ocorre em todas as fitas duplas de
DNA que su rgem du rante a reação, incluindo os dímeros dos iniciadores e outros
produtos inespecíficos, podendo superestimar a concentração do fragmento-alvo.
Outras duas alternativas utilizadas além do Syber Green são o TaqMan e o
Molecular Beacons, ambos com capacidade de hibridização gerando transferência
de energia para quantificação. Estes últimos consistem em sondas altamente es-
pecíficas à sequência-alvo, liberando fluorescência somente quando o produto de
PCR de interesse estive r p resente, sendo capazes de realizar reações 1núlt iplas.
Con10 descrito, a TaqMan é uma sonda, isto é, um fragmento de DNA mar-
cado utilizado para hibridizar outra molécula de D NA, empregado para detectar
sequências específicas nos fragmentos de DNA amplificados na PCR. Conforme
mostrado na figura 6 .10b, esta sonda apresenta um fluoróforo em uma extremi-
dade e, na outra extremidade, apresenta um quencher, que é uma molécula que
aceita energia do fluoróforo na forma de luz e a dissipa na fo rma de luz ou calo r.
Durante a PCR em tempo real, a sonda TaqMan hibridiza com a sequência

da fita simples de D NA complementar-alvo para a amplificação. Nesta última
etapa, a sonda TaqMan é degradada devido à atividade exonuclease 5' ➔ 3' da
Taq DNA-polimerase, separando o quencher da molécula fluorescente durante a
fase de extensão. A separação do fluoróforo do quencher resulta no aumento da
intensidade da fluorescência, fazendo com que durante o processo de amplifi-
cação, a e1nissão de luz seja au1nentada de for1na exponencial. Esse aumento da
fluorescência ocorre somente quando a sonda hibridiza e quando a amplificação
da sequência-alvo é estabelecida (HEID et alii, 1996).
5'
® SONDA
3'
(a) (b)
FIGURA 6.10 Syber Green entre as duplas fitas de DNA (a); Taq Man (b) (adaptado de NOVAIS e
P IRES-ALVES, 2004).
Molecular beacons são nucleotídeos utilizados como sondas de fita simples que
formam uma estrutura secundária entre as extremidades S' e 3', denominada de
haste-e-loop. O loop contém uma sequência que é complementar à sequência-alvo
e a haste é formada pelo anelamento das sequências complementares que estão
localizadas nas extremidades. Um fluoróforo é ligado no final de uma extremidade
e um quencher é ligado na outra, a1nbos por meio de ligações covalentes (figura
6 .11 a) .
Quando não há alvos, o oligonucleotídeo permanece livre em solução e não
emite fluo rescência, pois o quencher se encontra próximo do fluoróforo, captando
ene rgia. N o n1omento em que o molecular beacon encontra o seu alvo, ocorre a
hibridização, o que resulta em uma reorganização de sua estrutura (mudança
de conformação), sendo que o fluoróforo se dissocia do quencher, emitindo assim
fluo rescência (figura 6 .11 b).
É ünportante comentar que os molecular beacons podem ser sintetizados com
diferentes cores de fluoróforos, permitindo a realização de ensaios que requerem
a detecção de diferentes alvos em uma mesma reação. Tendo em vista a sua alta
especificidade, permitem discriminar sequências-alvo que diferem entre si por
apenas um nucleotídeo substituído.
(a) (b)
FIGURA 6.11 (a) Oligonucleotídeo utilizado como sonda é sintetizado de modo a possibilitar a
formação de uma estrutura secundária nas extremidades 5' e 3'; (b) Toda fita nova formada durante
a amplificação é alvo para o anelamento do molecular beacon, aumentando a intensidade da
fluorescência (adaptado de NOVAIS e PIRES-ALVES, 2004).
6.2.3 DGGE
A Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante, conhecida pela sua sigla

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), tem sido ai11plamente utilizada em
ecologia n1icrobiana por permitir o estudo filogenético de comunidades de micro-
-organismos (MUYZER et alii, 1 993). Consistindo em um método de fingerprinting
molecular, assim denominado, pois é capaz de gerar verdadeiras impressões digitais
("códigos de barra") de con1unidades microbianas, a técnica DGGE baseia-se na
eletroforese dos fragmentos de DNA, previainente an1plificados pela PCR, em gel
de poliacrilamida com gradiente linear de desnaturação. Esses fragmentos são sub-
metidos a um ainbiente com níveis crescentes de agentes químicos desnaturai1tes
(ureia e formamida), os quais promove1n mudai1ças conformacionais na molécula,
reduzindo sua migração (SIGLER et alii, 2004; ERCOLINI, 2004). Quando o
agente desnaturante é a temperatura, a técnica envolvida é a TGGE.
No caso da DGGE, a concentração de poliacrilainida no gel é constante,
o gradiente de concentração de ureia e forn1a1nida é crescente, e a temperatura
apresenta valor elevado e fixo (em torno de 60ºC). Em contrapartida, na TGGE
as separações são obtidas com um gradiente crescente de temperatura e uma con-
centração elevada e constante de ureia e formamida.
O princípio da dissociação se baseia no fato de que a mobilidade eletroforé-
tica do DNA em um gel de poliacrilainida é sensível à estrutura secundária da
molécula, co1n respeito à sua conformação, que pode se r helicoidal, parcialmente
desnaturada ou em fita simples. As moléculas parcialmente desnaturadas, com-
postas por partes em dupla hélice e partes em fita simples, movimentam-se de for-
ma mais lenta no gel em comparação com as moléculas em fita dupla ou simples
(MUYZER et alii, 1998).
Quando o DNA é submetido à eletroforese em condições crescentes de des-

naturação (química ou té rmica), os fragmentos permanecem em fita dupla até
atingir as condições necessárias para a desnaturação dos domínios da 1nolécula
denominados melting domains. Esses domínios possuen1 a característica de possuir
temperaturas de desnaturação idênticas, fazendo com que, a uma determinada
temperatura, ocorra a desnaturação completa nesses domínios, situados de fo rma
inte rcalada ao longo da molécula. Quando um do1nínio sofre desnaturação, ocorre
uma transição na conformação da molécula, a qual passa de helicoidal para par-
cialmente desnaturada. Nestas condições, a migração da molécula no gel pratica-
mente cessa, ocupando uma posição particular no gel, como n1ostra a figura 6 .1 2 .
Variações nas sequências de nucleotídeos desses domínios levam a diferen-
tes condições de desnaturação e as moléculas com sequências distintas param
de migrar e1n diferentes posições no gel, p ropiciando a separação das mesmas
(ROSADO e DUARTE, 2002).
0%
Gradiente
de ureia e
forma mida
100%
FIGURA 6.12 Esquema representando um gel paralelo contendo um gradiente de agentes
desnaturantes (adaptado de ROSADO e DUARTE, 2002).
É importante enfatizar que a determinação do comportamento de desnatu-

ração (melting behaviour) dos fragmentos de DN A é fundamental antes de realizar
a anál ise dos mesmos por DGGE/TGGE. Esse p rocedimento é necessário para
tornar ideal o gradiente e a duração da eletroforese (MUYZER et alii, 1998).
Quando se tem conhecimento prévio sobre a sequência nucleotídica de un1a ou
mais moléculas de DNA que serão analisadas nos geis desnaturantes, é possível
faze r a previsão teórica do gradiente ótimo necessário para a separação dos dife-
rentes produtos. Para esse fim, poden1 ser empregados programas de computador,
tais como o MELT95 (Ingeny, Leiden, Holanda) e diversos outros que prevêem o
comportainento de desnaturação das moléculas de DNA (ROSADO e DUARTE,
2002) .
O gradiente e o tempo de corrida que permitem a melhor separação dos pro-

dutos de PCR são geralmente determinados através de um gel perpendicular e/ou
em geis paralelos contendo gradientes diferentes, onde as amostras são aplicadas
em tempos variáveis. No gel perpendicular, existe uma concentração crescente de
desnaturantes, situados em uma posição perpendicular à direção da eletroforese.
O DNA é aplicado em uma canaleta que ocupa quase toda a largura do gel. Após
a coloração do DNA, é possível visualizar uma curva do tipo sig1noide, sendo que,
no lado esquerdo do gel (contendo concentrações mais baixas de desnaturantes),
os produtos de PCR apresentam a maior mobilidade eletroforética, uma vez que
o DNA permanece em fita dupla. Por sua vez, no lado direito do gel (com alta
concentração de desnaturantes), o DNA tem sua migração drasticamente inter-
rompida pela concentração elevada do agente desnaturante (ureia/formamida ou
temperatura). Na faixa intermediária de concentração de desnaturantes, onde os
produtos de PCR apresentam mobilidades diferentes, ocorre uma transição acen-
tuada na mobilidade, quando se atinge a concentração de desnaturantes exigida
para que comece a separação das fitas duplas em um dado domínio (o domínio que
requer a temperatura mais baixa, ou condição química, para desnaturar) . Para se
detenninar qual o melhor gradiente necessário para a separação dos produtos com
um par de "iniciadores" específicos, pode-se ta111bém utilizar vários geis paralelos
contendo gradientes diferentes (MUYZER et alii, 1998).
O tempo ótimo para a eletroforese é determinado pela eletroforese em geis
contendo gradientes paralelos. O gel contendo gradiente paralelo possui um gra-
diente crescente de agentes desnaturantes (químicos ou físicos), que vai aumentan-
do no sentido do início para o fim do gel. Eles são usados para analisar múltiplas
amostras no mesmo gel. Antes de analisar as amostras no gel paralelo, a duração
da eletroforese deve ser determinada, a fim de se obter a máxima resolução entre
os diferentes produtos de PCR (fragmentos de DNA). Para este propósito, as
amostras individuais são aplicadas e1n um gel paralelo, em intervalos constantes
de tempo, em u1n experünento deno1ninado time travel (MUYZER et alii, 1993).
Os produtos da PCR, que para uma dada reação geralmente constituem frag-
mentos possuindo o mesmo tamanho, mas com sequências de bases nucleotídi-
cas distintas, irão apresentar diferentes padrões eletroforéticos na DGGE, isto
é, diferentes perfis migratórios no gel desnaturante, o que possibilita diferen-
ciar cada 1nicro-organismo (MUYZER et alii, 1993; COUTINHO et alii, 1999;
ERCOLINI, 2004). Dessa for1na, fornecendo u1n padrão de "códigos de barra"
referente à comunidade bacteriana das a1nostras estudadas, a DGGE co111plemen-
ta as informações da PCR, uma vez que esta última técnica só fornece un1a única
banda que não é tão descritiva, conforme já discutido no item 6 .2.2.
Da mesma forma que para a reação de PCR, as bandas obtidas na DGGE/
TGGE podem ser visualizadas após coloração com bron1eto de etídio, prata ou
Syber Green I. A figura 6 .13 representa esque1naticamen te un1a si tuação em que
fragmentos de mesmo tamanho, obtidos após amplificação por PCR e visualizados

em gel de agarose, podem ser separados no DGGE devido ao fato de possuírem
diferentes sequências de nucleotídeos. Vale ressaltar que o con1portamento mi-
gratório do fragmento de DNA na DGGE não é somente ditado pela composição
dos nucleotídeos (conteúdo de G+C), mas também pelas interações entre estes na
molécula (BRESLAUER et alii, 1986; SUGIMOTO et alii, 1996).
PCR DGGE
-----
-
FIGURA 6.13 Esquema ilustrativo mostrando produtos de PCR com sequências nucleotídicas
diferentes analisados em gel de agarose e através de DGGE em gel de poliacrilamida com gradiente
desnaturante UF (adaptado de ROSADO e DUARTE, 2002).
Diante do que foi exposto, diferentes sequências de DNA, provenientes de

diferentes bactérias, desnaturam em diferentes concentrações de desnaturante,
o que resulta em um padrão de bandas, sendo que, teoricamente, cada banda
representa uma população distinta de organismos presentes na a1nostra. Desse
modo, pode-se ter uma ideia global das espécies predominantes no ecossistema
em questão. Na DGGE ou na TGGE é possível se detectar aproximadamente
50% das variações de sequências em fragmentos de DNA com até SOO pares de
bases (MYERS et alii, 1985). Esse índice pode ser aumentado para quase 100%
quando se acrescenta um segmento rico em GC (grampo de GC) a um dos lados
do fragmento de DNA.
Esse grampo, contendo 30 a 50 pb GC, quando anexado à extremidade 5' de
um dos iniciadores, é amplificado por PCR juntan1ente com o DNA e introduzido
no fragmento de DNA amplificado, agindo como um domínio de alta resistência
à desnaturação, impedindo a dissociação da dupla fita de DNA em fita simples
(SHEFFIELD et alii, 1989). Assim, evita-se que ocorra a perda da definição dos
padrões eletroforéticos (SHEFFIELD et alii, 1989; ERCOLINI, 2004). A adi-
ção desse grampo ainda permite o aumento da capacidade da DGGE em detectar
mudanças e1n uma única base no DNA (SHEFFIELD, 1989).
Alguns autores utilizam um grampo (clamp) químico de psoraleno, que con-

siste em um composto fotoativo que atua como intercalante de bases, marcando
um dos primers. Esse tipo específico de grampo possui a vantagen1 de não alterar
o comprimento dos primers embo ra apresente a desvantage1n de não pern1itir a
rea1nplificação direta dos produtos de PCR e aumentar a taxa de degradação do
DNA quando exposto à luz UV (ROSADO e DUARTE, 2002). Grampos bipola-
res, isto é, nos dois terminais dos produtos de PCR, vêm sendo sugeridos com o
intuito de aumentar a sensibilidade dos geis com desnaturantes de temperatura
em TGGE (GILLE et alii, 1998).
Uma vez gerados, os fingerprints podem ser enviados à base de dados na qual
a similaridade do fingerprint pode ser acessada para determinar as diferenças es-
truturais que existem entre os diversos ambientes ou entre tratamentos. A figura
6 .14 apresenta um gel de DGGE, obtido do produto de PCR amplificado utilizan-
do primers específicos para 16S rRNA, representativo de amostras da comunidade
microbiana de um reator de leito móvel com biofilme (MBBR) visando à nitrifica-
ção (BASSIN et alii, 201 O). Na figura 6 .14 pode-se ainda observar a similaridade
entre as bandas, isto é, entre as comunidades microbianas presentes nas amostras.
A análise do gel foi realizada por n1eio do software Bionumerics (Applied Maths)
(BASSIN et alii, 2010). Além de levar em consideração o número de bandas di-
ferentes para estimar a riqueza da comunidade microbiana, alguns autores levam
em consideração a intensidade de cada banda como indicativo da abundância da
população específica representada pela banda (NÜBEL et alii, 1999).
Pearson's coefficent
o o o o
o
,-... CX) (l) ....
Run 3 (Sample 2)
Run 3 (Sample 3)
Run 3 (Sample 1)
Run 2 (Sample 3)
Run 2 (Sample 1)
Run 2 (Sample 2)
Run 1 (Sample 1)
Run 1 (Sample 2)
Run 1 (Sample 3)
Run 4 (Sample 2)
Run 4 (Sample 3)
Run 4 (Sample 1)
FIGURA 6.14 Gel de poliacrilamina resultante da eletroforese em gel com gradiente desnaturante
de produtos de PCR amplificados e similaridades entre os diversos padrões de bandeamento das
amostras (BASSIN et alii, 201 O).
Segundo Muyzer et alii (1993), a DDGE consiste em uma técnica bastan-

te apropriada não somente para caracterizar comunidades microbianas com alto
grau de co1nplexidade, mas ta1nbém para inferir a filogenia dos men1bros da co-
munidade, testar a pureza de linhagens microbianas e monitorar o isolamento de
micro-organismos a partir de diversas amostras. Por adotar padrões de bandas, a
DGGE ta1nbém permite realizar o acompanhamento da dinâmica de populações
específicas em função de impactos ambientais (introdução de agentes causadores
de estresse, a exemplo de produtos químicos e outros poluentes) e também das
variações das condições do meio e de operação do sistema, permitindo o estudo, de
maneira relativamente rápida e simples, da variabilidade espaço-tempo ral dessas
populações. Além disso, tendo em vista os diversos primers de PCR disponíveis, a
DGGE ainda pode ser utilizada para investigar uma infinidade de filogenias ou
ainda organismos-a! vo específicos.
A técnica de DGGE ainda permite a excisão das bandas nos geis para sequen-
ciamento dos fragmentos de DNA contidos nas bandas. O fingerprinting obtido
pela técnica DGGE, quando associado ao sequenciamento das bandas e análise
filogenética, vem sendo bastante emp regado nos estudos da diversidade estrutural
de comunidades microbianas e no posicionan1ento filogenético de seus membros
(MUYZER e SMALLA, 1998; MUYZER et alii, 1996). O sequenciamento das
bandas presentes no gel pode ser submetido a um banco de dados mundial, per-
mitindo assin1 a comparação de resultados de diferentes grupos de pesquisa em
todo o mundo. Concomitantemente, as sequências obtidas poden1 ser reanalisadas
conforme o conteúdo do banco de dados aumenta, propiciando a atualização filo-
genética dos resultados. O DNA presente no gel também pode ser transferido para
membranas de náilon e hibridizado com sondas específicas para determinados
grupos microbianos. A figura 6.15 representa um esquema das diversas etapas e
possibilidades que existem quando se trabalha com geis contendo gradientes de
desnaturação.
Outro grande atrativo da DGGE é a possibilidade de compara r e analisar
diversas amostras em un1 único gel, diferentemente da clonagem (DAVIS et alii,
2004) . Já um inconveniente apresentado por essa técnica é que sequências muito
grandes podem não ser separadas de modo eficiente . O produto da PCR não deve
ultrapassar 500 pb, fato que pode limitar as informações para inferências filoge-
néticas (MUYZER e SMALLA, 1998).
Há ainda outros aspectos que devem ser levados em consideração quando
se deseja estudar comunidades microbianas por meio de técnicas baseadas em
PCR-DGGE. Atenta-se ao fato de que algumas amostras apresentam diversas
espécies distintas, embora com teores G+C (%) muito próximos, o que dificul-
ta a análise das comunidades, traduzidas como UTOs - Unidades Taxonômicas
Operacionais. J ones e Thies (2007) propuseram um método complementar ao
DGGE, acoplando uma análise bidimensional em gel de poliacrilamida no intuito

de separar os fragmentos de PCR gerados por comunidades microbianas, evitando
assim a sobreposição de frag1nentos.
[ Amostra ambiental ]
'
DNA/R NA
' •
PCR
•
______
Corte e el uição
,,_
( DGGE )
'.,-:;---
Transferência do
de bandas DNA para membrana
l de náilon
Sequenciamento
de DNA
l
Hibridização com
l sonda molecular
[ Filogen ia ]
FIGURA 6.15 Representação esquemática das etapas e possibil idades de análise dos DNAs
extraídos de diversas amostras por meio de DGGE (adaptado de ROSADO e DUARTE, 2002).
No que se refere à microbiologia ambiental, em particular, a DGGE vem sen-

do largan1ente empregada como ferramenta para obtenção do perfil de populações
microbianas complexas sem a necessidade de cultivá-las (MUYZER e SMALLA,
1998). A região 16S rRNA consiste na região mais utilizada na DGGE, em-
bora atualmente venha sendo proposto o uso de outros iniciadores ainda mais
específicos, sobretudo quando a análise envolver micro-organismos estreitamente
relacionados. O fato é que tem sido demonstrado que outras regiões do geno-
ma bacteriano, quando comparadas com a região 16S rRNA, possibilitam a ob-
tenção de melhores resultados na diferenciação de organismos de 1nesma espécie
(ERCOLINI , 2004; YERGEAU et alii, 2005; TACÃO et alii, 2005). Tacão et
alii (2005) obtiveram melhores resultados com a técnica DGGE quando lançaram
mão de uma região específica para o desenho dos primers, tornando-os capazes
de diferenciar a maioria das espécies de Aeromonas. Dessa forma, o uso de pri-
mers específicos, ao contrário dos primers universais, dispensa a etapa de cultivo
das amostras para que somente seja amplificada a região-alvo, permitindo que a
DGGE seja aplicada diretamente da amostra ambiental, o que acarreta na dimi-
nuição de custos e do tempo de processamento.
6.2.4 CLONAGEM ESEQUENCIAMENTO
A clonagem e o sequenciamento do gene que codifica para 16S rRNA são

considerados o método mais poderoso para exploração da diversidade 1nicro-
biana, sendo utilizado largamente no campo da ecologia microbiana molecular
(MUYZER, 1999).
A clonagem, em linhas gerais, significa "cortar" determinada sequência gênica
de um geno1na e inseri-la em outro DNA denominado vetor, que normalmente é
um plasmídeo (pequenos fragmentos de DNA de aproximadamente 3 kb que po-
dem ser naturalmente encontrados em bactérias, resistentes a um dado antibióti-
co) . E sse processo de corte seguido de inserção foi possível de se r realizado a partir
do conhecimento das enzimas de restrição e das ligases, respectivamente.
Vale lembrar que, além de genes de controle (resistência a antibióticos), os ve-
tores possuem um sítio de policlonagem com vários sítios de restrição de enzimas
e sequências iniciadoras. E stas permitem o rápido sequenciamento do fragmento
clonado. Em plasn1ídeos, pode-se inserir fragmentos de até 5 kb. Depois do corte,
inserção do fragmento (ou gene) no vetor, este é colocado no interior de célu-
las bacterianas por diversos métodos, tais como utilizando-se o cloreto de cálcio,
eletroporação e choque térmico. Uma vez dentro das células, os plasmídeos são
capazes de se multiplicar e produzir muitos plasmídeos que contêm o fragmento
clonado. Dessa forma, a clonagem possibilita que um organismo possa conter e
exp ressar um gene que não está presente naturalmente em sua estrutura. A figura
6 .16 representa, de forma esquemática, o processo de clonagem.
Como já visto, fragmentos do gene que codificam para 16S rRNA (ou ou-
tros genes, tais como genes funcionais de interesse) presentes no DNA genômico
de amostras complexas podem ser amplificados por meio da reação em cadeia
de polimerase (PCR). Uma biblioteca genômica derivada da amplificação dessas
amostras é produzida pelo método de clonagem. A etapa de clonagem possibilita
separar as diferentes cópias da sequência-alvo de 16S rDNA presentes no DNA
extraído de comunidades microbianas. Uma vez realizada a clonagem, a biblioteca
de clones do gene 16S rRNA pode ser acessada por diversos métodos, tais como
hibridização de colônias com sondas específicas para determinado gene, PCR com
primers específicos para confirn1ar a inse rção de produtos de PCR clonados ou
ainda sequenciamento para identificação dos f rag1nentos. Depois de identificados,
uma avaliação filogenética da comunidade microbiana representativa da amostra
original pode ser realizada com auxílio de programas de filogenia (OLSEN et alii,
1991; COLE et alii, 2003) . Outra rota para esse tipo de caracterização molecular
é a clonagem e o sequenciamento do cDNA transcrito a partir do 16S rRNA com
utilização da enzima t ranscriptase reversa (AMANN et alii, 1995).
Seeiuência gênica a ser clonada comendo

lamuna;çl!es com palíYeis com a enzima
de restriçilo do vetor (plasmfdeo)
Corte com enzim.Js

de restrição Si\io de
~ jl,. poliolonagem Ge ne clonado
Ligação com a
.....
enzima DNA. lir,ase
.....
Gene resistente
Gene fesiGtente
a antibiótico a antibiõlico
lntroaução ao p1asmldeo contendo 1)

gene e a mulliplicação em
cérulas bact erianas
FIGURA 6.16 Representação esquemática das etapas da clonagem molecular (adaptado de

CORDE IRO, 2003).
Enquanto os amplicons gerados de culturas puras de bactérias podem ser

sequenciados de forma direta, no caso da extração de DNA genômico de comuni-
dades microbianas, faz-se necessário a inclusão da etapa de clonagem para separar
as diferentes cópias de 16S rRNA, uma vez que a mistu ra de diferentes DNA não
pode ser prontamente sequenciada.
Em geral, a clonagem e a construção de uma biblioteca de genes rRNA têm
sido aplicada em combinação con1 outras técnicas no tratamento de águas re-
siduárias. A clonagem do gene completo permite a obtenção de informações fi-
logenéticas mais exatas em comparação com outras técnicas moleculares como
FISH ou DGGE, propiciando estudos taxonômicos bastante precisos e árvores
filogenéticas de alta resolução . A identificação de micro-organismos que ainda não
foram cultivados ou identificados é igualmente possível por meio da técnica de
clonagen1. Adicionalmente, deve-se mencionar o potencial da clonagem como uma
ferramenta utilizada no desenho de novos primers específicos para PCR e sondas
moleculares para a detecção e/ou quantificação de certos grupos microbianos por
hibridização fluorescente in situ (SANZ e KOCHLING, 2007).
A etapa de seleção de clones de uma biblioteca consiste em uma etapa fun-
dan1ental no processo de sequenciamento do metagenon1a. As metodologias de
seleção podem ser baseadas em sequência ou baseadas em função . A análise por

sequência apoia-se no uso de regiões conservadas do DNA para desenhar sondas
ou iniciadores de PCR empregados na seleção de clones que contenham certa
sequência de interesse (SCHLOSS e HANDELSMAN, 2003), não sendo depen-
dente da expressão de determinada característica pelo hospedeiro. Além disso, é
baseada em métodos de análise bastante confiáveis, tais como PCR, hibridização
de colônias e microarray . Como desvantage1n, o método não é seletivo para genes
completos, o que torna possível selecionar somente genes com sequências parciais
dos genes escolhidos (KNIETSCH et alii, 2003) . Já a análise por função depende
da capacidade de se testar um grande número de clones da biblioteca para a pro-
dução da enzima ou metabólito desejado, o que torna necessária a padronização de
testes em larga escala, tendo em vista que a maioria dos testes não são adequados
para avaliar de modo simples e rápido uma grande quantidade de clones. Há ainda
alguns casos onde a etapa de seleção de clones não é realizada, que são os sequen-
ciamentos aleatórios do DNA da amostra. Nesses, toda a biblioteca metagenômi-
ca, normalmente de insertos pequenos, é sequenciada (PEIXOTO et alii, 2008).
A criação de bibliotecas de genes permite identificar parcela substancial das
espécies n1icrobianas presentes em uma amostra, embora um panorama completo
do hábitat microbiano, além de demandar muito tempo, é bastante laborioso de
ser obtido. O fato é que dive rsos clones devem se r sequenciados para assegurar que
a maioria das espécies individuais na amostra tenha sido abrangida. Vale ainda
lembrar que a clonagem não consiste em uma técnica quantitativa e a PCR pode
favorecer certas espécies em virtude de diferenças na acessibilidade do DNA-alvo
(SANZ e KOCHLING, 2007) .
O fato de ser laborioso e consumir bastante tempo torna o método de clo-
nagem impraticável quando se dispõe de um grande número de amostras. Dessa
forma, o monitoramento de mudanças em comunidades microbianas fica com-
prometido, especial1nente se diversos pontos de amostrage1n são requeridos. Em
contrapartida, caso o tempo e o esforço não sejam fatores limitantes, a clonagem
cobre a maioria dos micro-organis1nos, incluindo grupos minoritários, os quais
dificiln1ente seriam detectados con1 1nétodos de fingerprinting.
Outro ponto que merece ser destacado é o problema apresentado pelas bi-
bliotecas metagenômicas no que se refere à baixa frequência que se encontra um
clone com a característica desejada (SCHLOSS e HANDELSMAN, 2003). Nesse
contexto, é comum a adoção de estratégias de enriquecimento da amostra para
aumentar a chance de se recuperar algum clone com a caracte rística p rocu ra-
da (PEIXOTO et alii, 2008). Entre essas estratégias de enriquecimento pode-se
mencionar a criação de uma biblioteca a partir de um ambiente onde a caracte-
rística desejada está presente em grande quantidade. Outro método de enrique-
cimento consiste na adição de um substrato de forma que os micro-organismos
que possuam a característica desejada consigam se multiplicar em detrimento

aos outros. Há ainda a técnica de sonda por isótopo-estável (Stable-Isotope Probe
- SIP), que consiste na adição de un1 substrato n1arcado com 13C à amostra. Os
micro-organismos capazes de usar o substrato irão incorporar o 13 C ao seu DNA,
fazendo com que ao se extrair o ácido nucleico da amostra, seja possível separar
o marcado do não marcado por ultracentrifugação com gradiente de densidade
(RADAJEWSKI e MURRELL, 2000 apud PEIXOTO et alii, 2008) .
A despeito de sua extensiva aplicação no estudo de comunidades microbianas
em hábitats naturais, as técnicas de clonagem são menos difundidas na pesquisa
de processos de tratamento de águas residuárias. E ssa falta de popularidade pode
ser devida à necessidade de n1ão-de-obra e equipamentos especializados, os quais
nem sempre estão disponíveis em departamentos de engenharia ou de química.
Essa tecnologia pode envolver uma grande complexidade, fazendo com que, fre-
quentemente, se restrinja a uma fe rramenta suporte, muito en1bora apresente
grande potencial de aplicação na área refe rente ao tratamento de águas residuárias
(SANZ e KOCHLING, 2007).
No que se refere ao sequenciamento, em particular, essa técnica é utilizada
principalmente para conhecer a sequência de bases nitrogenadas corresponden-
te a um frag1nento ou gene, sendo realizada de forma subsequente à clonagem.
Existem diversas metodologias para sequenciar cadeias de DNA. Entre elas, en-
contram-se o método químico, método dideoxi com marcação radioativa ou mar-
cação fluo rescente, entre outras.
Um dos métodos mais usados é o dideoxi com marcação fluorescente auto-
matizada, no qual se amplifica a sequência que se deseja estudar utilizando-se
misturas contendo, cada uma, um dos dNTPs (A, T, C ou G). Nessa mistura, além
do nucl eotídeo normal, estão presentes nucleotídeos (A ou T ou C ou G) do tipo
dideoxi, isto é, contendo hidroxilas na pentose, o que impede a ligação de um novo
nucleotídeo a ele. Nesse ponto da amplificação, a cadeia de DNA é interrompida.
Tendo en1 vista que há competição entre o dNTP dideoxi e o nor1nal, o ponto
de polimerização é interrompido em momentos distintos. Em adição, é possível
se obter fragmentos de diferentes tamanhos. Existem duas formas para realizar
essa reação : a primeira na qual se adiciona um iniciador contendo a marcação
fluo rescente (tetrametilrodamina) en1 quatro tubos que contê1n, cada um, um dos
nucleotídeos dideoxi e os outros norn1ais; a segunda é realizada adicionando-se
cada un1 dos quatro nucleotídeos contendo uma marcação fluorescente diferente
(fluoresceína; NDB - 4 cloro, 7-nit robenzeno, 2-oxal-diazol, tetrametilrodamina
e o vermelho do Texas) mais o nucleotídeo dideoxi adequado em quatro reações se-
paradas. Dessa forma, para cada sequência estudada, são realizadas quatro reações
em cadeia de polimerase (PCR) que são analisadas por eletroforese em gel, na qual
os fragmentos constituídos são revelados por seu tamanho molecular por meio da
marcação fluorescente (CORDEI RO, 2003) .
Caso se opte pela segunda maneira, pode-se correr as amostras em um único

slot do gel, tendo em vista que os fragmentos estão com marcações diferentes. O
resultado final é organizado sequencial1nente em computador, o qual fornece o
produto que corresponde à sequência correta das bases que compõem o gene ou
a sequência expressa. O sequenciamento automatizado é capaz de fornecer infor-
mações de sequências de até 1 kb por reação, permitindo o acúmulo de grande
quantidade de informações.
6.2.5 RSH(HIBRIDIZAÇÃO FLUORESCENTE IN S/T//J
A hibridização fluorescente in situ (fluorescent in situ hybridization - FISH)

consiste e1n uma das técnicas n1ais simples e rápidas aplicadas na identificação,
localização e quantificação de espécies de micro-organismos presentes nos mais
variados tipos de amostras. Esta técnica também surge como alternativa aos tra-
dicionais 1nétodos de identificação de micro-organismos baseados no isolamento
por meio de cultivo em meios de cultu ra apropriados. Em linhas ge rais, a h ibri-
dização in situ proporciona a interação dos conhecimentos da biologia celular, da
citogenética e da genética molecular (SPECTROR et alii, 1998) . Em se tratando
da 1nicrobiologia de sistemas de tratamento de águas residuárias, a técnica FI SH
tem se mostrado bastante útil, possibilitando a obtenção de sinais de células com
alta sensibilidade de detecção.
A técnica FISH é baseada na existência de sequências conhecidas e específi-
cas do rRNA de um organismo, as quais pe rmitem que se desenhe uma sequência
complementar à primeira. Esta sequência específica é conhecida como sonda. A
sonda fluorescente é comumente uma sequência pequena (15 a 30 nucleotídeos)
de D NA de fita simples, ligada a fluoróforos, que reconhece sequências comple-
mentares de rRNA (subunidades 16S e 23S no caso das bactérias) nas células
previamente fixadas (para se tornarem permeáveis à sonda) e as hibridiza in
situ (combinação D NA-RNA). Assim, tanto a localização quanto o tamanho das
sequências-alvo, que na verdade cor responde1n a diversos micro-organismos repre-
sentativos de dife rentes níveis taxonô1nicos, podem ser acessados por n1icroscopia
de fluorescência (AMANN et alii, 1990). A figura 6 .1 7 apresenta esquematica-
mente o procedimento envolvido durante a caracterização de amostras por FISH.
Vale ressaltar que nenhuma sonda irá hibridizar com as células que não con-
tên1 a sequência-alvo. Em contrapartida, as células contendo a sequência desejada
irão reter a sonda hibridizada e devido ao grande número de ribossomos entre as
células ativas, se tornam marcadas fluorescentemente .
Amostra de lodo fixada Sonda oligonucleotídica marcada

com fluorescência
Hibridização
l
Lente
objetiva
Visualização em
microscópio de
o
fluorescência Lavagem
FIGURA 6.17 Il ustração esquemática simplificada das etapas da técnica FISH (adaptado de
NIELSEN, 2009).
A metodologia FISH é ainda mais fácil e rápida caso as sondas requeridas

estejam disponíveis, permitindo a visualização direta de micro-organismos não
cultivados. Uma das vantagens desta técnica se refere à possibilidade de se obser-
var a distribuição espacial de mic ro-o rganismos nos diversos ambientes em que se
encontram. A quantificação de grupos microbianos específicos também é possível,
contrariamente do que ocorre nas técnicas convencionais (nún1ero n1ais provável,
contagem de placas) ou em outras técnicas moleculares. Não se faz necessária
mão-de-obra altamente treinada ou especializada, sendo requeridos apenas conhe-
cin1entos básicos de microscopia e experiência laborato rial .
A sonda de DNA pode ser marcada diretamente pela incorporação de um
precursor de nucleotídeo marcado com fluorescência, ou indiretamente, pela in-
corporação de um nucleotídeo contendo uma n1olécula repórter (biotina ou digo-
xigenina). Depois de incorporada ao DNA, essa molécula repórter é ligada, por
afinidade, a uma molécula marcada com fluorescência. A tabela 6.4 apresenta os
corantes fluorescentes mais comumente utilizados para marcar oligonucleotídeos
na análise por hibridização in situ po r fluo rescência.
TABELA 6.4 Corantes fluorescentes mais comumente utilizados para marcar sondas
oligonucleotfdicas na análise por FISH (adaptado de NIELSEN et alii, 2009)
Máxima Máxima Coeficiente
Fluorocromo Cor Excitação Emissão de Extinção
D (nm) D (nm) (M-1.cm-1)
Cy3 Vermelho 552 565 150 000

Cy5 Vermelho* 649 670 250 000
SYBR Gree Verde 494 520 73 000
DAPI Azul 350 456 27 000
FLUOS Verde 494 523 74 000
TAMRA Vermelho 543 575 65 000
Alexa-488 Verde 493 517 71 000
Alexa-546 Vermelho 562 573 104 000
Alexa-350 Azul 343 441 19 000
* Emissão na área do infravermelho, o que faz necessário uma câmera digital que detecte luz
infravermelha e análise de imagem para ser observável.
A especificidade das sondas possibilita a detecção/identificação em qualquer

nível taxonômico desejado, desde o Domínio até un1a resol ução que permita a dife-
renciação de grupos filogenéticos bastante específicos, como espécies. Geralmente,
uma sonda visando ao domínio Bacteria é utilizada em combinação com outras
sondas mais específicas.
Un1 ponto a ser considerado refere-se ao fato de que, apesar de a técnica FISH
ter permitido o aumento do conhecimento sobre comunidades n1icrobianas do-
minantes em diversos sistemas biológicos, tal metodologia não descreve aspectos
relacionados à função de micro-organis1nos, mas somente à filogenia de comuni-
dades microbianas.
A principal desvantagem dessa técnica consiste na disponibilidade limitada
de sondas específicas a determinados grupos bacterianos. Embora seja possível,
em teoria, desenvolver a sonda mais apta para cada aplicação em virtude do cresci-
mento das bases de dados da sequência de rRNA (16/18S e 23/28S rRNA), às ve-
zes se torna praticamente impossível o desenvolvimento de uma sonda que detecte
especificamente certos grupos n1icrobianos que compartilhan1 propriedades n1eta-
bólicas, como, por exemplo, os envolvidos na nitrificação e na redução de sulfato.
Alguns obstáculos associados à técnica FISH se referem à pobre permea-
bilidade de células, conteúdo de ribossomos insuficiente e inacessabilidade de
ribossomos. Outro ponto a se r destacado é o fato de a técnica FISH produzir
resultados falso-positivos (autofluorescência da amostra) e falso-negativos, sendo
que tanto fatores metodológicos quanto fatores ambientais podem influenciar no
desempenho dessa técnica. A escolha da sonda e do fl uorocromo, as condições de

t rabalho e os protocolos utilizados, a temperatu ra de hibridização, o fato de alguns
n1icro-organismos possuíre1n autofluorescência, o tipo específico do ecossistema
e o estado fisiológico das células-alvo podem influenciar significativan1ente a efi-
ciência dessa ferramenta molecular (OUVERNEY e FUHRMAN, 1997; DAIMS
et alii, 1999; MOTER e GOBER, 2000). Dessa forma, esses fatores deve1n ser
levados
,
em consideração para se obter informações sólidas e con1paráveis.
E importante ressaltar que o desenvolvimento e o melhoramento das condi-
ções de hibridização para uma nova sonda é um processo trabalhoso e relativa-
mente complicado, demandando experiência e dedicação, sendo que os resultados
podem n1uitas vezes não ser satisfatórios. A quantificação pode ser laboriosa e
subjetiva (contagem manual) ou complexa (análise de imagem). A análise estru-
tural dos agregados (lodo granular e biofilmes) requer um microscópio confocal
e um ambiente de análise de imagens, o que acarreta no aumento dos custos e a
necessidade de 1não-de-obra especializada (SANZ e KOCHLING, 2007).
Além disso, alguns conhecimentos prévios dos micro-organismos esperados
na amostra são geralmente requeridos para aplicação bem-sucedida desse método,
o que leva à necessidade de se utilizar outras técnicas. Para a identificação e a
quantificação de espécies particulares, uma sonda específica deve estar pronta ou
a sua sequência de 16S rRNA deve ser conhecida (caso a sonda não tenha sido
previamente publicada) (SANZ e KOCHLING, 2007).
O uso de sondas de oligonucleotídeos visando à região 16S rRNA representa
uma revolução na ecologia microbiana, tanto para a realização de pesquisas quan-
to para aplicações práticas. No que se refere ao tratamento de águas residuárias,
em particular, as técnicas de h ib ridização são de longe as mais utilizadas.
Para fins de ilustração e informação, as tabelas 6 .5 a 6.1 O apresentam algu-
mas das sondas mais utilizadas para a identificação de diversas bactérias encon-
t radas em plantas de tratamento de águas residuárias. As bactérias estão divididas
nos seguintes grupos funcionais: nitrificantes (bactérias oxidadoras de amônia
-AOB, bactérias oxidadoras de nitrito - NOB, bactérias anammox), desnitrifican-
tes, organismos acumuladores de polifosfato (PAO) e organismos acumuladores
de glicogênio (GAO). E sse conjunto de micro-organismos pode ser encontrado em
sistemas de tratamento aeróbios ou aeróbios/anóxicos/anaeróbios, baseados tanto
na tecnologia de lodos ativados e suas variações como na tecnologia de biofilmes.
TABELA 6.5 Sondas oligonucleotídicas visando à região rRNA utilizadas para detectar bactérias
oxidadoras de amónia (AOB) em sistemas de lodos ativados e biofilmes nitrificantes (adaptado de
DAIMS et alii, 2009 e LIPSKI et alii, 2001)
Sonda Organismos-alvo Sequência Referência
Nso1225 Bactérias oxidadoras CGC CAT TGT ATT Mobarry et alii, 1996
de amónia (subclasse ACGTGTGA
(3- Proteobacteria)
Nso190 Bactérias oxidadoras CGA TCC CCT GCT Mobarry et alii, 1996
de amónia (subclasse TTTCTCC
(3-Proteobacteria)
Nsm156 Nitrosomonas spp., TATTAG CAC ATCTTT Mobarry et alii, 1996

Nitrosococcus mobilis CGAT
Nsv443 Nitrosospira spp. CCG TGA CCG TTT Mobarry et alii, 1996
CGTTCC G
NSM1B Nitrosomonas TCT GTC GGT ACC Hovanec e Delong,

GTCAT 1996
NEU Nitrosomonas spp. CCC CTC TGC TGC Wagner et alii, 1995
halofílicos e halotolerantes ACTCTA
Nmv Nitrosococcus mobilis TCC TCA GAG ACT Juretschko et alii, 1998
ACG CGG
Cluster Nitrosomonas oligotropha CTT TCG ATC CCC Adamczyk et alii, 2003
6a192 ( Cluster 6a) TACTTTCC
CAPÍTULO 6 ◊ TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS AO ESTUDO DA DIVERSIDADE MICROBIANA... 29 7
TABELA 6.6 Sondas oligonucleotldicas visando à região 16 rRNA utilizadas para detectar bactérias
oxidadoras de nitrito (NOB) em sistemas de lodos ativados e biofilmes nitrificantes (adaptado de
DAIMS et alii, 2009 e LIPSKI et alii, 2001)
Sonda Organismos alvo Sequência Referência
NIT2 Nitrobacter CGG GTT AGC GCA Wagner et alii, 1996

CCGCCT
NIT3 Nitrobacter CCT GTG CTC CAT Wagner et alii, 1996

GCTCCG
Nb1000 Nitrobacter TGC GAC CGG TCA Mobarry et alii,

TGG 1996
NBAC2 Nitrobacter GCT CCG AAG AGA Hovanec e Delong,

AGGTCACA 1996
Ntspa662 Nitrospira GGA ATT CCG CGC Daims et alii, 2001

TCCTCT
Ntspa1026 Nitrospira - Sublinhagens AGC ACG CTG GTA Juretschko et alii, 1998
1 e li TTG CTA
Ntspa1431 Nitrospira - Sublinhagem 1 TTG GCT TGG GCG Maixner et a/ii, 2006
ACTTCA
Ntspa1 151 Nitrospira - Sublinhagem li TTC TCC TGG GCA Maixner et alii, 2006
GTC TCT CC
Nsr1156 Nitrospira - Sublinhagem li CCC GTT CTC CTG Schramm et a/ii, 1998
GGCAGT
Nspmar62 Nitrospira marina GCC CCG GAT TCT Foesel et alii, 2008
CGTTCG
TABELA 6.7 Sondas oligonucleotldicas visando à região 16 rRNA utilizadas para detectar bactérias
anammox em sistemas de lodos ativados e biofilmes

1
Pla46 Todos os Planctomicetos GAC TTG CAT GCC Neef et alii, 1998
TAATCC
Amx368 Todas as bactérias CCT TTC GGG CAT Schmid et alii, 2003
anammox TGCGAA
Amx820 8. anammoxidans AAAACC CCTCTA Schmid et alii, 2000
K. stuttgartiensis CTTAGTGCCC
Kst157 K. stuttgartiensis GTT CCG ATT GCT Schmid et alii, 2001

CGAAAC
Amx1015 8. anammoxidans GAT ACC GTT CGT Schmid et alii, 2000

CGC CCT
Bfu613 8. fulgida GGA TGC CGT TCT Kartal et alii, 2008

TCC GTT AAG CGG
Apr820 A. propionicus AAA CCC CTC TAC Kartal et alii, 2007

CGAGTG CCC
B8820 S. wagneri TAA TTC CCT CTACTT Kuypers et alii, 2003

AGTGCCC
Scabr1 11 4 S. brodae CCC GCT GGT AAC Schmid et alii, 2003

TAAAAACAAG
TABELA 6.8 Sondas oligonucleotldicas visando à região 16 rRNA para a identificação de potenciais
organismos desnitrificantes (adaptado de NIELSEN e HANSEN, 2009)

1
PAR651 Gênero Paracoccus ACC TCT CTC GAA Neef et alii, 1996
CTCCAG
G Rb Rhodobacter, GTC AGT ATC GAG Giuliano et alii, 1999

Roseobacter CCAGTGAG
HyphoCll-654 Hyphomicrobium CCC ACC TCT ATC Layton et alii, 2000

denitrificans, H. GGACTC
methylovorum, H. facilis
Curvi997 Curvibacter CTC TGG TAA CTT Thomsen et alii, 2004

CCGTAC
PAOmix Maioria de PAO462, PAO651 e Crocetti et alii, 2000

Accumulibacter PAO846
AZA645 Maioria dos membros do GCC GTA CTC TAG Hess et alii, 1997
cluster Azoarcus CCGTGC
THAU646 Thauera TCTGCC GTACTC Lajoie et alíi, 2000

TAG CCTT
ACl208 Acidovorax spp. CGC GCA AGG CCT Amann et alii, 1996
TGC
ZRA23a Maioria dos membros da CTG CCG TAC TCT Rosselló-Mora et alii,
linhagem Zoogloea AGTTAT 1995
AT1458 Cluster Azoarcus- GAA TCT CAC CGT Rabus et alii, 1999
Thauera GGTAAGCGC
Pae997 Maioria de Pseudomonas GCT GGC CTA GCC Amann et alii, 1996
spp. TTC
TABELA 6.9 Sondas oligonucleotldicas visando à região 16 rRNA para a identificação de potenciais
organismos acumuladores de fosfato (PAO) (adaptado de NIELSEN et alii, 2009 e LIPSKI et alii,
2001)
PAO462 Accumulibacter CCGTCATCTACWCAGGGTATTTAAC Crocetti et alii,

2000
PA0651 Accumulibacter CCCTCTGCCAAACTCCAG Crocetti et alii,

2000
PAO846 Accumulibacter GTTAGCTACGGCACTAAAAGG Crocetti et alii,

2000
PAOmix Accumulibacter PAO462, PAO651 e PAO846 Crocetti et alii,

2000
S-G-RHX- Candidatus GCTCTCTTGCGAGCACTC Hesselmann et

0991-a-A-18 Accumulibacter alii, 1999
phosphatis
RHC439 Rhodocyclus/ CNATTTCTTCCCCGCCGA Hesselmann et

Accumulibacter alii, 1999
RHC175a Rhodocyclaceae TGCTCACAGAATATGCGG Hesselmann et

alii, 1999
PAO462b Rhodocyclus tenuis CCGTCATCTRCWCAGGGTATTAAC Z illes et alii, 2002
PAO846b Rhodocyclus tenuis GTTAGCTACGGYACTAAAAGG Zilles et alii, 2002
Actino1011 Tetrasphaera japonica TTGCGGGGCACCCATCTCT Liu et alii, 2001
HGC69a Bactérias gram- TATAGTTACCACCGCCGT Roller et alii, 1994

positivas com alto
G+C - Actinobacteria
Actino221 Potenciais PAO - CGCAGGTCCATCCCAGAC Kong et alii, 2005

Actinobacteria
Actino658 Potenciais PAO - TCCGGTCTCCCCTACCAT Kong et alii, 2005

Actinobacteria
MP2 Microlunatus GAGCAAGCTCTTCTGAACCG Kawaharasaki et

phosphovorus alii, 1998
TABELA 6.1O Sondas oligonucleotldicas visando à região 16 rRNApara a identificação de potenciais

organismos acumuladores de glicogênio (GAO) (adaptado de NIELSEN et alii, 2009)
Sonda Organismos alvo Sequência Referência

1
GAM1019 Gammaproteobacteria GGTTCCTTGCGGCACCTC Nielsen et alii,

1999
GAM1278 Gammaproteobacteria ACGAGCGGCTTTTTGGGATT Nielsen et alii,

1999
GAOQ431 Gammaproteobacteria TCCCCGCCTAAAGGGCTT Crocetti et alii,

2002
GAOQ989 Competibacter (alguns) TTCCCCGGATGTCAAGGC Crocetti et alii,

2002
GB Competibacter (maioria) CGATCCTCTAGCCCACT Kong et alii,

2002
TFO DF218 Organismos relacionados GAAGCCTTTGCCCCTCAG Wong et alii,

a Defluviicoccus 2004
TFO DF618 Organismos relacionados GCCTCACTTGTCTAACCG Wong et alii,

a Defluviicoccus 2004
6.2.6 METO DOS ALTERNATIVOS APLICADOS NO ESTUDO DA DIVERSIDADE MICROBIANA
6.2.6.1 T-RFLP (Polimorfismo do tamanho e composição de bases de fragmentos terminais de restrição)

Um método alternativo ao DGGE no estudo dos perfis apresentados porco-
munidades microbianas é o polimorfismo do tamanho de fragmentos de restri-
ção, o qual responde pela sigla T-RFLP (Terminal R estriction Fragment Length
Polymorphism). Esta metodologia consiste em um método n1olecular quantitativo
para análises rápidas de comunidades microbianas complexas, com grande nú-
mero de espécies (LIU et alii, 1997). Esta técnica tainbém é baseada na PCR,
embora o procedimento posterior seja diferente das técnicas de PCRJDGGE ou
PCR/Clonagem.
Na T-RFLP, o gene 16S rRNA é amplificado com primers universais, sendo
um deles marcado por fluorescência com um fluorocromo, cuja função é "etique-
tar" os produtos de PCR. Esses são digeridos com enzin1as de restrição cortantes
(geralmente as que cortam quatro bases). As enzimas de restrição, também deno-
n1inadas de endonucleases de restrição, consistem en1 verdeiras "tesouras molecu-
lares" e tê1n a capacidade de reconhecer sequências específicas de bases na dupla
fita de DNA e clivar ainbos os fragmentos duplex en1 pontos específicos (STRYER,
1996). Supondo-se que cada espécie presente na ainostra apresente diferenças
na sequência amplificada do gene, o fragmento de restrição terminal vai possuir
tamanho diferente, podendo então ser separado por meio de eletroforese em gel.
Além disso, é possível sequenciar e identificar os fragmentos terminais de restrição
(T-RF) gerados comparando-os con1 uma base de dados de sequências, podendo-se
igualmente determinar o tamanho desses fragmentos e estimar a sua quantidade.
Os diferentes fragmentos obtidos são distinguidos por detecção fluorescente indu-
zida a laser. Os dados fluorescentes são convertidos em eletroferogramas.
Co1n base na localização terminal do marcador fluorescente nos produtos de
PCR, pode-se assegurar que apenas os fragmentos terminais sejam medidos. A
abundância de diferentes espécies presentes em comunidades microbianas é esti-
mada pela dete rminação do número de fragmento s terminais, obse rvados com a
digestão dos rDNAs totais das comunidades amplificados por PCR.
O padrão de T-RFLP obtido, que na verdade funciona como uma verdadeira
impressão digital das comunidades microbianas é um conjunto do número de
fragn1entos com tamanho único, sendo a observação de diferentes picos um indi-
cativo da existência de fragmentos diferindo em tamanho e a abundância relativa
de cada fragmento é refletida pela área embaixo dos picos no eletroferograma. As
amostras são corridas em gel de poliacrilamida em um sequenciador. Cada banda
fluorescente corresponderá a uma única população, sendo a intensidade de cada
banda diretamente p roporcional à quantidade do p roduto de PCR, o que fornece
uma indicação aproximada da abundância da população na comunidade (REIS
JR et alii, 2002). Essa característica deve ser observada com cuidado, da mes-
ma forma que a intensidade da banda nos padrões de um gel de DGGE (SANZ
e KOCHLING, 2007). Tendo em vista que diferenças na sequência irão gerar
amplicons de diferentes tan1anhos, é possível realizar o agrupa1nento (cluster) dos
grupos de populações de micro-organismos que são filogeneticamente diferentes
(LIU et alii, 199 7).
A vantagem da técnica T-RFLP é justamente a sua capacidade de detectar
até mesmo membros raros de uma co1nunidade microbiana. Em contrapartida,
alguns estudos apontaram que é possível que se forme fragmentos de restrição
pseudoterminais, ocasionando uma superestimativa da diversidade microbiana,
conforme resportado por Egert e Friedrich (2003). Além disso, Engebretson e
Moyer (2003) mostraram que a técnica T-RFLP parece ser bastante útil para es-
timar a diversidade de comunidades caracterizadas por possuir pequena ou média
diversidade, mas não para populações microbianas con1plexas.
Ao se realizar estudos de RFLP com o DNA bacteriano total, isto é, com
todo o genoma, é gerada uma enorme quantidade de fragmentos. Desta forma,
as diferenças nos tan1anhos dos fragn1entos não podem ser visualizadas de fo rma
direta no gel, u1na vez que inúmeros fragmentos resultantes do tratamento com a
enzima de restrição produzem, nesse gel, un1 efeito de arraste contínuo .
Com o objetivo de realizar a detecção dos marcadores RFLP, os fragmentos do
gel são transferidos para uma membrana de nylon ou nitrocel ulose, por meio de um
processo conhecido como Southern Blot. Finalmente, a visualização de fragmentos

polimórficos é possível através da hibridização com sondas de DNA que apresen-
tam sequências homólogas às do DNA imobilizado na men1brana (FERREIRA e
GRATTAPAGLIA, 1998). O método possui maior resolução se o gene-alvo estiver
presente em múltiplas cópias e for altamente conservado (MELO et alii, 2002).
A técnica T-RFLP tem demonstrado ser u111a ferramenta molecular útil e está
sendo constantemente melhorada estatisticamente. Estudos recentes vên1 descre-
vendo n1étodos para melhorar a análise estatística dos perfis de T-RFLP, possibi-
litando melhor interpretação dos dados gerados e possibilitando aos pesquisadores
escolher as opções metodológicas e estatísticas mais apropriadas para cada estudo,
em particular. Entre essas novas n1etodologias encontram-se a introdução de pro-
cedimentos objetivos para a distinção entre sinais e ruídos, alinhamento de picos
de T-RFLP e o uso de métodos estatísticos multivariáveis capazes de detectar
n1udanças nas comunidades microbianas devido à variação espaço-temporal ou a
efeitos ocasionados pelo tratamento (SCHUTTE et alii, 2008).
A técnica T-RFLP pode ainda ser combinada à PCR em tempo real (Real time
PCR), metodogia conhecida como polimorfismo do tamanho de fragmentos de
restrição em te1npo real (Real time T-RFLP). Proposta por Yu et alii (2005), essa
técnica pode ser aplicada para a determinação simultânea da diversidade e abun-
dância de micro-organismos presentes em uma comunidade microbiana complexa.
Validado utilizando uma comunidade microbiana modelo contendo três linhagens
microbianas específicas, o estudo da técnica T-RFLP em ten1po real confirmou
que a mesma consiste em uma eficiente ferramenta molecular para o maior dis-
cernimento a respeito de comunidades microbianas em vários sistemas concebidos
pela engenharia ou hábitats naturais, propiciando uma análise de fingerprinting
molecular quantitativa.
6.2.6.2 AFLP (Polimorfismo de tamanhodo fragm ento amplifi eado)
O 1nétodo AFLP é uma co1nbinação da PCR com o RFLP, baseado na análise

do padrão de restrição (RFLP) e posterior amplificação via PCR de frag1nentos
de DNA selecionados do total de fragn1entos obtidos da restrição. A restrição é
realizada com o uso de duas enzimas, as quais produzem fragmentos de DNA
contendo terminações diferentes. A essas terminações de sequências conhecidas,
são acoplados oligonucleotídeos curtos (adaptadores), que servirão de n1olde para
a PCR. A amplificação seletiva é realizada com o uso de dois primers complemen-
tares aos adaptadores, acrescidos de algumas bases complementares a terminações
de restrição (REIS JR et alii, 2002).
6.2.6.3 ARDRA (Análise de restrição do DNA ribossomal amplificado)
A ARDRA (Amplified Ribosomal DNA R estriction Analysis), consiste em um

tipo de RFLP e baseia-se no grau de conservação dos sítios de restrição do rDNA
que reflete padrões filogenéticos. Nessa metodologia, ocorre a digestão do frag-
mento de rDNA a1nplificado das amostras com enzimas de restrição (endonuclea-
ses) e visualização dos fragmentos resultantes por eletroforese em gel de agarose.
A ARDRA apresenta grande utilidade na análise rápida da diversidade de um am-
biente (GRIFONI et alii, 1995). Esta 1netodologia foi desenvolvida para estudos
comparativos de linhagens isoladas e na caracterização de genon1as bacterianos
(VANEECHOUTTE et alii, 1992).
É preciso ter cuidado quando da escolha do fragmento de rDNA a ser ampli-
ficado e analisado pelo método de ARDRA. Quando se trata da análise de diversi-
dade intraespecífica ou entre grupos isolados com elevada afinidade filogenética, o
fragmento amplificado deve incluir o espaço intergênico 1óS-23 S rDNA. Essa re-
gião intergênica, quando comparada com as regiões 1 óS ou 23 S rDNA, apresenta
maior variabilidade tanto na sua composição de bases quanto no seu tamanho.
Já quando se analisa a diversidade entre isolados distantes filogeneticamente, os
fragmentos amplificados podem ser o lóS ou 23S rDNAs, uma vez que esses
genes geram padrões de bandeamento mais simples, dependendo das enzimas de
restrição utilizadas (ROSADO et alii, 1999) .
6.2.6.4 SSCP (Polimorfismo de conformação de filamento único)
A metodologia SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism) é uma téc-

nica utilizada para detecção de pequenas alterações na sequência ou mutações
pontuais (ORlTA et alii, 1989). O DNA, em condições não desnaturantes, possui
uma estrutura dobrada que é determinada pela sua sequência de nucleotídeos.
Algumas mudanças nessa sequência, a exemplo de substituições simples de nu-
cleotídeos, são capazes de alterar essa estrutura, e, consequentemente, a sua mo-
bilidade eletroforética no gel . A mudança de mobilidade pode ser identificada na
forma de um perfil gerado pelas bandas em fita simples que param em posições
distintas no gel, dependendo da estrutura secundária que a molécula assume de
acordo com seu dobramento. Por conseguinte, a sensibilidade da técnica SSCP de-
pende da forma como as mutações afetam o dobramento da molécula e como o do-
bramento interfere na mobilidade eletroforética da sequência mutante (ROSADO
e DUARTE, 2002) . Essa técnica foi prin1eiramente utilizada para o estudo de
co1nunidades n1icrobianas por LEE et alii (1996), para a análise de comunidades
ambientais complexas.
6.2.6.5 RAPO (DNA polimórfico amplificado ao acaso)
A metodologia RAPD requer pequenas quantidades de DNA e é capaz de re-

velar alto grau de marcas polimórficas, consistindo em um método rápido e passí-
vel de automatização (FUNGARO e VIEIRA, 1998). Esse método é considerado
mais simples e de 1nenor custo quando comparado com o RFLP, e baseia-se na
amplificação de fragmentos não específicos de DNA. São utilizados primers com
sequências arbitrárias de nucleotídeos, as quais geram produtos de amplificação
via PCR que são anal isados. A habilidade de amplificação de fragmentos espe-
cíficos pode ser afetada pela inserção ou deleção de grandes fragmentos entre as
regiões de reconhecimentos dos primers, como também pela qualidade do DNA e
de outros fatores relacionados com a reação PCR (ELLS\iVORTH et alii, 1993).
Geralmente, a metodologia RAPD faz uso de primers, com cerca de 1O pb, com
anelan1ento a baixas temperaturas, sendo que as variações referentes a amplifica-
ções de regiões próximas aos introns podem ser estudadas com primers semirran-
dômicos (DOWLING et alii, 1996).
Sendo geradas arbitrariamente, as sequências primers possibilitam se observar
os perfis de RAPDs com vários produtos de amplificação, oriundos da existência
de diversos sítios homólogos a esses primers espalhados no genoma (FUNGARO
e VIEIRA, 1998). As variações na sequência de DNA dos fragmentos aplicados
pode1n ser avaliadas principalmente no que tange a variações em número, ta-
manho e conformação. A despeito de a análise de fragmentos apresentar menor
resolução quando comparada com a sequência de nucleotídeos, em muitos casos a
análise por RAPD tem sido usada como técnica eficiente e economicamente viável
para análise de grande número de populações microbianas (MELO et alii, 2002).
Fenótipos moleculares, gerados de RAPD, podem servir para diferenciar diversos
níveis taxonôn1icos, inclusive con1 poder de discriininação até níveis intraespecífi-
cos (REIS JR et alii, 2002). Vale mencionar que a técnica RAPD é mais utilizada
para isolados em cultura pura.
6.2.6.6 REP, ERIC e BOX
As técnicas REP, ERIC e BOX consistem em variações da PCR em que se

utilizam primers complementares a sequências de DNA de ocorrência natural al-
tamente conservadas e repetitivas, presentes em múltiplas cópias nos genomas da
maioria das bactérias. Três famílias de sequências repetitivas foram identificadas,
incluindo a REP de 35-40 pb, ERIC de 124-127 pb e o elemento BOX de 154 pb.
A utilização de primers, especificamente desenhados para essas sequências, leva
à an1plificação seletiva de regiões distintas no genoma. Os primers BOX são ge-
ralmente recomendados por gerar impressões digitais mais robustas e produzir
um padrão de fragmentos mais complexo. Já os primers para REP geram menor
complexidade, embora ainda produzam impressões digitais que apresentam repro-

dutibilidade e que permitem a diferenciação dos isolados. Por fim, o conjunto de
primers para o ERIC é 1nais sensível a condições não ideais da PCR, co1no apre-
sença de contaminantes na amostra de DNA, embora gere padrões de bandeamento
altamente di scriminatórios (RADEMAKER e DE BRUJIN, 1996). Da mesma
forma que a técnica RAPD, as metodologias REP, ERIC e BOX são mais aplica-
das para micro-organismos e1n cultura pu ra.
6.2.6.7 RISA
A análise da região espaçadora intergênica ribossomal (RISA - Intergenic

Spacer Region Analysis) foi desenvolvida por Borneman e Triplett (1997) e foi
primeiramente aplicada no estudo da diversidade n1icrobiana de solos.
Embora a maioria dos métodos moleculares para a identificação de micro-or-
ganisn1os sejam baseadas no gene 16S rRNA, outras regiões do DNA, tais como
as que carregam informação para genes específicos de interesse ou mesmo regiões
intergênicas específicas, também podem ser úteis para desempenhar tal função. O
espaçamento entre os genes 23 S rRNA (subunidade maior) e 16S rRNA (subu-
nidade 1nenor) é utilizado como alvo na PCR na anál ise por RISA. Essa região é
extremamente variável em tamanho, estendendo-se de 50 pb para mais de 1,5 kb,
e também na sua sequência nucleotídica.
Na técnica RISA, o polimorfismo revelado é relacionado ao grau de heteroge-
neidade. Os produtos da amplificação, diferentes em tamanho, são separados em
gel de poliacrilamida com base no seu tan1anho e visualizados após coloração com
prata. Essa ferramenta tem sido utilizada com sucesso na obtenção dejingerprints
de comunidades microbianas, onde cada banda corresponde a pelo menos um
micro-organismo (DORIGO et alii, 2005) .
A técnica RISA oferece maior resolução que a análise do gene 16S rRNA, ten-
do em vista que a região espaçadora não é tão conservada evolutivamente como os
genes ribosso1nais. D iferenças no comprimento dessa sequência e na co1nposição
de bases permite1n um método de 1nonitoramento rápido, como tan1bém servem
de ferramenta para distinguir micro-organismos a nível de subespécie GENSEN
et alii, 1993).
Fisher e Triplett (1999) apud Dorigo et alii (2005) desenvolveram a versão
automatizada da técnica RISA, denominada ARISA, no intuito de acessar a diver-
sidade microbiana de forma mais rápida e eficiente. A amplificação por PCR da
região 16S-23S é realizada utilizando-se um primer marcado com fluorescência,
o qual possibilita detectar amplicons por eletroforese capilar automatizada. O nú-
mero total de picos fluorescentes distintos obtidos com a técnica ARISA com uma
determinada amostra é tido como uma estimativa da diversidade de espécies, e os
tamanhos dos fragmentos podem ser comparados com aqueles presentes no banco
de dados GenBank, por exemplo.
6.2.6.8 PCR com genes que codificam para enzimas

Se o processo a ser monitorado envolver uma reação bioquímica caracterís-
tica, a exemplo da degradação biológica de certo composto orgânico, o gene que
codifica para a enzima envolvida na degradação pode ser amplificado por PCR e
os produtos subn1etidos à DGGE ou clonados em um vetor e sequenciado. E ssa
etapa específica de PCR, envolvendo primers especiais que identificam o gene de
interesse, exclui os micro-organismos que não possuem relevância no estudo em
questão e pern1ite até a diferenciação entre várias espécies de bactérias.
6.2.6.9 PLFA (Phospholipid ester linked fatty acid)
O método PLFA revela a presença de certos grupos microbianos por meio

da detecção de suas moléculas de ácidos graxos ligados a ésteres de fosfolipí-
dios, permitindo assim a identificação sem depender de genes e sua amplificação
(ROONEY-VARGA et alii, 1999).
6.2.6.10 Pirosequenciamento
Os recentes avanços en1 ciência e tecnologia estão conduzindo a uma revisão
e reorientação de metodologias, permitindo que questões antigas e atuais sejam
abordadas sob uma nova ótica. A geração de dados cada vez mais relevantes a
respeito das co1nunidades microbianas como consequência do au1nento da dispo-
nibilidade de técnicas n1oleculares, ao mesmo tempo que exige técnicas ainda mais
sofisticadas, contribui para a explosão do desenvolvimento de metodologias pro-
missoras para descrever sequências de DNA de células microbianas ou a diversida-
de microbiana de uma amostra ambiental de forma mais rápida e mais eficiente.
Observa-se nos últimos anos u1na transição do enfoque da "biologia tradicio-
nal" para o enfoque da "bioinforn1ática" e da "informática para biodiversidade".
Na 'biologia tradicional', a estratégia de busca e descoberta é baseada na coleta
de espécimes, na observação do sistema e na experimentação laboratorial, visan-
do à organização sistemática do conhecimento e à formulação de conceitos. A
abordagem da bioinforn1ática é baseada na coleta e no armazenainento de dados
em bancos de dados, na análise e na síntese da informação, visando à geração de
conhecimento. A mudança conceitual consiste na geração de conhecimento, ou
seja, o entendimento do que é importante em uma dada situação, a partir da in-
formação e dos dados disponíveis.
Esta mudança de paradigma é sustentada por uma combinação de diversos

fatores, incluindo principalmente o ritmo acelerado nos avanços tecnológicos em
áreas distintas e a demanda da indústria e da sociedade por descobertas inovadoras.
As novas técnicas denominadas high-throughput technologies estão contribuindo
cada vez mais para essa mudança de paradigma. Técnicas como pirossequencia-
mento e microarranjo de DNA (abordada no item 2 .6 .11 ) vêm sendo amplamente
utilizadas em ecologia 1nicrobiana, gerando uma grande quantidade de dados e
descobertas. As novas tecnologias devem atender a alguns objetivos principais, tal
como o aumento significativo de rendimento sem perda de qualidade dos dados
produzidos pela técnica utilizada (ROGERS e VENTER, 2005).
Para a Ecologia Microbiana Molecular atual, um dos maiores desafios con-
siste em identificar o maior número possível de sequências em uma determinada
amostra para que a representatividade amostral seja atingida e, consequentemen-
te, a dive rsidade total do ambiente amostrado seja detectada. A fim de solucionar
tal desafio, u1na nova geração de sequenciadores foi iniciada, buscando-se solucio-
nar a algumas limitações, tais como a construção de uma biblioteca de clones e o
método de Sanger (MARDIS, 2008).
Funcionando con10 técnica pioneira nessa nova conjuntura tecnológica, o sis-
ten1a integrado de pirossequenciamento genômico 454 Machine Life Sciences®
(454, Branford, CT, USA, Roche) constitui um método poderoso que vem sendo
utilizado para se estimar a diversidade taxonômica de uma determinada amostra.
Essa nova geração de sequenciadores fundamenta-se no conceito de sequen-
ciamento por síntese apresentado pela prin1eira vez por Nyren et alii (1993), na
qual o sequenciamento é realizado detectando a liberação de pirofosfato con1 casca-
ta enzimática terminando em luciferase e detecção da luz emitida (MARGULIES
et alii, 2005).
O pirossequenciamento é baseado na detecção de luz produzida quando um
nucleotídeo é incorporado, sendo independente de processos de separação física
para determinar a próxima base na fita de DNA, permitindo a essa metodologia
ser capaz de analisar qualquer volume de reação que gera níveis detectáveis de luz
(MARGULIES et alii, 2005) . Os resultados obtidos por esses autores permit iram
criar um sistema paralelo capaz de sequenciar 25 milhões de bases en1 u1n período
de 4 horas, capacidade 100 vezes mais rápida que o n1étodo de sequenciamento
de Sanger e que a eletroforese capilar, permitindo o sequenciamento do genoma
completo em apenas poucos dias (ROGERS e VENTER, 2005), com precisão
de 99% ou superior e com a vantagem de dispensar as etapas de clonagem e se-
leção de clones. Por exemplo, Roesch et alii (200 7) obtiveram cerca de 26 140 a
53 533 fragmentos do gene ribossomal 16S amplificados a partir do DNA bac-
teriano extraído diretamente do solo. O número de sequências obtidas com o uso
desta técnica permitiu uma melho r estimativa da diversidade taxonômica das
bactérias presentes nos diferentes solos amostrados. Detalhes da metodologia de
pirossequenciamento, mostrando as principais etapas do processo, podem ser en-

contrados no trabalho de Margulies et alii (2005) .
Vale le1nbrar que, até o presente 1nomento, são raras as análises desta mag-
nitude realizadas nos complexos sistemas microbianos encontrados nos processos
de tratamento de efluentes.
6.2.6.11 DNA-Microarrays (Microarranj os de DNA)
Atualmente sabe-se que os dados obtidos pelo sequenciamento das moléculas

de DNA, embora relevantes, são limitados, sendo imprescindível investigar tanto
os processos de transcrição das informações contidas nas sequências obtidas quan-
to os seus produtos, as proteínas. Neste contexto, a estratégia tecnológica denomi-
nadaDNA microarray (microarranjo de DNA) veio para revolucionar a capacidade
de coletar informação na área da genômica funcional .
Representando um dos últimos avanços dos métodos moleculares, a técnica
conhecida como microarranjo de DNA ou microchip de DNA apresenta grande po-
tencial para a elucidação de uma grande variedade de aspectos da ecologia micro-
biana em diversos ambientes, incluindo a identificação de variações na estrutura
de u1na comunidade microbiana presente e1n diferentes amostras, identificação de
grupos filogenéticos que podem estar ativos ou sem atividade durante determinado
período e ainda a identificação de diferenças entre estirpes isoladas de diferentes
ambientes. Adicionalmente, esta técnica vem impulsionando a pesquisa relativa
à genômica funcional de diferentes organismos (OGRAM, 2000; GUSCHIN et
alii, 1997).
A utilização mais frequente do microarranjo de DNA se refere à determina-
ção da expressão gênica, isto é, do perfil do transcriptoma, tendo como objetivo
medir os níveis de expressão de diversos transcritos de forma siinultânea, os quais
são detectados por hibridização. Em outras palavras, os microarranjos de DNA
permitem obter o perfil completo dos genes que são expressos em qualquer t ipo
celular ou até mesmo amostras diferentes, oferecendo neste caso importantes mar-
cadores para a avaliação do ambiente a partir do qual as amostras foram obtidas.
A capacidade de determinar a expressão diferencial de milhares de genes em um
único experimento contribui imensamente para o aumento da atratividade dessa
técnica (CHEUNG et alii, 1999).
Essa metodologia permite, simultanean1ente, a hibridização com grandes
sondas específicas de genes juntamente com a detecção de características filoge-
néticas ou n1etabólicas. Adicionalmente, possibilita a hibridização com sondas de
DNA específicas para regiões do DNA que codifica1n enzimas, podendo fornecer
informações importantes a respeito das características de degradação das comuni-
dades microbianas em estudo (DENNIS et alii, 2003).
Os microchips consistem em arranjos pré-definidos de moléculas de DNA

(fragmentos de DNA genômico, cDNAs ou oligonucleotídeos) sendo preparados
co1n sondas de oligonucleotídeos imobilizados de forma ordenada e em áreas es-
pecíficas (células de sonda) em un1a matriz de gel de poliacrilamida ligada a uma
superfície sólida, usualmente placas de vidro (lâminas de microscópio) revestidas
com compostos que conferem carga positiva (YERSHOV et alii, 1996). Podem
ainda ser preparados em 1nen1branas de náilon carregadas positivamente. Para
serem usados nos microchips, os oligonucleotídeos sintetizados devem ser purifica-
dos por eletroforese em gel ou por cromatografia líquida de alta pe1formance. Essa
exigência aumenta o controle sobre a qualidade de estringência, o que assegura
grande especificidade.
Em um único microchip, podem estar imobilizados milhares de oligonucleo-
tídeos diferentes, o que permite a detecção simultânea de grande variedade de
n1icro-organismos e1n uma amostra. En1 um único chip, pode-se encontrar repre-
sentações de pratica1nente todos os genes do genoma de uma série de organismos.
Vale ainda a ressalva de que um microchip, sendo lavado com água destilada, é
passível de utilização por até 30 vezes sem que ocorra a deterioração do sinal de
hibridização (GUSCHIN et alii, 1997).
O uso dos microarrays está relacionado à detecção e à quantificação de ácidos
nucleicos oriundos de amostras biológicas, os quais são dispostos para serem hi-
bridizados, por complementaridade de bases, com o DNA fixado no array, que, por
sua vez, apresenta sequências similares às dos genes de interesse e co1nplementa-
res às do RNAm ou cDNA (DNA complen1entar). As amostras de DNA ou RNA
são marcadas com fluorocromos (cianina 3 - Cy3 ou cianina 5 - CyS) quando se
utiliza microarrays de vidro ou com o isótopo 33-P quando os microarrays são pro-
duzidos em membrana de náilon. Em ambos os casos, é necessária a geração de
uma iinagem de hibridização. Esta última é obtida por n1eio de leitores (scanners)
a laser para os fl uorocromos, ou por meio de leitores de fósforo, para o isótopo
33-P (DALMA-WEISZHAUSZ et alii, 2006; CHEUNG et alii, 1999).
Um experimento típico consiste na comparação de níveis de expressão gênica
entre duas condições de teste, a exemplo de caso-controle, pré e pós-tratamento,
con1 ou sem determinada 1nanipulação experimental. De forn1a mais específica,
o procedimento utilizando a plataforma de microarrays mais utilizada internacio-
nalmente, isto é, o GeneChip®(Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA), envolve
a conversão do RNA total obtido a partir da amostra biológica em cDNA dupla
fita por meio de uma reação de transcriptase reversa. Subsequentemente, o cDNA
serve de molde para uma reação de transcrição in vitro na presença de oligonucleo-
tídeos marcados com fluoróforos, resultando no cRNA (RNA complementar) mar-
cado . Essas moléculas marcadas são hibridizadas na lâmina de microarray e podem
ou não se ligar às sondas rep resentadas no mesmo, dependendo de as sequências
serem co1nplementares. A lâmina hibridizada é então corada e submetida a um
scanner, conectado a um software que possibilita a análise dos dados e a quantifi-

cação da intensidade da fluorescência em cada ponto. O sinal gerado representa a
ligação do cRNA da an1ostra co1n a sonda no array e é proporcional à abundância
do cRNA presente, até certa concentração de transcritos. A quantificação do sinal
possibilita que a expressão de milhares de genes seja comparada entre diferentes
condições experimentais (LOCKHART et alii, 1996; CHEUNG et alii, 1999). A
figura 6 .18 apresenta um esquema sin1plificado da análise por microarranjos de
DNA.
Análise de genoma
!
Biblioteca genômica (cDNA)
! Hibridização com
sondas especificas
Fragmentos de ONA
o o o • o o • o o • •
I o
o • • • • • o • o •
• • o • • • • • • o •
Genes expressos
o o o o o •• • • o
Lêmina de microarray
Seleção, sequenciamento
e análise
FIGURA 6.1 8 Representação geral da metodologia de microarranjos de DNA (adaptado de
CORDEIRO, 2003).
Para efeito de comparação, a tabela 6 .11 sumariza as principais caracterís-

t icas de alguns dos ,métodos moleculares alternativos e complementares aborda-
dos no item 6.2.6 . E válido ressaltar que estes métodos realmente consistem em
opções viáveis para o estudo da diversidade microbiana, embora o seu estado de
desenvolvimento atual aliado à pouca disponibilidade de referências na área de
tratamento de águas residuárias e biorreatores os tornen1 menos utilizados que
métodos mais consagrados, como DGGE e FISH, por exemplo.
TABELA 6.11 Principais características de alguns dos métodos alternativos e complementares

empregados no estudo da diversidade microbiana (adaptado de SANZ e KOCHLING, 2007)
Método Descrição Vantagens Desvantagens
T-RFLP Método de - Procedimentos - Heterogeneidade nos

monitoramento que relativamente simples tamanhos dos fragmentos
leva em consideração - Fazendo uso torna as análises
a sequência 16S, da intensidade do filogenéticas menos
baseado nas diferenças sinal fluorescente, confiáveis
do comportamento de permite estimar, de - Não apresenta vantagens
restrição (polimorfismo) forma aproximada, a em comparação com a
abundância de espécies DGGE, a qual consiste no
método mais utilizado
RISA Filogenia com a região Alta sensibilidade, Pequena base de dados

intergênica entre as detectando-se até para análise comparativa
sequências 23S e 16S mesmo subespécies em comparação com
rRNA sequências 16S
PCR com Micro-organismos - Detecção direta - Não é capaz de fornecer

genes que contendo enzimas da presença de informações a respeito do
. .
codificam envolvidas no processo micro-organismos perfil global da comunidade
para de biodegradação são degradativos, com microbiana
enzimas detectados exclusão de bactérias - Os micro-organismos
que não são de que contribuem para o
interesse funcionamento do processo,
- Passivei classificação mas que não possuem os
a nível de estirpe genes da enzima-alvo, não
são detectados
PLFA Obtenção do perfil - Caracterização - Não é considerado uma

dos micro-organismos molecular de micro- boa opção quando utilizado
por meio do conteúdo organismos sem o como único método-padrão
de ácidos graxos envolvimento de genes - Necessidade de um
característicos - nformações
1 sistema de cromatografia/
complementares para espectrometria de massa
ensaios baseados em para identificação
16S
DNA Método de hibridização - Apto para análise - Equipamento de alto custo

microarray de várias amostras de grande número de - Dificuldade de manuseio
amostras
-Análise paralela de
diferentes parâmetros
CAPÍTULO 6 ◊ TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS AO ESTUDO DA DIVERSIDADE MICROBIANA... 31 3
6.3 APLICAÇÃO DAS TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR NO TRATAMENTO DE ÁGUAS

RESIDUÁRIAS
6.3.1 INTRODUÇÃO
A seguir serão descritos inúmeros estudos, presentes na literatura, relaciona-

dos à aplicação das técnicas de biologia molecular no estudo da diversidade 1nicro-
biana presentes em sistemas de tratamento de águas residuárias, sejam de escala
laboratorial ou escala real. Serão enfatizados os principais aspectos de cada traba-
lho de pesquisa, o que inclui os resultados mais significativos obtidos em cada um
deles. Cabe ao leitor avaliar o seu assunto específico de interesse e se aprofundar
procurando a fonte completa, isto é, o trabalho científico correspondente. Tendo
em vista que o objetivo do livro, como um todo, não se restringe apenas às ferra-
mentas moleculares, muitas vezes são realizadas pequenas discussões envolvendo
o processo biológico de tratamento.
6.3.2APLICAÇÃO DAS T~CNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR EM ESTUDOS DE CARACTERIZAÇÃO DE COMUNIDADES

MICROBIANAS REPRESENTATIVAS DE SISTEMAS DE TRATAMENTO DE AGUAS RESIDUARIAS
Bond et alii (1995) con1pararam a estrutura da comunidade 1nicrobiana de

dois sistemas de lodos ativados operados em bateladas sequenciais: um deles com
remoção de fosfato (RBS) e o outro não (RBS2 ). Os reatores eram alimenta-
dos com água residuária contendo, em média, DQO de 3 70 mg/L, enquanto a
concentração de fosfato solúvel foi em média de 18 mg/L. Logo após a partida
dos reatores, a alimentação do RBS foi suplementada com acetato de sódio para
aumentar a DQO em 100 mg/L. Tal procedimento foi realizado para favorecer o
desenvolvimento da população microbiana responsável pela remoção de fosfato no
RBS 1 em detrimento do RBS 2 , obtendo dessa forma dois sistemas com diferentes
capacidades de remoção desse nutriente.
Após três semanas de operação, foi observada uma remoção de fosfato superior
no RBS, e1n comparação com o RBS2 • A liberação de fosfato durante a fase anaeró-
bia pela biomassa do RBS 1 e do RBS2 foi de 35,4 e 5,2 mg/L, respectivamente. A
concentração de fosfato nos efluentes do RBS 1 e RBS 2 foi de 1,5 e 12,0 mg/L, res-
pectivamente. Esses dados evidenciaram diferenças marcantes nas comunidades
microbianas presentes nos dois reatores com respeito à transformação bioquímica
de fosfato (BOND et alii, 1995).
Bibliotecas de clone com sequências parciais do gene 16S rDNA das popu-
lações bacterianas do lodo fora1n construídas. A fim de identificar diferenças que
poderian1 indicar grupos ou gêneros importantes no processo de remoção biológica
de fósforo (conhecido pela sigla EBPR-Enhanced Biologi,cal Phosphorous Removal),
as estruturas das comunidades foram determinadas por meio de análises filogené-

t icas de 97 e 92 sequências parciais de clone representativos do RBS 1 e do RBS 2 ,
respectivamernte. Para ambos os reato res, o grupo bacteriano predominante com
o qual os clones foram afiliados foi a subclasse 13-Proteobacteria (28%). Bactérias
pertencentes a essa subclasse têm sido observadas por FISH como sendo domi-
nantes em comunidades de lodos ativados (VíTAGNER et alii, 1993; WAGNER et
alii, 1994). Devido à sua dominância nun1érica, é provável que os representantes
da subclasse 13 apresentem grande importância nos processos de degradação de
matéria orgânica, nutrientes e formação da estrutura do floco (BOND et alii,
1995) .
Outros grupos principais foram os pertencentes à subclasse cx.-Proteobacteria,
grupo do Planctomicetos e grupo relativo aos Flexibacter-Cytophaga-Bacteroides
(particularmente no RBS 2) . Além disso, inúmeros grupos de clone não afiliados
com conhecidos grupos bacterianos foram identificados nas bibliotecas de clone.
Acinetobacter spp ., relacionado como sendo um dos mais importantes n1icro-orga-
nismos na remoção de fosfato no lodo ativado de acordo con1 os métodos depen-
dentes de cultivo, conforme verificado por WENTZEL et alii (1988) apud BOND
et alii (1995), foram pobremente representados nas sequências de clone em ambas
as bibliotecas (aproximadamente 2%) . Diferenças na estrutura da co1nunidade
foram observadas entre os dois reatores, em particular ao que se refere ao grupo
Rhodocyclus entre a subclasse 13, o qual esteve presente em grande extensão na
comunidade microbiana do lodo do RBSl' capaz de remover fosfato . Essa consta-
tação pode estar relacionada ao fato de esse grupo microbiano, em particular, estar
associado a uma in1portante função no processo de remoção de fosfato. Os mesmos
autores ainda relatam que a grande diversidade de espécies presentes nos RBS e o
número limitado de clones analisado tornam difícil a tarefa de identificar uma ou
mais espécies bacterianas que podem possuir papel crucial na remoção de fosfato
(BOND et alii, 1995) .
Schramm et alii (1996) investigaran1, por n1eio da técnica FISH acoplada
à microscopia confocal de varredura a laser (CLSM), a distribuição de bactérias
litoautotróficas oxidadoras de amônia pertencentes aos gêneros Nitrosomonas e
Nitrobacter no biofilme nitrificante de um filt ro de percolação empregado em um
sistema de recirculação de água para aquicul tura. A concentração de a1nônio apre-
sentou valores que variara1n de 0,3 a 7 mM. A hibridização de células fixas foi
realizada com sondas oligonucleotídicas específicas para 16S rRNA. Observou-
se que as bactérias oxidadoras de amônia (AOB) formaram uma camada densa
de agregados celulares na parte superior do biofilme (porção ae róbia), enquanto
as bactérias oxidadoras de nitrito (NOB) formaram colônias menos densas e em
menor número quando comparadas con1 as colônias de Nitrosomonas. A CLSM
revelou a coexistência de AOB e NOB em regiões próximas, fato que está relacio-
nado com o metabolismo sequencial de ainônia a nitrato, via nitrito, promovido
pela ação conjunta desses dois grupos microbianos. Devido a esse arranjo espacial,
o caminho de difusão de Nitrosomonas para Nitrobacter é bastante curto e facilita
a transferência eficiente do intermediário n itrito. Ambas as espécies não ficaram
restritas à região óxica do biofilme, sendo detectadas, embora em número bem
menor, em camadas anóxicas. Algumas colônias de NOB, em particular, foram en-
contradas em camadas anóxicas superiores, a uma p rofundidade de 100 a 200 µ,m,
como també1n ocasional1nente no fundo do biofiln1e.
Snaidr et alii (199 7) investigaram a estrutura da comunidade de bactérias
em uma grande planta de tratamento de água residuária (processo de lodos ativa-
dos) utilizando rRNA. Genes quase completos que codificam para a subunidade
rRNA (rDNA) foram amplificados por PCR e subsequentemente clonados. Os clo-
nes foram classificados por meio de h ibridização dot-blot com sondas oligonucleo-
tídicas grupo-específicas. As afiliações filogenéticas dos clones foram comparadas
com os resultados obtidos com a amostra original por meio de hibridização in
situ com sondas oligonucleotídicas visando às rRNA marcadas com fl uorescên-
cia, verificando-se que os dados estava1n em concordância. Foram sequenciados
completamente 25 clones 16S rDNA, 11 foram quase totalmente sequenciados
(> 80%) e 2 7 foram parcialmente sequenciados.
Por meio de análise co111parativa das sequências, a maio ria dos clones exa-
minados (35 dos 67) foram afiliados à subclasse ~ da classe Proteobacteria. As
subclasses y e a dessa mesma classe foram representadas por 13 e quatro clones,
respectivamente. Oito clones foram agrupados no grupo ê de Proteobacteria e cinco
clones foram agrupados no grupo de bactérias gram-positivas com DNA de baixo
teor de G+C. O gene 16S rDNA de dois clones mostraram similaridade com os
genes 16S rDNA dos men1b ros do filo Chlamydiae e Planctomyces. Sondas oligonu-
cleotídicas foram desenhadas e utilizadas para enumerar as respectivas bactérias.
De forma interessante, representantes patogênicos do gênero Arcobacter estiveram
presentes em números significativos (4%) na amostra de lodo ativado examinada.
Burrell et alii (1998), no intuito de investigar a identidade de bactérias oxi-
dadoras de nitrito em plantas de t ratamento de águas residuárias, operaram um
reator batelada sequencial (RBS), alimentado com uma solução de sais inorgâni-
cos, sendo o nitrito a única fonte de energia. Fazendo uso de microscopia, de mé-
todos de cultivo e de técnicas moleculares, a biomassa desenvolvida no reator foi
investigada após um período de seis meses de ope ração do mes1no. Os 1nétodos de
biologia n1olecular ainda foram utilizados para caracterizar o lodo utilizado para
inocular o RBS (lodo semente), sendo este último comparado com a biomassa pre-
sente no interior do reator. Observou-se que a biomassa do RBS compreendia uma
comunidade co1nplexa e bastante diversificada contendo bactérias gram-negativas
e gram-positivas.
Os métodos baseados em cultivo em meio de cultura (micromanipulação, di-
1uição da amostra e plaqueamento) identificaram somente bactérias heterotróficas,
sendo que nenhum micro-organismo autótrofo foi isolado. Bibliotecas de clone

16S rDNA de duas comunidades microbianas revelaram que o lodo de inoculação
ap resentava uma comunidade microbiana complexa do1ninada po r Proteobacteria
(29% da subclasse ~ e 18% da subclasse y) e grande quantidade de bactérias
gram-positivas G + C (10%). Em relação aos insertos dos 77 clones da biblioteca
referentes a esse mesmo lodo, observou-se que, após o sequenciamento, a maioria
das sequências de clones foi agrupada ao filo Proteobacteria (56%), enquanto 4%
(três clones) foi agrupado ao filo Nitrospira, especificamente Nitrospira moscovien-
sis, sem que ocorresse a identificação de Nitrobacter. Insertos de 102 clones da
biblioteca referente à biomassa contida no interior do reator fo ram examinadas
por meio da análise com enzimas de restrição, os quais foram classificados em
13 unidades taxonômicas operacionais (OTU) diferentes. Um total de 90 clones
(88%) foram agrupados em uma OTU particular, enquanto as 12 OTUs restantes
foram co1npostas de clones individuais, sendo cada um correspondente a 1 % do
total do número de clones. A biomassa no interior do RBS apresentou preponde-
rância de bactérias relacionadas à Nitrospira moscoviensis, sendo duas sequências
de clones similares às do gênero Nitrobacter. Diante dos resultados obtidos, os
autores concluíra1n que as bactérias oxidadoras de nitrito "desconhecidas" (assim
designadas justamente por não seren1 passíveis de isolamento por meio de técnicas
convencionais de cultivo) presentes em sistemas de lodos ativados se referem às
pertencentes ao filo Nitrospira (BURRELL et alii, 1998).
Okabe et alii (1999) investigaram a organização espacial in situ de bactérias
oxidadoras de amônia (AOB) e oxidadoras de nitrito (NOB) no biofilme formado
em reator de discos rotativos, tanto alimentado com água residuária domésti-
ca quanto alimentado com meio sintético (biofilme nitrificante autotrófico), por
meio do uso de microssensores e pela técnica FISH utilizando sondas oligonu-
cleotídicas específicas para 16S rRNA. A combinação dessas técnicas permitiu
relacionar a atividade microbiana in situ diretamente com a ocorrência de popu-
lações bacte rianas nitrificantes . A hib ridização in situ (FISH) revelou que bacté-
rias pertencendo ao gênero Nitrosomonas representaram as AOB numericamente
dominantes em ambos os biofilmes. Entretanto, bactérias pertencendo ao gênero
Nitrobacter não fo ram detectadas. Nitrospira foi o principal gênero representativo
das NOB em an1bos os biofilmes, encontrando-se principalmente na parte inter-
mediária dos mesmos. As células dessa última linhagem microbiana formaram
agregados com forma irregular consistindo em pequenas microcolônias, as quais
se agruparam ao redor das AOB. Enquanto a maioria das AOB estiveran1 presen-
tes po r todo o biofilme, NOB ficaram restritas a zonas onde ocorria ativamente a
oxidação de nitrito, localizadas nas partes internas do biofilme. Por meio de me-
dições com microeletrodos, foi possível constatar que a zona ativa de oxidação de
a1nônia esteve localizada na parte externa do biofilme, enquanto a zona ativa de
oxidação de nitrito esteve localizada logo abaixo da zona de oxidação de amônia,

confirmando as observações obtidas por FISH.
AOI et alii (2000), utilizando a metodologia FISH com sondas oligonucleotí-
dicas específicas para 16S rRNA, investigaram a ecologia microbiana de bactérias
nitrificantes em vários tipos de processos de tratamento de águas residuárias.
Avaliou-se também a resposta dinâmica dos micro-organismos em diferentes tipos
de biofiln1es e de flocos suspensos, bem co1no a distribuição de bactérias oxidado-
ras de an1ônia (AOB) e de outras bactérias heterotróficas. Amostras de três tipos
de reatores nitrificantes foram analisadas: 1) biofilmes de um leito .fl uidizado
alimentado com a.fluente rico em amônia sem adição de compostos orgânicos nem
de micronutrientes; 2) lodos ativados (em virtude da não forn1ação de biofilme
denso nas partículas do leito .fluidizado) cujo a.fluente inorgânico continha micro-
nutrientes e apresentava baixa taxa de oxidação de amônia; e 3) biofilme de outro
leito .fluidizado alimentado com água residuária orgânica co1n alta concentração
de amônia e de compostos orgânicos.
Os mesmos autores observaram que as bactérias nitrificantes exibiram diversas
formas organizacionais de acordo com as diferentes condições operacionais impos-
tas, particularmente no que se refere à composição e à concentração do substrato.
As AOB mostraram-se dominantes en1 águas residuárias inorgânicas ricas em amô-
nia.Já em água residuária de caráter orgânico, tanto bactérias heterotróficas quanto
AOB se distribuíram em diferentes posições do biofilme. As amostras do reator 1
revelaram a predominância de bactérias do gênero Nitrosomonas, juntamente com
Nitrosococcus mobilis. No reator 2, foram detectados membros do gênero Nitrosomonas
(juntamente com N . mobilis) com tipos específicos de sonda, enquanto outro tipo
de sonda detectou outras AOB como Nitrospira, Nitrosovibrio e Nitrosolobus . Estes
grupos microbianos só aparecera1n no reator 2, o que provavelmente está rela-
+
cionado com as menores taxas de oxidação de amônia (0,3 kgN-NH 4 /(m3 ·d))
deste sistema em comparação com as dos outros reatores (1 e 3), característica
que permitiu a coexistência dos grupos microbianos mencionados. Nitrosomonas
conjuntamente com N . mobilis exibiram maior atividade em concentrações altas
de amônia, enquanto para Nitrosospira, Nitrosovibrio ou Nitrosolobus a atividade foi
maior em concentração baixa de amônia, fato que indica a forte dependência da
ecologia microbiana com as condições operacionais e torna a observação e o con-
trole dos grupos microbianos oxidadores de amônio de fundamental importância
na manutenção de atividade nitrificante estável (AOI et alii, 2000).
Já para o caso do reator 3, alin1entado com afluente de natureza orgânica, foi
detectada a presença de bactérias heterotróficas, as quais ocuparam a parte exter-
na do biofilme cuja espessura era de 100 µ,1n, e também de AOB, sendo este grupo
localizado na parte interna do biofiln1e. Segundo os autores, a razão para as AOB
e as bactérias heterotróficas tenderem a ficar localizadas em diferentes posições
do biofilme, deve-se ao fato de que a população heterotrófica possui maior taxa de

crescimento do que a população autotrófica, fazendo com que, no início, essas bac-
térias ocupasse1n a região externa do biofihne na qual as concentrações de oxigênio
dissolvido (OD) e de substrato eram suficientemente altas para propiciar o seu
crescimento. Em contrapartida, as AOB foram capazes de se distribuir tanto indi-
vidualmente quanto na fo rma de grupos na parte interior do biofilme, em virtude
de sua baixa taxa de crescimento, n1esmo consistindo essa região en1 um ambiente
de crescimento desfavorável em termos de concentração de OD. De forma similar
ao reator 1, Nitrosomonas consistiu no gênero de AOB predominante no reator 3 .
AOI et alii (2000) ainda aval iaran1 a resposta dinâmica das comunidades n1i-
crobianas frente a mudanças na composição do afluente, particularmente no que
se refe re à redução gradual da relação COT/N-NH; . Verificou-se que com a dimi-
nuição dessa relação, as AOB, que anteriorn1ente estavam somente localizadas na
parte interna do biofiln1e, estenderam sua área de crescimento para a parte mais
externa do mesmo, a qual era previamente ocupada exclusivamente por bactérias
heterotróficas. O que se percebeu é que o decréscin10 na quantidade de compostos
orgânicos limitou o crescimento dos micro-organismos heterotróficos, o que per-
mitiu, por consequência, o desenvolvimento do consórcio nitrificante (AOB) na
parte externa do biofilme. Para se ter uma ideia, quando a relação COT/N-NH;
atingiu valores nulos, as AOB ainda se mantiveram em grande número por todo o
biofilme, enquanto as bacté rias heterotróficas praticamente desapareceram. Após
determinado período nesta condição, a atividade nitrificante aumentou e a espes-
sura do biofilme, que no início deste regime sem carbono orgânico apresentou um
decréscimo, permaneceu estável. Os resultados indicaram que o controle efetivo
da ecologia microbiana pode ser obtido por meio do controle das condições opera-
cionais do reator, enfatizando a possibilidade de se obter biofilmes densos e alta-
mente ativos contendo grande diversidade de bactérias nitrificantes com a redução
gradual da relação COT/N-NH;. Este procedimento, por sua vez, reduz o tempo
de formação de um biofilme nitrificante efetivo para menos de um terço daquele
necessário para a formação de um biofilme nas condições operacionais do reator 1,
isto é, co1n afluente desprovido de material orgânico e de micronutrientes.
Procurando avaliar a relação entre a formação excessiva de espumas em
plantas de tratamento de águas residuárias e actinomicetos que contém ácido
m icólico (família Mycolata), os quais rep resentam micro-organismos geralmente
considerados como causadores de tal fenômeno, Davenport et alii (2000) desen-
volveram uma sonda específica a essas bactérias, bem como um protocolo para
permeabilizar tais micro-organismos e um método de quant ificação estatística.
A técnica FISH quantitativa foi utilizada para investigar a relação entre a pro-
dução de espuma e a concentração dos actinomicetos em um sistema de lodos
ativados, completamente agitado, com volume de 20 m 3 • Os autores verificaram
que a formação de espumas ocorreu quando o número de actinomicetos perten-

centes à família Mycolata excederam determinado valor. Este valor foi estimado
em torno de 2 x 106 células/mL.
O processo de nitrificação pode ocorrer em diferentes reatores com diferen-
tes configurações, embora muitas vezes a forma como as comunidades microbia-
nas nitrificantes atuam nas diversas configurações existentes seja uma incógnita.
Estudos recentes a respeito de bactérias oxidadoras de amônia (AOB) em sisten1as
de tratan1ento de águas residuárias tên1 sugerido que diferentes plantas suportam
diferentes populações e diferentes níveis de riqueza de espécies. Neste contexto,
Rowan et alii (2002) compararam a diversidade e a estrutura da comunidade de
AOB, pertencentes à classe ~-Proteobacteria, em duas configurações de reatores
operados em escala real : um filtro biológico aerado (FBA) e dois filtros de perco-
lação (FP) em série (primário e secundário). Os reatores fora1n alimentados com
a n1es1na água residuária mista, advinda predo1ninante de fonte industrial (70%
industrial/30% doméstica), previamente tratada por um sistema de lodo ativado
de alta taxa, e ainda misturada com água residuária doméstica (na razão de 2 : 1
- doméstica/industrial pré-tratada). Para a realização do estudo, foram empre-
gadas diferentes técnicas 1noleculares. A PCR foi usada para a amplificação dos
fragmentos do gene 16S rRNA, utilizando para isso primers seletivos para AOB
(~-Proteobacteria) . Já a DGGE permitiu a análise dos fragmentos amplificados
por PCR, sendo os perfis obtidos analisados para permitir comparações das popu-
lações de AOB dominantes nos reatores. Além disso, uma seleção dos frag1nentos
de gene 16 S rRNA amplificados por PCR e clonados, foram sequenciados para
determinar a afiliação filogenética das sequências representativas das espécies de
AOB dominantes.
Os resultados obtidos pela comparação visual dos perfis de DGGE apresenta-
dos pelos fragmentos de gene 16S rRNA provenientes do FBA e do FP revelaram
populações distintas em diferentes seções de cada reator e também diferenças
entre os reatores. O FBA era composto de três camadas interligadas, cada uma
direcionada a um processo de biodegradação diferente: desnitrificação (anóxica),
remoção de matéria orgânica (óxica) e nitrificação (óxica) . Uma mudança no ní-
vel de aeração pareceu ter un1 efeito na população bacteriana presente no reator.
Também se observou diferenças significativas nos resultados obtidos por DGGE
entre as profundidades dos FP e entre o FP primário e secundário, sendo que
mais bandas foram detectadas nas amostras do fundo do filtro primário e no filtro
secundário em comparação con1 o topo do filtro prin1ário (ROWAN et alii, 2002).
Os resultados obtidos pelos mesmos autores ainda revelaram que, embora
ambos os reatores (FBA e FP) tenham sido alimentados com a mesma água re-
siduária, eles abrigaram diferentes populações de bactérias. O FBA apresentou
uma menor diversidade de AOB quando comparado com o FP, tendo as amostras
oriundas deste último apresentado algumas bandas no gel de DGGE que não
apareciam nas amostras provenientes do FBA. Entretanto, ambos os reatores apa-

rentaram ter uma população predominante comum (ROWAN et alii, 2002) .
Bibliotecas de clone de genes 16S rRNA de AOB foram construídas a partir
das amostras de cada um dos reatores e foram selecionadas as que possuíram a
maior diversidade com base nos perfis de DGGE. As sequências de nucleotídeos
foram determinadas para cada tipo de clone das bibliotecas de clones e fo ram
comparadas com o banco de dados GenBank. A análise detalhada das sequências
recuperadas do FBA e do FP revelaram que todas derivaram de ~-Proteobacteria
ou de y-Proteobacteria não cult ivada. Além disso, a maioria das sequências (97%
do FBA, 80% do topo do FP e 85% do fundo do FP) apresentou maior relação
com as AOB (~- Proteobacteria). O restante das sequências recuperadas esteve re-
lacionado com Thaurea spp . e com Dechlorimonas agitatus (ROWAN et alii, 2002).
As sequências obtidas da unidade de nit rificação do FBA e do topo e fundo
do FP foran1 identificadas con10 pertencendo ao gênero Nitrosomonas . A biblioteca
de clones do FBA teve uma preponderância de Nitrosomonas mobilis, enquanto as
amostras do FP apresentaram maior diversidade, sendo os clones predominantes
pertencendo a N . mobilis e Nitrosomonas spp. As sequências de N. mobilis foram
encontradas em todos os reatores, mas foram mais abundantes na biblioteca de
clones do FBA (90% das sequências) do que nas do FP (33% do topo de secundá-
rio, 2 7% do fundo do secundário) (RO,iVAN et alii, 2002).
Persson et alii (2002) investigaram a composição do biofilme aderido a su-
portes plásticos (área superficial de 240 m 2/m3 ) de um filtro de percolação nitrifi-
cante (FPN) de escala real, aplicado no tratamento de água residuária municipal,
por n1eio de métodos n1icrobiológicos utilizando hibridização fluorescente insitu
(FISH) com sondas de oligonucleotídeos de 16S rRNA em combinação com mi-
croscopia confocal de varredura a laser. Em todas as amostras retiradas de dife-
rentes profundidades do FPN, que na verdade correspondiam a diferentes tempos
operacionais do reato r, observou-se que as bactérias oxidado ras de amônia (AOB),
com exceção a duas espécies marinhas do gênero Nitrosococcus, pertenciam à sub-
classe ~-Proteobacteria, particularmente ao gênero Nitrosomonas . Verificou-se ain-
da que nenhuma bactéria foi detectada com a sonda específica para Nitrosospira
spp., e que a aplicação de eletrodos específicos para Nitrosococcus mobilis e para
Nitrosomonas europaea para determinação da filogenia não forneceu sinais em ne-
nhuma das amostras.
Os resultados evidenciaram a tendência de decréscimo tanto da proporção
das AOB em relação ao total de bactérias quanto da quantidade total dessas bac-
térias nas diferentes camadas do biofilme (30 + 23% menor nas crunadas mais
externas em co1nparação co1n as 1nais internas). Esta quru1tidade total de AOB
ainda apresentou decréscimo progressivo com a profundidade, isto é, do topo ao
fundo do filtro de percolação. Medições e simulações da atividade de oxidação
de amônia também mostraram um decréscimo na atividade com o aumento da
profundidade do FPN, o qual geralmente foi operado em nitrificação completa

(PERSSON et alii, 2002) .
D ionisi et alii (2002), utilizando o princípio da PCR competitiva, desen-
volveram ensaios para quantificar bactérias oxidadoras de an1ônia (AOB) perten-
centes à espécie Nitrosomonas oligotropha e bact érias oxidadoras de nitrito (NOB)
pertencendo ao gênero Nitrospira (principais representantes das NOB em lodos
ativados) . As especificidades dos primers utilizados, os quais foran1 desenhados
para duas regiões-alvo (gene amoA e 16S rDNA de Nitrospira), foram verifica-
dos por meio de sequenciamento de DNA. Ambos os ensaios foram otimizados e
aplicados em amostras de um sistema de lodos ativados destinado ao t ratamen-
to de águas residuárias. Os resultados mostraram que as AOB representaram
0,0033% + 0,0022% do total da população bacteriana da planta de tratamento.
Verificou-se que AOB pertencentes à espécie N . oligotropha não foram detectadas
na a1nostra. Nitrospira spp. representou 0,39% + 0,28% da população bacte riana
presente na biomassa. O número de células de Nitrospira sp. na amostra da planta
de tratamento foi mais de 62 vezes maior que o número de células de N. oligotro-
pha, resultado esse baseado na análise de PCR competitiva. De qualquer forma,
os resultados confirmaram que a parcela representativa da biomassa autotrófica
nitrificante p resente e1n plantas de tratamento é pequena, fato observado e1n al-
guns trabalhos da literatura.
Juretschko et alii (2002) avaliaram a composição da comunidade microbiana
presente em sistema de lodos ativados nitrificante-desnitrificante de uma planta de
tratamento de água residuária industrial por meio de técnicas moleculares visando
ao gene que codifica para rRNA. O esgoto afluente da planta possuía altas concentra-
ções de amônia (em torno de SOO mg'L). Além disso, ácidos graxos de cadeia curta
(principalmente acetato, mas também butirato e propionato) foram encontrados em
quantidades significativas no esgoto afluente. No intuito de alcançar a nitrificação
e a desnitrificação em um único tanque, o sistema foi aerado de forma intermitente
(30 min de aeração e 15 minem condição anóxica). Durante o período de amostra-
gem, mais de 90% dos compostos nitrogenados presentes no afluente eram converti-
dos a compostos nitrogenados gasosos por meio da nitrificação e da desnitrificação.
Foram analisados filogeneticamente 94 clones do gene 16S rRNA (quase
tamanho completo) . Desses, 59% foram afiliados à classe Proteobacteria, agru-
pados na subclasse ~ (29 clones), a (24 clones) e õ (dois clones). Quinze clones
foram agrupados entre bactérias não sulforosas verdes (GNS) e 11 clones perten-
ce ram aos Planctomicetos . Verrucomicrobia, Acidobacteria, Nitrospira, Bacteroidetes,
Firmicutes e Actinobacteria fo ram representados, cada um, por um a cinco clo-
nes. De forma interessante, a maior riqueza de espécies medida como número
de unidades ta-..conômicas operacionais (OTUs) foi encontrada entre a subclasse
a-Proteobacteria, seguida de Planctomicetos, subclasse ~-Proteobacteria e bactérias
GNS CTURETSCHKO et alii, 2002).
Os mesmos autores ainda estudaram a composição da comunidade microbia-

na do sistema de lodos ativados, determinada quantitativamente por meio da téc-
nica FISH (junta1nente com 1nicroscopia confocal de varredura a laser), utilizando
3 6 sondas oligonucleotídicas grupo-, subgrupo- e unidades taxonômicas operacio-
nais (UTOs)- específicas visando ao gene rRNA. Observou-se que 89% de todas
as bactérias detectadas por FISH com sondas específicas para células bacterianas
puderam ser relacionadas a divisões específicas. De forma consistente aos dados
gerados na biblioteca de clones construída a partir do gene 16S rRNA, mem-
bros da subclasse ~-Proteobacteria foram dominantes na comunidade microbiana
e rep resentaram quase metade do biovolume de todas as bactérias detectadas por
FISH. Entre a subclasse-~, 98% das células puderam ser identificadas por n1eio
do uso de sondas gênero- ou UTO- específicas, demonstrando grande abundância
in situ de bactérias relacionadas a Zoogloea e Azoarcus, gêneros relacionados ao
processo desnitrificante (JURETSCHKO et alii, 2002) .
Em sistemas aeróbios-anóxicos, nos quais pequenas adições de oxigênio são
fornecidas para o reator anóxico para induzir a nitrificação e desnitrificação si-
multâneas, a oxidação de amônia na zona anóxica pode corresponder a 30-50%
da nitrificação total do reato r, mesmo que a concentração de oxigênio di ssolvido
esteja, geraln1ente, abaixo do limite detectável. No intuito de investigar se a
eficiência de nitrificação nos processos aeróbios/anóxicos é devida à presença de
bactérias oxidadoras de amônia (AOB) especializadas, Park et alii (2002) rea-
lizaram uma análise da população dessas bactérias no processo aeróbio/anóxico
Orbal e em um processo convencional de re1noção de nitrogênio. Para tanto,
lançaram mão de análises filogenéticas baseadas no gene amônia mono-oxige-
nase (amoA). A análise T-RFLP revelou que organismos como Nitrosospira fo-
ram os maiores responsáveis pela oxidação de amônia no reator anóxico/aeróbio
Orbal em escala real . Entretanto, as populações relativas de AOB, tais como de
Nitrosospira e Nitrosomonas, não foram constantes e ap resentaram variabilidade
sazonal. Clonagem e comparação de sequências dos fragmentos do gene amoA
mostraram que a maioria das AOB no processo Orbal pertenciam às linhagens
Nitrospira sp. e Nitrosomonas oligotropha. A abundância de organismos, como
Nitrosospira, em reato res ae róbios/anóxicos é significativa, uma vez que esse gru-
po de AOB não tem sido associado com nitrificação em plantas de t ratamento de
águas residuárias.
Chen et alii (2003) aval iaram a resposta dinâmica de culturas de lodos ati-
vados nitrificantes, cultivadas em regime batelada, frente ao aumento da concen-
t ração de cloreto até 30 000 mg/L, monitorando a taxa específica de nitrificação
e as espécies nitrificantes dominantes. Em uma das culturas, o aumento de clo-
reto foi realizado de forma gradual, sendo que na outra esse aumento se deu na
forma de pulso (aumento degrau) . As espécies de bactérias oxidadoras de amônia
(AOB) e oxidadoras de nitrito (NOB) foram examinadas por meio da técnica de
hibridização por fluorescência insitu (FISH), utilizando sondas de oligonucleo-

t ídeos específicas para 16S rRNA. Os experimentos, em ambas as culturas, foram
divididos em três fases operacionais distintas e1n tern1os do aumento de cloreto: Fase
1, com duração de 70 dias e aumento da concentração de cloreto até 1O 000 mg!L;
Fase 2, com duração de 70 dias e com aumento da concentração de cloreto de 1O 000
para 20 000 mg/L; e Fase 3, operada durante 60 dias e caracterizada pelo aumen-
to de 20 000 para 30 000 mgCl-/L. Na cultura submetida ao aun1ento degrau, a
concentração de cloreto era fixada em um certo valor em cada fase, enquanto para
o caso da cul tura submetida ao aumento gradativo deste íon, a concentração era
aumentada em 2 000 mgCl-/L a cada 1O dias.
Observou-se que concentrações abaixo de 10 000 mgCl-/L (Fase 1), tanto no
experimento de aumento gradual quanto no de aumento degrau, não afetaram a
taxa específica de nitrificação das culturas microbianas. É válido ressaltar ainda
que a concentração de 2 SOO mgCl-/L favoreceu o aumento da taxa de nitrificação.
A técnica FISH permitiu observar que os grupos de AOB nas culturas submetidas
aos índices crescentes de cloreto contiveram N . marine, N . oligotropha, N . euro-
paea, N . eutropha, N . halophila, N . mobilis, N . communis e N . cryotolerans . Com o
aumento gradativo ou degrau de 1O 000 para 20 000 1ngCl-/L na Fase 2, ocorreu
uma variação significativa nas duas culturas, fazendo com que ocorresse uma
queda inicial da taxa específica de nitrificação, reflexo da inibição ocasionada pelo
cloreto às AOB e NOB atuantes nos dois sistemas biológicos. Entretanto, depois
de deco rridos alguns dias, a taxa específica de nitrificação voltou a crescer, mesmo
com as concentrações salinas aumentadas. Este fato esteve associado a uma mu-
dança das espécies dominantes de AOB. Na verdade, ocorreu uma substituição de
espécies não resistentes à salinidade, como Nitrosomonas europaea e Nitrosomonas
eutropha, por bactérias resistentes ao efeito salino, como Nitrosococcus mobilis. A
taxa específica de nitrificação da cultura submetida ao aumento de cloreto na for-
ma de pulso foi menor do que aquela atingida pela cultura submetida ao aumento
gradual, o que implica que o aumento gradual da concentração de cloreto favore-
ceu a adaptação e o desenvolvimento de AOB resistentes ao efeito salino. Ainda
foi verificado que Nitrobacter foi a única espécie de NOB dominante quando a
concentração de cloreto foi menor que 1O 000 mg/L, não sendo observados outros
micro-organismos pertencentes a essa categoria quando a concentração de cloreto
foi igual ou maior que 18 000 n1g!L. Por fim, na Fase 3 (30 000 mgCl-/L), a
taxa de nitrificação se manteve constante para a cultura que foi acondicionada de
forma gradativa ao teor de cloreto, e apresentou um leve acréscimo para o caso da
cultura na qual o teor de cloreto foi aumentado de uma só vez (aumento degrau)
(CHEN et alii, 2003) .
Fazendo uso de técnicas moleculares, tais como PCR, DGGE, clonagem e se-
quenciamento, Tal et alii (2003) investigaram o consórcio microbiano de um bior-
reator de leito móvel (MBBR) conectado a um sistema de aquicultura marinho
com recirculação, procurando obter informações mais apuradas a respeito da fun-

ção de diferentes espécies bacterianas, tanto anaeróbias quanto aeróbias, no p ro-
cesso de re1noção de nitrogênio inorgânico. Na verdade, as informações a que se
refere possuem papel muito importante para aumentar a eficiência dos sistemas
biológicos de remoção de nitrogênio, propiciando melhorias das condições ope-
racionais (concentração de oxigênio dissolvido, vazão de afluente, temperatura e
carga nitrogenada) e fornecendo subsídios necessários para completar o ciclo do
nitrogênio no sistema, liberando esse nutriente para a atmosfera na sua forma
molecular.
Após quatro meses de operação do MBBR, parte dos suportes presentes nes-
se reator, que estavam sendo subn1etidos a altas cargas orgânicas, foi transferida
para um sistema experimental operado en1 condições aeróbias sem carga orgânica
e com tempo de retenção hidráulica semelhante ao sistema original . Este sistema
serviu como fonte de suportes submetidos a baixas cargas orgânicas para os estu-
dos posteriores. Desta forma, os diferentes processos biológicos de transformação
de nitrogênio foram dirigidos por meio de procedimentos de incubação de curta
duração, realizados em regime de batelada com os suportes submetidos tanto a
baixas cargas (provenientes do sistema experimental mencionado) quanto a altas
cargas orgânicas (provenientes do MBBR original) (TAL et alii, 2003) .
Foram encontrados Nitrosomonas cryotolerans e Nitrospira marina como repre-
sentantes das bactérias oxidadoras de amônia e oxidadoras de nitrito, respectivamen-
te. Foram também detectadas bactérias heterotróficas, incluindo Pseudomonas sp.,
Aquaspirillum metamorphum e Sphingomonas sp. U1n fato interessante observado
pelos autores foi a presença de dois produtos de PCR cujas sequências apresen-
taram grande similaridade com dois representantes de Planctomycetes sp., detec-
tados no sistema submetido a altas cargas orgânicas, sugerindo a capacidade de
oxidação anaeróbia de amônia (anammox). Os produtos de PCR ainda fornece ram
sequências que ap resentaram grande similaridade com os micro-organismos oxi-
dadores de sulfito, particularmente Sulfitobacter sp., sugerindo o estabelecimento de
uma condição anaeróbia que permitiu promover a redução de sulfato a sulfito no
MBBR. Nesse trabalho, em virtude da metodologia empregada para análise micro-
biana (DGGE baseada e1n produtos PCR), não foi possível determinar a abundância
relativa das diferentes espécies bacterianas aderidas ao biofilme, embora fosse pos-
sível se obter uma estimativa das espécies dominantes nos diferentes ensaios (alta
ou baixa carga orgânica aplicada), em virtude das atividades fisiológicas peculiares
a cada grupo microbiano e da capacidade de cada grupo em realizar processos espe-
cíficos relacionados ao ciclo do nitrogênio (TAL et alii, 2003).
Os experimentos de incubação realizados em baixa carga orgânica apresentaram
uma taxa máxima de remoção de amônia de 31,5 mgN-NH 3/(m2 ·h).Jáo valor obtido
nas incubações realizadas com alta carga orgânica foi de 25 mgN-NH3 /(m 2 • h),
sendo observados os processos de desnitrificação e anammox. A presença ativa da
população heterotrófica nos experimentos com alta carga orgânica teve relação
com o maior consumo de oxigênio e com a menor atividade nitrificante em com-
paração com os ensaios realizados em baixa carga orgânica (TAL et alii, 2003).
Tsuneda et alii (2003) investigaram a formação de grânulos de bactérias
nitrificantes em um reator de leito fluidizado aeróbio com fluxo ascendente
(RLFFA), aplicado para fins de nitrificação de uma água residuária sintética
contendo SOO mg/L de N-NH; . Foi observada a formação de grânulos esféricos,
pseudocúbicos e elípticos com diâmetros em torno de 346 f.lm no fundo reator,
após um período de operação de 300 dias. O sequenciamento dos fragmentos de
DGGE removidos dos géis não permitiu uma combinação perfeita das sequências
obtidas com as sequências registradas na base de dados, sugerindo dessa maneira
que estivessem presentes, nos grânulos do reator, populações de bactérias oxi-
dadoras de an1ônia (AOB) ainda não caracterizadas. Como resultado da análise
filogenética, uma sequência nucleotídica derivada de uma das bandas de DGGE
apresentou grande similaridade com Nitrosococcus mobilis, sendo que outras sequên-
cias derivadas de outras bandas foram 1nuito semelhantes àquelas apresentadas por
Nitrosomonas marina. Os autores sugeriram que as altas cargas de amônia aplicadas
ao sistema levaram à predominância do gênero Nitrosomonas no RLFFA, o que, se-
gundo os mesmos, é bastante coerente, sobretudo quando se leva em consideração
os diversos trabalhos descritos na literatura que apontan1 o don1ínio dos 1nicro-
-organismos pertencentes a esse gênero em sistemas biológicos que são operados
com grandes concentrações de nitrogênio amoniacal .
A análise de distribuição espacial pela técnica FISH revelou que as AOB
se encontravam em uma profundidade de 100 f.lm da superfície do grânu-
lo, sendo encontrados grupos de AOB com diâmetro variando de 10-20 f.lm .
Utilizando sondas específicas para NOB, verificaram que estas bactérias tam-
bém estavam localizadas próximas da superfície do grânulo . No entanto, o
número de NOB foi bem menor quando comparado com o número de AOB, fato
este que pode ser explicado pela maior taxa de produção de nitrato pelo Nitrobacter
(5,1-42 fmol/(célula·h)) e1n comparação co1n a taxa de produção de nitrito pelo
Nitrosomonas (0,9-42 fmol/(célula·h)) (PROSSER, 1989 apud TSUNEDA et
alii, 2003). Bactérias pertencentes ao gênero Nitrospira, embora sejam fre-
quentemente encontradas em sistemas de lodos ativados que desenvolvem a ni-
trificação (SCHRAMM et alii, 1998 apud TSUNEDA et alii, 2003), não foram
detectadas no RLFFA pela técnica de FISH utilizando sondas específicas para
este grupo microbiano. A ausência de Nitrospira provavelmente esteve ligada à
alta concentração de N-NH; alimentada ao sistema (500 1ng/L), valor este muito
superior ao comumente encontrado em sistemas convencionais de lodos ativados,
o qual pode atingir cerca de 100 mgN-NH:/L (TSUNEDAet alii, 2003) .
A hibridização in situ, visualizada por meio da microscopia confocal de var-

redura a laser, permitiu verificar que o crescimento de AOB foi intimamente rela-
cionado com o de outras bactérias, inclusive hete rotróficas e NOB. Tendo e1n vista
que este último grupo microbiano exibiu uma população minoritária, foi notável a
presença de micro-organismos heterotróficos nos grânulos nitrificantes, embora a
solução de alimentação não contivesse 1natéria orgânica. O fato é que a população
heterotrófica pode crescer utilizando como substrato os próprios produtos de lise
celular. Os efeitos ocasionados por esses micro-organismos heterotróficos na gra-
nulação de nitrificantes podem incluir a estabilização do grânulo e a manutenção
de sua estrutura t ridimensional (TSUNEDA et alii, 2003).
Egli et alii (2003a), operando um contactor biológico rotativo (RBC), ob-
servaram grande remoção de nitrogênio no tratamento terciário de um l ixivia-
do contendo, entre outros con1postos, alta concentração de nitrogênio amoniacal
(100-500 1ngN-NH; /L). Este lixiviado havia sido p reviamente tratado em outro
RBC preliminar, no qual se alcançou uma remoção de 88% dos compostos orgâ-
nicos (COT) . Seis por cento do COT foi removido pelo processo de adsorção em
carvão ativado aplicado antes do prüneiro RBC. E sse trata1nento prévio assegu rou
uma excelente remoção dos compostos orgânicos típicos de lixiviado proveniente
de aterros de resíduos perigosos pelo primeiro RBC, como hidrocarbonetos clo-
rados, fenóis e anilinas. Desta fo rma, o efluente do primeiro RB C continha ba-
sicamente alta concentração de amônio, sendo direcionado para o segundo RBC,
submetido a uma carga de N-NH; máxin1a equivalente a 30 kgN-NH;/d.
Foram analisadas a composição e a estrutura espacial da comunidade mi-
crobiana no biofilme do RBC, com ênfase na presença de bactérias oxidadoras de
amônio (AOB) e oxidadoras de nitrito (NOB) e de bactérias envolvidas no pro-
cesso de oxidação anaeróbia de amônio (anan1mox), procu rando relacionar essas
observações da biomassa com o processo de ren1oção de nitrogênio. A composi-
ção da comunidade microbiana presente nos biofilmes foi determinada utilizan-
do-se diferentes ferra1nentas moleculares. Inicialmente, un1a biblioteca de clones
16S rRNA foi construída a partir dos fragmentos de 16S rDNA an1plificados por
PCR, oriundos do D NA bacteriano presente no biofilme. O sequenciamento re-
velou a presença de um número de sequências de 16S rDNA pouco comuns, com
poucas sequências relacionadas às espécies mais conhecidas de AOB e NOB. Os
insertos DNA de 26 clones foram sequenciados, dos quais nove eram diferentes.
Duas sequências de 16S rRNA diferentes apresentaran1 93% de sen1elhança entre
si, mas ambas com pelo menos 97% de semelhança com a sequência 16S rRNA
de Sphingomonas sp. Outra sequência pertencia a un1 organisn10 relacionado ao
gênero Staphylococcus, além do fato de ser clonada uma região 16S rDNA de uma
suposta AOB relacionada ao gênero Nitrosomonas, a qual, por sinal , foi a única
sequência presente na biblioteca de clones relacionada ao grupo das AOB. Outras
sequências foram observadas, apresentando similaridades menores que 85% com a

classe Sphingobacteria, com o filo Actinobacteria e com o filo P lanctomicetos. As
sequências 16S rRNA das bactérias Anammox ou de N OB não foran1 detectadas
com a biblioteca de clones (EGLI et alii, 2003a).
A análise das amostras de biofilme pela técnica FISH com sondas filogené-
ticas conhecidas e por hibridização dot-blot com as mesmas sondas para o total de
RNA purificado das amostras de biofilme, permitiu verificar que quatro grupos
bacterianos representaram as 1naiores populações nas amostras de biofilme, sen-
do três destes envolvidos no processo de conversão do nitrogênio de acordo com
sua classificação filogenética. Entre os principais grupos de micro-organismos
constituintes do biofilme estavam AOB pertencentes aos grupos Nitrosomonas eu-
ropaea e Nitrosomonas eutropha, bactérias anammox do tipo Candidatus Kuenenia
stuttgartiensis, NOB pertencentes ao gênero Nitrospira e bactérias filamentosas
do filo Bacteroidetes. Bactérias oxidadoras de amônia, tanto aeróbias quanto
anaeróbias, estiveram presentes em quantidade de aproximadamente 20 a 30%
da biomassa, enquanto membros do filo CFB rep resentaran1 7% da mesma. De
acordo com a técnica FISH, as NOB estiveram presentes em quantidades relati-
vamente pequenas, em torno de 5% da biomassa. Não foram encontrados outros
grupos de AOB além dos mencionados, fato este que pode estar relacionado com
as altas concentrações de amônia (até 35 mM) e com as altas concentrações de sal
(10 g/L), que poderiam estar favorecendo a seleção dos grupos microbianos desta
categoria encontrados (Nitrosomonas europaea/eutropha), resistentes às condições
impostas. Vale ressaltar ainda que a presença de bactérias anammox sugere que
tanto as condições operacionais do sistema de tratamento quanto o tipo específico
de resíduo tratado propiciaram condições para a inoculação e enriquecimento es-
pontâneos dessas bactérias (EGLI et alii, 2003a) .
Além de ser investigada pela técnica FISH, a abundância relativa dos grupos
filogenéticos semelhantes foi realizada por hibridização dot-blot. Comparada com
a intensidade de sinal da h ibridização com a sonda específica para a maior parte
das bacté rias (considerada 100%), a quantidade de rRNA marcada com a sonda
específica para Nitrosomonas foi de 23%. A 1nesma quantidade relativa foi obtida
com uma sonda mais geral para AOB. A quantidade mais significativa obtida pela
hibridização dot-blot se refere às bactérias filamentosas do filo Bacteroidetes (em
to rno de 40%). Já a quantidade de NOB foi de 14%. As bacté rias anammox fo ram
detectadas en1 quantidades bastante reduzidas (em to rno de 1 %), embora a técnica
FISH tenha sugerido um número relativamente grande deste grupo no biofilme.
A metodologia FISH ainda permitiu realizar a análise da estrutura do biofilme,
mostrando claramente que os micro-organismos nitrificantes aeróbios estavam
localizados na parte superior do biofilme em uma densidade bastante elevada e
em grupos alternados, mantendo proximidade entre si. Já as bactérias anamn1ox
estiveram exclusivamente presentes em uma camada densa na parte inferior do
biofilme, na qual a difusão de oxigênio é dificultada, enquanto as bactérias fila-

mentosas do tipo CFB se espalharam por todo o biofilme (EGLI et alii, 2003a).
Egli et alii (2003b), operando reatores CSTR submetidos a diferentes con-
dições de pH, temperatura e taxa de diluição, e alimentados com meio sintéti-
co ou sobrenadante de digestor de lodo (ambos contendo 50 mM de amônio),
estudaram a nitrificação parcial de amônio a nitrito (nit ritação) sob condições
óxicas, investigando as condições necessárias para promover o estabelecimento
de uma comunidade microbiana especializada nesse processo a partir de inóculo
de lodos ativados. Em todos os sistemas biológicos atingiu-se nitritação estável
de 10 a 20 dias depois da inoculação. A análise FISH utilizando oligonucleotí-
deos fluorescentes específicos para rRNA nos diferentes reatores mostrou que as
bactérias oxidadoras de nitrito (NOB) pertencentes ao gênero Nitrospira somente
foram ativas no início da incubação dos reatores, isto é, imediatamente depois
da inoculação com lodo. Estas bactérias gradualmente perderam sua atividade e
foram arrastadas quase que completa1nente dos reatores. De acordo co1n FISH e
com a análise RFLP do gene amoA (que codifica a subunidade dos sítios ativos
da enzima amônia mono-oxigenase), a comunidade de bactérias oxidadoras de
amônia (AOB) apresentou alteração entre os primeiros 15 a 20 dias de operação
dos reatores, de un1 grupo 1nais diversificado de populações no lodo de inoculação,
representadas por membros de Nitrosomonas communis e Nitrosomonas oligotropha e
de Nitrosomonas europaea-Nitrosomonas eutropha, para um grupo menor no interior
dos reatores.
Os autores ainda verificaram que os padrões de RFLP nos reatores subme-
tidos a p H 7 ,O e 30ºC diferiram consideravehnente dos submetidos a pH 7 ,5 e
30ºC e a pH 7 ,5 e 25ºC. Os reatores operados a 30ºC e pH 7 ,5 apresentaram
predominância de um tipo de RFLP amoA do grupo N . europaea - N . eutropha.
Já os reatores cujo pH era 7 apresentaram comunidades diversificadas, ocorrendo
mudanças transitórias na população, inclusive no que se refe re à comunidade de
AOB . Os reatores mantidos em pH 7,5 e temperatura de 25 ºC desenvolve ram
comunidades que foram indistinguíveis pelas sondas de FISH aplicadas, embora
diferissem nos tipos de RFLP amoA . Além disso, sob estas condições, o aumento
das AOB foi menos pronunciado do que a 30ºC. Em contrapartida, a co1nunidade
de NOB não se estabilizou em nenhum momento, apresentando declínio e não
sendo mais quantificável depois de 10 dias (EGLI et alii, 2003b).
As comunidades microbianas dos reatores alimentados com sobrenadante de
digestor de lodo exibiram maior diversidade, e os padrões de RFLP derivados
da comunidade presentes nesses sistemas foram muito semelhantes ao DNA da
própria biomassa advinda do sobrenadante do digestor de lodo. E ste fato revelou
que esses reatores eram constantemente inoculados com a própria alimentação do
digestor de lodo, isto é, eram reinoculados com AOB advindas do próprio afluente,
permitindo a esses sistemas serem operados com maiores taxas de diluição (O, 75 d- 1)
quando comparados com os reatores alimentados con1 meio sintético (0,2 d- 1) . Os

reatores alimentados com sobrenadante de digestor apresentaram comunidades
bastante similares entre si, embora divergindo bastante daqueles al in1entados com
meio sintético. Apesar do desempenho dos diferentes reatores ter sido similar
no que tange aos parâmetros avaliados, as estruturas das comunidades foram
diferentes, o que provavelmente deve ter influenciado a estabilidade durante as
perturbações (EGLI et alii, 2003b).
Lançando mão da técnica FISH e de microscopia eletrônica, Diaz et alii
(2003) avaliaram a diversidade, em termos qualitativos e quantitativos, de micro-
-organismos presentes em lodo granular aeróbio alimentados com diferentes subs-
tratos. Os grânul os apresentaram uma estrutura com diversas camadas, nas quais
foram observadas microcolônias pouco ou densamente empacotadas. Na região
externa dos grânulos, somente foram encontradas bactérias. Em contrapartida, no
centro dos grânulos foram encontradas arqueias e bactérias. Embora a densidade
de células nos grânulos fosse elevada (superior a 1O células por grama, marcadas
com DAPI), somente u1na pequena fração das células foi hibridizada con1 as son-
das específicas utilizadas. Os autores observaram diferenças significativas na com-
posição microbiana dos grânulos alimentados com diferentes substratos (formato,
acetato em altas e baixas concentrações, propionato, sacarose, amido e peptona).
Proteobactérias ativas estiveram em pequeno número nos grânulos submetidos a
ácidos graxos voláteis. Bactérias do gênero Syntrophobacter do1ninaram quando os
grânulos foram alimentados com propionato. No que se refere às arqueias metano-
gênicas, espécies do gênero Methanosaeta foram predominantes quando utilizados
substratos complexos ou acetato em baixas concentrações. Quando a al imentação
consistiu de acetato em altas concentrações ou de formato, bactérias do gênero
Methanosarcina e n1embros da ordem dos Methanobacteriales foram dominantes,
respectivamente.
Kim et alii (2004) utilizaram a técnica FISH para analisar comunidades
microbianas nitrificantes em um reator de lodo ativado (RLA) e em um reator de
leito fixo (RLF) para o tratamento de água residuária gerada en1 criatório de suí-
nos. Oxidação heterotrófica e nitrificação estavam ocorrendo simultaneamente ao
RLA, sendo as eficiências de remoção de DQO e de nitrificação dependentes das
cargas aplicadas. No RLF, a eficiência de nitrificação esteve relacionada também
à carga de an1ônio aplicada ao reator, sendo que se acumulou nitrito quando a
concentração de amônia livre foi maior que 0,2 mgN-NO3/L. Por meio de FISH,
constatou-se que as bactérias oxidadoras de amônia (sonda NSOl 225) e as bacté-
rias desnitrificantes (sonda RRP 1088) eram menos abundantes que outras bacté-
rias (sonda EUB33 8) no RLA. Análises subsequentes na comunidade de bactérias
nitrificantes no RLF mostraram que espécies de Nitrosomonas (sonda NSMl 56) e
de Nitrospira (NSRl 156) era1n, respectivamente, as bactérias oxidadoras de amô-
nia e nitrito dominantes no sistema de tratamento desse sistema de suinocultura.
Limpiyakorn et alii (2005) investigaram as bactérias oxidadoras de amônia

(AOB) em lodos ativados provenientes de 12 sistemas de tratamento de esgotos,
os quais eram alimentados com baixas concentrações de N-NH; . Esses sistemas
ap resentavam diferentes eficiências de remoção de amônia e eram operados segun-
do diferentes processos de tratamento: p rocesso anaeróbio/anóxico/aeróbio (A2 O),
processo anaeróbio/aeróbio (AO) e processo de lodos ativados convencional (LA).
As amostras foram coletadas durante três diferentes est ações (verão, outono e
inverno). Nesse trabalho, utilizou-se a técnica quantitativa PCR em tempo real
(Real time PCR) para revelar o número total de bactérias e de AOB, fazendo uso
também de amplificação de PCR específica seguida de DGGE, clonagem e sequen-
ciamento de genes 16S rRNApara identificar as comunidades de AOB. O número
total de bactérias e de AOB ficou na faixa de 1,6 x 1O12 - 2 ,4 x 10 13 e 1,0 x 10 9 -
9,2 x 10'º células/1, respectivamente, tendo esse nún1ero variado de acordo con1 a
estação do ano. A maior população de AOB ocorreu no inverno, seguida do outono
e do verão. Entretanto, foi na estação referente ao outono que a proporção de AOB
no total de bactérias aumentou, fato esse possivelmente causado pelo decréscimo
da relação DBO/N-NH; no afluente durante este período. A atividade de oxida-
ção de an1ônia por célula de AOB variou de O a 49,6 fmol/(célula · h), valor este
dependente da estação do ano. Os maiores valores para esse parâmetro ocorreram
durante o verão, seguidos daqueles obtidos durante o outono e o inverno.
Embora tenham sido observadas variações periódicas no número de AOB, o
mesmo não ocorreu para a composição das comunidades de AOB, as quais apre-
sentaram um comportamento bastante estável, mesmo com a temperatura va-
riando ao longo das estações. A maioria das bandas excisadas do gel de DGGE e
sequenciadas apresentou relação com o grupo Nitrosomonas spp. O maior número
destas bandas analisadas foi relativo ao grupo Nitrosomonas oligotropha, o qual foi
encontrado em todas as amostras. Representantes dos grupos Nitrosomonas euro-
paea-Nitrosococcus mobilis (frequentemente considerados micro-organismos halofí-
licos capazes de suportar altas concentrações salinas), e espécies desconhecidas de
Nitrosomonas apareceram somente no sistema anaeróbio/anóxico/aeróbio (A2O).
Membros do grupo Nitrosomonas cryotolerans estiveram praticamente presentes
somente neste últ imo sistema, embo ra este grupo tenha aparecido em outros sis-
temas durante algumas estações. Integrantes do g1upo Nitrosomonas communis
estiveram presentes quase que exclusivamente em associação com sistemas A2O e
sistemas anaeróbios/aeróbios, sem marcar presença nos sistemas LA. Observou-se
que o tempo de retenção celula r influenciou o núme ro total de AOB, enquanto a
concentração de oxigênio dissolvido afetou a atividade de oxidação de amônia por
célula de AOB. Não foi possível efetuar uma relação entre os diferentes sistemas
de lodos ativados e a presença do grupo Nitrosospira, o qual foi somente recupera-
do de uma única amostra (LIMPIYAKORN et alii, 2005).
Por meio da técnica T-RFLP, Hoshino et alii (2005) monitoraram a dinâmi-

ca microbiana no início do processo de desnitrificação de um reator de lodos ati-
vados com ae ração intermitente. Os fragmentos de restrição te rminais (T-RF) que
aumentaram devido ao início da desnitrificação foram determinados e identifica-
dos por meio de análise das sequências de 16S rRNA obtidas por clonagem. Foi
observado que as bactérias pe rtencentes ao gênero Hydrogenophaga e Acidovorax
estiveram em maior número após a desnitrificação ter sido iniciada.
Cortés-Lorenzo et alii (2006) avaliaram a diversidade microbiana, por meio
de PCR/TGGE, de um filtro submerso de escala laboratorial utilizado para re-
moção de amônia e fenol de uma água residuária com alta concentração salina
(30 g!L), proveniente de uma indústria farmacêutica. A concentração de amônia
afluente era de 340 mg/L e de fenol equivalente a 1 000 mg!L. O sistema com-
binava os processos de nitrificação e desnitrificação e consistiu em duas colunas
separadas (un1a anóxica e outra aeróbia), conectadas entre si, sendo operado no
modo de pré-desnitrificação.
A diversidade espacial das comunidades microbianas no biofilme foi anali-
sada coletando-se amostras em quatro diferentes alturas no sistema. Os perfis
de TGGE das sequências do gene 16S rRNA (região hipe rvariável V3) ampli-
ficadas por PCR mostraram significativas variações na diversidade n1icrobiana,
principalmente devido à variação da concentração de 0 2 ao longo do sistema.
Diversas bandas obtidas de TGGE foram reamplificadas e sequenciadas, de modo
a explorar a composição das comunidades microbianas p resentes no biofilme. A
maioria das bandas sequenciadas (10 de 13) foi relacionada ao gene 16S rRNA
de a -Proteobacteria n1arina, principalmente agrupada no gênero Roseobacter. O
restante das sequências que foram relacionadas à a-Proteobacteria foram agru-
padas na ordem dos Rhizobiales. Organismos filogeneticamente relacionados ao
grupo R oseobacter se encontram em diversos lugares e são importantes coloniza-
dores primários de superfícies em ambientes costeiros, sendo precu rsores da for-
mação de biofilmes (GONZÁLEZ e MORAN, 1997 apud CORTÉS-LORENZO
et alii, 2006). Outras sequências foram relacionadas à y-Proteobacteria, à
Nitrospira marina (oxidadora de nitrito presente somente na parte aeróbia do sis-
tema) e às bactérias anaeróbias responsáveis pela degradação de fenol da família
Desulfobacteraceae (CORTÉS-LORENZO et alii, 2006).
Otawa et alii (2006) investigaram comunidades bacterianas, de forma ge-
ral, como também comunidades específicas de bactérias oxidadoras de amônia
(AOB) em um reator batelada sequencial (RBS 1) com aeração intermitente e em
12 plantas de tratamento de água residuária de dejetos animais (oito RBS e qua-
t ro sisten1as de lodos ativados convencional). No intuito de investigar variações
sazonais nas comunidades microbianas, lançou-se mão de técnicas como RT-PCR
seguida de DGGE e da construção de bibliotecas de clone para os genes 16S
rRNA e amônia mono-oxigenase (amoA) . No RBSl' as bactérias dominantes foram
representadas pelas até então não cultivadas Bacteroidetes e Proteobacteria, sendo

as percentagens das bandas relacionadas a estes dois grupos em relação ao total de
bandas sequenciadas correspondendo a 4 7 ,4 e 34,2%, respectivamente. Os perfis
de DGGE mostraram que as comunidades bacterianas foram estáveis durante
um dado ciclo do tratamento, embora tenham variado sazonalmente . Em relação
às comunidades de AOB, dois filotipos (Nitrosomonas ureae - oligotropha-marina)
foram dominantes no RBS, durante as estações. E1nbora os filotipos de AOB
apresentassem diferença entre as 13 plantas de tratamento, foi observada a domi-
nância de um ou dois grupos em todas as plantas.
O sequenciamento das bandas de DGGE indicou que as sequências amoA
pertencentes ao grupo Nitrosomonas europaea-eutropha foram don1inantes em 11
plantas, justamente nas quais a concentração de nitrogênio amoniacal na água
residuária bruta era alta. Já nas plantas onde esta concentração era relativamente
baixa, ocorreu a predon1inância dos grupos Nitrosomonas urea-oligotropha-marina.
Os autores ainda observaram que, apesar da eficiência de ren1oção se manter es-
tável durante o período em estudo, a comunidade bacteriana apresentou variação
durante o ano, evidenciando que a estabilização da eficiência de tratamento não
se traduz necessariamente na estabilização de sua comunidade bacteriana. O que
ocorre é que mesmo variações nas características do afluente do processo e da
ten1peratura do reator poden1 ocasionar mudanças na estrutura da con1unidade
bacteriana (OTAWA et alii, 2006) .
Feng et alii (2007) investigaram a biodiversidade das comunidades micro-
bianas dominantes durante a partida de um reator batelada sequencial com lodo
granular, no qual se verificou a remoção parcial de nitrogênio pelo p rocesso de
nitrificação/desnitrificação simultâneas (SND) . Este processo, por sinal, é favore-
cido pela distribuição irregular de oxigênio dissolvido e pelo microambiente anó-
xico, sendo o acúmulo de nitrito comum nesses sistemas (YOO et alii, 1999). O
processo de partida do reato r foi dividido em três etapas: a primeira (1 o. ao 150. dia)
foi caracterizada por baixas taxas de remoção de nutrientes e grandes flutuações;
na segunda (16Q ao 35Q dia) ocorreu um aumento da concentração de N-NH1 com
consequente acúmulo de nitrito; e na terceira etapa (36n ao 6Q!l dia), o acúmulo
de nitrito permaneceu constante e a taxa de remoção de poluentes atingiu índices
estáveis.
Lançou-se mão do método DGGE para fornecer um fingerprint das comu-
nidades de a-Proteobacteria, ~-Proteobacteria, bactérias oxidadoras de amônia
(AOB) e Nitrospira durante o start-up do processo. Os resultados obtidos por essa
técnica mostraram que os perfis apresentados pela con1unidade microbiana sofre-
ram modificações durante o acúmulo de nitrito. Foram observadas modificações
substanciais du rante o período inicial, especialmente do 25º ao 35n dia, embora
a estrutura da co1nunidade n1icrobiana tenha se tornado estável após o 45.Q dia de
operação. A análise da biodiversidade baseada nos padrões de DGGE foi realizada
calculando-se o índice Shannon (H) . O valor de H obtido com as amostras dos

dias 25 e 35 apresentou maior valor para ~-P roteobacte ria em comparação com
a subdivisão-a, embo ra esta última tenha apresentado maiores valores nas duas
últimas amostras (45il e 5 52 dia), e consequentemente maior biodiversidade quan-
do atingida a estabilidade do processo SND. Durante o período experimental,
ocorreu um decréscimo no índice H tanto para ~-Proteobacteria quanto para
Nitrospira. E m contrapartida, esse índice permaneceu praticamente estável para
a-Proteobacteria e para bactérias oxidadoras de amônia, o que permite inferir
que algumas espécies de ~-Proteobacte ria são mais sensíveis à amônia livre (FA)
do que a-Proteobacteria. Na verdade, a inibição po r amônia livre pode resultar
na eliminação de algumas espécies de ~-Proteobacteria e 1'litrospira (F ENG et
alii, 2007).
Já a PCR em tempo real, determinando as cópias de 16S rDNA, permitiu
quantificar os diferentes mic ro-organismos presentes no sistema. Observou-se,
do dia 25 ao 35, uma mudança aparente no tamanho das populações de a e
~-Proteobacteria, as quais apresentaran1 um crescimento de 6, 7xl0 11 célula/L
para 1,0xl 0 12 célula/L no primeiro dia do processo SND, crescimento esse muito
similar ao apresentado pela população de AOB . Em contrapartida, a população
de Nitrospira decresceu no início do processo de SND e co1n o acúmulo de nit rito.
Os tamanhos das populações de AOB e Nitrospira foran1 de 8,7x l 0 9 - 2,4x10 1º
célula/L e 1, 7xl O10 - 2, 1xl 0 1º célula/L, respectivamente. Já a proporção de AOB
e Nitrospira no total de bactérias no estágio estável foi de 2,1 -2,4% a 0,8-1,2%,
respectivamente. Os mesmos autores ainda verificaram, por meio do coeficiente
de correlação de Pearson, a relação entre a atividade nitrificante, biodiversidade
e o tamanho da população de AOB e Nitrospira. Observou-se que o tamanho da
população representa um fator mais importante do que a biodiversidade no que se
refere à capacidade de degradação (FENG et alii, 2007) .
Liu et al,ii (2007) investigaran1 a estrutura da comunidade bacteriana de
duas plantas de tratamento de esgoto con1 dife rentes processos e desempenhos,
por meio de DGGE dos fragmentos do gene 16S rRNA amplificados por meio de
nested PCR utilizando primers grupo-específicos. Uma das plantas (planta A) ado-
tou um processo anóxico-anaeróbio-aeróbio (A2O) e outra planta (planta B) utili-
zou um processo anóxico/aeróbio (AO) . As duas plantas apresentaram diferentes
características do lodo, particularmente no que se refere à formação de espun1a e
sedimentabilidade, alén1 de diferentes eficiências de remoção de poluentes.
Amostras do esgoto b ruto e do efluente tratado fo ram amplificadas utilizando
o método PCR para toda a célula, e as amostras do lodo ativado fo ram ampli-
ficadas utilizando-se o DNA genômico extraído antes que os p rodutos de PCR
fossem analisados no mesmo gel de DGGE para análise da con1unidade bacteria-
na. Análise da comunidade de bactérias oxidadoras de amônia e actinomicetos
também foi realizada no intuito de investigar a relação entre as estruturas de
populações específicas e o desempenho do sistema. As amostras de esgoto bruto de

ambas as plantas ficaram localizadas em um cluster no dendograma devido à sua
similaridade (coeficiente de D ice equivalente a 73%), fato que pode ser atribuído
aos constituintes do esgoto serem similares. Por sua vez, essa semelhança na cons-
t ituição do esgoto afluente das plantas pode ter levado à similaridade observada
nas amostras de lodo ativado das duas plantas (coeficiente de Dice igual a 60%).
Os coeficientes de Dice obtidos quando se compara a similaridade das amos-
tras de esgoto bruto e do lodo ativado em ambas as plantas foram muito baixos,
27 e 29%, respectivamente. O fato é que muitas populações de bactérias do esgoto
bruto não apareceram nas amostras do lodo ativado, sugerindo que as populações
bacterianas dominantes no esgoto bruto provavelmente não apresentam impor-
tante papel no tratamento biológico . A maior parte das populações n1icrobianas
presentes no esgoto bruto é advinda de dejetos sanitários ou do solo. As bactérias
provenientes de dejetos sanitários são micro-organismos intestinais os quais re-
sultam da excreção humana ou animal, as quais dificilmente conseguem sobrevi-
ver em a1nbientes impróprios, con10 estações de tratainento (MARSHALL, 1 980
apud LIU et alii, 2007).
Conforme já descrito, as duas plantas apresentaram similaridade nas estru-
turas da comunidade microbiana referente ao esgoto bruto e lodo ativado, embora
as populações microbianas nos seus respectivos efluentes fossem diferentes (coefi-
ciente de Dice de 25%). A diferença na sedimentabilidade entre os dois sisten1as
pode ter sido a principal razão para a diferença na estrutura da comunidade de
bactérias. O IVL da planta B foi de 197 L/g, valor maior em comparação com o
da planta A, que foi de 71 L/g. A relativa má sedimentabilidade do lodo ativado
da planta B quando comparada com a da planta A, possivelmente levou à lavagem
(washout) de bactérias sem seleção de um ou outro grupo específico, motivo pelo
qual a similaridade das populações entre o efluente e o lodo ativado foi alta (coe-
ficiente de Dice equivalente a 79%). Por outro lado, somente algumas espécies de
bactérias fo ram seletivamente lavadas da planta A, o que resultou en1 baixa sin1i-
laridade na estrutura da comunidade bacteriana apresentada pelo efl uente e pelo
lodo ativado (coeficiente de Dice igual a 26%) (LIU et alii, 2007) .
Embora as duas plantas apresentassem diferentes propriedades do lodo em
termos de sedimentabilidade e formação de espuma, ambas continham comunida-
des de actinomicetos (relacionados aos altos IVL devido aos filamentos) semelhan-
tes, o que é um fato interessante, tendo em vista que a planta A não apresentou
o fenômeno do bulking (intumescimento do lodo). O coeficiente de Dice para as
comunidades de actinomicetos das duas plantas foi de 88,3%, sugerindo que as
populações dessa linhagem microbiana na planta B podem não ter relação com o
bulking do lodo (LIU et alii, 2007).
Os mesmos autores ainda realizaram estudo comparativo entre a estrutura
das comunidades de AOB nas duas plantas. A planta A apresentou mais bandas
em DGGE em comparação com a planta B. Além disso, os dois sistemas apresen-

taram diferentes estruturas das comunidades dessas bactérias. A maior remoção
de amônio obtida na planta A pode se r atribuída à sua 1naior riqueza em espécies
de AOB. As principais bandas do gel de DGGE relativo às AOB foram excisadas
e sequenciadas. Análise das sequências dos genes 16S rRNA revelaram que to-
das as bandas fo ram relacionadas ao gênero Nitrosomonas spp. Análises obtidas
por meio de sequencian1ento mostraram que as p rincipais popul ações presentes
no esgoto bruto eram bactérias não cultivadas, enquanto no lodo ativado as po-
pulações predominantes pertenciam à subclasse B-Proteobacteria. Tendo em vista
sua dominância numérica, ficou evidente que os representantes dessa subclasse
apresentam importância significativa no processo de lodos ativados (remoção de
matéria orgânica, nutrientes e formação da estrutura do floco) (LIU et alii, 2007).
Considerando-se que as velocidades específicas de crescimento e a atividade
das bacté rias oxidadoras de amônia (AOB) são bastante reduzidas a baixas tem-
peraturas, Isaka et alii (2007) desenvolveram uma tecnologia de imobilização de
bactérias nitrificantes em suporte sob a forma de gel de polietilenoglicol (PEG)
capaz de atingir altas taxas de nitrificação (0, 71 kgN/(m 3 • d)) para t ratamento
de lixiviado n1es1no em baixas tempe raturas (1 0ºC). Os suportes de PEG fo ram
adicionados a um reator air-lift de 1,2 L, cuja fração de enchin1ento (razão entre
o volume de recheio e o volume total do reator) foi de 15% (180 mL) . Segundo
os autores, a imobilização das AOB se ria um fato r-chave no desenvolvimento do
processo nitrificante nas condições de temperaturas reduzidas. A concentração de
N-NH; do efluente variou de 16 a 35 mg!L independente da carga de nitrogê-
nio, sendo observado acúmulo de nitrito. No caso específico desse trabalho, este
acúmulo não esteve relacionado com o baixo nível de oxigênio dissolvido, que foi
maior que 7 mg!L, mas pode estar vinculado à perda da atividade das bactérias
oxidadoras de nitrito (NOB) devido a outros fatores, como inibição por amônia
livre (ANTHONISEN et alii, 1976). Por meio da técnica DGGE, quatro bandas
representativas de bactérias oxidadoras de amônia foram confirmadas. A árvore fi-
logenética baseada nas sequências do gene 16S rRNA incluindo as sequências das
bandas de DGGE permitiu observar que t rês dessas bandas eram similares às de
Nitrosomonas e uma banda era similar à de Nitrosospira sp. (95% de similaridade).
Para identificar a presença dessas AOB, foi utilizada a técnica FISH baseada nos
resultados prévios de DGGE obtidos, empregando-se sondas oligonucleotídicas
para detecção de Nitrosomonas sp. e Nitrosospira sp. Como resultado, confirmou-se a
presença de ambos os grupos de AOB, embora Nitrosomonas sp. tenha sido o grupo
dominante, informação essa obtida por contagem direta de células.
Montràs et alii (2008) estudaram o biofilme aderido em supo rtes esféricos de
poliestireno expandido (Biostyr®) de un1 reator de leito empacotado contendo duas
espécies autotróficas (Nitrosomonas europaea e Nitrobacter winogradskyi) , depois de
4,8 anos de operação contínua visando à nitrificação completa. Comprovou-se

que essas duas espécies eram as únicas representantes das bactérias oxidado ras
de amônia (AOB) e das bactérias oxidado ras de nitrito (NOB), respectivamen-
te, presentes no reator, o qual tinha sido inoculado inicialmente com essas duas
linhagens microbianas. Por meio da PCR quantitativa em tempo real (Q-PCR),
utilizada para quantificação das duas espécies mencionadas ao longo do eixo ver-
t ical do reator (dividido em oito frações - F 0 a F 7 , de baixo para cima), os autores
observaram uma segregação espacial dessas n1esmas linhagens microbianas. Os
resultados da Q-PCR mostraram grande similaridade na posição F O (89, 7 + 7 ,8%
N . europaea) e F 1 (91,3 + 7,1% N . europaea). De forma semelhante, as quanti-
dades relativas de N . europaea nas amostras de F 2 (57,3 + 8,3% N. europaea) e
F 3 (58, 7 + 5,3% N . europaea) também apresentaram valores muito semelhantes.
Observou-se também um aumento gradual de N . winogradskyi com o aumento da
altura do leito, conforme demonstrado pelas quantidades relativas obtidas nas
posições F 4 (61,0 + 2,6% N . winogradskyi), F 5 (70,1 + 1,3% N. winogradskyi)
e F 6 (70,0 ± 1,0% N . winogradskyi). Na última fração do leito empacotado (F 7),
observou-se um aumento da relação N . europaea/N. winogradskyi , sendo a quanti-
dade relativa dessa última espécie reduzida para 53,9 + 1,9% nessa posição es-
pecífica do reator. E sses resultados permitiram detectar um perfil de distribuição
espacial de AOB e NOB, perfil esse já obtido em outros biorreatores nitrificantes
com escoamento unidirecional, a exemplo dos filtros de percolação nitrificantes
ou biorreatores nitrificantes de fluxo-pistão (plug-flow) (HOLBEN et alii, 1998
apud MONTRÀS et alii, 2008).
A avaliação dos p rincipais parâmetros que influenciaram a segregação das
espécies nitrificantes, isto é, a diferente abundância relativa dessas bactérias ao
longo do leito, foi realizada por meio de um modelo de biofilme unidimensio-
nal multiespécies, que por sua vez esteve de acordo com os dados experimentais.
Verificou-se que o fator que mais influenciou na abundância relativa das espécies
bacterianas envolvidas (Nitrosomonas europaea e Nitrobacter winogradskyi), isto é,
no seu perfil de distribuição ao longo do leito fixo, foi a presença de um escoamen-
to que apresentava pequeno desvio em relação ao padrão de fluxo de um tanque de
mistura perfeita com regime plug-jlow (MONTRÀS et alii, 2008).
Mertoglu et alii (2008) monitoraram as mudanças ocorridas na população de
bactérias nitrificantes submetida a uma carga de cádmio em um sistema de nitrifi-
cação de fluxo contínuo, alimentado com efluente sintético. Para tanto, os autores
utilizaram algumas ferramentas microbiológicas moleculares, como hibridização
slot-blot (detecção de bactérias oxidadoras de nitrito), DGGE e PCR em tempo real
seguida da análise das curvas de fusão (detecção de bactérias oxidadoras de amô-
nia), clonagem e sequenciamento (identificação de espécies microbianas) .
Enquanto alimentado com dosagens equivalentes a 1 mgCd/L, nenhum de-
créscimo foi observado nas taxas de remoção de runônia. Nem mesmo o aumento
CAPÍTULO 6 ◊ TÉCNICAS DE BIOLOGIAMOLECULARAPLICADAS AO ESTUDO DA DIVERSIDADEMICROBIANA... 33 7
degrau para 1O mgCcl/L causou inibição ao consórcio microbiano. Entretanto,

após 15 dias de operação com esta concentração, verificou-se u1n decréscimo na
eficiência de remoção de amônia de 99 para 10% e uma redução na concentração
de biomassa. D iante dos resultados obtidos, a adição de cádmio foi interrompida
para permitir a recuperação da atividade microbiana. N essas condições, o efeito
inibitó rio foi cessado. Na segunda aplicação da mesma concentração de cádmio
(10 m&'L), observou-se uma adaptação da biomassa a esse 1netal, e a inibição
atingiu 60%. Na próxima etapa, quando a concentração de cádmio foi aumentada
para 15 m&'L, a eficiência de remoção de amônia foi de 50% (MERTOGLU et
alii, 2008) .
Observou-se uma mudança da diversidade das bactérias oxidadoras de amô-
nia após a prin1eira aplicação de 1O mg/L de Cd, sendo que as espécies resistentes
ao metal tornaram-se dominantes, ocorrendo a substituição de Nitrosomonas e
Nitrosococcus sp. para Nitrospira sp. Esta última linhagem, por sinal, mostrou-se
resistente a altas cargas de cádmio, tornando-se gradualmente predominante no
sistema. Os resultados obtidos indicaram que o nível de inibição da nit rificação
não esteve somente relacionado com a concentração de metal e com a quantidade
de micro-organismos, mas também dependeu do tipo específico das espécies pre-
sentes no sistema (MERTOGLU et alii, 2008).
Dytczak. et alii (2008) verificaram que um reator batelada sequencial nitrifi-
cante (RBS) de escala laboratorial, operado sob condições anóxicas/aeróbias alter-
nadas, atingiu taxas de nitrificação duas vezes maior do que outro reator (RBS2),
de mesmas dimensões e condições operacionais, embora estritamente aeróbio. As
populações microbianas em ambos os reatores foran1 exan1inadas por meio da
técnica FISH, a qual revelou a predominância de micro-organismos nitrificantes
rápidos, con10 Nitrosomonas e Nitrobacter (79 ,5% da população nitrificante) no
reator anóxico/aeróbio, enquanto no reator estritamente aeróbio predominaram
nitrificantes lentos, como Nitrosospira e Nitrospira (78,2% do total de nitrifi-
cantes) . A proporção total de bactérias oxidadoras de amônio (AOB) no total de
células identificadas por DAPI foi maior no RBS 1 (25,9%) quando comparado
com o RBS 2 (19,9%), embora a diferença mais significativa tenha sido observada
quando se efetuou a comparação entre as populações de bactérias oxidadoras de
a1nônia (AOB) presentes en1 cada um dos reatores, notada1nente no que se refere
a Nitrosomonas . No RBSI' estes micro-organismos chegaram a atingir percentual
de 8 1 % do total de AOB, enquanto no RBS 2 este percentual foi de apenas 19%.
Comportamento semelhante ocorreu para a população de NOB em relação ao total
de bactérias, que ap resentou proporção maior no RBSl' embo ra a maior discre-
pância fosse relacionada à população de Nitrobacter em relação ao total de NOB
nos dois reatores, que foi de 76% no RBS 1 e 27% no RBS2 • Em suma, tanto as
AOB quanto as NOB foram mais abundantes no RBSI' o qual também exibiu
uma maior razão AOB/NOB.
O RBS 2 (estritamente aeróbio) operou em taxa máxima e foi afetado negativa-
mente pelo amônio ou nitrito, enquanto as ta,'<:as de nitrificação obtidas no reator
submetido a condições alter nadas (anóxicas/aeróbias) foram proporcionais às con-
centrações de amônio ou nitrito. Obse rvou-se que as condições alternadas fo ram
mais favoráveis, uma vez que foram capazes de selecionar os micro-organisn1os
nitrificantes mais rápidos, caracterizados por taxas de oxidação, crescimento e
decaimento mais elevadas. Esses resultados são bastante úteis na operação de rea-
tores biológicos voltados à nitrificação, os quais na maioria das vezes são projeta-
dos con1 base na taxa de crescimento de n itrificantes determinadas sob condições
estritamente aeróbias (DYTCZAK et alii, 2008) .
Munz et alii (2008) compararam um biorreator com membrana (MBR) em
escala piloto com um sistema de lodo ativado convencional (LA), ambos tratando
águas residuárias da indústria de couro e com as mesmas condições operacionais,
no intuito de avaliar a eficiência global de tratan1ento, a presença e a distribui-
ção de bactérias gram-negativas e a cinética das bactérias nitrificantes. O MBR,
em con1paração com o LA, apresentou percentual de remoção de DQO maior, e o
processo de nitrificação foi mais estável e completo no primeiro reator, resultados
estes que podem estar relacionados a diferenças na composição e na distribuição
da comunidade microbiana.
As bactérias gram-negativas foram detectadas utilizando a técnica FISH,
empregando sondas filogenéticas específicas para a-, ~- e y-Proteobacteria das
principais bactérias oxidadoras de amônia (AOB) e oxidadoras de nitrito (NOB)
pertencentes ao gênero Nitrobacter e Nitrospira. Os resultados mostraran1 que as
principais diferenças na composição da biomassa entre as duas tecnologias de
reatores foram a grande abundância de a - e ~-Proteobacteria no MBR e a p resen-
ça de agregados de AOB somente na superfície dos flocos presentes neste reator.
Vale ressaltar que ocorreu a predon1inância de a-Proteobacteria nas amostras p ro-
venientes das duas configurações de reatores, e não de ~-Proteobacteria como é
relatado com muita frequência na literatura. Este fato pode estar relacionado com
a água residuária específica alimentada ao sisten1a, proveniente da indústria de
couro. As diferenças observadas na distribuição quantitativa das t rês subdivisões
de Proteobacteria (a, ~ e y) entre as amostras do MBR e do LA sugeriram que
o modo de separação da biomassa, seja ela realizada pelo processo de filtração
(MBR) ou sedimentação (LA), afetou a seleção da biomassa (MUNZ et alii, 2008).
\i\Ten et alii (2 008), operando um reator de lei to fl uidizado (RLF) sem se-
paração entre as zonas aeróbia e anóxica, observaram o processo de nitrificação-
-desnitrificação simultâneas (SND) por meio do controle da concentração de
oxigênio dissolvido. Nesse estudo, foram investigadas a eficiência e a composição
das bactérias nitrificantes. A carga nitrogenada volumétrica variou entre O, 12
e O, 20 kgN/(m3 ·d). A eficiência de remoção de amônia foi maior que 80% e a

concentração de OD, mantida dentro da faixa de 1 a 5 mg/L, não apresentou
influência nesse parâ1netro. Quando a concentração de oxigênio dissolvido foi
inferior a 3 mg/L, a eficiência de remoção de nitrogênio foi maior que 50%.
Por meio da técnica T-RFLP baseada em fragmentos de 16S rRNA, foi possível
caracterizar a diversidade e a distribuição de bactérias oxidadoras de amônia
(AOB) e de nitrito (NOB) no RLF. Os resultados indicaram que a composição e
a quantidade de AOB e de NOB variaram de acordo com a posição no interior
do reator e com o tempo de operação. As espécies dominantes da comunidade de
AOB foram representadas por Nitrosomonas sp. Foi detectado também Nitrobacter
sp. no sistema. Segundo os autores, o mecanismo de SND no RLF foi resultado
da estratificação vertical das populações ativas. No entanto, a possível presença
de microambientes dentro do biofilme não foi descartada (\iVEN et alii, 2008) .
Moura et alii (2007), lançando mão da técnica DGGE, estimaram a diver-
sidade de bactérias e monitoraram as mudanças da comunidade microbiana em
duas lagoas aeradas (lagoa 1 e lagoa 2) de uma planta de tratamento de águas resi-
duárias urbanas e industriais. Foram detectadas mudanças significativas quando
foram comparadas as amostras coletadas nos meses de inverno/primavera e de
outono/verão. Em outras palavras, a variação da co1nunidade microbiana ocorreu
sazonaln1ente. Como descrito anteriormente, Otawa et alii (2006) também veri-
ficaram um padrão de variação sazonal da comunidade bacteriana presente em
reator operado em bateladas sequenciais com aeração intermitente.
As variáveis que causaram maior impacto nas comunidades bacterianas fo-
ram temperatura, oxigênio dissolvido e pH. Os autores realizaran1 uma análise
numérica dos padrões de DGGE por n1eio de dois indicadores, cada um descre-
vendo um aspecto diferente da diversidade da comunidade de micro-organismos.
Os índices de diversidade foram obtidos levando em consideração a intensidade
relativa de cada banda do gel de DGGE. A reprodutibilidade dos resultados foi
obtida por meio de réplicas de géis (MOURA et alii, 2007).
O índice de Shannon (H), utilizado para calcular a diversidade de comuni-
dades microbianas, variou de 0,717 a 1,042 e de 0,784-1,121 nas lagoas 1 e 2,
respectivamente. Os maiores valores de H foram registrados nos meses de Agosto
e Março, indicando maior número de espécies e maior abundância relativa nesses
meses. Outro indicado avaliado foi o índice de equitatividade (E), o qual pode
variar de valores próximos a O (o que indica dominância pronunciada de alguns
grupos microbianos) a próximo de 1 (o que indica completa igualdade de abun-
dância de todas as espécies). A análise dos padrões de DGGE forneceu valores de
índice de equitabilidade dentro da faixa de 0,756-0,886 e 0,796-0,968 para as
lagoas 1 e 2, respectivamente. Esses valores permitiram inferir uma distribuição
consideravelmente uniforme de táxons entre as amostras em termos de abundân-
cia em ambas as lagoas (MOURA et alii, 2007).
A afiliação filogenética dos grupos predominantes foi realizada por meio do

sequenciamento dos fragmentos de 16S rDNA excisados do gel de DGGE. Os
resultados da análise filogenética pern1itiram agrupar os micro-organismos aos
grupos Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides (CFB), Firmicutes e ~- e i::-proteobacteria
(MOURA et alii, 2007).
Recentemente, foi descoberto que a oxidação autotrófica de amônia não é res-
trita apenas ao domínio Bacteria (KONNEKE et alii, 2005, TREUSCH et alii,
2005) . A arqueia oxidadora de amônia (AOA) denominada Nitrosopumilus mari-
timus foi isolada de um aquário marino (KONNEKE et alii, 2005) e consiste no
prin1eiro representante das AOA. E sses micro-organismos, tal como as bactérias
oxidadoras de amônia (AOB), crescem em condições quimiolitotróficas oxidando
amônia a nitrito. Características como alta diversidade, alta taxa de nitrificação
e baixo requerimento de oxigênio dissolvido podem tornar as AOA importantes
agentes nos processos de nitrificação parcial.
Nesse contexto, Zhang et alii (2009) procu raram caracterizar a comunidade
de AOA tanto en1 u1n biorreator de lodos ativados destinado à ren1oção de nitrogê-
nio quanto em plantas de tratamento de águas residuárias, utilizando para tanto
um par de primers específicos para a subunidade a da amônia mono-oxigenase
(an10A) de arqueias. E sse estudo confirmou a ocorrência de AOA nos sisten1as
avaliados. No total, 18 sequências do gene funcional amoA foram recuperadas e
comparadas con1 as sequências reportadas previamente. A co1nparação entre as
bibliotecas de clones obtidas com as amostras de uma das estações e do biorreator
de escala laboratorial indicou que a comunidade de AOA variou significativamen-
te somente após 30 dias de enriquecimento. Os auto res ainda verificaram que a
comunidade de AOA das estações de tratamento estudadas foi semelhante àquelas
encontradas e111 sedimentos e solos, mas distinta daquelas p resentes em sistemas
de lodos ativados de outros lugares. Por fim, ainda mencionam que para a detec-
ção das diversas comunidades de AOA presentes em amostras ambientais, faz-se
necessário o uso de uma combinação de diferentes primers específicos para o gene
amoA (ZHANG et alii, 2009).
Bassin et alii (2011) estudaram o efeito da salinidade na atividade de bac-
térias nitrificantes, nas características do floco e na estrutura da con1unidade
microbiana por meio de FISH e DGGE. Dois reatores batelada sequencial (RBS,
e RBS 2) fo ram sub111etidos ao aumento da concentração salina. No RBSl' quatro
concentrações foram testadas (5, 1 O, 15 e 20 g NaCl/L), enquanto no RBS 2 ,
apenas duas concentrações (10 e 20 g NaCl/1) foram aplicadas. As duas formas
distintas de adaptação gradual a elevadas concentrações de sal ocasionaram dife-
rentes mudanças na estrutura da comunidade de micro-organismos, embora não
tenham influenciado no desempenho do processo, notadamente no que se refere à
nitrificação. Os resultados obtidos por esses autores suge riram que, independente
da composição de bactérias nitrificantes presente no reator, o processo nitrificante

se manteve estável na faixa de salinidade testada. Bassin et alii (2011) ainda ob-
servaram que as taxas de oxidação de amônio apresentaran1 maior queda no reator
na qual o aumento da concentração salina foi realizado de forma mais brusca
(RBS2) . O aun1ento gradual da concentração de NaCl apresentou efeito positivo
nas propriedades de sedimentação do lodo (redução do IVL), embora tenha cau-
sado o aumento da concentração de sólidos no efluente. Protozoários, nen1atoides
e rotíferos, como também organismos filan1entosos, não foram capazes de tolerar
altas concentrações salinas (BASSIN et alii, 2011).

Levando-se em consideração todos os itens abordados nesse capítulo, pode-se
observar a grande quantidade de informações obtidas pelas técnicas que primam
por uma abordagem molecular das amostras biológicas. Essas técnicas, funda-
mentadas na biologia molecular, permitem o estudo da diversidade de comunida-
des microbianas presentes nos n1ais diversos ambientes, a exemplo dos sistemas
biológicos de tratamento de águas residuárias, foco principal desse capítulo.
Um período de iinensa disponibilidade de informações está apenas no co-
meço. Métodos integrados, en1 constante crescimento, tornarão possível avaliar
tanto a taxonomia quanto a diversidade funcional de complexas comunidades de
micro-organismos. Essas informações são de particular interesse, uma vez que,
estabelecendo-se a ligação entre as medições experimentais e as análises n1icrobio-
lógicas, mais facilmente se conseguirá elucidar as relações entre biodiversidade e
o funcionamento dos ecossistemas, sejam naturais ou concebidos pela engenharia.
No caso particular dos sistemas de tratamento de águas residuárias, as novas
técnicas serão extremamente úteis para o diagnóstico do sistema e a identificação
de problemas ligados à sua operação, tais como intumescimento do lodo (bulking)
e formação de espumas/escumas. Atualmente, as plantas de tratamento apenas
"funcionam", algu1nas bem, outras não. Entretanto, na grande maioria das vezes,
não se sabe o porquê.
Embora um conhecimento já tenha sido estabelecido sobre a estrutura de
lodos ativados e de processos com biofilme, ainda se está longe do entendimento
completo das estruturas das co1nunidades microbianas desses processos. O obje-
tivo é justamente saber de onde são procedentes detern1inados micro-organismos,
por que e como eles apresentam alterações (dinâmica das populações microbia-
nas), e de que forma eles estão relacionados com o desempenho dos processos
biológicos. Em outras palavras, é preciso se obter o entendimento necessário de
determinadas populações microbianas e como elas interagem com as águas re-
siduárias, abrangendo desde a microbiologia de uma única célula até estudos em
escala laboratorial . E é justamente o melhor entendimento da microbiologia e da

ecologia de diversos grupos de bactérias que fornecerá os caminhos essenciais para
n1elhorar o desempenho e o controle dos processos, desvendando o que está por
trás de um bom funcionamento dos mesmos. Tal conhecimento consiste justa-
mente na "ponte" que une o conhecimento fundamental a respeito das comunida-
des microbianas e os processos de tratamento de águas residuárias.
Estudos buscando esses conhecimentos já estão acontecendo em diversos
centros de pesquisas do mundo, em grande parte sendo realizados em sistemas
montados em laboratório, fornecendo um entendimento rapidamente crescente
dos principais micro-organismos envolvidos nos processos de tratamento e como
eles alteram seus números e atividade. Entretanto, há uma grande lacuna no co-
nhecimento, especialmente devido ao fato de haver poucos estudos em sistemas
em escala real, aliado ao fato da dificuldade de se extrapolar o conhecimento dos
estudos em laboratório para plantas em escala real.
Em última análise, se espera que, no futuro, co1n o auxílio das técnicas de
biologia molecular, seja possível manipular e controlar populações de micro-orga-
nismos, selecionar apenas os que "trabalham" melhor em determinadas condições
operacionais, atingindo com isso 1nelhores eficiências de remoção de poluentes e
maiores estabilidades operacionais, requisitos primordiais de qualquer estação de
tratamento. Olhando ainda mais adiante, pode-se pensar no monitoramento em
tempo real de sistemas biológicos de tratamento, obtendo a diversidade e a ativi-
dade de comunidades de micro-organismos associadas a detern1inadas condições
operacionais em qualquer tempo desejado.
É preciso, dessa forma, encorajar engenheiros de processo a apreciar melhor
o valor dessas informações valiosas obtidas a nível molecular quando da realiza-
ção do projeto das plantas de tratamento, e não somente levar em consideração
parâmetros químicos e físicos. Seguindo nessa lógica, a operação desses sistemas
segu ramente será realizada de forma menos empírica, contribuindo para o su rgi-
mento de uma nova era dos novos e avançados processos biológicos de tratamento.
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Processos Biólogicos Avançados - Dezotti Et Al

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PROCESSOS BIOLÓGICOS AVANÇADOS

Para tratamento de efluentes

Editora Int.erciência Lt<ia.

Impresso no Brasil - Printed in Brazil

microbianos se desintegram mais facilmente, além de estarem mais expostos aos

Márcia, Geraldo e João Paulo

3 .2 Princípio de Funcionamento do MBBR . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

4 .6 Processos de Conversão em Grânulos Aeróbios . . . . . . . . . 134

6 .3 , Aplicação das Técnicas de Biologia Molecular no Tratamento

uitos têm sido os avanços no tema dos processos biológicos

nologia de Granulação Aeróbia, e Técnicas de Biologia Molecular Aplicadas ao

'' '' '' ''

Estabelecimento dos princípios básicos da técnica PCR (polymerase chain reaction) ,

Detecção de polimorfismo de conformação de filamento único (SSCP - Single-Strand

Desenvolvimento da técnica FISH (Fluorescent in-situ Hibridization),

Utilização da técnica DGGE para separação de pequenas unidades ribossomais,

Desenvolvimento da técnica de microarranjos de □ NA (DNA microa"ay), Schena et alii

Registro do uso da técnica RQP (Respíratory Quínone Profífe) para caracterização da

Desenvolvimento da técnica TRFLP (Terminal Restriction Fragment Lenght

Análise da região espaçadora intergênica ribossomal (RISA-Ribosomal

Combinação das técnicas FISH e MAR (Micro Autoradiography) para análise

FIGURA 1.2 Evolução do desenvolvimento de diferentes técnicas moleculares e de microscopia

Biorreatores com Membranas

s biorreatores com membranas, mais conhecidos pela sigla de língua

regem o tratamento biológico de efluentes é de fundamental importância para

Há na literatura registros de que o primeiro MBR foi desenvolvido pela Em-

2.2 TIPOS DE BIORREATORES COM MEMBRANAS

A partir dos anos 90 a configuração que emprega membranas submersas,

afluente --- (permeado)

Mais recentemente foi proposta a instalação dos módulos de membranas em

afluente, Q efluente (permeado)

FIGURA 2.3 Configuração de MBR com dois tanques.

Os sistemas de múltiplos tanques utilizados para remoção de matéria or-

!afluente efluente (permeado)

Além do reciclo para manter e controlar a concentração de lodo nos tanques,

FIGURA 2.5 Esquema il ustrativo de um MABR.

A aplicação de men1branas microporosas de fibras ocas em MABRs tem sido

membranas compostas densas, altament e permeáveis, na forma de fibras ocas,

Outra modalidade de biorreator com membranas tem sido investigada para

FIGURA 2.8 MBR anaeróbio: sistema desenvolvido pela Empresa Kubota.

Esclarecimentos adicionais sobre esse processo podem ser encontrados na

Na figura 2 .9 encontra-se o esquema de um modelo de AnMBR proposto por

2.3 ESTÁGIO ATUAL DA TECNOLOGIA MBR

TABELA 2.1 Características de módulos de membranas comercializados por algumas empresas

Na figura 2 .1O são apresentados alguns sistemas comerciais de módulos sub-

Feixe de membranas Conjunto de feixes (elemento) Módulo

Os volumes de ar utilizados são significativos, como revelam dados de insta-

transferência de oxigênio no biorreator, os custos de energia associados à aeração,

Tipo de módulo tubular tubular placas planas

Diâmetro dos tubos (mm) 11 ,5 5 2-8

Os autores mencionam a construção p revista de plantas de grande capacidade

2.4 FOUL/NG EM MBRs

O aumento gradual da resistência à permeação é um fato inconteste e que

Alguns autores empregam a noção de fluxo crítico, ou ainda, a de fluxo sus-

Segundo Le-Clech et alii (2006a) o fluxo crítico corresponde àquele a par-

propostas de MBRs, para níveis na faixa de 8 a 12 g/L. Essa mudança se deveu

aumentar os custos de energia para o processo de tratamento. Como já comenta-

irreversível, causado pela deposição de material orgânico e inorgânico na entrada

2.4.2 FORMAÇÃO DO FOULING EM MBRs

Como já comentado, a natureza complexa dos meios líquidos contidos nos

(a) (b) (e)

Vários eventos contribuem para a ocorrência desses estágios. Os flocos micro-

No segundo estágio vários eventos têm curso: restrição e bloqueio de poros;

2.4.3SUBSTANCIAS POLIMfRICAS EXTRACELULARES EPRODUTOS MICROBIANOS SOLÚVEIS