Universidade Federal da Paraíba

Centro De Ciências Exatas e da Natureza

Departamento de Biologia Molecular
Fundamentos de Química de Proteínas

Discente: Matheus V. S. Laurentino

Imunoensaios

Imunoprecipitação
Técnica qualitativa e até quantitativa da interação Ag-Ac. Assim como em ensaios de
aglutinação e floculação, nessa técnica é necessário haver uma equivalência entre a quantidade
de Ag e Ac para formar uma zona de equivalência e quantidade de agregados (precipitados)
detectáveis, quando há excesso de Ac (ou falta de Ag) forma-se uma zona de excesso chamada
de efeito pró-zona e proporciona falso-negativo. Para evitar esse problema deve-se usar
diferentes diluições do anticorpo frente à concentração fixa do anticorpo. LOGO, a
concentração de anticorpo empregada deve ser equivalente à concentração mínima de antígeno
detectável (quando detectar bem o Ag é pq aquela é a concentração detectável mínima).

Precipitados em meio liquido é difícil de observar, por que as amostras em soro têm sua própria
turvação e coloração variáveis. Aas técnicas manuais de imunoprecipitação, atualmente em uso, são
realizadas em meio gelificado, o que facilita a leitura e reduz os volumes necessários para a interação.
No entanto, demora muito para a difusão do Ag ou Ac formar um imunocomplexo visível.

A turbidimetria e nefelometria são técnicas automatizadas, que são mais sensíveis que o olho
humano para detectar os imunocomplexos e capazes de corrigir ou anular os interferentes
presentes na amostra.

Imunodifusão
Baseada na difusão de substancias solúveis por movimentos moleculares ao acaso em meio
gelificado como o ágar ou gel de agarose. Enquanto as moléculas de anticorpos e/ou antígenos
livres corre a difusão no meio. Quando ocorre a interação entre as moléculas, formam-se os
imunocomplexos (imunoprecipitado) que por terem elevado peso molecular ficam
imobilizados no gel, e pode ser observado a olho nu.
Imunodifusão simples linear
O anticorpo é incorporado ao meio gelificado e a mistura é colocada em um tuno. Após a
gelificação, coloca-se os antígenos no topo da coluna em concentração maior ao anticorpo. O
tubo e selado e mantido a 25°C. Após 1 semana, observa-se a formação da linha de precipitação
na área de equivalência. A concentração do antígeno é proporcional à espessura da linha de
precipitação e a distância percorrida pelo antígeno até forma o imunocomplexo.

Imundifusão simples unidimensional. As moléculas antigênicas em solução se difundem no gel contendo os

anticorpos imobilizados que formam o imunocomplexo na área de equivalência.

Nefelometria e turbidimetria
A nefelometria e turbodimetria, são ensaios automatizados de imunoprecipitação desenvolvido
a partir da técnica de imunodifusão simples radial. A diferença entre essas duas técnicas é que
na nefelometria a interação Ag-Ac é detectada por meio da difusão da lux incidente, já na
turbodimetria a detecção é feita a partir da lux que é absorvida pelo ensaio, ou seja, por sua
absorbância.
Immunoblot ou western blotting
Immunoblot é um ensaio imunoenzimático onde a interação Ag-Ac é feita em um suporte de
membrana de nitrocelulose. Em resumo as etapas para realização são: I. obter as membranas
com frações dos antígenos, isso é feito com uma eletroforese em gel de poliacrilamida depois
da separação os Ag são transferidos, por eletrotrasferência, para uma membrana de
nitrocelulose onde ficam fixados. II. A amostra (que contém o Ac) é incubada com a membrana.
III. É feita uma lavagem para retirar os não fixados depois colocado anti-Ig humana conjugado,
que vai se ligar aos Ac da amostra. IV. Outra lavagem para retirar o excesso de anti—Ig, e é
adicionado o substrato cromogênico que gera cor insolúvel. V. É feito um stop da reação com
a retirada do substrato por lavagem. VI. por fim é feita a leitura. Por meio de análise de bandas,
onde tem bandas (cor) foi onde ocorreu a reação da enzima conjugada ao anti-Ig, logo, onde
teve Ac da amostra ligado.

Teste de avidez de IgG

Para avaliar a avidez de IgG pode ser feito um ELISA com os Ag fixados, em que é feito um
ELISA convencional e um ELISA com solução dissociante depois da primeira lavagem após a
incubação com a amostra. A avidez é a força total das ligações entre o antígeno e anticorpos,
logo, depende da afinidade do anticorpo para o epítopo, da valência do anticorpo e do antígeno
e a disposição geométrica das interações. Em geral, a baixa avidez de anticorpos significa que
está na fase aguda ou a infecção é recente, e ainda está no início das reações de maturação da
afinidade no centro germinativo.